목재부후균의생육조건과효소 - 제 3 장 - 1 제 1 절목재부후균의생육조건 영양, 수분, 산소, 온도, ph, 광선 1. 영양 에너지원, 균체성분, 4대영양분가. 탄소화합물 ( 탄소원 ) Glucose( 포도당, dextrose), Mannose, Xylose, 전분등 인공배지 : glucose 첨가 Xylan(β-D-xylose) Mannan(β-D-mannose) 2 1
Cellulose 와 Starch 의화학구조 3 나. 질소화합물 ( 질소원 ) 무기질산염, 암모늄염, 유기요소등 인공배지 : 펩톤첨가 다. 무기염류 ( 미량원소 ) 목재세포내함유물질, 세포벽중에존재 P, Mg, K, S 등 : 세포내삼투압조절, ph 의안정화 Ca, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn 등 : 효소의활성화, 조효소성분 인공배지 : K 2 HPO 4, MgSO 4 7H 2 O 첨가 라. 생육인자 ( 미량물질 ) 비타민류, 아미노산등 인공배지 : 맥아추출물첨가 4 2
자연계에서목재부후균의영양섭취 목재로부터영양분섭취하며생활 4대영양분중에서 탄소원, 무기염류, 생육인자 : 목재로부터섭취가능 질소원 : 균체증식 ( 단백질합성 ) 을위해상당량이필요 - 균사생장에필요한배양기중의질소함유량 : 0.5~2.0% - 목재내질소함유량 : 0.1~0.4%( 목재전건중량대비 ) - 부족 부족한질소원조달방법 추정 1 질소고정세균의도움 - 근거 : 목재초기부후에질소고정세균관여 2 토양중의질소원이용 - 근거 : 토양접지부로부터목재내부로질소화합물이동 3 균사의자기소화 - 근거 1: 부후말기목재에서균사관찰이불가능 - 근거 2: 균사생육과정중에어느조건에서강한단백질분해효소 (protease) 분비 5 부후초기 부후말기 6 3
2. 수분 세포내원형질의최다구성성분 물질대사의매체역할 목재부후균의생장 : 목재내수분과밀접한관계有 참고 목재중의수분존재상태 1 결합수 ( 흡착수 ) 세포벽구성성분과물리화학적으로결합 ( 수소결합, 반데르바알스힘 ) 하고있는수분 섬유포화점 (FSP) 이하에서의수분 2 자유수 세포내강이나공극에액체상태로존재하는수분 섬유포화점이상에서의수분 목재부후균이이용할수있는수분 7 가. 목재함수율과부후 1 기건재 : 함수율약 15% 전후 부후발생불가능 2 포수재 : 함수율약 150%( 고비중재 ) ~ 200%( 저비중재 ) 부후발생불가능 3 다습재 : 포수함수율에가까운함수율을갖는목재 부후발생불가능, 연부후발생 나. 수분조건과부후 1 공중습도 최적 : 95~99%( 최저 85%) 2 목재함수율 최적 : 30~60% 불량 : 25% 미만, 100% 이상 8 4
3. 산소 1 단당류의산화에필요 ( 당류 화학에너지 ) 2 목재부후균 : 호기성균 기체상태의산소를이용 수중또는지중깊은곳의목재 : 부후발생곤란 산소조건과수분조건은밀접한관계有 3 산소요구성 : 부후균 > 연부후균 4 산소요구도측면에서목재공극율 담자균류생장 : 공극율 20% 이상 9 4. 온도 가. 미생물의생육적온에의한분류 1 저온균 : 18 이하 2 중온균 : 25~40 3 고온균 : 45 이상 나. 목재부후균 : 대부분중온균 - 세분화 1 好저온균 : 24 이하 Serpular lacrymans 2 好중온균 : 24~32 Fomitopsis palustris, Trametes versicolor 3 好고온균 : 32 이상 Gloephyllum saepiarium, Pycnoporus coccineus 다. 목재부후균의온도에대한저항성 야외발생균 ( 토목용재, TRV) > 실내발생균 ( 건축용재, SEL) 10 5
5. ph 가. 균류생장의최적 ph 부후균, 연부후균 : 산성측 (ph 4~6) 세균, 방선균 : 약알칼리측 (ph 6.5~7.5) 나. 부후시험 : 배양액 ph 5.5~6.0으로조정 11 6. 광선 가. 균사생장에는불필요, 자실체형성에필요나. 자외선 ( 파장 100~400nm): 균생장에유해 살균에이용 일광소독 파장 240~280nm: 살균력有 파장 260~265nm: 살균력强 (253.7nm) 殺菌機構 ( 추정 ): 세포내핵산 (DNA) 에변화발생 신진대사장해 12 6
다. 자외선照射에의한變異株생산 백색부후균에자외선 (260~265nm) 조사 Cellulase 缺損변이주출현 Cellulase 결손변이주 : 생물적 pulping(bio-pulping) 에사용 Modified wood structures due to bio-pulping Overview of the 50-ton outdoor bio-pulping chip pile (4 meters high, 9 meters wide, 21 meters long) 제 2 절목재부후균의효소 < 효소의분류 > 1) 세포외효소 ( 균체외효소 ): 균체외로분비되어촉매작용 고분자물질의저분자화 ( 解重合 ) 에관여하는효소 Cellulose, Hemicellulose, Lignin 분해계효소 필요에따라생산하는효소 ( 誘導酵素 ) 2) 세포내효소 ( 균체내효소 ): 균체내에서촉매작용 호흡, 발효에관계하는효소 ( 호흡, 발효계효소 ) 항상균체내에존재하고있는효소 ( 構成酵素 ) 14 7
효소의기능 16 8
1. 셀룰로오스분해효소 Cellulose의 β-1 4-D-glucoside 결합을加水分解하는효소 - Cellulose: glucose로구성된 monopolysaccharide( 단순다당류 ) Cellulose( 다당류 ) Glucose( 단당류 ): 관여효소 1 Cellobiohydrolase 2 endo-glucanase 3 Cellobiase 가. Cellobiohydrolase(CBH) : exo-1,4-β-d-glucanase 1 셀룰로오스의결정영역 (micell, crystalline region) 을가수분해 2 대표적인생산균류 : 갈색부후균은분비하지않음 곰팡이류 : Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Fusarium 백색부후균 : Phanerochaete chrysosporium( 유색고약버섯 ), Schizophyllum commune( 치마버섯 ) 3 CBH의종류 : CBHⅠ, CBHⅡ 화학구조와분해특성이각각다름 17 1) Cellobiohydrolase I 1 Cellulose 환원성말단기로부터 glucose oligomer를절단 glucose oligomer: cellotriose(g3) ~ cellohexose(g6) glucose oligomer 중에서 cellotetrose(g4) 를가장많이절단 2 셀룰로오스를불규칙하게절단 2) Cellobiohydrolase II 1 Cellulose 비환원성말단기로부터 cellobiose (G2) 또는 cellotriose(g3) 를절단 2 G3에서 glucose를절단하기도함 18 9
Crystalline cellulose Amorphous cellulose Cellulose 분자구조 ( 비환원성말단기, 환원성말단기 ) Cellulose 가수분해효소 19 나. Endo-glucanase(EG) 1 별칭 : endo-1,4-β-d-glucanase, glucanohydrolase 2 셀룰로오스의비결정영역 (non-crystalline region) 을가수분해 3 Glucose oligomer 생성 cellobiose 생성다. Cellobiase 1 별칭 : β-d-glucosidase 2 Cellobiose Glucose 20 10
21 갈색부후균의셀룰로오스분해메카니즘 갈색부후균의셀룰로오스분해효소 EG와 cellobiase만분비 셀룰로오스결정영역을분해하는 CBH는분비하지않음 그럼에도세포벽을극심하게분해 갈색부후균은셀룰로오스를어떻게분해할까? 저분자대사물질의세포벽내로의확산에의해분해 과산화수소의 Fenton 반응가설제시 (Koenigs, 1974) Fenton s reaction: 강력한산화반응 과정 : 갈색부후균과산화수소분비 목재중의전이금속 (Fe) 과 Fenton 반응 수산화자유 radical(ho ) 생성 HO 에의해셀룰로오스절단 22 11
갈색부후균의셀룰로오스분해 효소적가수분해와산화반응계가중요한역할 저분자대사물질이관여하는것은확실 기작은불확실 23 24 12
25 2. 헤미셀룰로오스분해효소 Hemicellulose: heteropolysaccharide 구성다당류의종류 : 1 Glucuronoxylan: 활엽수 HC의주체 ( 활 : 25~35%, 침 : 5~15%) 2 Glucomannan: 침엽수 HC의주체 ( 침 : 10~20%, 활 : 2~5%) 3 Arabinoglucuronoxylan( 침 : 10~15%, 활 : 0.1~2.0%) 가. Xylanase 별칭 : 1,4-β-D-xylanohydrolase Xylan의주쇄 (β-1 4-D-xyloside 결합 ) 를加水分解 1) endo-xylanase xylan 무작위로 xylose oligomer 생성 xylose oligomer: 주로 xylotriose 또는 xylotetrose 2) exo-xylanase xylose oligomer를 xylose로가수분해 26 13
Fig. Schematic representation of the action of the xylanolytic enzyme system. 1 endoxylanases; 2 α-l-arabionofuranosidases; 3 glucuronidases; 4 feruloyl and coumaroyl esterases; 5 acetyl xylan esterases; 6 β-xylosidases. Source: Chavez etal., 2006 27 나. Mannase Mannan의주쇄 (β-1 4-D-mannoside 결합 ) 를가수분해 1) endo-mannase glucomannan으로부터무작위로 oligomer 생성 (mannose + mannose) oligomer (mannose + glucose) oligomer 2) β D-mannosidase (mannose + mannose) oligomer mannose 3) β D-mannosidase, β D-glucosidase (mannose + glucose) oligomer mannose, glucose 28 14
Glucomannan (acetyl 기 ) β-d-mannose β-d-glucose 다. 기타 측쇄를가수분해하는효소 - acetyl esterase, glucuronidase, arabinosidase 등 Hemicelluse의가수분해에는 cellulose에비하여많은종류의효소가관여 29 3. 리그닌분해효소 리그닌의화학구조 : 매우복잡 구성단위 : phenylpropane phenylpropane 의종류 1 p-hydroxyphenylpropane 2 syringylpropane 3 guaiacylpropane 식물리그닌의구조단위 식물의진화와함께리그닌구조단위도복잡 벼과식물 : 1+2+3 활엽수 : 주로 2 - 분해가용이 침엽수 : 주로 3 - 분해가곤란 p-coumaryl alcohol (p-hydroxyphenyl propane) sinapyl alcohol (syringyl propane) coniferyl alcohol (guaiacyl propane) 30 15
가. 효소에의한리그닌의분해과정 phenylpropane 단위의분해 1 탈메톡실화 (demethoxylation) 2 α 자리탄소의산화 (carbonyl 화, C=O) 3 측쇄구조의절단 4 β-o-4(β-arylether 결합 ) 결합의절단 5 방향환의개환 나. 리그닌분해에관여하는효소 지금까지알려진효소 1 리그닌과산화수소효소 (lignin peroxidase, Lip, lignase) 2 망간의존형과산화수소효소 (Mn-dependant peroxidase, MnP) 3 Laccase 2 3 4 1 5 침엽수리그닌 (guaiacylpropane) 분해모식도 31 다. 리그닌분해미생물 대부분백색부후균 백색부후균의 40%: Lip 와 MnP 를생산 백색부후균의 60%: MnP 와 Laccase 를생산 Pycnoporus cinnabarinus: Laccase 만생산 방선균 : Nocardia, Streptomyces 세균 : Pseudomonas, Xanthomonas 1) 리그닌과산화수소효소 (LiP) Phanerochaete chrysosporium( 유색고약버섯 ) 에서발견된효소 효소활성에과산화수소 (H 2 O 2 ) 를필요로하는산화환원효소 리그닌구조의분해 β-o-4(β-arylether 결합 ), C α -C β 간의결합분해 LiP 생산균주 유색고약버섯, 구름버섯, Phlebia radiata, Trametes hirsuta 32 16
2) 망간의존형과산화수소효소 (MnP) 과산화수소 (H 2 O 2 ) 와 2 가의망간 (Mn ++ ) 을필요로하는산화효소 Mn ++ 를 Mn +++ 로산화시키면서페놀구조를산화 산화력 : 활엽수리그닌 > 침엽수리그닌 MnP 생산균주 유색고약버섯, 표고버섯, Phlebia radiata, Ceriporiopsis 3) Laccase laccase 의리그닌분해에관한보고 1928 년 Bavendamm( 독일 ) Bavendamm 반응 : 목재부후균의부후형식별수단 리그닌구조의산화분해 C α 의산화, 탈메톡실화, phenyl 기의개열, C α -C β 의절단 유백색의생옻액 ( 주성분 : urushiol) 에도존재 옻칠의건조에불가결한효소 ( 옻칠의산화중합효소 ) urushiol 33 Bavendamm s reaction 목재부후균의부후형 ( 갈색, 백색 ) 식별수단 방법 탄닌산또는몰식자산 (gallic acid) 함유배지 未知의담자균접종 수일간배양 균사체주위에갈색띠형성유무확인 갈색띠형성 : 백색부후균 ( 갈색부후균 : 음성 ) Lignin의분해와옻칠의건조 Lignin의분해 : laccase에의한산화분해 - in vivo( 생체내 ) 옻칠의건조 : laccase에의한산화중합 in vitro( 시험관내 ) 리그닌분해실험 in vivo( 생체내 ) 상에서는재중합이발생되지않음 in vitro( 시험관내 ) 상에서는분해된리그닌의재중합발생 34 17
Fig. Characteristics of the Bavendamm s reaction caused by the oxidation of gallic acid and the formation of quinones on a Fusarium sp. strain D3-FB culture 35 18