RESEARCH ARTICLE Kor. J. Aesthet. Cosmetol., Hesperidin 의 Ultraviolet B 에의한광노화억제효과 이현진건국대학교일반대학원생물공학과 Inhibitory Effects of Hesperidin on the Ultraviolet B-Induced Photo-Aging Hyunjin Lee Department of Bioengineering, Graduate School of Konkuk University Abstract Hesperidin is a flavanone glycoside found abundantly in citrus fruits. In vitro and in laboratory research, hesperidin has anti-inflammatory and anti-oxidant effects, reduced cholesterol and blood pressure. In this study, to investigate UVB- induced anti-oxidant and anti-aging effects of hesperidin, we measured ROS scavenging assay, matrix metalloproteinases (MMP) -1, 3, type 1 collagen (col1a1) gene expression in human dermal fibroblasts (HDFs) and NF-κB transcription activity in NIH 3T3 stable cell. Hesperidin at concentration of below 100 μm did not affect cell viability and in ROS scavenging activity, hesperidin had anti-oxidant activity in a dose-dependent manner. Futhermore hesperidin suppressed NF-κB transcription activity. To determine MMP-1, 3 and type 1 collagen gene expression is regulated by hesperidin, we performed Quantitative RTPCR (qrt-pcr) in HDFs. Levels of gene expression of MMP-1 and 3 were significantly decreased and col1a1 expression increased by hesperidin-dependently. From the above results, it is referred that hesperidin appears to have potent UVB-induced anti-oxidant and anti-anging activity. These finding suggest that hesperidin is useful ingredient for anti-aging effects of skin Keywords: Hesperidin, Anti-oxidant, Anti-aging, MMP, Collagen 의학의발전과사회, 경제, 문화의발달로인간의평균수명을 100 세그이상을바라보는현시대에성별과나이를불문하고 더젊고건강하게살아갈수있는방법에대한관심이급증하고 있다. 이러한사회적트렌드에맞춰미용산업역시항노화에 대해이슈화되고있고항노화화장품에대한소비자의관심뿐 만아니라국내외화장품산업에도영향을미치고있다 ( 박종숙, 2012). 피부노화는크게내인성노화와외인성노화로나누어지며, 내인성노화는시간의흐름에따라자연스럽게신체기능이저 하되는나타나는현상으로호르몬, 가족력, 유전자인자등을 Corresponding author: Hyunjin Lee, Department of Bioengineering, Graduate School of Konkuk University, 1 Hwayang-dong, Gwangjingu, Seoul 143-701, Republic of Korea E-mail: suphia77@hanmail.net Received August 1, 2015; Revised October 10, 2015; Accepted October 19, 2015; Published October 30, 2015 포함하고, 외인성노화는햇빛에의한피부노화현상을가장주요요인으로간주하고흡연, 음주, 스트레스등의요인도포함하고있다 (Farage et al., 2008; 강태진, 2011). 피부노화를일으키는요인중일상생활에서가장노출이심한자외선은피부세포내신호전달체계에영향은미쳐 DNA 손상과유전자발현을변화시켜세포노화및세포사멸을일으킨다. 자외선이피부세포에지속적으로노출될경우, 진피층의섬유아세포에서는활성산소가증가하고사이토카인 (cytokine) transforming growth factor-beta (TGF-β) 와전사인자 activator protein 1 (AP-1) 의발현이활성화된다 (Lee et al., 2012; Saito et al., 2004; Varani et al., 2002). TGF-β는콜라겐의합성을촉진하는사이토카인으로서자외선에의해 TGF-β의발현이감소하여콜라겐합성이저해되고, AP-1은 matrix metalloproteinases (MMPs) 의조절하여콜라겐의분해를촉진하는전사인자로서자외선노출시세포내 AP-1의활성이증가하여콜라겐분해가촉진되어진다 (Yolanda et al., 2008). MMP 중 collagenase 1으로알려져있는 MMP-1은 type I 과 III collagen을기질로하며, MMP-2, 9는 gelatinase A, www.kosac.or.kr 631
Kor. J. Aesthet. Cosmetol., B로서알려져있으며피부세포간질 (ECM) 성분들중 gelatin 과 collagen type IV와 V를분해한다고알려져있다 ( 소승호등, 2008; Fisher et al., 1996). 이들 MMPs의발현은자외선에의하여발현이촉진되는데이들의발현을저해할경우피부주름이완화되는것으로일반적으로알려져있다 ( 이상명등, 2013). 또한자외선은세포내대표적인전사인자 NF-κB를활성화시켜 interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factoralpha (TNF-α) 와 collegn I의분해를촉진하는 collagenase MMP1 등다양한유전자의발현을유도하는데, 특히 NF-κB 로인한 MMP1의발현증가는콜라겐을분해를증가시켜자외선에의한피부노화를촉진시키는대표적인요인으로보고되고있다 (Oh et al., 2004; Wenk et al., 2004). Hesperidin은플라보노이드 (flavonoid) 에속하는플라본 (flavone) 배당체로서 hesperitin에 rutinose가결합된형태이며, 감귤류껍질속에많이함유한것으로알려져있다. 또한 hesperidin은 Rutin과함께 bioflavonoid 라고도불리는 vitamin P군에속하며항산화 (Hirata et al., 2005), 혈압 (Ohtsuki et al., 2003), 콜레스테롤 (Monforte et al., 1995), 항염증 (Emim et al., 1994; Galati et al., 1994) 에도탁월한효과가있는것으로보고되어지고있다. 따라서본연구는 UVB로인한피부세포의노화를억제함에있어 hesperidin의효능을입증하고, 향후 hesperidin의항노화화장품의소재로서의가치를연구하고자한다. 다. 배양된 well에 EZ-Cytox cell viability assay kit reagent 10 μl 첨가하여 1 h 배양후microplate reader (Bio-Rad, USA) 를이용하여 490 nm에서흡광도측정하였으며, 3회반복수행하여세포생존율평균값을도출하였다. 3. 세포내 ROS 변화량측정 HDFs를접종하여 24 h 배양후 hesperidin과 H 2 O 2 처리하여 2 h을배양하였다. Dichlorofluorescein diacetate (DCF- DA) 를 10 μm 첨가하여 30 min 배양후세포를수확하여 Flow cytometry (Becton Dickinson, USA) 를이용하여 ROS의변화량을측정하였다. 4. NF-κB luciferase assay NF-κB reporter NIH-3T3 stable cell 을 60 mm culture dish에 1 10 5 개의농도로접종하여 24 h 배양후 hesperidin 을적절한농도로각각처리하고 24 h을배양하였다. 배양된세포를수확하여 Passive lysis buffer (Promega, USA) 를첨가하고 ice에서 10 min간방치하여용해한다음 4 조건에서 12,000 rpm으로 30 min간원심분리하여상등액을회수하였다. Bradford assay로정량화된시료군을각각 80 μg 씩 black 96-well plate에넣은후 luciferin (Promega) 을첨가후 Luminometer (Veritas, USA) 를이용하여 luciferin의발광정도를측정하였다. 1. 세포배양본연구는진피층에분포하는 human dermal fibroblasts (HDFs) (Lonza, USA) 와 NF-κB 전사활성변화를확인하기위해 promoter에 luciferase 유전자가삽입된 NF-κB reporter NIH-3T3 stable cell line (Cell Biolabs, USA) 를사용하였다. HDFs와 NIH-3T3는 10% feta bovine serum (FBS) 과 1% penicillin/streptomycin이첨가된 DMEM 배지 (Welgene, korea) 를사용하여, 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. Hesperidin (Sigma, USA) 는 DMSO에 200 mm의농도로녹여사용하였고, UVB는 UV-B lamp (UVP, USA) 를이용하여 100 mj/cm 2 의강도로조사하였다. 2. 세포생존율측정세포생존율은 EZ-Cytox cell viability assay kit ( 주 ) 이츠바이오, Korea) 를이용하였으며, HDFs를 96-well plate에 3 10 3 cells/well 의농도로 100 μl씩접종하여 24 h 배양후 hesperidin과 UVB를적정농도처리하고 24 h 동안배양하였 5. mrna 추출및 cdna 합성 Hesperidin과 UVB가조사된세포눈 Trizol reagent (Invitrogen, USA) 를이용하여 mrna를추출하였으며, 추출된 mrna는 Nanodrop (Nanodrop, USA) 을이용하여순도를측정하여 260 nm/280 nm의 ratio 1.8 이상의 mrna만을실험에사용하였다. cdna는 1 μg의 RNA를대상으로 M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, Korea) 을이용하여합성하였다. 6. Quantitative real-time PCR (qrt-pcr) UV와 Hesperidin에의해 HDF 내에서일어나는 MMP1, MMP3, Col1A1 유전자변화를정량하기위하여 SYBR green (Invitrogen, USA) 을이용하였으며, Linegene K (BioER, Table 1. Lists of primers used in this study Gene Forward primer Reverse primer -actin GGATTCCTATGTGGGCGACGA CGCTCGGTGAGGATCTTCATG Col1A1 AGGGCCAAGACGAAGACATC AGATCACGTCATCGCACAACA MMP1 TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC MMP3 ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC CATTTGGGTCAAACTCCAACTGTG 632 www.kosac.or.kr
Hesperidin 이 UVB 에의한광노화억제효과 Figure 1. Cytotoxicity of hesperidin on HDFs. Figure 2. The effect of hesperidin on cell viability in UVBinduces HDFs. China) 를사용하여 PCR을진행하였다. PCR 결과는각결과별 melting curve로검증하였고, 각유전자의발현은 β-actin의발현을표준화하여비교분석하였다. 실험에사용된유전자의 primer는 Table 1과같다. 1. 세포생존율저해억제효과 Hesperidin을농도별로 HDFs에처리하여세포독성을확인한결과 50 μm까지는생존율에영향을미치지않았으며, 100 μm에생존율이 87%, 200 μm에서는 77% 로생존율이감소하여 200 μm에서는세포독성이있는것으로판단하여이후실험에서는 hesperidin의농도를 100 μm로제한하였다 (Figure 1). HDFs에 hesperidin 20, 50, 100 μm의농도로전처리후 UVB 조사하여세포생존율을변화를확인하였다. HDFs는 UVB 100 mj/cm 2 을조사하였을때 68% 로생존율이감소하였으나 hesperidin 20 μm 전처리시 86%, 50 μm 전처리시 96%, 100 μm 전처리시 98% 로농도의존적으로세포생존율이증가하는것으로확인하였다 (Figure 2). 이러한결과는 UVB로인한세포사멸을 hesperidin이보호하여세포사멸을억제하는데도움을주는것으로판단된다. 2. ROS 억제효과자외선으로인한세포내 ROS의증가는교원섬유의합성을저해하고 MMP 합성을촉진하여교원섬유의분해를증가시켜노화를촉진시킨다 (Yolanda et al., 2008). 항산화작용에우수한효과가있다고보고되어진 (Patricia et al., 2003) hesperidis의자외선에의해세포내발생하는 ROS의억제효능을확인한결과 HDFs에 UVB 100 mj/cm 2 강도로조사하였을때 UVB를조사하지않았을때보다 ROS가 3배증가하였으나, hesperidin을 20, 50, 100 μm 처리시 ROS Figure 3. The effect of hesperidin on ROS scavenging in UVBinduced HDFs. 는 2.5, 1.7, 1.4 배로 hesperidin 의농도의존적으로억제하 였다. Hesperidin 100 μm 처리하였을때 ROS 억제효과는 NAC (ROS scavenger) 처리했을때와비슷한수치로감소시켜 hesperidin 이활성산소제거에탁월한효과가있다는것을확 인하였다 (Figure 3). 3. NF-κB 전사활성억제효과 자외선에의해세포내 ROS 가증가하면 NF-κB 의전사를활 성화시키고이는 collagnase 의발현을촉진시켜피부주름을 형성하는데기인한다 (Masamitsu et al., 2009). 자외선에의해 활성화된 NF-κB 를억제하기위한 hesperidin 의효능을검증 한결과 UVB 100 mj/cm 2 강도로조사하였을때 luciferin 의 발광이 3.3 배증가하여 UVB 조사시 NF-κB 의전사가활성되 는것을알수있었다. 그러나 hesperidin 을 20, 50, 100 μm 으 로처리하여측정한결과 luciferin 의발광정도는 UVB 를조사 하였을때보다 2.7, 1.9, 1.3 배로감소하여 hesperidin 의농도 www.kosac.or.kr 633
Kor. J. Aesthet. Cosmetol., Figure 4. Inhibition of NF-κB activity by hesperidin in UVBinduced NIH 3T3. 가증가할수록 NF-κB의전사활성은감소하는것으로확인할수있었다. Hesperidin 100 μm을처리했을때는 UVB를조사하지않았을때와유사한수치로나타나 hesperidin이자외선으로부터 NF-κB 활성화되어노화를일으키는과정을억제하는것에효과가있는것으로판단된다 (Figure 4). 4. Hesperidin에의한 MMP1, MMP3, Col1A1 유전자발현변화노화를일으키는요인중외적인요인, 즉광노화에의해주름이형성될때 collagenase의발현을증가하고 collagen의합성을저해되어내인성노화와는달리더깊은주름을야기시킨다 ( 한영숙외, 2011). 자외선에의해생성되는주름형성을억제하기위해서는 collagen의합성을촉진시키고 collagenase 의합성을억제하여야한다. Hesperidin의이러한효과를확인한결과 UVB 100 mj/cm 2 강도로조사하였을때 MMP1의 mrna 발현양은 2.7로 UVB를조사하지않았을때보다 2배이상증가하는것으로나타났으나 hesperidin을 20, 50, 100 μ M으로처리하였을때 MMP1의 mrna 발현양은 2.2, 1.5, 1.2 로감소하였다 (Figure 5A). MMP3의 mrna 발현은 UVB 100 mj/cm 2 강도로조사하였을때 2.4, hesperidin을 20, 50, 100 μm으로처리하였을때는 2.1, 1.5, 1.1로 MMP1의 mrna 발현양과비슷한결과를보였다 (Figure 5B). 자외선을받으면 collagen 합성이저해되는데 hesperidin이 collagen 합성에영향을미치는지확인한결과 UVB 100 mj/cm 2 강도로조사하였을때 col1a1의 mran 발현은 0.61로 UVB를조사하지않은대조군에비해 40% 가량감소하였다. 그러나 hesperidin 을 20, 50, 100 μm으로처리하였을때 col1a1 mrna 발현양은 0.7, 0.8, 0.9로 UVB를조사하지않은대조군과유사한수치로증가하는것을확인할수있었다 (Figure 5C). 이러한결과는 hesperidin이자외선으로부터활성화된 collagenase의발현은억제하고비활성화되는 collagen의발현은활성화시킴으로 Figure 5. Quantification of mrna expression levels by qrt- PCR. (A) MMP-1, (B) MMP-3, (C) col1a1; *p<.05 자외선으로인한주름형성을지연시키는데도움을주는것으로 사료된다. 햇볕에지속적으로노출될경우자외선이피부에흡수되 634 www.kosac.or.kr
Hesperidin 이 UVB 에의한광노화억제효과 어 ROS가발생되고이는산화적스트레스로인해세포막, 지질, 미토콘드리아, 그리고 DNA를손상시킨다 (Yolanda et al., 2008). 자외선에의한피부세포내 ROS 증가는 MAP kinase pathway에 cytokine의발현을조절하여콜라겐을분해하는 MMPs의발현은촉진하고 (Fisher et al., 1996), 콜라겐합성을촉진시키는유전자들의발현은감소되어콜라겐합성이저해된다 (Quan et al., 2002). 또한자외선은 NF-κB의활성이촉진시켜 MMPs의발현이증가되어콜라겐분해를야기시키는것으로보고되고있다 (Berneburg et al., 2000). 본연구는항산화와항염증으로탁월한효능이있는플라보노이드 hesperidin이자외선에의해피부세포에일으킬수있는노화의과정, 즉, 세포내 ROS, NF-κB, MMPs, collagen 의변화에영향을미치는지확인하였다. 결과는 hesperidin은 UVB에의해사멸되는 HDFs를 protection하여생존율을높여주었고, UVB를조사하였을때 HDFs 내에증가하는 ROS를 hesperidin이농도의존적으로감소시켰다. MMPs의발현을촉진시키는 NF-κB 발현또한 hesperidin 이저해시키는것을확인하였다. UVB에의해 MMPs 발현은증가되고, collagen 의합성은저해되어주름을야기하는데 hesperidin은세포내 MMP1, 3의 mrna 발현을감소시키고, col1a1의 mrna 발현을증가시키는것으로확인하였다. 본연구의결론은 hesperidin이 UVB으로인한피부세포의 ROS 증가를억제함으로서산화적손상을극복할수있고, 동시에 hesperidin이 UVB에의한 NF-κB의활성억제, MMPs 발현저해, collagen 합성이촉진함으로서광노화로부터피부세포를보호할수있는효과가있음을검증하였다. 이는항노화화장품의원료로써도충분한가치가있음을시사하고앞으로원료로서화장품에사용되어질방법을연구할필요성이있다고사료된다. 강태진. 피부노화의원인. BioWave, 2011. 박종숙. 국내외항노화스킨케어시장동향. 한국보건산업진흥원, 2012. 소승호, 이성계, 황의일, 구본석, 한경호, 정진호, 이민정, 김나미. 홍삼생약복합물 (KTNG0345) 의피부주름개선에관한작용기전. J. Ginseng. Res., 32: 39-47, 2008. 이상명, 임영호, 김석창, 최재환, 김진희. 홍삼에함유된프로토파낙사트리올계전환사포닌의피부주름개선효과. Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 11: 877-882, 2013. 한영숙, 최태부, 이연희, 김춘자, 김주연, 장미혜. 피부학 3판, 2011. Berneburg M, Plettenberg H, Krutmann J. Photoaging of human skin. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 16: 239 244, 2000. Emim JA, Oliveira AB, Lapa AJ. Pharmacological evaluation of the anti-inflammatory activity of a citrus bioflavonoid, hesperidin, and the isoflavonoids, duartin and claussequinone, in rats and mice. J. Pharm. Pharmacol., 46: 118 122, 1994. Farage MA, Miller KW, Elsner P, Maibach HI. Intrinsic and extrinsic factors in skin ageing: a review. Int. J. Cosmetic Sci., 30: 87 95, 2008. Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, Wang ZQ, Varani J, Kang S et al,. Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism. Nature, 379: 335-339, 1996 Galati EM, Monforte MT, Kirjavainen S, Forestieri AM, Trovato A, Tripodo MM. Biological effects of hesperidin, a citrus flavonoid. (Note I): antiinflammatory and analgesic activity". Farmaco, 40: 709 12, 1994. Hirata A, Murakami Y, Shoji M, Kadoma Y, Fujisawa S. Kinetics of radical-scavenging activity of hesperetin and hesperidin and their inhibitory activity on COX-2 expression. Anticancer Res., 25: 3367 3374, 2005. Lee YR, Noh EM, Han JH, Kim JM, Hwang JK, Hwang BM, Chung EY, Kim BS, Lee SH, Lee SJ. Brazilin inhibits UVB-induced MMP-1/3 expressions and secretions by suppressing the NF-κB pathway in human dermal fibroblasts. Eur. J. Pharmacol., 674: 80-86, 2012. Masamitsu I, Hideya A, Masaki Y, Yoko N, Mary M. Photoaging of the skin. Anti-Aging Med., 6: 46-59, 2009. Monforte MT, Trovato A, Kirjavainen S, Forestieri AM, Galati EM, Lo Curto RB. Biological effects of hesperidin, a Citrus flavonoid. (note II): hypolipidemic activity on experimental hypercholesterolemia in rat. Farmaco, 50: 595 599, 1995. Ohtsuki K, Abe A, Mitsuzumi H, et al,. Glucosyl hesperidin improves serum cholesterol composition and inhibits hypertrophy in vasculature. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 49: 447 450, 2003. Oh JH, Chung AS, Steinbrenner H, Sies H, Brenneisen,. P. Thioredoxin secreted upon ultraviolet A irradiation www.kosac.or.kr 635
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