한국어병학회지제 22 권제 1 호 (2009) J. Fish Pathol., 22(1):67 ~ 73 (2009) 양식산황복에서 tetrodotoxin 유사독소의미량존재가능성제시 김도영 김주완 박기석 강희웅 전중균 정준기 최상훈 최민순 박관하 군산대학교해양과학대학수산생명의학과, 한국생명공학연구원바이오평가센터 국토해양부목포지방해양항만청완도사무소, 국립수산과학원서해수산연구소 강릉대학교생명과학대학해양생명공학부, 부경대학교수산과학대학수산생명의학과 Possible existence of tetrodotoxinlike toxins in cultured river puffer fish, Takifugu obscurus DoYoung Kim, JuWan Kim, KiSeok Park, HeeWoong Kang, JoongKyun Jeon, JoonKi Chung, SangHoon Choi, MinSoon Choi and Kwan Ha Park Department of Aquatic Life Medicine, College of Ocean Science and Technology, Kunsan National University, Korea BioEvaluation Center, KIRBB, Ochangeup, Cheongwongun, Korea Wando Maritime Office, Mokpo Regional Maritime Affairs and Port Office, MLTMA, WandoGun, Cheonam, Korea West Sea Fisheries Research and Development Institute, NFRDI, Incheon, Korea Division of Marine Bioscience and Technology, College of Life Sciences, Kangnung National University, Kangnung, Korea Department of Aquatic Life Medicine, College of Fisheries Sciences, Pukyung National University, Busan, Korea It was examined whether the common belief that "cultured puffer fishes do not contain tetrodotoxin (TTX)", the major lethal substance that accidently causes death in consumers of those fishes, is true in river puffer fish Takifugu obscurus. In mouse bioassay, lethal levels of toxins were detected in the ranks: gonad>liver>intestine>muscle>skin in wild puffer fish. In contrast, no mortality occurred in the mouse bioassay on cultured fish. However, there were sleepiness, sluggish behavior, and hind limb paralysis with the tissue extracts of cultured fish suggesting the presence of TTX or other similarly acting toxins. An attempt to confirm the presence of TTX in cultured fish with high performance liquid chromatography (HPLC) was not very successful. The results suggest possible existence of TTX toxins or similarly acting toxins. Key words: Tetrodotoxin (TTX), Bioassay, Wild puffer fish, Cultured puffer fish 황복 (Takifugu obscurus) 은복어목참복과 (Tetradontidae) 에속하는어류로성어가되면전장이 30 cm쯤까지성장한다. 황해와동지나해에 흐르는대륙의큰강에서식하고있고, 중국의 전당강, 양자강, 황하및요하등에산재하고한 국에서는낙동강, 금강, 한강, 대동강및압록강 등큰강의하류에서식하였으나현재에는강들의수질악화로개체수가많이감소하였다. 흔히자연산황복은다른복어류처럼신경마비를유발하는천연맹독소를함유하고있어부적당한요리를식용으로이용하는경우치사사고가가끔발생되고있다 ( 안등, 1999). 이런독소에대하여 1909년田原이 tetrodotoxin(ttx) 으로명명하였으며, 이독소는물과유기용매 ( 벤젠, 알콜 ) 등에는녹지않고, 산 ( 초산, 염산 ) 등에잘녹는다 ( 수산식품분석지침서, 1998). Corresponding Author : Kwan Ha Park, Tel : 0634691885 Fax : 0634639493, Email : khpark@kunsan.ac.kr 67

68 김도영 김주완 박기석 강희웅 전중균 정준기 최상훈 최민순 박관하 TTX 는복어류체내에서자체합성하는것이아니라, 미생물이합성한것을섭이를통해, 복 어체내에저장된다고하는것이일반적인이론이다. 신경에자극이가해지면축색막의 Na + 의투과성이급격히증가하면서탈분극 (depolarization) 이일어나는데 TTX는 Na + 의투과를선택적으로봉쇄하여신경활동전위를차단함으로써말초기관마비, 호흡마비, 혈압하강, 구토등의증상을보이며적절한조치가이루어지지않으면사망에도이르게한다 ( 김경환, 2003). 복어의함유된독소의양은어종별로다른뿐아니라동일어종이라도서식환경에의해서도차이를보인다 (Tani, 1945; 김경찬등, 1995; 김동수등, 1995) Saito et al.(1984) 은양식산과자연산자주복의 TTX함량에대한비교연구를통해양식된자주복의독성이매우약함 (<10MU/g) 을확인하였으며 TTX는복어의난소및간장에서높은농도로검출됨을보고하였다. 복어독중독사고는자연산복어를먹은사람에게서만보고되어왔으며, 양식한복섬 (Fugu niphobles) 이나양식산자주복에서는 TTX가검출되지않는다는보고 (Matsui et al., 1982; Saito et al., 1984) 이래양식산에서는 TTX가존재하지않는다고일반적으로믿고있다. 전등 (1995) 이한국산자연산황복 (Takifugu obscurus) 의장기별독소의함유량을분석한결과정소, 내장, 담낭과비장은강독, 근육과껍질은약독, 혈액은무독함을관찰하였으며이독소는모두자연산복어에한정되어나타남을보고하였다. 한편이런연구들은사람을치사시킬수있는위험한수준의독소를함유하고있는가아닌가만을판정하기위해만들어진공정시험법따라시험 ( 수산식품품질검사원, 1998; 衛生試驗法, 1995) 한후동물이치사하는경우에만 TTX 양성이라고정의하고있다. 따라서, 치사에이르지못하는미량을함유하는경우에는인체에전혀위험하지않기때문에전혀함유되지않은것과동등하게취급하지만실제로농도가영 (zero) 이 라는의미는아니다. 자연산복어는환경중의다양한 TTX생산미생물을섭이함으로서 TTX가축적 (Yasumoto et al., 1986; Noguchi et al., 1989) 된다고믿고있지만복어를양식하는사육수에서이런미생물들이전혀존재하지않는다고보기는어려울것이다. 본연구에서는유사한크기의자연산및양식산황복에서 TTX 의함유량에차이가있는지를시료의추출액을최대한농축한후 mouse를이용한 bioassay법으로이의문을규명하고자시도하였다. 표준물질 재료및방법 TTX( 순도 >95.0%) 의분석을위한표준물질은 Alomone Labs (Jerusalem, Israel) 에서구입한것을비교용으로사용하였다. 시험에사용한다른시약은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구입한 reagent grade의것을사용하였다. 황복시료 황복의 TTX의독성분석을위한시료는자연산황복 ( 체장 : 22.15±4.39 cm, 체중 : 299.45± 96.85 g) 9 마리를인천강화도부근에서 2003년 1 년간수회에걸쳐채집하였고양식산황복 ( 체장 : 21.73±3.58 cm, 체중 : 304.29±116.18 g) 은시중에서유통중인황복 9 마리를동시기에구입하여냉동상태로실험실로운반해 deep freezer에 70 에서보관하고실험시에녹여서사용하였다. Bioassay 용 mouse Mouse(ICR계, 웅성, 다물사이언스, 대전 ) 에서 specific pathogenfree상태인것을구입하여실험실에서순치시킨후생후 4주령 (1921 g) 이되었을때사용하였다. Mouse 를이용한 TTX 의정량 (bioassay) TTX 를추출하기위해황복의조직 ( 근육, 간,

양식황복과 TTX 69 생식소, 장, 피부 ) 을미리세절하고 homogenizer 로충분히마쇄하였다. 시료 10 g 을환류냉각관 이부착된 200 ml 환저플라스크에취하여 2% 초 산성메탄올 50 ml 을넣고환류냉각관을연결하 여 70~75 에서 10 분간가온하였다. 가온후시 료액을동양여과지 No. 5A 로여과하고감압농 축한뒤, 증류수를넣고분액깔대기로옮긴다음 에틸에테르로 2 회탈지하였다. 수욕중에서넣고 에테르를감압제거하고증류수를넣어 20 ml 로 정용하였다 ( 이때 1 ml 는시료 0.5 g 에상당 ). Mouse 에서의독량평가는수산식품분석지침서 ( 국립수산물품질검사원, 1998) 에따라수행하였다. 즉, 우선예비시험에서는조독원액 (crude extract) 에증류수를사용하여 10, 100, 1,000, 10,000 배까지희석하여이용액 1 ml 씩을 2 마리 mouse 의복강내에주사하여증상, 사망여부를관찰한후 5 분간에사망한희석독액에대하여 다시공비 1, 2, 4 배로단계희석한뒤, 각희석액 을 1 ml 씩을 2 마리 mouse 의복품질내에주사 하고 10 분정도에서사망하는피검액에대하여 다시 3~5 마리의 mouse 에 1 ml 씩주사하여독 량을주어진표에의하여계산하였으며 1 MU 를 0.22 μg 으로하여계산하였다. 결과및고찰 본연구에서자연산황복에존재하는 TTX 가 양식산황복에서도존재하는가에대한해답을얻을목적으로 bioassay 방법으로분석을수행하였다. 본연구의결과로 bioassay를통해자연산에서는예상대로상당한수준의독성이여러장기에서발견되었다 (Table 1). 즉, 현재국내및일본에서인체에무해한수준의 TTX양을 10 MU/g tissue로설정 ( 수산식품분석지침서, 1998; 衛生試驗法 註解, 1995) 하고있으며이기준에의하면총 45개의장기별시료중 9개에서간장또는생식소의 TTX 수준이이기준을상회하는것으로보인다. 한국산황복의독성을연구한전등 (1995) 의 bioassay를이용한연구결과에서는근육의평균독력은 5±3 MU/g, 간장은 181±58 MU/g, 생식소는숫컷이 71 ± 35 MU/g, 암컷이 268 ± 67MU/g, 장에서는 64 ± 13 MU/g 그리고피부는 20 ± 4 MU/g인것으로보고하고있다. 본연구에서는자연산황복의근육이 3.39 ±1.91 MU/g( 평균 ± 표준편차 ) 이었으며간장 30.9 ± 28.8 MU/g, 생식소는 47.45 ± 65.49 MU/g이었다. 장과피부의경우에는각각 3.51 ± 1.39 MU/g과 1.84 ± 0.53 MU/g으로전의연구에서보다는대체적으로낮은독력이관찰되었다. 그러나 TTX 의축적량은계절, 수온등다양한서식환경에의한영향을받을것이지만두연구에서의시료채취시기가크게다르지않으며결과에근본적인차이가있다고보기도어려울것이다. 한편양식산황복의경우에는 bioassay에서, 독력이매우약해서사망하는동물이출현하지는않았지만추출액의복강투여후많은개체에서졸거나자극을주어도거의움직임이없는증상이관찰되었다 (Table 2). 일부의시료에서는 TTX 또는유사물질 ( 예, paralytic shellfish poisons) 의전형적인독성작용기전에해당하는신경계의마비로판단되는후지마비증세를일으키는것이발견되었다. 양식산에서의이결과가, 공정법에따라복어의독력을측정하는방법및기준 ( 수산식품분석지침서, 1998) 에의하면분명히안전하다고인정되는수준이며, 또한동물에서나타나는미약한증상으로미루어낮은수준이기는하나 TTX 또는다른유사작용물질을함유하고있을것으로강한의구심을갖게한다. Bioassay의결과양식산에도 TTX가미량이기는하나존재할것으로추정되어자연산황복과양식산황복의조독원액을정제하여 HPLC를이용한기기적인분석을시도하였다. 그러나자연산의경우에는 bioassay의결과에서예상되는 TTX의양의1736% 에상당하는 TTX의양을독력이아주강한시료들에서만확인할수있었으며, 독력이약한일부의시료와양식산에서는 TTX로의심되는지문 peak( 정량한계이하 ) 를

70 김도영 김주완 박기석 강희웅 전중균 정준기 최상훈 최민순 박관하 관찰하거나또는검출에실패하여서결과에는삽입하지않았다. 본연구에서양식산황복에서기기분석학적방법으로 TTX를분석하는데실패한근본적인이유는 TTX의함량이매우낮을뿐아니라 HPLC의 TTX의검출능력은 bioassay보다결코예민하지가못하기때문이다 (Nu ezvázquez et al., 2000). HPLC를이용한분석법에서는조직중에방해물질이다양하게들어있기때문에시료의전처리과정중의 cleanup이필수적 (Nagashima et al., 1999) 이며, 그결과본연구에서 TTX의회수율은 32% 정도로결코 bioassay보다예민하지못하였다. TTX의농도가낮은경우 HPLC 분석법에서 Table 1. TTX levels in wild Takifugu obscurus Sample No. Sex 1 2 3 4 5 6 7 8 9 또다른장애요인은복어조직내에는독성을발휘하는물질로 TTX 만이존재하는것이아니고다른근연물질, 4epiTTX, 4,9anhydroTTX, 4 cysttx 등도공존한다는점이다. 복어의종류에따라서는 TTX 이외에 saxitoxin과같은전혀다른종류의독소가존재하기도한다 (Kungsuwan et al., 1997; YotsuYamashita et al., 2001; Jang et al., 2006). 이모든독소들이 bioassay에서는 TTX로계산되지만 TTX자체는전체독소의 50% 이하에불과하다 (Nu ezvázquez et al., 2000; Jang et al., 2006). 자연산의복어에존재하는 TTX는 Vibrio spp. 를포함한수종의수생미생물에서생성되어먹이연쇄를통해복어에축적된다고믿어지고있 TTX levels TTX level Muscle Liver Gonad Intestine Skin Bioassay (mouse unit/g) 2.12 97.20 1.65 1.22 1.78 Expected TTX (μg/g) 0.47 21.38 0.36 0.27 0.39 Bioassay (MU/g) 2.79 124.50 182.0 4.59 1.86 Expected TTX (μg/g) 0.61 27.39 40.0 1.01 0.41 Bioassay (MU/g) 2.95 101.60 2.15 3.13 1.57 Expected TTX (μg/g) 0.65 22.35 0.47 0.69 0.34 Bioassay (MU/g) 1.26 8.43 0.96 5.0 2.50 Expected TTX (μg/g) 0.28 1.85 0.21 1.10 0.55 Bioassay (MU/g) 2.90 94.20 0.89 5.11 2.56 Expected TTX (μg/g) 0.64 20.72 0.20 1.12 0.56 Bioassay (MU/g) 1.47 3.86 1.84 2.30 1.15 Expected TTX (μg/g) 0.32 0.85 0.41 0.51 0.25 Bioassay (MU/g) 9.73 56.2 207.6 2.71 1.35 Expected TTX (μg/g) 2.14 12.36 45.67 0.60 0.30 Bioassay (MU/g) 5.62 77.6 26.55 5.62 2.81 Expected TTX (μg/g) 1.24 17.1 5.84 1.24 0.62 Bioassay (MU/g) 1.66 8.43 3.45 1.96 0.98 Expected TTX (μg/g) 0.37 1.86 0.76 0.43 0.22 Expected TTX level was calculated based on the assumption that 1 mouse unit (MU)/g is equivalent to 0.22 μg/g tissue ( 수산식품분석지침서, 1998).

양식황복과 TTX 71 Table 2. Symptoms in mice injected with organ extracts of cultured Takifugu obscurus 다 (Yasumoto et al., 1986; Noguchi et al., 1989; Ritchie et al., 2000). 따라서양식한복어는미생물을섭식한먹이생물에의존해사육되지않기때문에 TTX이함유되어있지않다고일반적으로믿고있다 (Matsui et al., 1982; Saito et al., 1984). 합성사료를공급하여양성한복어에서는 TTX가농축될확률이적지만양식산이라고해서이런TTX합성미생물이완벽하게제거된사육수에서양식할수는없을것이며따라서적어도미량은양식산복어의체내에저장될것이다. 따라서양식산에서는 TTX가존재하지않을것이라는통념에대해서는의문이제기되고있다. 즉, Matsumura(1995) 는 TTX를검출하기위한방법으로매우예민한분석법인 enzyme immunoassay(eia) 를개발하였고, 이방법을사용하여자주복의장기별로 TTX를분석해보면양식산의간장, 피부, 근육, 내장등에서모두 TTX 를검출할수있었다 (Matsumura, 1996). 양식산복어에서 TTX의존재가능성에대한또다른설명은 TTX가전부외래성이아닐수도있다는점이다. 자주복의알을부화단계에서 embryo에이르는단계까지기르면서관찰하면세포내에서이미 TTX를합성하는것이관찰된다 (Matsumura, 1998). 이런사실은복어의 TTX 는주로먹이연쇄를통해서축적되어가지만일부는복어의장기로부터자체합성되고있을수도있음을시사하기때문이다. 황복에서는 TTX 의생성과관련하여어떤현상이일어나고있는 Sample Symptoms No. Sex Muscle Liver Gonad Intestine Skin 1 Gasping 2 3 4 5 6 7 8 9 All symptoms were examined with 10fold concentrated extracts of initial solutions. HLN: hind limb paralysis

72 김도영 김주완 박기석 강희웅 전중균 정준기 최상훈 최민순 박관하 지전혀알려진바가없으나이런경우라면양식산에서 TTX가검출된다고하더라도별로놀라울것은없을것이다. 이연구에서는양식산황복에서낮은농도로존재하는것으로의심되는 TTX을기기분석학적으로확인하지는못하였지만, 적어도다른어떤연구에서도양식산황복에서 TTX가존재할것인가아닌가에대해다루고있지않기때문에 342354, 1998. 김경환 : 이우주의약리학강의. 제 5판, 의학문학사, 1997. 김경찬, 박진우, 이명자, 김상록, 김동수, 김현대, 박영호 : 시판되고있는까칠복 (Fugu stictonotus) 의독성. Bull. Kor. Fish, Soc., 28:3134, 1995. 김동수, 김삼록, 이명지, 설명훈, 정동윤, 김현대 : 본연구의 bioassay에서발견한결과는중요한 중국으로부터 수입된 삼채복 (Fugu 의미를지닌다. 결론적으로양식산황복의각종조직에는위험한수준은아니지만 TTX가최소한존재는하는것으로판단되며, 다른독소의존재에대한연구도필요한것으로생각된다. flavidus) 의독성. J. Kor. Fish. Soc,. 28:533 538, 1995. 안석근, 임용수, 김재광, 민순식, 류일, 양혁준, 박철완, 이근 : 복어중독의임상적고찰. 대 한응급의학회지, 10:447455, 1999. 요 약 전중균, 유재명 : 한국산복어의독성Ⅰ: 황복의 부위별독성. J. Kor. Fish. Soc., 28:137140, 양식산복어에서는 tetrodotoxin(ttx) 가존재하지않는다고일반적으로생각되고있다. 본연구에서는실제로양식산황복 (Takifugu obscurus) 1995. 衛生試驗法 註解 : 日本藥學會輯, 金原出版株式會社, 1995, 山根靖弘編 에는 TTX가존재하지않는지확인하기위해생쥐를이용한 bioassay로여러장기를동시에분석하였다. 자연산에서는동물이치사하는수준의독력을함유한시료가있었으며정소 > 간장 > 장 > 근육 > 피부의순으로독력이확인되었다. 양식산시료에서는 TTX의미량존재로추정되는졸림, 행동둔화, 후지마비등의증상이나타났지만치사동물은발견되지않았다. 이결과는양식산황복에서 TTX가매우낮은농도로존재할가능성을제시하지만기기분석법을이용한정확한정량이필요하다고판단된다. Jang, J. and YotsuYamashita, M.: Distribution of tetrodotoxin, saxitoxin, and their analogs among tissues of the puffer fish Fugu pardalis. Toxicon, 48: 980987, 2006. Kungsuwan, A., Arakawa. O,, Promdet, M. and Onoue, Y.: Occurrence of paralytic shellfish poisons in Thai freshwater puffers. Toxicon, 35:13411346, 1997. Matsui, T., Sato, H., Hamada, S. and Shimizu, C.: Comparison of toxicity of the cultured and wild puffer fish Fugu niphobles. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish., 48:253, 1982. 사 사 Matsumura, K.: A monoclonal antibody against tetrodotoxin that reacts to the active group 본논문은 2009년군산대학교수산과학연구소 for the toxicity. Eur. J. Pharmacol., 293:41 에서출연한학술연구비에의하여연구되었음. 45, 1995. Matsumura, K.: Tetrodotoxin concentrations in cultured puffer fish, Fugus rubripes. J. Agr. 참고문헌 Food Chem., 44:12, 1996. 수산식품분석지침서 : 국립수산물품질검사원, pp. Matsumura, K.: Production of tetrodotoxin in puffer

양식황복과 TTX 73 fish embryo. Environ. Toxicol. Pharmacol., 6:217219, 1998. Nagashima, Y., Hamada, Y., Ushio, H., Nishio, S., Shimakura, K. and Shiomi, K.: Subcellular distribution of tetrodotoxin in puffer fish liver. Toxicon, 37:18331837, 1999. Noguchi, T., Jeon, J.K., Arakawa, O., Sugita, H., Deguchi, Y., Shida, Y. and Hashimoto, K.: Occurrence of tetrodotoxin and anhydrotetrodotoxin in Vibrio sp. isolated from the intestine of a xanthid crab, Atergatis floridus. J. Biochem., 99:311314, 1986. Nu ezvázquez, E.J., YotsuYamashita, M., Sierra Beltrán, A.P., Yasumoto, T. and Ochoa, J.L.: Toxicities and distribution of tetrodotoxin in the tissues of puffer fish found in the coast of the Baja California Peninsula, Mexico. Toxicon, 38:729734, 2000. Ritchie, K.B., Nagelkerten, I., James, S. and Smith, G.W.: A tetrodotoxinproducing marine pathogen. Nature, 404:354, 2000. Saito, T., Maruyama, J., Kanoh, S., Jeon, J.K., Noguchi, T., Harada, T. and Murata, O.: Toxicity of the cultured Pufferfish Fugu rubripes along with their resistibility aganist tetrodotoxin. Bull. Jpn Soc. Sic. Fish., 50:15731575, 1984. Tani, I.: Toxicological studies of puffers in Japan. Teikokutosho, Tokyo, pp. 5557, 1945. Yasumoto, T., Yasumura, D., Yotsu, M., Michishita, T., Endo, A. and Kitaoki, Y.: Bacterial production of tetrodotoxin and anhydrotetrodotoxin. Agr. Biol. Chem., 50:793 795, 1986. YotsuYamashita, M., Sugimoto, A., Terakawa, T., Shoji, Y., Miyazawa, T. and Yasumoto, T.: Purification, characterization, and cdna cloning of a novel soluble saxitoxin and tetrodotoxin binding protein from plasma of the puffer fish, Fugus pardalis. Eur. J. Biochem., 268:59375946, 2001. Manuscript Received : September 29, 2008 Revision Accepted : April 7, 2009 Responsible Editorial Member : Kim, JungHo (Kangnung National Universuty)