(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2017년04월06일 (11) 등록번호 10-1716106 (24) 등록일자 2017년03월08일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/97 (2017.01) A61K 8/02 (2006.01) A61K 8/99 (2017.01) (52) CPC 특허분류 A61K 8/975 (2013.01) A61K 8/02 (2013.01) (21) 출원번호 10-2016-0046936 (22) 출원일자 2016 년 04 월 18 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR1020100066784 A* KR1020100039106 A* JP2015174850 A* KR1020130133561 A* 2016 년 04 월 18 일 * 는심사관에의하여인용된문헌 (73) 특허권자 주식회사단정바이오 강원도원주시호저면호매곡 1 길 85 ( 주 ) 아마란스 부산광역시강서구녹산산단 165 로 14 번길 26 ( 송정동 ) (72) 발명자 정의수 강원도원주시개운로 30 105 동 803 호 ( 개운동, 휴먼시아원주개운 1 단지아파트 ) 윤재웅 강원도원주시남원로 526 한일아파트 105 동 203 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 김희소 전체청구항수 : 총 10 항심사관 : 최수형 (54) 발명의명칭항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물, 이의제조방법및이의화장료조성물 (57) 요약 본발명은항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물및그의제조방법에관한것으로, 상세하게는꼬시래기, 쇠미역으로부터추출, 농축, 건조공정을거친후꼬시래기분말, 쇠미역분말을수득하고, 상기꼬시래기분말, 쇠미역분말을혼합하고효모균으로접종하여발효시킨해조류혼합발효물을제공 ( 뒷면에계속 ) 대표도 - 도 1-1 -
함으로써, 세포내자유라디칼소거를하고, 지질과산화, 리폭시게나아제, 히아루로니다아제의활성을억제하도록하고, 상기해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물을제공함으로써, 피부염증, 알러지및아토피피부를개선하고, 피부자극에대한부작용이없도록하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물에관한것이다. 또한, 본발명은꼬시래기또는쇠미역중어느하나이상이선택된해조류를초음파또는열수추출을한후효모균으로발효되는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을제공한다. 또한, 본발명은꼬시래기와쇠미역을각각초음파또는열수추출하여꼬시래기추출물과쇠미역추출물을얻는단계 (S10) 와, 상기꼬시래기추출물과쇠미역추출물을각각감압농축하여꼬시래기농축액과쇠미역농축액을얻는단계 (S20) 와, 상기꼬시래기농축액과쇠미역농축액을각각동결건조하여꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을얻는단계 (S30) 와, 상기꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을혼합하고정제수를투입하여혼합용액을제조한후탄산칼슘을첨가하여 ph 를조절하는단계 (S40) 및상기 ph 조절된혼합용액에효모균 saccharomyces 또는 candida 로접종하여발효시켜혼합발효물을얻는단계 (S50) 로이루어지는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물의제조방법을제공한다. 아울러, 본발명은해조류혼합발효물을포함하여항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류 혼합발효물을함유하는화장료조성물을제공한다. (52) CPC 특허분류 A61K 8/99 (2013.01) A61K 2800/82 (2013.01) A61K 2800/85 (2013.01) (72) 발명자 박민희 강원도원주시강변로 27 이종섭 강원도원주시호저면호매곡 1 길 83 배해병 강원도원주시호저면호매곡 1 길 83 최찬기 부산광역시동래구충렬대로 107 번길 54, 19 동 405 호 ( 온천동, 럭키아파트 ) 백현 경상남도김해시장유로 362( 신문동 ) 쌍용예가 2 차아파트 208 동 204 호 채가연 부산광역시사하구하신번영로 300 번길코리아빌 B 동 201 호 전병국 부산시강서구명지오션시티 2 로 71 극동스타클래스 114 동 202 호 신혜진 부산광역시강서구명지오션시티 8 로 22 번길 7 명품하우스 204 호 - 2 -
명세서청구범위청구항 1 꼬시래기또는쇠미역중어느하나이상이선택된해조류를여러번수세하여염분을충분히제거한후에열처리하고, 각각초음파추출, 농축, 동결건조공정을거친후효모균으로발효되고, 상기해조류는감태를더포함하여추출한후효모균으로발효되고, 상기효모균은 saccharomyces 또는 candida인것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물. 청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 제 1 항에있어서, 상기 saccharomyces는 saccharomyces bayanus, saccharomyces boulardii, saccharomyces cerevisiae, saccharomyces chevalieri, saccharomyces dairenensis, saccharomyces ellipsoideus, saccharomyces eubayanus, saccharomyces exiguus, saccharomyces florentinus, saccharomyces uvarum으로구성된군으로부터선택되는하나또는둘이상의균주으로이루어지는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물. 청구항 5 제 1 항에있어서, 상기 candida는 candida albicans, candida ascalaphidarum, candida amphixiae, candida antarctica, candida argentea, candida atlantica, candida atmosphaerica, candida blattae, candida bromeliacearum, candida carpophila, candida carvajalis, candida cerambycidarum, candida chauliodes, candida corydali, candida dosseyi, candida dubliniensis, candida ergatensis, candida fructus, candida glabrata, candida fermentati, candida guilliermondii, candida haemulonii, candida insectamens, candida insectorum, candida intermedia, candida jeffresii, candida kefyr, candida keroseneae, candida kluyveromyces, candida krusei, candida lusitaniae, candida lyxosophila, candida maltosa, candida marina, candida membranifaciens, candida milleri, candida mogii, candida oleophila, candida oregonensis, candida parapsilosis, candida quercitrusa, candida rugosa, candida sake, candida shehatea, candida temnochilae, candida tenuis, candida theae, candida tolerans, candida tropicalis, candida tsuchiyae, candida sinolaborantium, candida sojae, candida subhashii, candida viswanathii, candida utilis, candida ubatubensis, candida zemplinina으로구성된군으로부터선택되는하나또는둘이상의균주으로이루어지는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물. 청구항 6-3 -
제 1 항에있어서, 상기추출은물, 탄소수 1 내지 4개의무수또는함수저급알코올, 에틸아세테이트, 글리세린및에틸렌클리콜로구성된군으로부터선택되는어느하나또는둘이상혼합된추출용매를사용하는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물. 청구항 7 꼬시래기와쇠미역을여러번수세하여염분을충분히제거한후에열처리하고, 각각초음파추출하여꼬시래기추출물과쇠미역추출물을얻는단계 (S10); 상기꼬시래기추출물과쇠미역추출물을각각감압농축하여꼬시래기농축액과쇠미역농축액을얻는단계 (S20); 상기꼬시래기농축액과쇠미역농축액을각각동결건조하여꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을얻는단계 (S30); 상기꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을혼합하고정제수를투입하여혼합용액을제조한후탄산칼슘을첨가하여 ph를 6.0으로조절하는단계 (S40) 및상기 ph 조절된혼합용액에효모균 saccharomyces 또는 candida로접종하여발효시켜혼합발효물을얻는단계 (S50) 로이루어지되, 상기단계 (S10) 에서초음파추출은 20 내지 60 KHz를가지는파장및 300 내지 700 Watt 출력으로 30 내지 60 에서 3 내지 24 시간동안추출하는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물의제조방법. 청구항 8 제 7 항에있어서, 상기 S10 내지 S30 단계의방식으로감태를사용하여감태농축분말을얻고상기단계 (S40) 에상기감태농축분말을더포함하는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물의제조방법. 청구항 9 제 7 항에있어서, 상기단계 (S10) 에서물, 탄소수 1 내지 4개의무수또는함수저급알코올, 에틸아세테이트, 글리세린및에틸렌클리콜로구성된군으로부터선택되는어느하나또는둘이상혼합된추출용매를사용하여초음파또는열수추출또는침적추출을하는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물의제조방법. 청구항 10 삭제청구항 11 삭제청구항 12 삭제 - 4 -
청구항 13 제 1 항, 제 4 항또는제 5 항중어느한항의해조류혼합발효물을포함하여항염, 항알러지및아토피피부개선 효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물. 청구항 14 제1항, 제4항또는제5항중어느한항의해조류혼합발효물을화장료조성물총건조중량대비 0.001 내지 5 중량 % 를포함하는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물. 청구항 15 제 13 항에있어서, 상기화장료조성물은화장수, 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 유화형자외선차단용크림, 유화형파운데이션, 유화형메이크업베이스, 오일케익형파운데이션, 투웨이케익, 또는파우더팩트의제형으로제형화하는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물. 발명의설명 [0001] [0002] 기술분야본발명은항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물및그의제조방법에관한것으로, 상세하게는꼬시래기, 쇠미역으로부터추출, 농축, 건조공정을거친후꼬시래기분말, 쇠미역분말을수득하고, 상기꼬시래기분말, 쇠미역분말을혼합하고효모균으로접종하여발효시킨해조류혼합발효물을제공함으로써, 세포내자유라디칼소거를하고, 지질과산화, 리폭시게나아제, 히아루로니다아제의활성을억제하도록하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물및그의제조방법에관한것이다. 또한, 본발명은해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물을제공함으로써, 피부염증, 알러지및아토피피부를개선하고, 피부자극에대한부작용이없도록하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물에관한것이다. [0003] [0004] 배경기술피부는외부환경에직접적으로노출되는신체부위로서, 과도한자외선이나오염물질등에노출되면홍반, 부종, 가려움등의피부자극및염증반응이유발된다. 이러한피부트러블은미관상문제가될뿐만아니라, 염증반응과정에서생성되는물질들이부수적으로색소침착을일으키고, 피부탄력섬유의붕괴를촉진시켜피부주름을증가시키는것으로알려져있다. 또한, 피부손상에는자유라디칼과관련된것으로알려져있다. 자유라디칼이론은 1950년대중반디하만 (D. Harman) 에의해서제시되었으며, 최근학회와관련업계에서주목을받고있다. 자유라디칼은세포를파괴하거나피부진피층의결합조직을절단하거나교차결합을일으키므로주름형성, 피부암, 세포살상, 류마티스성관절염, 아토피성피부염, 여드름등여러가지문제를발생시킨다. [0005] [0006] [0007] 자유라디칼이생성되는원인은백혈구의식작용, 미토콘드리아에서의 ATP 생산과정중전자전달계, 미엘로퍼옥사이드 (Myeloper Oxide(MPO) 의작용, 자외선, 담배, 정상적인대사과정, 스트레스, 공해물질, 세균으로알려져있다. 상기식작용이란세포체가이물혹은박테리아등을자기체내에받아들여서이것을분해, 무해화 ( 無害化 ) 하는작용을말한다. 물론인체에는항산화물질 ( 라디칼소거제 ) 인슈퍼옥사이드디스뮤타제 (SuperOxide Dismutase : SOD), 카탈라 - 5 -
아제, 비타민 E, 비타민 C, 유비퀴놀 (Uviquinol) 이있지만, 나이, 공해, 자외선, 스트레스에의해항산화체계 가무력화되고, 자유라디칼이점차증가하게된다. [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 증가된자유라디칼은진피의결합조직인콜라겐 (Collagen), 엘라스틴 (Elastin), 히아루론산 (Hyaluronic aci d) 을파괴하여피부의일정부위침하현상 ( 주름 ) 을일으키며, 또한, 세포막의지질부분을산화시켜세포의파괴현상이발생되어피부염, 여드름, 피부암의질병을유발하게되는것이다. 상기자유라디칼은멜라닌형성과정중자발적인산화반응 ( 도파퀴논이멜라닌으로전환 ) 에관여하여기미, 주근깨등의원인및주름생성의원인이되기도한다. ( 대한화장품학회지 23권 1호 75~132) 염증은해로운주위환경, 즉세균과같은외부이물질의침입과기계적손상으로부터생체를보호하는생리적인반응이다. 이염증현상은여러종류의다형핵백혈구 (PMNs) 와면역물질의많은증가를초래하고, 이들세포들은염증성세포산물인다양한종류의단백질분해효소와시토키닌 (Cytokine) 등을분비함으로써치료및방어를할수있게한다. Elastase, hyalurinidase 및 lipoxygenase와같은효소들은염증시생성되는단백질및지질분해효소들로잘알려져있다. 한편이들의작용은때로는인접해있는조직세포와비세포성분들에게도해로운손상을일으키기도하므로, 적절한조건하에서의염증은초기상태가지난후에는정상기능을되찾게되지만염증을자극하는자극제가없어지지않거나계속해서만들어지면결과적으로만성염증이일어나게되어더욱더심각한조직의손상을가져온다. 이처럼과다염증에의해유발되는단백질분해효소들에의해세포및결합조직이손상을입고, 결합조직의손상은피부의탄력을감소시켜주름의원인이될뿐아니라나아가세포의재생및증식에도나쁜영향을미치게되어빠른피부노화를초래하게된다. 또한피부에있어서염증은국소적인홍반과부풀음에의해특정지어지며, 손상이보다커지게되면정상조직은섬유아세포의증식과결합조직단백질의축적의결과로나타나는흉터조직에의한소산단계에있어서복원된다. 그러나만일조직이보다심각하게손상되고염증반응이지속된다면정상적인조직구조와기능을회복시키는일은훨씬어렵게된다. 염증과함께백혈구의이주를촉진시키는매개체의생성은 arachidonic acid를통한과정에의해서도이루어진다. 이경로는 cyclooxygenase에의한과정과 lipoxygenase에의한과정으로되어있으며이들효소에의해생성된 leukotriene과 prostagladine이염증유발인자로작용한다. 따라서 lipoxygenase와 cyclooxygenase의저해제는염증유발물질의생성억제뿐만아니라염증시생성되는활성산소에의한세포막파괴와지질의과산화반응을억제하는물질로서항염증작용을나타낼수있다. 또한과다염증에의해생성되는단백질및지질분해효소들을억제함으로서그로인해손상되는세포들을보호하여피부노화를억제할수있다. 또한, 아토피피부는종전유아기에주로발생하여태열이라고도하였으며주로각질층내의세라마이드 (Ceramides) 의함량이감소됨에따라발생하는것으로서각질층의수분유지기능이떨어짐에따라피부가건조되어각질이쉽게일어나며피부장벽 (skin barrier) 기능이저하됨에따라자극유발물질이각질층내로침입하여자극을유발시키고정상피부에서는침입하기어려운항원단백질이침입함에따라피부알러지등이용이하게발생하여견디기힘들만큼의소양증증상을나타낸다. 그러므로아토피환자의 90% 이상이포도상구균에감염되어있는데이균은환자가가려움을참지못해긁어서생기기도하지만최근의보고에의하면이세균의외독소가우리몸의면역체계를자극하여알레르기를일으키는화학물질을나오게하여아토피를악화시킨다고한다. 즉, 이세균자체가알레르겐으로작용한다는것이다. 이러한아토피피부의발생원인에대해서는지금까지크게네가지로밝혀져있는데, 첫째는유전적원인에의한것으로피부보호기능을담당하는피부보호막인세포막의인지질과각질세포간의결합물질인세포간지질을구성하는필수지방산인감마-리놀레인산 (γ-linoleic acid; GLA) 이부족한상태로인해피부보호막을단단하게만들지못하므로피부표면의수분이쉽게소실되고외부자극에의해쉽게알러지가발생한다는것이며, 둘째로환경적요인에의한것으로현대인의주거환경의변화로아파트생활이보편화되면서생활환경이건조한상태로변화됨에따라세계적으로아토피피부가증가되고있으며이로인해수분보유력이저하되고피부보호기능이상실되어적은자극에도민감하게반응하여알러지가발생한다는것이고, 셋째는활성산소에의한것으로활성산소에의해과산화지질이생성하게되고이것에의해아토피피부가발생한다는것, 넷째로세균, 바이러스, 곰팡이에감염되어발생한다는것으로서이러한원인들이복합적으로관계하여발생한다고보고있다 ( 피부과학, 대한피부과학회간행위원회, 여문각, 1992). 항염, 항알러지에관한종래기술로는대한민국공개특허공보제10-2014-0042886호가개시되어있는데, 이는피 - 6 -
롤리딘고리를갖는 16,17 위치에서응축된항염증용스테로이드에관한것으로, 상세하게는항염증및항알러지작용을갖는글루코코르티코스테로이드류의화합물, 이들화합물의제조방법, 그들을포함한약제조성물, 조합물그리고그들의치료용도에관한것이고, 더상세하게는피롤리딘유도체인글루코코리티코스테로이드에관한것이다. [0017] [0018] [0019] 상기종래기술은항염, 항알러지의효능을얻기위하여인위적인유기합성을통해화합물을제조하는것으로, 합성시안정성이좋지못하여실질적인효과를얻기어렵고, 사람에따라상기화합물에의해부작용이발생되는문제점이있다. 즉, 각종스트레스원에의한피부자극및염증을감소시키고, 화장품사용으로인한부작용을줄이기위해서는, 항염증, 항알러지및피부자극완화효능이있는물질을개발하는것이절실히요구되며, 이와함께인체에부작용이적은천연물의유용성분의성분파괴를최소화면서이를효과적으로추출할수있는방법이함께필요하다. 따라서, 이러한항염, 항알러지, 아토피피부개선을위해서는항염, 항알러지및아토피피부개선의효과가우수하며, 부작용이없고비용이저렴한물질의개발및그물질을함유하는사용이용이한화장료의개발이필수적이다. 발명의내용 [0020] [0021] 해결하려는과제본발명은상기와같은문제를해결하기위해안출된것으로, 꼬시래기, 쇠미역으로부터추출, 농축, 건조공정을거친후꼬시래기분말, 쇠미역분말을수득하고, 상기꼬시래기분말, 쇠미역분말을혼합하고효모균으로접종하여발효시킨해조류혼합발효물을제공함으로써, 세포내자유라디칼소거를하고, 지질과산화, 리폭시게나아제, 히아루로니다아제의활성을억제하도록하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물및그의제조방법을제공하는데목적이있다. 또한, 본발명은해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물을제공함으로써, 피부염증, 알러지및아토피피부를개선하고, 피부자극에대한부작용이없도록하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물을제공하는데목적이있다. [0022] [0023] [0024] 과제의해결수단본발명은꼬시래기또는쇠미역중어느하나이상이선택된해조류를초음파또는열수추출을한후효모균으로발효되는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을제공한다. 또한, 본발명은꼬시래기와쇠미역을각각초음파또는열수추출하여꼬시래기추출물과쇠미역추출물을얻는단계 (S10) 와, 상기꼬시래기추출물과쇠미역추출물을각각감압농축하여꼬시래기농축액과쇠미역농축액을얻는단계 (S20) 와, 상기꼬시래기농축액과쇠미역농축액을각각동결건조하여꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을얻는단계 (S30) 와, 상기꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을혼합하고정제수를투입하여혼합용액을제조한후탄산칼슘을첨가하여 ph를조절하는단계 (S40) 및상기 ph 조절된혼합용액에효모균 saccharomyces 또는 candida로접종하여발효시켜혼합발효물을얻는단계 (S50) 로이루어지는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물의제조방법을제공한다. 아울러, 본발명은해조류혼합발효물을포함하여항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물을제공한다. [0025] 발명의효과상기와같이본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물및그의제조방법은꼬시래기, 쇠미역으로부터추출, 농축, 건조공정을거친후꼬시래기분말, 쇠미역분말을수득하고, 상기꼬시래기분말, 쇠미역분말을혼합하고효모균으로접종하여발효시킨해조류혼합발효물을제공함으로써, 세포내자유라디칼소거를하고, 지질과산화, 리폭시게나아제, 히아루로니다아제의활성을억제하도록하는효과가있다. - 7 -
[0026] 또한, 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장 료조성물은해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물을제공함으로써, 피부염증, 알러지및아토피피부 를개선하고, 피부자극에대한부작용이없도록하는효과가있다. [0027] 도면의간단한설명 도 1 은본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물제조방법의플 로우차트. [0028] [0029] [0031] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0039] [0041] [0043] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은항염, 항알러지및아토피피부개선에효과가있는근본적인물질을찾고자자연의여러가지천연물질들을검색한결과, 감태, 꼬시래기, 쇠미역에매우우수한항염, 항알러지및아토피피부개선등의효능을나타냄을발견하였으며, 이를혼합하여발효시킨혼합발효물적용제품들의안정성, 안전성문제를동시에해결하였다. 또한, 화장료조성물에서일정농도이상배합하여사람피부에직접도포한실험결과에서도뚜렷한피부상태가개선되는효과를발휘하게됨을발견하게되었다. 이하, 본발명은상세히설명하고자한다. 본발명은꼬시래기또는쇠미역중어느하나이상이선택된해조류를초음파또는열수추출을한후효모균으로발효되는것을특징으로하는항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을제공한다. 상기꼬시래기 (Gracilaria Verrucosa) 는홍색해조류과의일종으로홍조식물꼬시래기과에속하며우리나라에서는주로남해안일대와완도등조간대의자갈이나조개류껍데기에붙어서식하고있다. 꼬시래기의줄기는보통 1-3 mm의직경에길이는 20 cm에서최대약 3 m까지자란다. 꼬시래기에는탄수화물이풍부하여 seafood로도활용이되고있을뿐아니라, 알긴산과카라지난, 생리활성물질인 prostaglandin A2와 E2, phenol류, flavonoid류등다양한생리활성물질을함유하고있어항산화및항염, 항노화, 항암등다양한효능효과를지니고있다 ( 노연숙등, 한국생약학회, 1995, 26(1), p99-100, Gouda S 등, Int. J. Pharm. Pharm. Sci., 2013, 16(1), p707-710). 상기쇠미역 (Ecklonia stolonifera Okamura) 는감태와달리다시마목 (Laminariales) 다시마과 (Laminariacea e) 에속하는다년생갈조류로서부산, 거제도, 울릉도, 영일만등남해안및동해안일대에서흔히발견되고있다 (Issa Babgoura 등, 한국생명과학회, 2015, 25(7), p780-785). 주로얕은바닷가의말뚝이나자갈등약 2~10 m 조하대에주로서식하고있지만 30 m까지서식한다고보고되어있고있다. 쇠미역에는순도높은 fucoidan을비롯하여알긴산, L-Ascorbic acid, phlorotannin, collagen이다량함유되어있어피부항산화, 항염, 피부항노화등다양한피부개선천연물로서보고되었다 ( 황은경등, 한국황경생물학회, 2008, 26(1), p30-35). 또한, 상기해조류는감태를더포함하여효모균으로발효되는것을특징으로한다. 감태 (Ecklonia Cava) 는다년생갈조류다시마목 (Laminariales) 미역과 (Alariaceae) 의식물에속하는식용해조류로주로우리나라동해남부의남해안과제주연안일대에서발견되고있다. 길이는 1 m에서크게는 2 m가량되며원기둥형태의줄기모양을나타내고있다. 감태에는후코이단및알긴산, 다당류등의생리활성물질을함유하고있으며, 그중에서도 phloroglucinol을기본구성으로하는 polyphenol 화합물인 phlorotannin 성분을함유하고있어항산화, 항염, elastase 활성억제효과, tyrosinase 활성억제효과등여러가지효능을지니고있는것으로보고되었다 ( 김보람등, 한국미생물생명공학회, 2011, 42(1), p93-98). 상기꼬시래기와쇠미역을이용하여제조된해조류혼합발효물또는상기꼬시래기와쇠미역에감태를더함유하여제조된해조류혼합발효물은세포내자유라디칼소거를하고, 지질과산화, 리폭시게나아제, 히아루로니다아제의활성을억제하는효과가탁월하다. 상기꼬시래기, 쇠미역, 감태를이용하여해조류혼합발효물을제조하는방법은첨부도면을참조하여설명하면다음과같다. 도 1은본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물제조방법의플 - 8 -
로우차트이다. [0045] [0047] [0049] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0062] [0063] 이하, 본발명에대한바람직한실시내용은첨부한도면을참조하여설명하며, 본발명의항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물제조방법은하기단계를포함하는것이바람직하나이에한정되지않는다. 본발명은꼬시래기와쇠미역을각각초음파또는열수추출하여꼬시래기추출물과쇠미역추출물을얻는단계 (S10) 와, 상기꼬시래기추출물과쇠미역추출물을각각감압농축하여꼬시래기농축액과쇠미역농축액을얻는단계 (S20) 와, 상기꼬시래기농축액과쇠미역농축액을각각동결건조하여꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을얻는단계 (S30) 와, 상기꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을혼합하고정제수를투입하여혼합용액을제조한후탄산칼슘을첨가하여 ph를조절하는단계 (S40) 및상기 ph 조절된혼합용액에효모균 saccharomyces 또는 candida로접종하여발효시켜혼합발효물을얻는단계 (S50) 로이루어지는것을특징으로한다. 본발명의제조방법을각단계별로나누어서설명하면다음과같다. 꼬시래기와쇠미역을각각초음파또는열수추출하여꼬시래기추출물과쇠미역추출물을얻는단계 (S10) 를수행한다. 꼬시래기, 쇠미역을물로여러번수세하여초음파추출기에투입하고추출용매를첨가하여꼬시래기추출물과쇠미역추출물을수득한다. 상세하게는상기초음파추출기에서 20 내지 60 KHz를가지는파장과 300 내지 700 Watt 출력으로꼬시래기, 쇠미역을각각추출물을추출하되, 30 내지 60 에서 3 내지 24 시간동안추출이수행된다. 상기파장과출력범위는꼬시래기와쇠미역의조직이파쇄되어침전물이발생하지않도록하는최적의범위이고, 상기온도범위는꼬시래기와쇠미역이삶아지지않고형태를유지할수있는최적의범위이다. 또한, 상기파장, 출력, 온도범위는꼬시래기와쇠미역으로부터세포내자유라디칼소거를하고, 지질과산화, 리폭시게나아제, 히아루로니다아제의활성을억제하는효과가우수하게나타나는최적의범위이다. 상기추출용매는물, 탄소수 1 내지 4개의무수또는함수저급알코올, 에틸아세테이트, 글리세린및에틸렌클리콜로구성된군으로부터선택되는어느하나또는둘이상혼합된추출용매를사용하고, 꼬시래기, 쇠미역중량의 1 내지 15배의양을첨가하는것이바람직하다. 다른추출방법은열수추출방식으로꼬시래기, 쇠미역을물로여러번수세하여냉각콘덴서를구비한추출기에투입하고, 추출용매를첨가하여꼬시래기추출물과쇠미역추출물을수득한다. 상세하게는용매가증발되는것을방지하기위해냉각콘덴서를구비한추출기에꼬시래기, 쇠미역및추출용매를투입하고, 30 내지 100 에서 3 내지 48 시간동안가열추출한다. 열수추출시온도범위는꼬시래기와쇠미역으로부터세포내자유라디칼소거를하고, 지질과산화, 리폭시게나아제, 히아루로니다아제의활성을억제하는효과가우수하게나타나는최적의범위이다. 상기추출용매는물, 탄소수 1 내지 4개의무수또는함수저급알코올, 에틸아세테이트, 글리세린및에틸렌클리콜로구성된군으로부터선택되는어느하나또는둘이상혼합된추출용매를사용하고, 꼬시래기, 쇠미역중량의 1 내지 15배의양을첨가하는것이바람직하다. 또다른추출방법은꼬시래기, 쇠미역을물로여러번수세한후침적기에투입하고, 물, 탄소수 1 내지 4개의무수또는함수저급알코올, 에틸아세테이트, 글리세린및에틸렌클리콜로구성된군으로부터선택되는어느하나또는둘이상혼합된추출용매를사용하여 5 내지 30 에서 1 내지 5 일간침적시켜유효성분을추출한다. 상기꼬시래기추출물과쇠미역추출물을각각감압농축하여꼬시래기농축액과쇠미역농축액을얻는단계 (S20) 를수행한다. 상기단계 (S10) 에서얻은꼬시래기추출물과쇠미역추출물을감압농축기에투입하고물, 탄소수 1 내지 4개의무수또는함수저급알코올, 에틸아세테이트, 글리세린및에틸렌클리콜로구성된군으로부터선택되는어느하나또는둘이상혼합된추출용매를이용하여 30 내지 50 에서농축함으로써꼬시래기농축액과쇠미역농축액을수득한다. - 9 -
[0065] [0066] [0068] [0069] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0078] [0079] [0081] [0082] [0084] 상기꼬시래기농축액과쇠미역농축액을각각동결건조하여꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을얻는단계 (S30) 를수행한다. 상기단계 (S20) 에서얻은꼬시래기농축액과쇠미역농축액을각각동결건조한후분쇄하여꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을수득한다. 상기꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을혼합하고정제수를투입하여혼합용액을제조한후탄산칼슘을첨가하여 ph를조절하는단계 (S40) 를수행한다. 상기단계 (S30) 에서수득한꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을전체중량의 0.4 %(w/v) 가되도록용해한후 CaCO 3 를이용하여 ph를 5.0 내지 7.0으로조절한다. 상기 ph 조절된혼합용액에효모균 saccharomyces 또는 candida로접종하여발효시켜혼합발효물을얻는단계 (S50) 를수행한다. 상기 ph 조절된혼합용액에 5% Dextrose를함유한 YEP(Yeast extract-peptone) 배지에서종배양한효모균을 OD 600 값이 0.9가되도록배양한후전체중량의 1~5 %(v/v) 가되도록접종한다. 상기효모균은 saccharomyces 또는 candida이며, 상기 saccharomyces는 saccharomyces bayanus, saccharomyces boulardii, saccharomyces cerevisiae, saccharomyces chevalieri, saccharomyces dairenensis, saccharomyces ellipsoideus, saccharomyces eubayanus, saccharomyces exiguus, saccharomyces florentinus, saccharomyces uvarum으로구성된군으로부터선택되는하나또는둘이상의균주으로이루어지는것이바람직하고, 상기 candida는 candida albicans, candida ascalaphidarum, candida amphixiae, candida antarctica, candida argentea, candida atlantica, candida atmosphaerica, candida blattae, candida bromeliacearum, candida carpophila, candida carvajalis, candida cerambycidarum, candida chauliodes, candida corydali, candida dosseyi, candida dubliniensis, candida ergatensis, candida fructus, candida glabrata, candida fermentati, candida guilliermondii, candida haemulonii, candida insectamens, candida insectorum, candida intermedia, candida jeffresii, candida kefyr, candida keroseneae, candida kluyveromyces, candida krusei, candida lusitaniae, candida lyxosophila, candida maltosa, candida marina, candida membranifaciens, candida milleri, candida mogii, candida oleophila, candida oregonensis, candida parapsilosis, candida quercitrusa, candida rugosa, candida sake, candida shehatea, candida temnochilae, candida tenuis, candida theae, candida tolerans, candida tropicalis, candida tsuchiyae, candida sinolaborantium, candida sojae, candida subhashii, candida viswanathii, candida utilis, candida ubatubensis, candida zemplinina으로구성된군으로부터선택되는하나또는둘이상의균주인것이바람직하다. 상기효모균은 saccharomyces cerevisiae 또는 candida kluyveromyces를이용하는것이더바람직하다. 접종후배양온도 25 내지 35, ph 5.0 내지 7.0, 교반속도 150 내지 250 rpm, 배양시간 24 내지 72시간의조건으로 10 L 발효조를이용하여발효하여해조류혼합발효물을수득한다. 또한, 본발명은상기단계 (S40) 에감태농축분말을더포함하여혼합한후정제수를투입하여혼합용액을제조한후탄산칼슘을첨가하여 ph를조절하는단계 (S42) 를수행한다. 상기감태농축분말제조는단계 (S10 내지 S30) 를이용하되, 꼬시래기, 쇠미역대신에감태를사용한다. 감태농축분말은꼬시래기농축분말과쇠미역농축분말을혼합한후상기단계 (S40) 과같이수행한다. 상기단계 (50) 이후에추가적으로다음과같은단계를수행할수있다. 상기단계 (50) 에서발효가완료된후더이상발효가진행되지않도록발효액을멸균 (121, 15분, 1.5기압 ) 한다. 발효미생물이더이상증식할수없도록사멸시킨해조류혼합발효물에에탄올을첨가하여최종적으로 30%(v/v) 에틸알코올수용액이되도록농도를조절하여냉각콘덴서가달린추출기에서 70 내지 90 범위로 3 시간씩 2 내지 5 회중탕추출한후 200 내지 500 메쉬여과지로여과하고, 에드벤텍 5번여과지와와트만 GF/C 150 mm 여과지로 2번여과하여최종적으로 0.1 μm이하의해조류혼합발효추출액만을정밀여과한다. 그리고감압농축기를이용하여 30 내지 60 에서해조류혼합발효추출액을농축하고동결건조하여해조류혼합발효건조물을수득한다. ( 단계 (S60)) 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물은피부염증, 알러지 - 10 -
및아토피피부를개선하고, 피부독성이없고, 민감성피부에적용할수있으며, 장기간사용하여도피부부작 용이없기때문에각종화장료조성물에사용이가능하다. [0085] [0086] [0087] [0089] [0091] [0093] [0094] [0096] [0097] [0099] [0100] [0102] [0103] 또한, 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장료조성물은세포내자유라디칼소거효과, 지질과산화, 히아루로니다아제활성억제, 리폭시게나아제활성억제효과등의항산화, 항염, 피부개선의효과가우수하며, 피부자극시험에서부작용이없는안전하고또한생산비용이저렴하고사용이용이한화장료로써효능성과안전성그리고저렴성, 사용의용이성이탁월한화장료조성물이다. 즉, 상기해조류혼합발효물은화장료로적용하기위해, 유화형, 가용화형, 오일성, 분말분산형, 또는고체분말성으로제조될수있다. 구체적으로, 화장료조성물로는화장수, 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩등으로적용이가능하며, 보다구체적으로, 유화형자외선차단용크림, 유화형파운데이션, 유화형메이크업베이스, 오일케익형파운데이션, 투웨이케익, 파우더팩트로적용이가능하다. 상기화장료조성물에서본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물은화장료조성물의총액상중량대비 0.1 내지 10 중량 % 를포함할수있으며, 또한, 냉각콘덴서가달린증류장치를이용하여증발되어나오는용매를회수하면서그건조중량으로서 0.001 내지 5 중량 %, 바람직하게는 0.01 내지 3 중량 % 를포함할수있다. 이하, 본발명의실시예, 비교예, 시험예및제형예에의해상세히설명한다. 하기실시예, 비교예, 시험예및제형예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명이하기실시예, 비교예, 시험예및제형예에한정되는것이아니다. < 실시예 1 > 꼬시래기추출물및분말제조방법채취한꼬시래기를흐르는물에여러번수세하여염분을충분히제거한후에 121 에서열처리한꼬시래기 1 kg을 30 % 에틸알코올 10 kg에넣고초음파추출기 ( 파장 : 40.5 KHz, 출력 : 500 watt) 로 50 로 3 시간추출한후 300 메쉬여과포, 1 마이크로, 0.45 마이크로필터로여과하였다. 그리고감압농축기를이용하여 40 에서농축한농축액을동결건조기를이용하여동결건조하여건조중량 120.7 g을얻었다. < 실시예 2 > 쇠미역추출물및분말제조방법채취한쇠미역을실시예 1과같은방법으로추출, 농축, 동결건조하여건조중량 125.1 g을얻었다. < 실시예 3 > 감태추출물및분말제조방법채취한감태를실시예 1과같은방법으로추출, 농축, 동결건조하여건조중량 123.5 g을얻었다. < 실시예 4 > 꼬시래기발효추출물및분말제조방법실시예 1에서추출한꼬시래기추출분말을정제수 5 L로전체중량의 0.4 %(w/v) 가되도록용해한후 CaCO 3 를 이용하여 ph를 6.0으로조절한수용액에 5 % Dextrose를함유한 YEP(Yeast extract-peptone) 배지에서종배양한효모 Saccharomyces 또는 Candida, Kluyveromyces에속하는효모를 OD 600 값이 0.9가되도록배양한후전체중량의 1 내지 5 %(v/v) 가되도록접종하였다. 바람직하게는 Saccharomyces cerevisiae를이용하여접종하고, 배양온도 25 내지 35, ph 5.0 내지 7.0, 교반속도 150 내지 220 rpm, 배양시간 24 내지 72시간의조건으로 10 L 발효조를이용하여발효하였다. 발효가완료된후더이상발효가진행되지않도록발효액을멸균 (121, 15 분, 1.5 기압 ) 하였다. 발효미생물이더이상증식할수없도록사멸시킨꼬시래기발효물에에탄올을첨가하여최종적으로 30 %(v/v) 에틸알코올수용액이되도록농도를조절하여냉각콘덴서가달린추출기에서 70 내지 90 범위로 3시간씩 2 내지 5회중탕추출한후 300 메쉬여과지로여과하고, 50 의온도에서에드벤텍 5번여과지와와트만 GF/C 150 mm 여과지로 2번여과하여최종적으로 0.1 μm이하의발효추출액만을정밀여과하였다. 그리고감압농축기를이용하여 50 에서농축한농축물을동결건조하여건조분말 11.3 g을얻었다. [0105] [0106] [0108] [0109] < 실시예 5 > 쇠미역발효추출물및분말제조방법실시예 4와같은방법으로발효, 추출, 농축, 동결건조하여건조중량 13.8 g을얻었다. < 실시예 6 > 감태발효추출물및분말제조방법실시예 4와같은방법으로발효, 추출, 농축, 동결건조하여건조중량 16.2 g을얻었다. - 11 -
[0111] [0112] [0114] [0115] [0117] [0118] < 실시예 7 > 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물 ( 꼬시래기, 쇠미역 ) 및분말제조방법실시예 1에서추출한꼬시래기추출물과실시예 2에서쇠미역추출물을동일비율 (1 : 1) 로혼합하여실시예 4 와같은방법으로발효, 추출, 농축, 동결건조하여건조중량 14.1 g을얻었다. < 실시예 8 > 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물 ( 꼬시래기, 쇠미역, 감태 ) 및분말제조방법실시예 1에서추출한꼬시래기추출물, 실시예 2에서쇠미역추출물, 실시예 3에서추출한감태추출물을동일비율 (1 : 1 : 1) 로혼합하여실시예 4와같은방법으로발효, 추출, 농축, 동결건조하여건조중량 14.6 g을얻었다. < 제형예 1 > 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는화장수의제조실시예 7의해조류혼합발효물분말과실시예 8의해조류혼합발효물분말을함유한화장료중화장수 ( 스킨로션 ) 의처방예는표 1과같다. [0119] 번호 원료 함량 ( 중량 %) 함량 ( 중량 %) 1 실시예 7 해조류혼합발효물분말 1.0-2 실시예 8 해조류혼합발효물분말 - 1.0 3 글리세린 3.0 3.0 4 부틸렌글리콜 2.0 2.0 5 프로필렌글리콜 2.0 2.0 6 폴리옥시에칠렌경화피마자유 1.0 1.0 7 에탄올 10.0 10.0 8 트리에탄올아민 0.1 0.1 9 방부제 미량 미량 10 색소 미량 미량 11 향료 미량 미량 12 정제수 미량 미량 표 1 [0121] [0122] [0124] [0125] < 제조방법 > 12번에 3, 4, 5, 9번을순서대로투입하고교반하여용해시킨후, 6번을 60 정도가열하여용해시킨후, 11 번을투입하여용해한후 12번에투입한다. 마지막으로 7, 8, 10번을투입하되, 1번과 2번을각각투입하여충분히교반한뒤숙성시킨다. < 제형예 2 > 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는영양로션의제조실시예 7의해조류혼합발효물분말과실시예 8의해조류혼합발효물분말을함유한화장료중영양로션의처방예는표 2와같다. [0126] 번호 원료 함량 ( 중량 %) 함량 ( 중량 %) 1 실시예 7 해조류혼합발효물분말 1.0-2 실시예 8 해조류혼합발효물분말 - 1.0 3 밀납 1.0 1.0 4 폴리솔베이트 60 1.5 1.5 5 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 0.5 6 유동파라핀 10.0 10.0 7 소르비탄스테아레이트 1.0 1.0 8 친유형모노스테아린산글리세린 0.5 0.5 9 스테아린산 1.5 1.5 표 2-12 -
10 글리세릴스테아레이트 / 피이지-400 스테아레 1.0 1.0 이트 11 프로필렌글리콜 3.0 3.0 12 카르복시폴리머 0.1 0.1 13 트리에탄올아민 0.2 0.2 14 방부제 미량 미량 15 색소 미량 미량 16 향료 미량 미량 17 정제수 잔량 잔량 [0128] [0129] [0131] [0132] < 제조방법 > 11, 12, 14, 17을혼합교반하면서 80 ~ 85 사이로가열하여제조부에투입한후유화기를작용시키고 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13을 80 ~ 85 사이로가열용해한후유화한다. 유화가끝나면교반기를이용하여교반하면서 50 까지냉각한뒤 16번을투입하고 45 까지냉각한뒤 15번을투입하고 35 에 1번과 2번을각각투입하여 25 까지냉각한뒤숙성시킨다. < 제형예 3 > 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는영양크림의제조실시예 7의해조류혼합발효물분말과실시예 8의해조류혼합발효물분말을함유한화장료중영양크림의처방예는표 3과같다. [0133] 번호 원료 함량 ( 중량 %) 함량 ( 중량 %) 1 실시예 7 해조류혼합발효물분말 1.0-2 실시예 8 해조류혼합발효물분말 - 1.0 3 스테아린산 2.0 2.0 4 세틸알콜 2.0 2.0 5 글리세릴모노스테아레이트 2.0 2.0 6 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 0.5 0.5 7 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 0.5 8 글리세릴모노스테아레이트 / 글리세릴스테아 1.0 1.0 레이트 / 폴리옥시에틸렌스테아레이트 9 왁스 1.0 1.0 10 유동파라핀 4.0 4.0 11 스쿠알란 4.0 4.0 12 카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드 4.0 4.0 13 카르복시비닐폴리머 0.3 0.3 14 부틸렌글리콜 5.0 5.0 15 글리세린 3.0 3.0 16 트리에탄올아민 0.5 0.5 17 정제수 잔량 잔량 표 3 [0135] [0136] [0138] [0139] < 제조방법 > 13, 14, 15, 17을혼합교반하면서 80 ~ 85 사이로가열하여제조부에투입한후유화기를작용시키고 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12를 80 ~ 85 사이로가열하여용해한후 16을투입교반하여제조부에투입하고유화한다. 유화가끝나면교반기를이용하여교반하면서 35 까지냉각하고 1번과 2번을각각투입하여 25 까지냉각한뒤숙성시킨다. < 제형예 4 > 본발명에따른항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물을함유하는에센스의제조실시예 7의해조류혼합발효물분말과실시예 8의해조류혼합발효물분말을함유한화장료중에센스의처방예는표 4와같다. - 13 -
표 4 [0140] 번호 원료 함량 ( 중량 %) 함량 ( 중량 %) 1 실시예 7 해조류혼합발효물분말 1.0-2 실시예 8 해조류혼합발효물분말 - 1.0 3 시토스테롤 1.7 1.7 4 폴리글리세릴 2-올레이트 1.5 1.5 5 세라마이드 0.7 0.7 6 스테아레스-4 1.2 1.2 7 콜레스테롤 1.5 1.5 8 디세틸포스페이트 0.4 0.4 9 농글리세린 5.0 5.0 10 마카다미아오일 15.0 15.0 11 카르복시비닐폴리머 0.2 0.2 12 산탄검 0.2 0.2 13 방부제 미량 미량 14 향료 미량 미량 15 정제수 잔량 잔량 [0142] [0143] [0145] [0146] [0148] [0149] [0151] [0152] [0153] < 제조방법 > 3, 4, 5, 6 및 7을일정한온도에서균질화하여비이온계양친매성지질이라칭한다. 상기비이온계양친매성지질과 8, 9 및 15를혼합하되, 1번과 2번을각각투입하여혼합하고일정한온도에서균질화하여마이크로플루이다이져를통과하고이어 10을일정한온도에서서서히첨가하여균질화한후다시마이크로플루이다이져에재차통과시킨다그리고 11, 12, 13, 14를투입하여분산시켜안정화하고숙성시킨다. < 시험예 1 > 세포무독성및세포증식효과평가상기실시예 1 ~ 8에서제조된추출물및추출발효건조분말에대하여세포배양을이용한세포증식효과를측정하였다. 1) 실험방법세포독성및증식실험을다음과같은방법으로실시하였다. 배양하고있는세포 ( 파이브로블라스트, 3T3 cel l) 를 96 웰마이크로플레이트에 5,000세포 / 웰로분주하여 30분간항온조에서배양하고, 시료를농도별각각 50, 100, 200, 500(μg/ml) 로투여하여 72시간동안배양하였다. 그리고티아졸린블루 (Thiazoline blue) 를투여하고 4시간동안추가배양을하였다. 배양액을모두버리고마이크로플레이트의각웰에반응정지액을가하고 5분간교반한후, 570 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군은시료주입량만큼 10 % 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS) 배지를투여하여세포성장의최적조건으로동시배양을하였으며, 대조군의세포증식을 100% 로하고시료투입실험군의세포증식율을계산하였다. 2) 실험결과세포증식효과는계산식 1에의해산출되었고, 그결과는하기표 5에나타내었다. [ 계산식 1 ] [0154] [0155] 농도 표 5 세포증식효과 (%) μg/ml 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 실시예 8 대조군 100 100 100 100 100 100 100 100 50 102.1 103.7 101.1 104.5 105.2 104.2 107.2 110.1 100 106.9 107.2 103.5 109.6 110.9 109.6 115.2 120.7 200 109.3 110.9 108.7 112.8 117.3 115.2 121.9 128.6 500 117.1 115.2 113.7 119.6 121.8 123.6 131.6 139.5-14 -
[0156] [0157] [0158] [0160] [0161] [0163] [0164] [0166] [0167] [0168] 본시험예 1은꼬시래기, 쇠미역, 감태의개별추출분말및개별추출발효분말과추출물혼합발효분말의세포독성및증식을확인하기위한실험이었다. 표 5에나타난바와같이, 세포성장최적조건에서의세포증식을 100% 로하였을때, 꼬시래기, 쇠미역, 감태의개별추출분말및개별추출발효분말과추출물혼합발효분말은모두세포증식효과가있음을확인하였다. 또한, 세포증식효과가있음은꼬시래기, 쇠미역, 감태의개별추출분말및개별추출발효분말과추출물혼합발효분말이세포에대한독성이없다는것을의미하는것으로, 상기세포증식효과실험으로부터본발명의꼬시래기, 쇠미역, 감태의개별추출분말및개별추출발효분말과추출물혼합발효분말의우수한세포증식효과와더불어세포독성이없는안전한것임을확인할수있었다. 그중에서실시예 7과실시예 8 분말의경우에는개별추출및개별추출발효분말에비하여매우우수한세포증식효과가있음을확인하였다. < 시험예 2 > 자유라디칼 (free radical) 소거효과평가상기실시예 1 ~ 8에서제조된추출물및추출발효건조분말에대하여자유라디칼 (Free radical) 소거효과를측정하였으며비교예 1로 Quercetin을사용하였다. 1) 실험방법 DPPH(1,1-디페닐-2피크릴-히드라질 ) 법 ( 참조 : Blois.M.S.Nature 181, 1190, 1958) 을사용하여실험을수행하였으며, DPPH와 Quercetin은시그마 (Sigma) 사의것을사용하였다. 0.2 mm DPPH 메탄올용액 1 ml에여러농도 (5, 10, 20, 50 μg/ml) 의실시예 1 ~ 8 그리고비교예 1인 Quercetin의에탄올또는메탄올용액 2ml를첨가하고잘교반한후실온에서 10분간반응을시킨다. 그리고 517 nm에서흡광도를측정하였으며, 이때공시험으로각시료대신정제수를사용하였다. 2) 실험결과하기계산식 2를이용하여자유라디칼소거효과를구하고그결과를아래의표 6에기재하였다. [ 계산식 2 ] [0169] [0170] 표 6 농도 자유라디칼소거효과 (%) μg/ml 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 실시예 8 querceti n 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 7.7 9.8 6.9 11.7 12.5 16.2 24.3 26.0 27.6 10 38.6 28.8 30.2 46.1 44.9 49.6 60.7 63.2 65.7 20 68.7 62.5 66.3 84.5 80.9 83.2 90.6 94.1 97.6 50 93.8 92.7 95.3 96.9 97.3 95.1 99.2 99.6 - SC 50 21.43 23.07 22.32 18.14 18.52 17.66 14.23 14.02 9.21 [0171] 상기표 6에서보는바와같이실시예 1 내지 3의추출분말의자유라디칼 50% 소거효과는 21.43, 23.07, 22.32 이며, 개별추출분말을각각발효한분말인실시예 4 내지 6의자유라디칼 50% 소거효과는 18.14, 18.52, 17.66 이고, 각추출물을혼합하여발효한분말인실시예 7 내지 8의자유라디칼 50% 소거효과는 14.23, 14.02로각각의추출분말과각각의추출분말발효분말과비교했을때월등히자유라디칼소거효과가우수함을확인할수있었다. 비교물질인 Quercetin의자유라디칼 50% 소거농도 (SC 50 ) 9.21 μg/ml보다떨어지는것으로나타났으나 Quercetin 이단일물질이며이를추출하여그순수물질의수득과사용상의안정성및비용을고려한다면실시 예 7 내지 8 이더효과적이다는것을알수있다. [0173] < 시험예 3 > 지질과산화 (Lipid peroxydation) 억제효과평가 - 15 -
[0174] [0176] [0177] [0179] [0180] [0181] 상기실시예 1 ~ 8에서제조된추출물및추출발효건조분말에대하여지질과산화 (Lipid peroxydation) 억제효과를측정하였으며비교예 2로녹차추출물을사용하였다. 1) 실험방법 8% Sodium lauryl sulfate 수용액에 linolenic acid를 0.1% 가되게용해하여 3.9 ml을취해서여기에농도별 (100, 300, 500, 700, 1000 μg/ml) 로시료를 0.1 ml를첨가한후자외선을한시간조사한다. 그리고 1 ml를취해서 0.8% TBA 수용액 1.5 ml와 20% 초산 (ph 3.5) 1.5 ml를첨가하고 1시간동안중탕하여냉각한후정제수 1 ml와 n-buoh:pyridine(15:1) 5 ml를가하여진탕하고원심분리후 n-buoh층을취해 532 nm에서흡광도를측정한다. 2) 실험결과공시험은시료를첨가하지않은것으로하였다. 하기계산식3를이용하여지질과산화효과를구하고그결과를아래의표 7에기재하였다. [ 계산식 3 ] [0182] [0183] 표 7 농도 지질과산화억제효과 (%) μg/ml 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 실시예 8 녹차추 출분말 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 9.9 6.5 8.1 13.1 11.2 10.6 15.3 16.1 10.5 300 20.7 14.2 18.5 21.6 25.7 22.1 29.2 30.8 18.6 500 35.9 29.1 27.9 40.6 38.7 36.9 49.1 50.9 33.1 700 73.7 71.2 61.2 70.8 78.1 80.1 82.7 83.9 60.2 1,000 86.3 82.1 80.5 89.7 90.7 92.3 97.6 98.5 88.5 IC 50 568.00 615.07 643.82 550.45 531.06 532.35 476.65 470.35 603.01 [0184] 상기표 7 에서보는바와같이실시예 7 ~ 8 은실시예 1 ~ 6 및녹차추출분말의지질과산화 50% 억제농도 (IC 50 ) 568.00, 615.07, 632.82, 550.45, 531.06, 532.35, 603.01 μg/ml 보다월등히우수한 476.65, 470.35 μg/ml 로매우우수한지질과산화효과가있음을확인하였다. [0186] [0187] [0189] [0190] [0192] [0193] < 시험예 4 > 리폭시게나아제 (Lpoxygenase) 활성억제효과평가상기실시예 1 ~ 8에서제조된추출물및추출발효건조분말에대하여리폭시게나아제 (Lpoxygenase) 활성억제효과를측정하였으며비교예 1로 Quercetin을사용하였다. 1) 실험방법 TBAS법을사용하여실험을수행하였으며, 실험에사용하는 Linoleic acid와 Lipoxygenase, Thiobabitulic acid, Quercetin는시그마 (SIGMA) 사의것을사용하였다. 1 mm Linoleic acid 1 ml에여러농도 (5, 10, 30, 50 μg/ml) 의실시예 1~8, 그리고 Quercetin을 0.05 ml를첨가하고 Lipoxygenase 0.95 ml를투여후잘교반하고 25 에서 10분간반응을시킨다. 그리고 Trichloroacetic acid를 0.5 ml 투여하고 Thiobarbiturlic acid 1ml 첨가한후 10분간 heating을한후얼음물에서 2~3분간냉각시켜반응을종료시킨다. 반응이종결된반응액에 Butanol 2 ml를넣고 4,000ⅹg로 5분간원심분리한후 535 nm에서흡광도를측정하였으며, 이때공시험으로각시료대신정제수를사용하였다. 2) 실험결과하기계산식 4를이용하여 Lipoxygenase 활성억제효과를구하고그결과를아래의표 8에기재하였다. - 16 -
[0194] [ 계산식 4 ] [0195] [0196] 표 8 농도 리폭시게나아제활성억제효과 (%) μg/ml 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 실시예 8 Querceti n 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2.9 4.5 2.1 5.5 7.7 3.2 10.8 11.2 11.6 10 15.4 20.9 18.3 26.7 27.3 19.6 30.6 32.2 33.7 30 38.7 46.1 31.9 50.5 55.5 58.7 76.9 78.2 79.5 50 77.6 80.8 75.1 81.9 90.1 88.1 92.3 95.6 98.8 IC 50 33.97 31.17 35.97 29.58 26.83 27.76 23.13 22.4 21.62 [0197] 상기표 8 에서보는바와같이실시예 7 ~ 8 의리폭시게나아제 50% 활성억제농도 (IC 50 ) 는 23.13, 22.4 μg/ml 로실시예 1 ~ 6 의리폭시게나아제 50% 활성억제농도 (IC 50 ) 33.97, 31.17, 35.97, 29.58, 23.83, 27.76 μg/ml 보다월등히우수하였으며, 비교예 1 인 Quercetin 의 21.62 μg/ml 보다는근소하게차이를보이고있음을확인할 수있었다. [0198] [0200] [0201] [0203] [0204] [0205] [0207] [0208] [0209] 그러나 Quercetin이단일물질이며이를추출하여그순수물질의수득과사용상의안정성및비용을고려한다면실시예 7 ~ 8이더효과적이다는것을알수있다. < 시험예 5 > 히아루로니다아제활성억제효과평가상기실시예 1 ~ 8에서제조된추출물및추출발효건조분말에대하여히아루로니다아제활성억제효과를측정하였다. 1) 실험방법 Morgan-Elson 법을응용한방법이다. Hyaluronidase의최종효소활성을 400NF unit/ ml, HA의최종농도를 0.4 mg/ml로하고게다가활성제인 Compound 48/80 buffer 용액 (0.1 mg/ml) 을사용하여불활성형 Hyaluronidase의활성화단계의저해작용을중심으로 Hyaluronidase 활성을측정하였다. 시료는 buffer에용해하여시료용액으로하고대조군은시료용액대신에 buffer를사용하였다. 또한, 각각의 blank로는효소용액대신에 buffer를사용하였으며, 대조군으로는녹차추출물을사용하였다. 2) 실험결과하기계산식 5를이용하여히아루로니다아제활성억제효과를구하고그결과를아래의표 9에기재하였다. [ 계산식 5 ] [0210] [0211] 표 9 농도 히아루로니다아제활성억제효과 (%) μg/ml 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 실시예 8 녹차추 출분말 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 9.6 7.1 8.2 9.6 16.8 8.8 19.7 20.9 9.1 300 19.9 15.7 19.1 21.6 25.3 22.7 39.2 40.8 21.6 500 39.5 44.2 44.2 50.6 48.7 45.2 75.3 76.7 40.7 700 87.2 84.1 89.7 88.5 86.7 87.2 96.8 97.3 86.3 1,000 98.7 97.2 98.2 96.7 97.1 92.9 97.5 98.1 98.7-17 -
IC 50 503.92 514.22 523.17 485.17 475.03 503.74 347.56 341.57 501.77 [0212] 상기표 9 에서와같이실시예 7 ~ 8 의히아루로니다아제 50% 활성억제농도 (IC 50 ) 는 347.56, 341.57 μg/ml 로 실시예 1 ~ 6 의리폭시게나아제 50% 활성억제농도 (IC 50 ) 503.92, 514.22, 523.17, 485.17, 475.03, 503.74 μ g/ml 및비교물질인녹차추출분말의 501.77 μg/ml 보다월등히우수함을확인할수있었다. [0214] [0215] [0216] [0217] [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] [0223] [0224] [0225] [0226] [0227] [0228] [0229] < 시험예 5 > 히아루로니다아제활성억제효과평가제형예 3의화장료에대한아토피피부개선효과의임상평가를측정하였다. 상기제조예 3 화장료의아토피피부의개선효과를평가하기위해, 아토피성피부를가지고한의원및병원에내원하여치료받는소인 20명을대상으로다음과같은실험을실시하였다. 시험시료를이중맹검법 (double-blinded test) 에의하여각각오른쪽과왼쪽으로나누어전신에도포하되, 가능한한시험시료의효과에영향을미칠수있는다른보습제의사용은금지하였다. 시험시료를도포한지 1, 2, 3, 4주후의효과를스코래드 (SCORAD; SCORing Atopic Dermatitis) 측정법으로평가하여그결과를하기표 10에나타냈다. 1) 판정기준 1 정도기준 (Extent criteria) : 면적 = 피손부위 /100 2 강도기준 (Intensity criteria) - 홍반 (1/2/3) - 부종 (1/2/3) - 삼출 (1/2/3) - 피부벗겨짐 (1/2/3) - 태선화정도 (1/2/3) - 건조정도 (1/2/3) 3 주관적기준 - 가려움 (1-10) - 불면증 (1-10) * 스코래드계산 = ( 정도기준 /5) + ( 강도기준 /7) + 주관적기준 표 10 [0230] 분류 0주 1주 2주 3주 4주 처방예 3 63.9 37.5 19.8 15.7 10.6 ( 실시예 7) 처방예 3 ( 실시예 8) 비교예 3 ( 정제수 ) 0.00% 41.31% 69.01% 75.43% 83.41% 61.8 35.7 18.7 14.3 9.1 0.00% 43.40% 70.58% 79.5% 85.34% 66.2 46.6 43.5 33.8 30.6 0.00% 29.61% 34.29% 48.94% 53.78% [0231] [0232] 상기표 6에서보는바와같이, 꼬시래기, 쇠미역혼합발효물분말 ( 실시예 7) 을함유하는제형예 3의화장료와꼬시래기, 쇠미역, 감태혼합발효물분말 ( 실시예 7) 을함유하는제형예 3의화장료가제형예 3에서꼬시래기, 쇠미역, 감태혼합발효물분말 ( 실시예 8) 함량만큼정제수를첨가한비교예 3에비해아토피피부개선효과가매우우수하다는것을알수있다. 특히, 4주후의결과를보면 83%, 85% 정도의우수한개선효과를나타내고있다. 한편, 보호자가느끼는아토피피부염완화효과를살펴보기위하여, 제형예 3 및비교예 3의화장료를 1개월 - 18 -
동안사용한후, 사용자의부모가하기기준에따라피부염의가려움증, 홍반변화, 피부건조증에대한만족도 와함께전반적인피부염개선정도및시험시료에의한부작용여부등을평가하도록하여하기표 12 에나타 냈다. [0233] 표 11 ( 판정기준 ) 1 2 3 4 5 효과없음 약간있음 보통 우수 매우우수 매우불만 불만 보통 만족 매우만족 표 12 [0234] 분류 피부가려움증 홍반변화 피부건조증 전반적개선효과 부작용 제형예 3 4.02 3.86 3.91 4.33 4.15 ( 실시예 7) 제형예 3 4.13 3.98 4.08 4.58 4.30 ( 실시예 8) 비교예 3 3.42 2.35 3.13 2.79 3.65 [0235] [0237] 상기표 12에서보는바와같이, 본발명에따른제형예 3의화장료는피시험자인아토피성피부를갖는소아에대하여전평가항목에서개선효과가있음을확인할수있다. 본발명에서설명한것은항염, 항알러지및아토피피부개선효과를가지는해조류혼합발효물, 이의제조방법및이의화장료조성물을위한실시예에불과한것으로, 본발명은상기실시예에한정되는것이아니라서로다른다양한형태로구현될수있으며, 단지본실시예는본발명의개시가완전하도록하고, 본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자에게발명의범주를완전하게알려주기위해제공되는것이며, 본발명은청구항의범주에의해정의될뿐이다. 도면 도면 1-19 -