생체시스템에서탄화수소의촉매적산화 이승재전북대학교자연과학대학화학과 Catalytic Oxidation of Hydrocarbons in Biological Systems Seung Jae Lee Department of Chemistry, Chonbuk National University, Jeonju, Jeonbuk 561-756, Korea Abstract: 바이오촉매에대한연구는학문적관심뿐만아니라산업적이용가치를고려해볼때, 그파급효과가매우크다고할수있다. 생체내화학반응기작을조절하는촉매가바로효소이다. 최근들어, 바이오에너지와지구온난화문제를해결할수있는대안으로박테리아에존재하는효소를응용하려는연구가활발히진행되고있다. 이러한연구결과중, 메탄의산화가진행되는수용성메탄모노옥시게나제를응용한바이오촉매를개발하려는노력은현재도활발히진행되어지고있다. 지난 30 여년동안메탄모노옥시게나제의기작을이해하기위한연구가활발히진행되어많은부분이이해되었으나, 아직도많은난제들을극복하지못하고있다. 수용성모노옥시게나제는히드록실아제, 조절효소, 환원효소로구성되어져있으며, 바이오촉매로써의기능을수행하기위해, 세가지효소를모두필요로한다. 또한산소와반응하여탄화수소를산화시키기위한반응중간체를활성부위를중심으로생성시킨다. 본고찰에서는메탄의산화를실현하는수용성메탄모노옥시게나제를중심으로, 생화학적기작을구조적특성과비교하여기술하였으며, 최신연구동향과주요관심사항에대하여고찰하였다. Keywords: hydrocarbon oxidation, biocatalysts, soluble methane monooxygenase, particulate methane monooxygenase, reductase, regulatory component 1. 서론 1) 메탄 (methane, CH 4 ) 가스로부터메탄올 (methanol, CH 3 OH) 이생성되는화학반응은바이오에너지 (bioenergy) 의생산과지구온난화 (global warming) 방지라는측면에서이미관련분야전문가뿐만아니라일반인에게도매우중요한관심분야가되었다. 메탄가스는지구상에서늪지, 호수, 바다에서발생하는자연적인생산량이외에공업화에따른화석연료의사용에의하여배출량이증대되고있다. 기업화된대규모가축사육도메탄가스의발생량을증가시키는요인이다. 온실가스의대부분을차지하고있는이산화탄소에비하여, 메탄가스는매우적은양이생산되는것이사실이 저자 (E-mail: slee026@jbnu.ac.kr) 다. 하지만, 이산화탄소보다메탄가스는효율적으로열을흡수하기때문에, 지구온난화현상을방지하기위하여메탄가스의저감기술은꼭해결되어야할중요한과제라할수있다. 현재공업적으로이용되어지고있는메탄의산화공정들은강한결합을이루고있는탄소-수소간결합을활성화시키기위하여높은온도를필요로하며, 비용과부수물의처리에있어서도비효율적이다. 이러한단점을보완하기위하여, 메탄가스를메탄올로산화시키려는생화학 생물공학적노력들이계속해서진행되고있다. 최근들어, 효소의바이오에너지및바이오정화로의이용가능성이증가되며, 그에대한연구가활발히진행되고있다. 메탄가스를유일한탄소에너지원으로이용하는미생물인메탄균 (Methanotropic bacteria, methanotrophs) 의경우, 세포내에서메탄모노옥시게 8 공업화학전망, 제 17 권제 3 호, 2014
생체시스템에서탄화수소의촉매적산화 Table 1. 모노옥시게나제미생물의다중합체 (BMM) 에포함되어있는효소들의분류 히드록실아제 조절효소 환원제 Rieske 알킨모노옥시게나제 (αβ) 2 AmoB AmoR - 페놀모노옥시게나제 (αβγ) 2 PHM PHP - 톨루엔모노옥시게나제 (αβγ) 2 ToMOD ToMOF ToMOC 메탄모노옥시게나제 (αβγ) 2 MMOB MMOR - 나제 (methane monooxygenase, MMO) 라는효소를이용하여메탄을메탄올로산화시킨다. 지금도새로운메탄균주를발굴해내어, 그기작을밝혀내기위한노력은선진국을중심으로활발히진행되고있다 [1]. 메탄모노옥시게나제는수용성메탄모노옥시게나제 (soluble methane monooxygenase, smmo) 와미립자메탄모노옥시게나제 (particulate methane monooxygenase, pmmo) 의두가지형태로발현이된다. smmo는메탄균주의배양에있어구리이온 (Cu 2+ ) 이배제되어진상태에서만발현이되는특징을갖고있다. 실험실에서인공적인배양을할경우에도 smmo를발현시키는과정에서구리이온이함유되지않은배지에서만 smmo의발현이이루어진다. pmmo의경우막단백질 (membrane protein) 로써분리및정제가용이하지않아생화학적인구조및정확한반응기작을밝히기난해하여, 지금까지주로 smmo 중심으로메탄의산화반응기작이연구되어져왔다. smmo 의경우이철 (diiron) 이온이활성부위 (active sites) 에존재하고있으나, 최근밝혀진 pmmo의구조에서는구리이온이메탄의변환을이루어내는것으로밝혀졌다 [2]. smmo는모노옥시게나제미생물의다중합체 (Bacterial multicomponent monooxygenase, BMM) 의범주에포함되어진다. BMM은산화시키는기질의종류에따라서 Table 1과같이효소의이름이결정되어진다. 각기질을산화시키기위하여, 자연계에존재하는히드록실아제효소는조절단백질 (regulatory component) 과환원제 (reductase) 의도움을받아서 히드록실효소에존재하는활성부위에서기질의특징적인산화를이루어낸다. BMM의범주에포함되는모든효소는공통적으로산화되어질기질을포함하여, 산소 (O 2 ) 분자, 양성자 (proton), 전자 (e - ) 가반응에반드시필요한요소라할수있다. 톨루엔모노옥시게나제 (Toluene-o-xylene monooxygenase, ToMO) 의경우특징적으로리스키 (Rieske) 효소인 ToMOC를포함하고있어서전자의흐름이메탄모노옥시게나제보다정교하게제어될것으로예상된다. BMM에속하는모노옥시게나제중 smmo만이다양한종류의기질을산화시킬수있는장점을갖고있다. 메탄모노옥시게나제의경우를비롯한대부분의 BMM은히드록실라제가 α-, β-, 그리고 γ-소단위체 (subunits) 로구성되어있어, 생체시스템에서도매우강한 C-H 결합을 C-OH로변환시키는화학반응이매우정교하게이루어짐을유추할수있다 [3]. smmo의생화학적기작을이해하고응용하여산업적으로이용하려는노력도계속해서진행되고있다. 메탄을비롯한알칸, 알킨, 고리화합물, 할로겐화합물은 smmo에의하여산화되어진다. 따라서, smmo의반응기작을이용하여생물공학적인방법으로각기질의특성에따른알콜을생성시킬수있는큰가능성을포함하고있다. 이와같이, 다양한탄화수소화합물을이용할수있는가능성을갖고있어, 대사공학이나생체공학에적용시키려는시도가진행되고있다. 생화학적, 분자생물학적접근이용이하지않은효소라는측면에서산업화로의전환이쉽지않으므로, 화학반응기작을이해하는것이그공업적활용에매우중요하다. 본고에서는가장많이연구되어진 KIC News, Volume 17, No. 3, 2014 9
Figure 1. 수용성메탄모노옥시게나제 (smmo) 의메탄산 화반응. Figure 3. 산화된이철 (Fe(III)-Fe(III)) 의활성부위에서아 미노산잔기들과배위결합을형성함. Figure 2. smmo의히드록실아제효소는호모다이머 (αβ γ) 2 의구조를보임 (PDB: 1MTY). Methylococcus capsulatus (Bath) 의 smmo를이용하여복잡하고다양한화학반응을유도하는각단백질의특성과기능에대하여최신연구동향과관심분야에대해서살펴보고자한다 (Figure 1). 이러한, 기초위에서생물공학적인방법이이용되어진다면다양한산업화의응용이가능할것으로사료된다. 2. 활성부위 (Active site) 를포함하는히드록실아제효소 (hydroxylase enzyme, MMOH) smmo의경우반응기작및구조는 Methylococcus capsulatus (Bath) 와 Methylosinus trichosporium OB3b의균주를이용하여연구초기부터많은결과들이보고되어왔다. M. capsulatus (Bath) 는잉글랜드의 Bath 지역에서서식하는균주로써 45 C에서배양을하는박테리아이다. 일반적인실험에있어서는구리이온이없는 NMS (nitrate minimal salts) 배지를이용하여균을배양한후, 히드록실아제를분리 정제하여효소의기작에대한정보를얻을수있었다 [4]. 히드록실아제 의구조는 α 2 β 2 γ 2 의호모다이머 (homodimer) 로이루어져있으며, 분자량은 251 kda이다 (Figure 2). 메탄의산화가이루어지는활성부위는 α-소단위체 (subunit) 에위치해있고, 각각의모노머에이철 (diiron) 이존재하고있다. 비햄성이철 (nonheme diiron) 은 α-subunit의표면에서내부로약 12 Å의거리에위치하며, 산소와반응하여높은에너지의중간체를생성한다. 이후메탄의산화를이루어내는중간체 (intermediates) 를생성하는촉매의중심역할을한다. 이철 (Fe1 & Fe2) 은 Figure 3에서보는바와같이네개의글루탐산과두개의히스티딘잔기에의하여배위결합되어있다 [4]. 단백질구조분석으로부터알수있듯이, 첫번째철 (Fe1) 은 Glu 114, Glu 144, His 147, 그리고물분자와결합을이루고있다. 산화된이철의경우, Fe1과 Fe2의거리는일반적으로 3.0~3.1 Å 정도로관측되어지며, 환원되어진상태에서는 (Fe (II)-Fe(II)) 그거리가약 3.2~3.3 Å으로관찰되어진다. 활성부위의산화상태에따른결합특성및원자간의거리는산소 (O 2 ) 분자가최초로히드록실아제와반응을위하여이철과결합을이루었을경우, 반응중간체 (intermediates) 를유추하는데매우중요한역할을한다. 산화상태의이철 (MMOH ox, Fe(III)-Fe(III)) 에서 Fe2는 Glu 243과단일결합을이루고, Glu 209 및 His 246과배위결합을형성한다. 산소분자가결합하여중간체를형성할수있는환원된히드록실아제 (MMOH red ) 의경우 (Fe(II)-Fe(II)), Glu 243의잔기인카르복 10 공업화학전망, 제 17 권제 3 호, 2014
생체시스템에서탄화수소의촉매적산화 Figure 4. 환원된이철 (Fe(II)-Fe(II)) 의활성부위에서아미노산잔기들과배위결합을형성함. 실기가 Fe2와킬레이트화 (chelation) 결합을형성한다. 산화된 MMOH ox 의활성부위에서존재하던말단물분자 (H 2 O) 와의결합을상실하게된다. Glu 144의경우 Fe1 및 Fe2와배위결합을이루고있다 (Figure 4). 산화상태에따른아미노산잔기들의변화중, Glu 243의카르복실기는주목할만한위치의이동을보이고있다. Glu 243의경우활성부위에존재하는이철이온들과의직접적인결합을이루는잔기이며, 환원되어진상태에서는 Fe2와킬레이트화결합을보이고있다. 이철이온은오직환원되어진상태 (Fe(II)-Fe(II)) 에서만산소분자와의결합을형성하고, 결합된산소분자를이용하여, 메탄의산화를이끌어낼수있는 Q 중간체 (Fe(IV)- Fe(IV)) 를생성할수있다. 따라서, 환원된상태에서는산소를활성부위의내부로이끌수있도록, Glu 243의카르복실기가위치변화를이루는것으로판단되어진다. 이와는반대로, 산화상태에서는이철과산소의반응이촉진되어지도록아미노산들의잔기들이이동하여, 산소분자의활성을도와주며 Glu 243이말단은물분자와수소결합을형성하는것으로판단된다. α-소단위체 (60.6 kda) 는 8개의긴 α-나선구조를비롯하여, 여러개의작은 α-나선구조와두개의작은 β-핀 (β-hairpin) 의이차구조로형성되어져있다. 앞서언급한바와같이, 네개의나선 (four-helical band) 이이철이온을포함하고있는데, α-나선구조중활성부위주위에서 π-나선 (π -helical) 구조를나타내고있다. 싸이토크롬 P450 (cytochrome P450) 등을포함한많은효소들이활 성부위주변의 π-나선을포함하고있는유사구조로미루어보면, 메탄과같은기질이보다효율적으로산소에의해형성되어진 H peroxo 중간체및 Q 중간체 (high valant oxo intermediate, Fe(IV)- Fe(IV)) 와반응을이룰수있도록도와주는역할을한다. β-소단위체 (40.5 kda) 도대부분 α-나선의이차구조로구성되어져있다. smmo의 α-소단위체와구조를비교하였을경우아미노산서열의유사성은없으나, 여러개의 α-나선이구조적으로일치하는것이관측된다. β-소단위체의가장큰역할은두개의단위체 (monomer) 가이분자체 (dimer) 를이룰수있도록결합을형성하는것이다. α-소단위체의경우매우제한된부분에서단위체간의상호결합을이루고있으며, γ-소단위체의경우히드록실아제의왼쪽과오른쪽가장자리에위치하고있어결합에직접적인참여를하지않는다. γ-소단위체는아직정확한기작이밝혀지지않았으나, 히드록실아제의용해도를증가시키는것으로유추된다. α- 혹은 β-소단위체의경우, 시험관내 (in vitro) 에서발현시키려는시도를하였을경우용해성이매우저조하나 γ-소단위체의경우높은용해도를보인다. 히드록실아제는메탄의산화를위하여, 양성자 (proton), 산소 (O 2), 전자 (e - ) 의이동이원활히이루어져야한다. 현재까지많은연구들이진행되어왔음에도아직정확한기질의경로는확인되고있지않은상태이다. 매사추세츠공과대학의리파드교수연구팀에서는산소와메탄의이동경로를유추하기위하여, 메탄과유사한반데르발스 (van der Waals) 반지름을갖는비활성기체인제논 (Xe) 가스를이용하여그경로를살펴보았다. α-소단위체에위치한 cavity를통하여히드록실아제표면에서이철이위치한활성부위로기질이이동하는것이관찰되었다 (Figure 5). 전자와양성자의이동경로는활성부위의바로위쪽에위치한 Asn 214, Glu 240 및 Thr 213이형성하는공간 (pore) 으로양성자및전자가이동될것으로판단되어진다 [6]. 기질의정확한이동경로의파악은향후메탄 KIC News, Volume 17, No. 3, 2014 11
Figure 5. MMOH α-소단위체에위치한 cavity에서제논가스 ( 검은볼 ) 들이관찰됨 (PDB: 1FZI). 모노옥시게나제의생물공학적이용에있어서매우중요한정보를제공할것이다. 그에대한예로써, 탈수소화효소 (dehydrogenases) 도매우복잡한단백질의구조적특성을갖고있으며, 여러소단위체들의다른자리입체성효과 (allosteric effect) 를통하여, 매우작은화학반응들을이끌어낸다 [5]. 3. 조절효소 (regulatory enzyme, MMOB) 에의한반응속도의증가 smmo의조절효소인 MMOB (15.9 kda) 는 141개의아미노산으로이루어져있다. smmo의구성효소중가장작은분자량을갖고있으며, 유일하게금속이온등을비롯한보결분자단 (prosthetic group) 을포함하고있지않은효소이다. 메탄모노옥시게나제의반응을촉진시키기위해서는반드시조절효소인 MMOB가히드록실아제의산화반응에참여하여야한다. 초창기연구결과에서부터 MMOB가반응에밀접한관련이있음이확인되었고, 효소가갖는촉매의성격을나타내는빠른반응속도와회전율 (turnover rate) 을위해서필수적인단백질이다. MMOH와결합을이루지않는 MMOB의용액상태에서의구조는핵자기공명 (NMR) 을이용하여확인되었다 (Figure 6). M. capsulatus (Bath) 에존재하는 MMOB의구 Figure 6. 조절효소인 MMOB는보결분자단을포함하지않고있으며, 산화반응에필수적인조효소로작용함 (PDB: 1CKV). 조는크게 3가지범위로나눌수있다. Met 1에서부터 Ser 35까지의 N-말단기 (N-terminus) 에위치한아미노산은일정한형태의구조를보이지않고있다. 하지만, 2차구조를예측하는프로그램상에서 Gly 17에서 Phe 25의아미노산이 α-나선구조를이룰것으로예상하기도하였다 [6]. 두번째구간인, Asp 36부터 Leu 129까지의 MMOB는매우특징적인 2차구조의특성을보이는데, 7개의 β- 가닥 (β-strands) 으로이루어진두개의 β-병풍구조 (β-sheets) 로이루어져있다. 이부분은또한 3개의 α-나선구조를포함하고있어, 향후그기작을알아내는것도매우중요한연구과제이다. 마지막으로, Met 130부터나머지구간의아미노산들도특징적인구조적특성을보이지않고있으나, NADH를이용한효소활성측정결과 141개아미노산의대부분이존재할경우최대활성을갖는것이관측되었다 [6]. MMOB와 MMOH의결합을이해하기위하여 X선회절분석법등을포함한다양한구조적분석을시도하였으나, 최근까지단백질결정화가용이하지않아, 분광분석법이나산화환원전위법 (redox potential) 을이용한실험을통해 MMOB- MMOH 상호작용을이해하려하였다. MMOB의당량을변화시켜가며, NADH의산화를측정한실험에서 2 당량의 MMOB가존재할경우, 최대의효소활성을나타내었다. 다시말하여, 두개의 MMOB와한개의 MMOH가존재하는조건에서최대의효소활성을나타내었다. 2 당량이상또는 12 공업화학전망, 제 17 권제 3 호, 2014
생체시스템에서탄화수소의촉매적산화 Figure 7. MMOH-2MMOB complex의구조분석은결합과반응성을예측할수있는많은정보를제공함 (PDB: 4GAM). 이하의 MMOB는 MMOH의효소활성측정시최대활성을보이지못하였다. 이결과는 1개의 MMOH (α 2β 2γ 2) 효소와두개의 MMOB가결합할수있는가능성에대한간접적인결과를나타낸것이다. 산화환원전위법을이용한실험에서, MMOB와 MMOR이서로경쟁적으로 MMOH에결합하려는특성을보이는것으로관측되어졌다. MMOH와 MMOB의결합특성과 MMOB가 MMOH의반응기작에미치는영향등을파악하기위하여, 단백질결정화를통한구조분석은가장직접적이고명확한정보를제공한다. 최근 M. capsulatus (Bath) 의 MMOH-MMOB 중합체에대한구조가밝혀짐에따라반응기작을이해할수있는계기가마련되었다 (Figure 7). 두개의 MMOB는한개의 MMOH (α 2β 2γ 2) 와 MMOH-MMOB 중합체를형성한다 [7]. 2 당량의 MMOB가최대활성을보이는것이매우논리적으로설명되어진다. 또한, MMOB의 N-말단기에있어서큰구조적변화를관찰할수있다. MMOB 만존재하는용액내 MMOB의 N-말단기는아무런구조적특징을보이지않았으나, MMOH- MMOB 중합체에서 MMOB의 N-말단기는매우정돈된구조를보이고있다 (Figure 8). 또한 Gly 17에서 Phe25에이르는아미노산잔기들은뚜렷한 α-나선구조를형성하고있다. MMOH의표면에위치한 helix E, F, H는 MMOB Figure 8. MMOB의 N-말단은 MMOH와결합후 (MMOH-MMOB) 일정한구조를이루며, 새로운 α-나선구조를형성함 (PDB: 4GAM). 의중심부와수소결합및소수성결합을통하여상호결합을이루고, MMOH 표면의 α-나선을 MMOB 방향으로끌어당김을알수있다. N-말단기의경우대부분 MMOH 표면에위치한나선 H 와나선 4 부근에원형의형태로결합을이룬다. 8개의수소결합은 N-말단이 MMOH 표면에고정된결합을형성할수있도록도와주며, N-말단에위치한 α-나선의경우 MMOH와소수성결합을통한상호작용을보이고있다. 특이하게도, MMOB α-나선의수용액을향한부분은용해도증가를위하여친수성아미노산으로이루어져있음을 MMOH- MMOB 구조분석을통하여확인할수있다. 이는 MMOH의낮은용해도를 MMOB가결합하였을경우극복하기위한것이다. MMOB의 N-말단기와중심부는다른자리이성질현상을통하여, MMOH의활성부위에구조적변화를일으키며, 이러한현상은촉매반응에있어서중요한화학반응을일으킨다. MMOB의결합으로, MMOH의활성부위에위치한이철은주변아미노산의말단과의배위결합에변화를보인다. 특히, Fe2의경우는 Glu 243과킬레이트화결합을생성하게된다. 환원된이철과유사한킬레이트로보여지나, MMOH-MMOB 중합체에서는실제카르복실기에위치한산소와철의결합거리가 MMOB의영향으로짧아지게된다. 표면에위치한 Fe2의경우, MMOB의중심에위치한아미 KIC News, Volume 17, No. 3, 2014 13
Figure 9. MMOR에위치한 FAD 결합도메인은 NADH로부터얻은전자를 [2Fe-2S] 도메인으로이동시키는역할을함 (PDB: 1TVC). 노산의영항으로 MMOH의내부에자리잡고있는 Fe1보다큰위치의변화를겪게된다. 이러한일련의현상들은 MMOB가상호결합을이룸으로써, 산소분자가이철과반응중간체를쉽게생성할수있도록 MMOH만이존재하는산화된상태와상이한구조적변화를모색하는것이다. 4. 환원제 (Reductase, MMOR) 에의한전자의이동메탄을계속적으로산화시키기위해서, 산소와결합할수있는이철을환원된형태 (Fe(II)-Fe(II)) 로만들어주기위하여, 전자를공급해주는 MMOR 의역할이필수적이다. 촉매회로 (catalytic cycle) 를계속해서활성화시키는작용은 MMOR의역할에직접적으로의존하고있다. MMOR은 FAD 결합도메인과 [2Fe-2S] 결합도메인으로구성되어져있다. 현재까지 MMOR 전체단백질의 3차구조는밝혀지지않았으나, FAD 결합도메인과 [2Fe-2S] 결합도메인을각각발현시켜정제한구조는핵자기공명을통하여확인하였다. Figure 9 은 FAD 결합도메인의용액상태하의구조를나타낸것이다. 전체적인전자의흐름은 NADH로부터 FAD 결합도메인으로전자가제공되며, 이전자는 [2Fe-2S] 도메인으로이동된다. 최종적으로 [2Fe-2S] 도메인은산소분자와이철 (diiron) 이결합할수있도록, 전자를활성부위에제공하는것이다. 이러한방식으로제공된전자는최종적으로산화되어 Figure 10. smmo 촉매회로반응은다양한분광학적방법을이용하여아래와같은중간체를형성할것으로예측되고있음. 진 MMOH ox (Fe(III)-Fe(III)) 를다시환원시켜촉매회로 (catalytic cycle) 를가속화시킨다 [8]. MMOR과 MMOH의결합특성을파악하는것은 smmo의촉매회로를이해하는데매우중요한부분을차지한다. 상호결합에의한전자의이동거리및경로를파악하는것은향후단백질공학을이용한효소의작용을제어할중요한지식을제공하기때문이다. 현재까지 MMOH와 MMOR 의중합체구조를밝히지못하였으나, 실험에기반을둔여러가설들은 MMOR이 α-소단위체에 MMOB와경쟁을하며결합을이루는경우와, α- 소단위체가아닌 β-소단위체에결합하여 MMOB 와비경쟁적으로 MMOH에결합하는두가지가설이유력하다. 향후분광학적인방법과구조적분석등을통하여 MMOH와 MMOR의상호작용을이해하는것이 smmo의공업적이용에큰기여를할것으로예상되어진다. 5. 반응기작의규명효소반응기작을이해하는것은매우난해한일이며, smmo와같이여러단백질을포함하는경우촉매회로반응을규명하기위하여다양한실험결과들을분석해야만한다. 현재까지연구되어진연구결과를바탕으로 smmo (M.capsulatus (Bath)) 의기작을구성해보았다 (Figure 10). 첫번째반응단계로, 환원된상태의 Fe(II)- Fe(II) 는산소분자와결합하여 P* 중간체를매우짧은시간동안생성해낸다. P* 중간체의정확한산화상태는현재까지알려져있지않으나, Fe(III)- 14 공업화학전망, 제 17 권제 3 호, 2014
생체시스템에서탄화수소의촉매적산화 Fe(II) 혹은 Fe(III)-Fe(III) 로유추되고있다. 반응중간체를이해하기위하여영하 140도에서반응물을급속동결시켜 Mössbauer, Raman, UV-Vis 등을이용한분석법으로산소원자와철의결합을이해할수있다. 짧은 P* 중간체는 MMOH peroxo 중간체로변환되어지며, 이중간체는 UV-vis과 Mössbauer 실험으로규명되었다. smmo의촉매회로에서, 전자를많이포함하고있는탄화수소는 H peroxo 중간체 (Fe(III)-Fe(III)) 에의해서산화가이루어지는것이 Stopped-flow spectrometer를이용하여증명되었다. 기질의산화를유도하는이와같은반응중간체는현재까지도합성을통하여활성부위를모방하고자연구가진행중이다. H peroxo 는메탄을산화시키지못하지만, Q 중간체의경우메탄을메탄올로산화시키는능력을포함하고있다. 높은산화수를갖는 Q (Fe(IV)-Fe(IV)) 중간체의완전한분리는 Rapid Freeze-Quench (RFQ) 방법을사용해도쉽지않으나, 기존의연구결과는각각의산소원자가 Fe1과 Fe2에결합되어진다이아몬드형태를이룰것으로예측하고있다. Q 중간체에위치한 Fe1-Fe2의거리는약 2.46 Å이며, 산화상태 (MMOH ox) 나환원상태 (H red) 보다메탄을산화시키는 Q 중간체가좀더작은단위의이철활성부위를형성하는것으로보인다. H peroxo 와더불어 Q 중간체에대한정확한구조적정보를얻는것이탄소-수소의강력한결합을활성화시킬수있는화학촉매를개발하는첫번째단계라할수있다. 공업적이용을위하여, 활성부위를모방한새로운무기화합물은향후메탄의산화촉매로써뿐만아니라, 다양한탄화수소의촉매를디자인할수있는많은정보를포함하고있다 [9]. H peroxo 와 Q 중간체가탄화소수를산화시키고나면, 활성부위의이철은 Fe(III)-Fe(III) 상태로존재하게된다. 다음회로반응을위하여 MMOH ox 는전자두개를 MMOR로부터차례대로얻게되어 Fe(II)-Fe(II) 상태의 MMOH red 변환된다. 최근발표된반응기작연구에따르면, 탄화수소기질이존재하지않을경우 Q 중간체는 Q* 중간체로변환된후전자를얻기위한 MMOH ox 상태가될것 으로예측되었다. smmo의경우, 반응기질이존재하면반응속도가매우빠르게증가하여, 반응중간체의분리가매우어렵게된다. 따라서반응중간체의용이한분리를위하여기질이배제된상태하에서 RFQ실험을진행하는것이반응순도가높은반응중간체를획득할수있는요소이다. 6. 맺음말바이오촉매의장점은기존의화학반응이갖는한계를뛰어넘는높은경제성에서연구가치를더하고있다. 화학반응시목표하는생성물을얻기위하여고온, 고압을필요로하고, 부반응에따른회수, 정제의비효율적인측면을극복하기위한대안으로바이오촉매는그중요성이부각되고있다. 이러한성질을이용하여기질의선택성, 초정밀성, 반응의경제성을높이기위한바이오촉매의개발이선진국을중심으로활발히진행되어지고있다. 국가적지원을넘어선, 다국적제약회사를중심으로새로운바이오촉매의개발을위하여, 기존의효소를기반으로합성효소를창출하여정밀화학산업에적용하려는시도를하고있다. 바이오촉매시장의확대는기존의생산체계가보이고있는오염물질의저감이라는측면에서도우수성을확인할수있다. 본문에서기술한메탄모노옥시게나제는, 현재인류가직면한에너지와환경이라는두가지난제에대한해결책을제시하는효소로간주되어진다. 이를위하여 smmo의정확한기작을이해하는연구가지속적으로수행되어야할것으로보인다. 최근셰일가스 (shale gas) 에대한이용과관심이증가하면서, 메탄모노옥시게나제는다음세대의에너지원으로이용될수있는 C1 가스의효율성을극대화시킬대안으로간주되고있다. smmo의경우메탄가스만이아닌, 다양한기질의산화를촉진한다. 이는산업적응용에있어서다양한산화반응을비교적용이하게만드는생물공학기술을이용하여실현시킬수있는가능성을내재하고있다. 새로운메탄균주의발굴을보고하는연구결과 KIC News, Volume 17, No. 3, 2014 15
는지금도계속되고있다. 메탄모노옥시게나제를이용한바이오촉매의개발에있어서, 지금까지밝혀지지않은균주의탐색도함께이뤄져야한다. 새로운균주로부터효소를분리 정제하여화학적 생물학적반응기작을파악하고, 산업화에적용시키는일련의과정은향후바이오촉매사업분야를포함한화학산업에전환점을마련할것으로판단된다. 참고문헌 1. R. S. Hanson, T. E. Hanson, Microbiol. Rev. 60, 439 (2009). 2. M. Merkx, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2782 (2001). 3. B. J. Wallar and J. D. Lipscomb, Chem. Rev. 96, 2625 (1996). 4. A. C. Rosenzweig, C. A. Frederick, S. J. Lippard, & P. Nordlund, Nature, 366, 537 (1993). 5. D. A. Whittington and S. J. Lippard, J. Am. Chem. Soc., 123, 827 (2001). 6. K. J. Walters, G. T. Gassner, S. J. Lippard, and G. Wagner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7877 (1999). 7. S. J. Lee, M. S. McCormick, S. J. Lippard, and U.-S. Cho, Nature, 494, 380 (2013). 8. L. L. Chatwood, J. D. Gross, G, Wagner, and S. J. Lippard, Biochemistry, 43, 11983 (2004). 9. C. E. Tinberg and S. J. Lippard, Biochemistry, 48, 12145 (2009). 이승재 2000 전북대학교화학과학사 2002 전북대학교화학과석사 2002~2004 희성엘겔하드연구소연구원 2010 매릴랜드주립대약학대학 박사 2010~2013 메사츄세츠공과대학박사 후연구원 2013~ 현재 전북대학교화학과조교수 16 공업화학전망, 제 17 권제 3 호, 2014