06.hwp

Size: px

Start display at page:

Download "06.hwp"

다민 내
7 years ago
Views:

1 大韓環境工學會誌論文 - Original Paper 662~ 메탄올탈수소효소저해시메탄산화에의한메탄올전환생성특성 Characteristics of Methanol Production Derived from Methane Oxidation by Inhibiting Methanol Dehydrogenase 유연선 한지선 안창민 민동희 모우종 윤순욱 이종규 * 이종연 ** 김창균 Yeon-Sun Yoo Ji-Sun Han Chang-Min Ahn Dong-Hee Min Woo-Jong Mo Soon-Uk Yoon Jong-Gyu Lee* Jong-Yeon Lee** Chang-Gyun Kim 인하대학교환경공학과 * 포항산업과학연구원 ** 한국환경공단 Department of Environmental Engineering, Inha University *Research Institute of Industrial Science & Technology **Korea Environment Corporation, Environmental Research Complex (2011 년 1 월 31 일접수, 2011 년 9 월 28 일채택 ) Abstract : This study was conducted to biologically convert methane into methanol. Methane contained in biogas was bio-catalytically oxidized by methane monooxygenase (MMO) of methanotrophs, while methanol conversion was observed by inhibiting methanol dehydrogenase (MDH) using MDH activity inhibitors such as phosphate, NaCl, NH 4Cl, and EDTA. The degree of methane oxidation by methanotrophs was the most highly accomplished as 0.56 mmol for the condition at 35 and ph 7 under 0.4 (v/v%) of biogas (CH 4 50%, CO 2 50%) / Air ratio. By the inhibition of 40 mm of phosphate, 50 mm of NaCl, 40 mm of NH 4Cl and 150 µm of EDTA, methane oxidation rate could achieve more than 80% regardless of type of inhibitors. In the meantime, addition of 40 mm of phosphate, 100 mm of NaCl, 40 mm of NH 4Cl and 50 µm of EDTA each led to generating the highest amount of methanol, i.e, 0.71, 0.60, 0.66, and 0.66 mmol when 1.3, 0.67, 0.74, and 1.3 mmol of methane was each concurrently consumed. At that time, methanol conversion rate was 54.7, 89.9, 89.6, and 47.8% respectively, and maximum methanol production rate was 7.4 µmol/mg h. From this, it was decided that the methanol production could be maximized as 89.9% when MDH activity was specifically inhibited into the typical level of 35% for the inhibitor of concern. Key Words : Methanotrophs, Methylosinus Sporium, Biogas, Methanol, Methane Monooxygenase (MMO), Methanol Dehydrogenase (MDH) 요약 : 본연구에서는메탄의생물학적메탄올전환에관한연구를수행하였다. 바이오가스중의메탄은메탄산화균의 methane monooxygenase (MMO) 의생물학적촉매반응에의해산화되었으며, 인산염, NaCl, NH 4Cl, EDTA 와같은 methanol dehydrogenase (MDH) 의활성저해제를이용하여 MDH 의활성도를저해함으로써메탄올의전환이이루어졌다. 메탄산화균은 35, ph 7, 인공바이오가스 (CH 4 50%, CO 2 50%) / Air 의부피비가 0.4 인조건에서메탄산화정도가 0.56 mmol 로최대로나타났다. 인산염 40 mm, NaCl 50 mm, NH 4Cl 40 mm, EDTA 150 µm 이하일때저해제의종류에상관없이메탄산화율은 80% 이상을달성하였다. 한편, 인산염 40 mm, NaCl 100 mm, NH 4Cl 40 mm, EDTA 50 µm 주입시각각 1.30, 0.67, 0.74, 1.30 mmol 의메탄이산화되는동시에각각 0.71, 0.60, 0.66, 0.66 mmol 의메탄올이최대로생성되었다. 이때의메탄올전환율은각각 54.7, 89.9, 89.6 및 47.8% 였으며최대메탄올생성속도는 7.4 µmol/mg h 였다. 이로부터대상저해제로 MDH 활성도를일반적으로 35% 저해시에메탄올생산량이최대인 89.9% 까지나타남을알수있었다. 주제어 : 메탄산화균, Methylosinus Sporium, 바이오가스, 메탄올, Methane Monooxygenase (MMO), Methanol Dehydrogenase (MDH) 1. 서론 매립지에서발생하는매립가스와혐기성소화시발생하는소화가스는 55~60% 의 CH 4, 35~40% 의 CO 2 와 N 2, O 2 그리고미량의 H 2S, NH 3, CFCs 및 VOC 등이구성되어있으며, 1) 그중메탄은온실효과가이산화탄소의 20배이상인대표적인 non-co 2 가스이다. 2) 2013년부터유기성폐기물의해양투기가전면금지되면서유기성폐기물의처분및에너지생산을동시에가능하게하는바이오가스생산및바이오연료생산연구가활발히진행중이지만, 시설비가높고가스정제가필요하며대규모인경우에만경제성을가진다는단점이있다. 현재국내전국매립지 (226개소) 중대부분의중소규모매립지 (216개소) 에서발생하는매립가스를소각및 대기중에방출시켜처리하며, 3) 특히소화가스경우 7.3% 가소각등으로처리되고있다. 4) 또한소비시장과거리가먼지역으로부터생산된가스의운반시경제성이낮다. 따라서최근에이러한바이오가스의주성분인메탄을자동차연료, 화학물질의원료및연료전지의에너지원등으로이용가능한메탄올로전환하는연구가진행중이다. 5) 그러나대부분물리화학적전환기술을채택하고있어그에따른고온고압의에너지비용이과다하게요구된다. 이러한문제점을해결하고자메탄산화균 (methanotrophs) 을이용한생물학적메탄의메탄올전환연구가수행되고있다. 메탄을유일탄소원과에너지원으로하여생육하는특이메탄산화균은그람음성의호기성세균으로, 6) 이들은 methane monooxygenase (MMO), methanol dehydrogenase (MDH), Corresponding author cgk@inha.ac.kr Tel: Fax:

大韓環境工學會誌論文메탄올탈수소효소저해시메탄산화에의한메탄올전환생성특성 663 formaldehyde dehydrogenase (FAD), formate dehydrogenase (FDH) 등의효소를이용하여메탄을메탄올 포름알데히드 개미산 이산화탄소로식 (1) 과같이산화시킨다.

2 大韓環境工學會誌論文메탄올탈수소효소저해시메탄산화에의한메탄올전환생성특성 663 formaldehyde dehydrogenase (FAD), formate dehydrogenase (FDH) 등의효소를이용하여메탄을메탄올 포름알데히드 개미산 이산화탄소로식 (1) 과같이산화시킨다. 7) CH 4 CH 3OH HCHO HCOOH CO 2 (1) 이과정에서균체내에생성된메탄올이 MDH에의해식 (2) 와같이포름알데히드로산화시키기때문에효소저해제또는분자생물학적으로 MDH의효소활성을억제하여메탄올을에너지원으로회수할수있다. Methanol MDH cytochrome C L cytochrome C H oxidase (2) MDH 활성저해제는디티오트레이톨 (Dithiothreitol, DDT), 페닐하이드라진 (phenylhydrazine), 금속킬레이트제, 요오드아세트산, MgCl 2, 고농도의인산염, cyclopropane, cyclopropanol 등이알려져있다. 8) 이중고농도의염은그이온강도에의해미생물생체내의단백질- 단백질간정전기적인력에영향을준다. 9) Chan 등 10) 은고농도의염이 cytochrome c와 MDH의친화도를감소시키는작용을한다고규명하였다. EDTA는메탄산화균전체세포에서의메탄올산화를저해하며, 11) EDTA와 EGTA는 MDH에잔류하는 lysyl나 arginyl를고정하여결국초기결합프로세스를막음으로써 MDH에서 cytochrome CL로의전자전달을저해한다고알려져있다. 12) 이러한원리를이용한메탄올생산연구가몇몇보고되고있다. Mehta 등 13) 은휴면기의 Methylosinus trichosporium NCIB 11131와 70~80 mm의인산염을이용한경우최대메탄올생성속도는 6 µmol/mg h이었으며, 박등 14) 은 Methylosinus trichosporium OB3b와 91 mm의인산염을이용, 4.5 시간동안메탄올의생성속도는평균 4.7 µmol/mg h 이었다. Takeguchi 등 15) 은 Methylosinus trichosporium OB3b을이용, cyclopropanol 67.0 nm로처리된반응의메탄올생산량은 152 mmol/g dry cell이었으며, Lee 등 16) 은 NaCl 200 mm을저해제로하고 Methylosinus trichosporium OB3b를이용하여 7.7 mm의메탄올을축적하였다. 메탄산화균을이용할경우상온및상압조건에서메탄의메탄올로의직접전환이가능하여 17) 물리화학적방법에비해경제적이다. 그러나균체의배양조건, 저해제의종류와농도에따른메탄올생성조건및메탄올전환수율등에관한비교연구가아직미흡하다. 따라서기존연구에사용된인산염, NaCl 저해제와 Chan 등 12) 의연구결과중 MDH 활성도저해가높은 NH 4Cl과 EDTA를선정하여가능성을시험해보고그결과를비교함으로써, 메탄산화균의 MDH 효소활성을저해하면서메탄올을높은수율로합성할수있는최적의저해제와그조건을확립하고자본연구를수행하였다. 2. 실험재료및방법 2.1. 균주및배양조건 메탄올축적을위해서는 smmo가존재하는메탄산화균이필요하므로 smmo를 coding하는유전자 mmox를가진 Methylosinus sporium (KCTC, 22312) 을한국생명공학연구원생물자원센터로부터분양받아사용하였다. 균주는 modified Higgins nitrate mineral salt medium을사용하여배양하였으며, 본실험에서는기질특이성을나타내는 smmo를 18) 메탄산화효소로이용하기위해서배지내구리를제외하였다. 7) 배양용기로는 530 ml serum bottle (Wheaton) 을사용하였으며, 배양액의부피는 200 ml로하였다. 인공바이오가스 (CH 4 50% + CO 2 50%) 와공기를 100 ml 용량의유리실린지 (Hapdong) 를이용하여 4:6의비율로취한후가스치환방식으로 5회주입한후에 200 rpm의 shaking incubator (Vision, vs-8480) 에넣어 35 에서배양하였다. Methylosinus sporium에대한 smmo 및 MDH 효소의존재여부를확인하기위해 PCR를실시하였으며, 그결과는 Fig. 1과같다. PCR은미생물의 16S rrna gene, MMO coding gene (mmox) 및 MDH coding gene (mxaf) 을증폭하였다. Fig. 1과같이메탄산화균내에 smmo를 coding하는유전자 mmox와 MDH를 coding하는유전자 mxaf를확인할수있었다. 이를통해본실험에사용된 Methylosinus sporium은 Fig. 1. Gel picture of MMO coding gene (mmox ) and MDH coding gene (mxaf ) of Methylosinus Sporium. 대한환경공학회지제 33 권제 9 호 2011 년 9 월

3 664 大韓環境工學會誌論文유연선 한지선 안창민 민동희 모우종 윤순욱 이종규 이종연 김창균 MMO와 MDH가존재하는 type II 메탄산화균으로, 메탄을 MMO에의해메탄올로산화하고 MDH에의해생성된포름알데히드를 serin 경로를통해동화하는것으로확인되었다. 7) 2.2. MMO 및 MDH coding 유전자분석방법 mmox는 smmo의수산화효소의 subunit을 coding하는유전자이며 mxaf는 methanol dehydrogenase 활성부분의 subunit 을 coding하는유전자이다. 따라서분자생물학적으로메탄산화균의 smmo 및 MDH 유무를확인하기위해 Table 1과같은프라이머 19,20) 를사용하여 PCR machine (Techgene) 으로 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭을실시하였다. PCR 수행후 ethidium bromide를포함하는 0.8% agarose를 0.5 TAE 완충용액 (Tris-acetate EDTA buffer) 에서전기영동 (Mupid-α, Japan) 한후 UV transilluminator (Vilber lourmat) 로그증폭산물을확인하였다 가스및메탄올분석방법 반응기내의메탄, 산소, 질소및이산화탄소의함량을분석하기위하여 packed column (Alltech ) 및 TCD 가장착된가스크로마토그래피 (HP6890 series GC system, U.S.A.) 를이용하였다 (Inlet 110, Oven 50, Detector 210 ). 반응액을 0.45 µm filter로여과후 HP-INNOWax Polyethylene Glycol (Agilent 1909N-133) 칼럼및 FID가장착된가스크로마토그래피 (Agilent Technologies 6890N Network GC System, USA) 로메탄올을분석하였다 (Inlet 220, Detector 250, 운반가스 He 1.5 ml/min, Oven 35 5 min 5 /min /min min) smmo 및 MDH 활성도분석방법 smmo의활성도는수정된 Naphthalene oxidation assay 21) 로 UV-spectrophotometer (Agilent) 를이용하여 525 nm에서측정하였다. Control은 CuSO 4 5H 2O 0.5% 가포함된배지를사용하였다. smmo의비활성도는 Diazo dye가 naphthalene 이 smmo 효소에의해 naphthol로산화된농도에비례하므로이를통해결정하였다. MDH의활성도는메탄올산화속도 13,14) 로측정하였다. 즉, 초기균주의농도는 1 mg/l, 메탄올농도는 1 mm로고정하고, 초기와 24시간후의메탄올농도를측정하였으며, 저해제를주입하지않았을때의메탄올산화량을활성도 100% 로기준하여상대적인메탄올의산화속도로 MDH 활성도를구하였다 메탄산화균의메탄산화영향인자실험방법 메탄산화균에의한최적메탄산화조건을수립하기위해온도 (25, 30, 35 및 40 ), ph (5, 6, 7, 8 및 9) 및인공바이오가스 / 공기부피비율 (0.2, 0.3, 0.4 및 0.5) 을달리하여실험을수행하였다. 즉, 각영향인자에따라 72시간동안 1 mg dry cell/l의 Methylosinus sporium을주입하여배양하였으며, 이때 smmo 활성도증가율과메탄및산소의변화를측정하였다. 배양용기로는 Fig. 2와같은 250 ml serum bottle (Wheaton) 을사용하였으며, modified Higgins nitrate mineral salt medium의부피는 100 ml였다 저해제에따른메탄산화특성및효소활성도실험방법 MDH의활성도저해제인인산염 (10~100 mm), NaCl (0~125 mm), NH 4Cl (0~80 mm), EDTA (0~250 µm) 의농도를달리하여 100 ml 배양액에주입하였으며, 초기농도 20 mg dry cell/l의 Methylosinus sporium의 48시간대사과정에이용한메탄산화특성변화와 smmo와 MDH 활성도변화를분석하였다. 배양온도는 35 이고 250 ml serum bottle (Wheaton) 을사용하였으며, 주입한초기메탄은 head space 의 10%, 산소는 15% 였다. 초기조건과 48시간배양후의가스변화를측정하였다. Fig. 2. Batch type reactor for methanol biosynthesis MDH 저해제에따른최대메탄올발생량및메탄올전환수율실험방법 Methylosinus sporium을 100 ml의 modified Higgins nitrate mineral salt medium과함께 250 ml serum bottle (Wheaton) 에 20 mg dry cell/l이되도록주입하였다. 배지의저해제인 Table 1. Amplification primers of MMO and MDH target gene Target gene Size of product (bp) Primer Sequence (5-3 ) Reference mmox 719 mmox206f ATCGCBAARGAATAYGCSCG mmox886r ACCCANGGCTCGACYTTGAA Hutchens, E. et al. 19) mxaf 550 mxa1003f GCGGCACCAACTGGGGCTGGT mxa1561r GGGCAGCATGAAGGGCTCCC Mcdonald, I. R. et al. 20) Journal of KSEE Vol.33, No.9 September, 2011

4 大韓環境工學會誌論文메탄올탈수소효소저해시메탄산화에의한메탄올전환생성특성 665 인산염 (10~100 mm), NaCl (0~125 mm), NH 4Cl (0~80 mm), EDTA (0~250 µm) 의농도를변화시켰으며, 48시간동안 6시간별로가스농도변화와메탄올발생량을측정하여메탄올이최대로발생했을때의메탄올과메탄의양을측정하였다 메탄산화균농도및시간에따른메탄올생산량분석결과메탄산화균의농도에따른메탄올생성량확인을위해 NaCl 100 mm을저해제로하고 Methylosinus sporium의초기농도를 1, 5, 10, 25, 50 mg/l로변화시켜 100 ml의배지와함께 250 ml serum bottle (Wheaton) 에주입하고 35 에서 30시간배양하여메탄올생성량을측정하였다. 또한, 시간에따른메탄올생산량을분석하기위해초기미생물농도를 20 mg/l로하고 NaCl 100 mm을저해제로첨가하여 30 시간동안메탄올생산량을모니터링하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 메탄산화균의메탄산화영향인자분석결과온도, ph 및인공바이오가스 / 공기부피비율을달리하여실험을수행한후 smmo 활성도증가율과메탄및산소의저감율을산정하여 Fig. 3에나타내었다. 온도가 25~40 로변화하는경우배양 72시간후 smmo 활성도증가율은 35 에서가장높았으며, 이때초기반응기의 head space 중평균 8.6% 를차지하는메탄의산화율은 89% 로가장활발하였다. 그러나 40 의경우가스산화율및 smmo 활성도가급격히감소하는것으로보아 40 이상에서는메탄산화균의생장이저해됨을알수있었다. 일반적으로 Type II 메탄산화균은 45 에서생장하지못하는특성이있으며 7) 본실험에서도 Type II 메탄산화균의일종인 Methylosinus sporium은 40 에서생장이저해되고 35 에서최대생장을보이는중온균임을확인하였다. 배양액내의 ph 변화에따른 smmo 활성도는 ph 7에서가장높은증가를보였으며, 메탄및산소의소모율은 ph 7 이상에서큰차이가없었다. ph 5의경우 smmo 활성도와메탄소모율이가장낮은것으로보아산성조건보다 ph 7 이상의중 염기성조건에서메탄산화균의활성이높음을알수있었다. 인공바이오가스 / 공기 (v/v) 의주입에따라 head space 내에포함된산소와메탄 mmol로환산하였을때초기및 72시 Fig. 3. Effect of (a) temperature, (b) ph and (c) artificial biogas/air ratio (v/v%) on gas oxidation rate and change rate of smmo activity for 72 hr incubation (dry cell concentration = 1 mg/l). 간후의메탄 / 산소몰비는 Table 2와같다. 메탄산화균이이론적으로메탄을이용하여메탄올을합성하는데 1몰의메탄과 1몰의산소가필요하며, 7) Table 2에서보는바와같이바이오가스 / 공기 (v/v) 비가 0.3 및 0.4의경우메탄이 0.55~ 0.56 mmol로가장많이산화되어이때메탄 / 산소의몰비는 1.04~1.45로이론적값에근사하였다. 그러나그비가 0.2 및 0.5의경우메탄 / 산소의몰비는 0.80 및 1.79로나타나메 Table 2. Variation of gas concentration by artificial biogas/air ratio (v/v%) CH 4 (mmol) CH 4 oxidized O 2 (mmol) O 2 consumed 0 hr 72 hr (mmol) 0 hr 72 hr (mmol) Artificial biogas/air ratio (v/v%) Initial CH 4/O 2 ratio 대한환경공학회지제 33 권제 9 호 2011 년 9 월

666 大韓環境工學會誌論文유연선 한지선 안창민 민동희 모우종 윤순욱 이종규 이종연 김창균 탄의농도가낮거나이론적몰비에서크게벗어난경우메탄산화에영향을주는것으로판단되었다. 3.2.

5 666 大韓環境工學會誌論文유연선 한지선 안창민 민동희 모우종 윤순욱 이종규 이종연 김창균 탄의농도가낮거나이론적몰비에서크게벗어난경우메탄산화에영향을주는것으로판단되었다 MDH 활성도저해제에따른메탄산화특성및효소활성도분석결과 MDH의활성도저해제인인산염, NaCl, NH 4Cl, EDTA를배양액내에농도를달리하여주입시에메탄산화균의 48 시간대사과정에이용한메탄산화특성변화와 smmo와 MDH 활성도저해정도를분석한결과는 Fig. 4와같다. 초기메탄 10%, 산소 15% 를차지하는 head space 내의 48시간배양전후의가스산화정도를측정하였으며, 상대적활성도는저해제를주입하지않았을때의활성도를 100% 로기준하여나타내었다. 배양액은 10 mm의인산염완충액을포함하고있으며, 인산염 40 mm, NaCl 50 mm, NH 4Cl 20 mm, EDTA 150 µm 이하의주입농도에서메탄산화율은각각 83.8, 79.8, 75.8, 86.0% 이상이었으나, 그이상의농도에서는메탄산화율이크게감소하여메탄의산화가저해되는것을알수있었다. 그원인은효소의활성도분석을통해파악할수있었으며인산염 40 mm, NaCl 50 mm, NH 4Cl 20 mm, EDTA 150 µm 이하의농도에서 smmo 활성도는 90.1, 80.3, 86.8, 82.3%, MDH 활성도는 72.1, 79.4, 75.7, 29.7% 로 MDH 활성도는저해하면서 smmo 활성도는크게저해하지않으나, 그이상의농도에서는 MDH 활성도저해뿐만아니라 smmo 활성도도크게저해되어메탄산화에영 향을주는것으로나타났다. 또한, 인산염, NaCl, NH 4Cl 저해제에비해 EDTA 는 smmo 활성도는크게저해하지않으면서 MDH 활성도를 29.7% 까지저해하므로가장고효율의 MDH 저해제로작용하여메탄산화율을증가시키는동시에고농도의메탄올을생성할수있었다 MDH 저해제에따른최대메탄올발생량및메탄올전환수율저해제의농도에따른메탄올최대발생량과메탄에대한메탄올전환수율은 Fig. 5와같다. 메탄올전환수율은메탄산화균이 48시간동안의대사과정을모니터링하는중에서이용한메탄 (mmol) 대비최대로생산된메탄올 (mmol) 을퍼센트비율로나타낸것이다. 인산염저해제 40 mm 주입시메탄이 1.3 mmol 산화되어 0.71 mmol의최대메탄올이생산되어산화된메탄의양대비메탄올전환수율은 54.7 % 였다. 이때의최대메탄올생성속도는 7.4 µmol/mg h 로 Mehta 등 13) 이얻은최대메탄올생성속도인 6 µmol/mg h보다높은결과를얻을수있었다. NaCl 저해제 100 mm 주입시최대메탄올의발생량이 0.60 mmol( 최대메탄올생성속도는 6.25 µmol/mg h) 이었으며, 메탄은 0.67 mmol 산화되어메탄올전환수율은 89.9% 로산정되었다. 이결과는저해제농도별메탄산화및효소활성도결과에서예측한바와다른결과를나타낸다. 이는효소활성도실험은정확히 48시간후에측정한실험결과이나최대메탄올전환수 Fig. 4. Effect of MDH activity inhibitors on gas oxidation rate and relative enzyme activity (a) phosphate, (b) NaCl, (c) NH 4Cl, (d) EDTA (dry cell concentration = 20 mg/l). Journal of KSEE Vol.33, No.9 September, 2011

6 大韓環境工學會誌論文메탄올탈수소효소저해시메탄산화에의한메탄올전환생성특성 667 Fig. 5. Effect of MDH activity inhibitors on methane, methanol concentration and conversion rate (a) phosphate, (b) NaCl, (c) NH 4Cl, (d) EDTA (dry cell concentration = 20 mg/l). 율을구하기위해진행한본실험에서최대메탄올전환은 48시간이전에일어나그결과가서로상이한것으로여겨진다. NaCl의경우수율은높으나인산염저해제에비해메탄산화량및메탄올생산량이낮아인산염저해제가 NaCl 저해제에비해메탄산화와메탄올생산을동시에효과적으로달성할수있음을보였다. NH 4Cl 저해제 40 mm 주입시메탄이 0.74 mmol 산화되어최대 0.60 mmol( 최대메탄올생성속도는 6.25 µmol/mg h) 의메탄올이생산되었으며, 메탄의메탄올전환수율은 89.6 % 로높게나타났다. 또한, 60 mm 및 80 mm의경우도메탄올전환수율은높았지만메탄산화량이각각 0.35 mmol 및 0.27 mmol로매우낮아고농도의저해제에의해메탄산화가방해받는것으로판단되었다. EDTA 저해제 50 µm 주입시메탄이 1.30 mmol 산화되어생성된메탄올은 0.66 mmol로높았고이때의최대메탄올생성속도는 6.88 µmol/ mg h이었으나 NaCl 100 mm 및 NH 4Cl 40 mm을사용할경우의메탄올전환수율 ( 약 90%) 보다 47.8% 로낮았다 메탄산화균농도및시간에따른메탄올생산량분석결과 Fig. 6은 NaCl 100 mm을저해제로하고메탄산화균의농도를 1, 5, 10, 25, 50 mg/l까지증가시킨경우메탄올생성량을나타낸것이다. 메탄산화균의농도가 1 mg/l일때최대메탄올생산량은 0.16 mmol이었다. 그이상의농도에서는메탄올농도가감소하였다가점차적으로메탄올의생산량이증가하여 50 mg/l일때 0.21 mmol의메탄올이축적되었다. 이는메탄산화균의농도가 1 mg/l 이상일때, 생산된메탄올이다시메탄산화균에의해산화되어메 Fig. 6. Effect of (a) cell concentration and (b) reaction time on methanol formation inhibited by NaCl 100 mm (20 mg/l of dry cell was injected for (b)). 대한환경공학회지제 33 권제 9 호 2011 년 9 월

7 668 大韓環境工學會誌論文유연선 한지선 안창민 민동희 모우종 윤순욱 이종규 이종연 김창균 탄올의축적이원활히이루어지지않았지만메탄산화균의농도를 25 mg/l 이상으로높일경우메탄올의산화속도보다생산속도가더빠르게진행되어메탄올의축적양이증가한것으로여겨진다. 메탄산화균의농도 20 mg/l, NaCl 100 mm 주입조건에서배양시간에따른메탄올생산량변화를평가하였다. 즉, 저해제를가하더라도생산된메탄올의일부는메탄산화균에의해산화될수있기때문에, 일단생산된메탄올의고효율회수를위하여최적배양시간을결정하고자하였다. 실험결과배양시간 3시간이후부터메탄올의축적이일어나기시작하여 20시간을전후로급격하게메탄올생산량이증가했다. 27시간후에는최대 0.60 mmol의메탄올이생산되어 27시간후까지배양을지속할경우메탄올을최대로회수할수있는것으로나타났다 MDH 활성도와메탄올생성량의상관관계 Fig. 7은저해제를주입하지않은경우의 MDH 활성도를기준으로저해제주입시활성도저감정도를상대적 MDH 활성도를 x축에그에따른메탄올생성량을 y축에나타내었다. Mehta 등 13) 과박성훈과추석열 14) 의연구에서인산염저해제로 MDH 활성도를약 20% 및 30% 까지저해하였을때, 또한 Lee 등 16) 의연구에서 NaCl 저해제로 MDH 활성도를약 45% 까지저해하였을때메탄올이최대로생성되었다. 본연구에서는저해제별메탄올생성은각각인산염 40 mm, NaCl 100 mm, NH 4Cl 40 mm 및 EDTA 50 µm 주입시최대로나타났으며, 이때상응하는 MDH 활성도는 72.1, 58.7, 54.0 및 75.7% 까지저해되었다. 따라서 MDH 활성도를저해제종류에관계없이평균 65% 까지저해시메탄올의생성량이최대로획득되는것으로판단되었다. 그이상의농도로저해제를주입하여 MDH 활성도를저해하는경우 smmo 활성도또한동시에저해되어메탄올의생성농도가감소하는것으로여겨졌다. 4. 결론 본연구에서는메탄산화균 Metylosinus sporium의메탄산화영향인자를분석한후에, 메탄올탈수소효소의활성도저해제인인산염, NaCl, NH 4Cl, EDTA의농도를달리하여주입한경우메탄산화에미치는영향과메탄올생성량분석을실시하였다. 효소 coding 유전자분석을통해메탄산화균으로사용한 Methylosinus sporium (KCTC, 22312) 내에 MMO, MDH 효소가존재함을확인하였다. Methylosinus sporium은 35 에서메탄산화량및증식속도가높은중온균이었으며, ph는산성보다는중 염기성조건에적합하였다. 인공바이오가스 ( 메탄 50%, 이산화탄소 50%) 와공기의주입비율이 0.4인경우이론적메탄 / 산소몰비 1에비교적부합하며다소높은메탄산화량을보였다. 저해제의농도별실험결과, 인산염 40 mm, NaCl 50 mm, NH 4Cl 40 mm, EDTA 150 µm일때메탄산화율이 80% 이상으로큰저해가없었으나, 그이상의농도에서 MDH 활성도저해보다 smmo 활성도의저해가더커메탄산화에영향을미치는것으로나타났다. 인산염저해제 40 mm 주입시 0.71 mmol의메탄올이생산되었으며이때의최대메탄올생성속도는 7.4 µmol/mg h로나타났다. 최대메탄올이생산된각저해제농도에서의 MDH 활성도는평균 65% 였다. 따라서저해제로 MDH 활성도를 35% 저해시에메탄올을최대로생성할것으로보인다. 본연구결과메탄산화균을이용하여바이오가스중메탄의효율적인산화저감이가능하였다. 또한 MDH 활성도저해제를주입시메탄의산화와동시에메탄올을생산하여바이오가스의자원화기술로의적용가능성이있을것이라판단된다. 사사 본연구는포항산업과학기술연구원 (RIST) 의 전처리에의한바이오가스생성효율증대및바이오가스중메탄에기인한메탄올합성기술개발 과제및환경부의 폐기물에너지화특성화대학원사업 의지원으로수행되었습니다. 참고문헌 Fig. 7. Correlation between relative MDH activity and methanol. 1. 이성호, 문동현, 조대섭, 생활폐기물매립지의매립가스자원화에관한연구, 대한환경공학회지, 8(1), 203~213(2003). 2. Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC), Climate Change 2001 : The Scientific Basis, Cambridge University Press, Cambridge, UK(2001). 3. 환경부자원순환국, 전국생활폐기물매립시설설치운영실태조사결과, 환경부 (2009). 4. 환경부, 공공하수도시설에너지절감대책수립에관한연구 : 최종보고서, 환경부 (2006). Journal of KSEE Vol.33, No.9 September, 2011

8 大韓環境工學會誌論文메탄올탈수소효소저해시메탄산화에의한메탄올전환생성특성 Persson, M., Biogas-a renewable fuel for the transport sector for the present and the future, Swedish Gas Center (SGC), Sweden(2007). 6. Ford, T. E., Aquatic Miobiology, Blackwell Scientific Publications, Inc., Boston, pp. 82~89(1993). 7. Hanson, R. S. and Hanson, T. E., Methanotrophic bacteria, Microbiol. Rev., 60(2), 439~471(1996). 8. Carver, M. A., Humphrey, K. M., Patchett, R. A. and Jones, C. W., The effect of EDTA and related chelating agents on the oxidation of methanol by the methylotrophic bacterium, Methylophilus methylotrophus, Eur. J. Biochem., 138(3), 611~615(1984). 9. Pettigrew, G. W. and Moore, G. R., Cytochrome c: Biological Aspects (Springer Series in Molecular Biology), Springer, New York, pp. 29~113(1987). 10. Chan, H. T. C. and Anthony, C., The interaction of methanol dehydrogenase and cytochrome CL in the acidophilic methylotroph Acetobacter methanolicus, Biochem. J., 280(1), 139~146(1991). 11. Anthony, C. and Williams, P., The structure and mechanism of methanol dehydrogenase, Biochim. Biophys. Acta, 1647 (1~2), 18~23(2003). 12. Chan, H. T. C. and Anthony, C., The mechanism of inhibition by EDTA and EGTA of methanol oxidation by methyltrophic bacteria, FEMS Microbiol. Lett., 96(2~3), 231~ 234(1992). 13. Mehta, P. K., Mishra, S. and Ghose, T. K., Methanol accumulation by resting cells of Methylosinus trichosporium(i), J. Gen. Appl. Microbiol., 33(3), 221~229(1987). 14. 박성훈, 추석열, Methylosinus trichosporium OB3b 를이용한메탄올의생산, 한국생물공학회지, 8(4), 341~350(1993). 15. Takeguchi, M., Furuto, T., Sugimori, D. and Okura, I., Optimization of methanol biosynthesis by Methylosinus trichosporium OB3b: and approach to improve methanol accumulation, Appl. Bioochem. Biotechnol., 68(3), 143~152(1997). 16. Lee, S. G., Goo, J. H., Kim, H. G., Oh, J. I., Kim, Y. M. and Kim, S. W., Optimization of methanol biosynthesis from methane using Methylosinus trichosporium OB3b, Biotechnol. Lett., 26(11), 947~950(2004). 17. Anthony, C., The Biochemistry of Methylotrophs, Academic Press, New York, pp. 17~34(1982). 18. Anthony, C., The structure and function of methanol dehydrogenase and related quinoproteins containing pyrrolo-quinoline quinone, Biochem. J., 304(3), 665~674(1994). 19. Hutchens, E., Radajewski, S., Dumont, M. G., McDonald, I. R. and Murrell, J. C., Analysis of methanotrophic bacteria in Movile Cave by stable isotope probing, Environ. Microbiol., 6(2), 111~120(2004). 20. Mcdonald, I. R. and Murrell, J. C., The methanol dehydrogenase structural gene mxaf and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs, Appl. Environ. Microbiol., 63(8), 3218~3224(1997). 21. Bowman, J. P., Jimenez, L., Rosario, I., Hazen, T. C. and Sayler, G. S., Characterization of the methanotrophic bacterial community present in a trichloroethylene-contaminated subsurface groundwater site, Appl. Environ. Microbiol., 59 (8), 2380~2387(1993). 대한환경공학회지제 33 권제 9 호 2011 년 9 월

03이경미(237~248)ok

03이경미(237~248)ok The recent (2001-2010) changes on temperature and precipitation related to normals (1971-2000) in Korea* Kyoungmi Lee** Hee-Jeong Baek*** ChunHo Cho**** Won-Tae Kwon*****. 61 (1971~2000) 10 (2001~2010).