작품번호 1601 제 59 회전국과학전람회 Chlorophyll 의항산화작용에영향을주는요인과 최적의항산화조건에대한탐구 출품분야학생부출품부문농림수산 2013. 7. 8 구분성명 출품학생 지도교사 김대엽, 심은섭, 이원배 신석진
- 목차 - 1. 탐구동기및목적 1 2. 탐구내용및수행과정 2 가. 탐구내용 2 나. 탐구수행과정 3 3. 선행연구및이론적고찰 4 가.Chlorophyl 의구조적특징과항산화효과 4 1)Chlorophyl 의구조및유도체의분류 4 2)Chlorophyl 의항산화효과 5 3)Chlorophyl 의항산화메커니즘 6 나.Chlorophyl 의구조와중심금속의변화 7 다.Chlorophyl 의항산화효과의측정 8 1)β-carotene 블리칭법 8 2)DPPH 법 8 라.Chlorophyl 의소화과정과세포속에서의역할 9 1) 위와소장에서 Chlorophyl 의소화 9 2) 세포내 ROS 와항산화물질의반응 9 4. 실험재료준비및분석장비 11 가. 시금치에서 Chlorophyla,b 의추출및분리 11 나. 항산화효과와형광방출량의측정 12 1)UV-Vis 분광기 12 2) 형광분광기 (FluorescenceSpectrophotometer) 13 다.Chlorophyl 의중심금속을철로치환한화합물의합성 14 5. 탐구방법및탐구결과 16 가. 과제 1:pH 및체내환경에서 Chlorophyl 의항산화효과 16-2 -
1)pH 에따른 Chlorophyl 의항산화효과측정 16 2) 체내환경 (invitro) 에서 Chlorophyl 의항산화효과측정 17 3) 위조건에서시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과측정 19 나. 과제 2: 열과온도에따른 Chlorophyl 의항산화효과 19 1) 열을처리한 Chlorophyl 과시금치의항산화효과측정 19 2) 온도에따른 Chlorophyl 의항산화효과측정 21 다. 과제 3: 빛노출에따른 Chlorophyl 의항산화효과 22 1) 빛노출시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과 22 2) 빛에따른 Chlorophyl 의형광방출량측정 23 라. 과제 4:Chlorophyl 의중심금속치환에따른항산화효과 25 1) 포르피린구조에다양한금속들이치환된화합물의항산화효과비교 25 2) 체내조건에서 Chlorophyl 의중심금속을철로치환한화합물의항산화효과비교 26 6. 결론및제언 28 가. 결론 28 나. 제언및연구의제한점 29 7. 참고문헌 30
[ 표차례 ] [ 표 1]Chlorophyl 유도체의분류 5 [ 표 2] 열에의한시금치속 Chlorophyl 유도체들의조성변화 8 [ 표 3] 표 3ICP 마그네슘농도측정결과 (mg/l) 15 [ 그림차례 ] [ 그림 1] 탐구과정을나타낸 Flow Chart 2 [ 그림 2] 탐구수행과정을나타낸 Flow Chart 3 [ 그림 3]Chlorophyl 의일반적인형태 4 [ 그림 4]Chlorophyl 유도체사이의변화 5 [ 그림 5] 폴리페놀의항산화메커니즘 6 [ 그림 6]Chlorophyl 의항산화메커니즘 7 [ 그림 7]Chlorophyl 에서 Pheophytin 으로의전환 7 [ 그림 8]DPPH 의라디칼반응 9 [ 그림 9]DPPH 의 UV-Vis 스펙트럼 9 [ 그림 10] 세포호흡부산물에의한과산화물, 자유라디칼의형성 11 [ 그림 11]Chlorophyl 의추출방법 12 [ 그림 12] 회전증발농축기사용하는모습 12 [ 그림 13]Chlorophyl 을추출하는모습 12 [ 그림 14] 감압증류기를사용해 Chlorophyl 을거르는모습 12 [ 그림 15] 본교의 UV-Vis(Cary-60,Agilent) 12 [ 그림 16] 본교의 UV-Vis 를이용해측정하는모습 13 [ 그림 17]Jablonskidiagram 13 [ 그림 18] 본교의 FluorescenceSpectrophotometer(LS55-PerkinElmer) 13
[ 그림 19] 결과를해석하는모습 13 [ 그림 20] 동일하게합성한다양한금속치환화합물 14 [ 그림 21] 원심분리한모습 14 [ 그림 22] 본교의원심분리기 14 [ 그림 23]ICP 스펙트럼 15 [ 그림 24] 본교에있는 ICP-OES 로측정하는모습 15 [ 그림 25]Fe-Pheophorbidea 의 UV-Visspectrum 15 [ 그림 26]DPPH M 3ml 16 [ 그림 27]pH 에따라변화한 Chlorophyl 과 DPPH 16 [ 그림 28]pH 에따른 Chlorophyla,b 의항산화효과비교 17 [ 그림 29] 체내환경을 in vitro 에서설정하기위한조건 18 [ 그림 30] 체내조건에서의 Chlorophyla,b 의항산화효과 18 [ 그림 31]pH=2 조건에서시간에따른항산화효과비교 19 [ 그림 32] 열을가한시간에따른 Chlorophyla,b 의항산화효과 20 [ 그림 33] 열을가한시간에따른시금치 (Spinach) 의항산화효과 21 [ 그림 34] 가열온도에따른 Chlorophyla,b 의항산화효과 22 [ 그림 35]UV 를받으면형광을방출하는엽록소의모습 23 [ 그림 36] 열에의한변화를막기위해수조를설치하여고안한실험장치 23 [ 그림 37] 빛을가해준시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과 (IP) 값변화 23 [ 그림 38] 빛을가한시간에따른형광방출의변화 24 [ 그림 39] 중심금속에따른항산화효과 (IP)(%) 26 [ 그림 40]Fe-Pheophorbide 과 Chlorophyl 의항산화효과 27
1. 탐구동기및목적 세포에서대사과정의부산물인활성산소는자유라디칼로매우불안정한특성이있어노화와암을유발한다. 활성산소에의한피해와유해성은 TV 나인터넷을통해많이알려지고있으며, 많은사람들이비타민 C, 토코페롤, 클로렐라와같은다양한항산화식품을섭취하고있다. 항산화물질들을조사하는과정에서지구탄생에서부터가장긴역사를가진 Chlorophyl 의항산화작용은상당히흥미로운점이었다. 다양한항산화물질에대한선행연구들을조사한결과, 많은연구들이비타민류나, 리코펜과같은유색과일이가지고있는항산화물질에치중되어있었으며,Chlorophyl 의항산화작용에대한연구는상대적으로부족한편이었다. Chlorophyl 에대한연구들은주로녹색식물에서 Chlorophyl 을분리및녹색식물농축액에 ph 나온도를변화시켜 Chlorophyl 과유도체들의함량이나 Chlorophyl 의구조변화를조사하고있었다 (Erge etal.,2008;turkmen etal., 2005;Feruzzietal.,2001).Chlorophyl 의항산화작용에대한연구는 카로틴블리칭 ( carotenebleaching) 방법을이용하여 ph 에따른항산화효과의변화나 Chlorophyl 의중심금속을구리이온 (Cu ) 으로치환한화합물을합성하고이에대한항산화효과를조사하였다 (Lanfer-Marquezetal.,2005; 이경애,2005). 하지만, 카로틴블리칭방법은 Chlorophyl-b 의 UV 흡수피크와의간섭과측정에사용된리놀산에의해 Chlorophyl 의항산화활성이줄어드는단점이있다 (Usuke, 1984). 이에항산화효과측정의안정성과편리성으로널리알려진 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 방법으로 Chlorophyl a,b 의항산화효과를조사하고자한다. 최근에는클로렐라와같은 Chlorophyl 이함유된항산화식품이많이홍보되는추세이나, 위와소장에서의소화과정에서 Chlorophyl 과유도체의항산화효과를조사한연구는없다. 즉,Chlorophyl 의항산화효과는체내환경에서유의미하게나타나야하므로, 지용성인 Chlorophyl 의소화과정과흡수되는상황에서 Chlorophyl 의항산화효과를자세히조사할필요가있다. 이에 in vitro 상황에서 Chlorophyl 의체내소화과정및소화시간을고려하여 Chlorophyl 의항산화효과를조사하고자한다. 분자적인관점에서 Chlorophyl 의항산화효과에는포르피린구조와중심금속의성질이영향을준다고보고되었다 (Endoetal.,2005).Chlorophyl 의구조변화에영향을주는열과온도와같은변인들을조절하여 Chlorophyl 의항산화효과를측정하고, 최적의항산화작용을가지는시점이나조건을탐색하고자한다. 이와더불어진화의과정을고려하여포르피린의중심에철이온 (Fe ) 이치환된화합물을합성하고, 기존에보고된포르피린의중심에다른금속이온이치환된화합물들의항산화효과를비교하였다. 즉,Chlorophyl 의항산화효과에영향을주는요인을탐색하 - 1 -
고최적의조건을찾는다면,Chlorophyl 이함유된항산화식품제조에있어서유용 한정보를제공할수있을것이다. 2. 탐구내용및수행과정 가. 탐구내용 1)pH 및체내환경에따른 Chlorophyl 의항산화효과를측정하고비교한다. 2) 열처리시간과온도에따른 Chlorophyl 의항산화효과를측정하고비교한다. 3) 빛을가해준시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과와형광방출을측정하고관련성을파악한다. 4)Chlorophyl 의중심에철이온 (Fe 2+ ) 이치환된화합물을합성하며중심금속의종류에따른 Chlorophyl 의항산화효과를비교한다. 그림 1. 탐구과정을나타낸 Flow Chart 나. 탐구수행과정 이번연구는선행연구및관련이론조사, 연구아이디어탐색, 분석및측정방 법교육, 실험수행, 실험결과해석세미나의과정을거쳐진행하였다. 선행연구 - 2 -
및관련이론조사과정에서는 Chlorophyl 과 Chlorophyl 의유도체에관한전반적인내용 (İnanç,2011) 을학습하였고 Chlorophyl 과다른항산화물질들의항산화메커니즘 (Peron and Brumaghim,2009;Siesand Stahl,1995) 에대해서알아보면서어떠한요인들이항산화효과에영향을주는지에대해서알아보았다. 또한열을가한후 Chlorophyl 의변화 (Turkmenetal.,2005) 를알아보았다. 연구아이디어탐색과정에서는기존선행연구들의부족한점을보완하거나연구되지않은점을위주로이번연구의방향을설정하였다. 그래서그결과로체내조건, 열처리조건, 빛노출시간, 중심금속이라는 4가지큰연구주제를잡고진행하였다. 분석및측정교육과정에서는 DPPH 를이용한항산화효과 (IP) 의측정을위한 UV-Vis 분광기사용방법, 형광분광기사용방법,ICP-OES 측정방법, 시료전처리과정들에대해서학습하였다. 실험수행후다같이모여서실험결과를확인하며그에대한의견을주고받으면서결과를실험목표와비교하고상호토론을진행하였다. 일반적으로 UV-Vis 분광기를통해얻은 IP 의경향성을확인한후화학과생물학의이론들을적용하여결과를해석하였다. 그림 2. 탐구수행과정을나타낸 Flow Chart - 3 -
3. 선행연구및이론적고찰 가.Chlorophyl 의구조적특징과항산화효과 1)Chlorophyl 의구조및유도체의분류 Chlorophyla,b 는시금치, 상추와같은녹색야채의색을결정하는색소로나무에서부터작은관목까지다양한식물에서널리사용된다. 이러한 Chlorophyl 은중심금속이바뀌거나 R기가치환, 제거되는등다양한유도체를가지고있다. 그림 3.Chlorophyl 의일반적인형태 1) 그림 2는일반적인 Chlorophyl 의일반적인형태를표현하고있다. 그림속의 Chlorophyl 에서 R1,R2,R3 위치에붙는탄소사슬들은다양한형태로존재하도록진화되어왔다.R 기의다양성은 Chlorophyl 의유도체들이서로다른특징을갖도록한다. 예를들어 Chlorophyla 와달리메틸기를갖지않고포르밀기를갖는 Chlorophylb 는포르피린의 -결합콘쥬게이션 ( -bond conjugation) 이증가되어조금더높은파장대의빛을흡수하게된다. 이름 Chlorophyl Pheophytin Pyropheophytin 구조 특징 중심금속 Mg 2+ 와곁가지를 갖는전형적인형태 중심금속이없고포르피린과 곁가지만남은형태 Pheophytin 에탈카복실화 반응이일어난형태 1) İnanç, A. Levent. "Chlorophyll: Structural Properties, Health Benefits and Its Occurrence in Virgin Olive Oils." - 4 -
이름 Chlorophylide Pheophorbide Pyropheophorbide 구조 특징 곁가지가떨어지고포르피린과 중심금속만남은형태 곁가지와 Mg 2+ 중심금속이 사라진형태 Pheophorbide 에탈카복실화 반응이일어난형태 표 1.Chlorophyl 유도체의분류앞의표에서보았듯이다양한형태를가지는유도체들이존재하여서로다른이름으로불린다.Chlorophyl 의유도체들은함께하나로분류되더라도구조에는많은차이가있다 ( 그림 4). 그림 4.Chlorophyl 유도체사이의변화 2)Chlorophyl 의항산화효과 Chlorophyl 은조혈작용과해독작용등과같은각종이로운효과를많이제공하는데, 이중가장대표적인기능은바로항산화효과이다.Chlorophyl 은체내에흡수되면활성산소및유해물질로부터세포를보호하며, 동시에세포의노화를방지하는주요기능을하기때문에최근새롭게항산화물질로주목받고있다. Chlorophyl 에관한사람들의관심이높아짐에따라스피루리나, 클로렐라와같은 Chlorophyl 을함유한각종건강기능식품들의인기가높아졌다. Chlorohpyl 과그유도체는 ROS(Reactive Oxygen Species) 에의한돌연변이를포착및억제하는효과가있다고다수에의해보고되었다 (Feruzzietal.,2002; Fahey etal.,2005). 그리고각각사람들과쥐에게엽록소가포함된클로렐라를섭취시킨결과, 혈장내알파-토코페롤수준과적혈구의항산화효소인카탈라아제,SOD(SuperOxideDismutase) 의활성이섭취전과비교하여다소증가함을보고하였다. 이는곧엽록소의섭취는직접적인항산화작용뿐만이아니라항산화 - 5 -
효소의활성을촉진하는효과도제공한다는것을알수있다 ( 식품의약품안전청 - 용역연구사업.,2005;Lee.,2003). 3)Chlorophyl 의항산화메커니즘 Chlorophyl 의항산화메커니즘에대해서알아보기위해서 Chlorophyl 과공통점을가지는항산화물질들의메커니즘에대해서알아보았다. 먼저토코페롤의경우컨쥬게이트된방향족고리를가지고있는것이 Chlorophyl 과유사하다. 토코페롤은방향족고리에붙어있는산소원자의 오비탈과라디칼이상호작용하여서항산화작용이이루어지게된다 (SiesandStahl,1995).Chlorophyl 의경우, 포르피린고리에있는질소원자가유사한작용을할것이라고생각된다. 또한역시항산화효과가크다고알려진폴리페놀의경우그항산화메커니즘이페놀의히드록시기가철이온 (Fe ) 과배위를하여서전자를주고받음으로서산화환원반응이일어난다 (Perron and Brumaghim,2009).Chlorophyl 과비교하였을때중심에배위하고있는마그네슘이온 (Mg ) 이철이온 (Fe ) 과유사하게전자를외부물질로부터받아주는역할을할수있을것이라고생각된다 ( 그림 5). 그림 5. 폴리페놀의항산화메커니즘 2) Chlorophyl 과 Pheophytin 의항산화작용은주로 Chlorophyl 의포르피린고리에기인하고 DPPH 와같은자유라디칼을환원시키며컨쥬게이트시스템 (conjugated system) 의 -양이온이 Chlorophyl 이산화된경우에생성된다는것이알려져있다 (Endoetal.,1984). 그래서과산화라디칼과반응하는경우에는그림 6과같은메커니즘으로반응한다고하였다. ROO CHL ROO CHL 2) Perron, Nathan R., and Julia L. Brumaghim. "A review of the antioxidant mechanisms of polyphenol compounds related to iron binding." Cell biochemistry and biophysics 53.2 (2009): 75-100. - 6 -
그림 6.Chlorophyl 의항산화메커니즘 나.Chlorophyl 의구조와중심금속의변화 Chlorophyl 은다양한요인에의해구조와중심금속이변하게된다. 선행연구에따르면 Chlorophyl 에산을가할경우중심금속이해리되어 Pheophytin 이형성된다고한다 ( 그림 7). 이러한 Chlorophyl 유도체의전환은분자내전자분포의변화를유도하여항산화효과에영향을줄수있다.Chlorophyl 유도체가운데 Pheophytin 의항산화효과는 -carotene 블리칭방법에의해측정되었으며 Pheophytin 이 Chlorophyl 보다높은항산화효과를가진다는것이보고되었다. 3) 그림 7.Chlorophyl 에서 Pheophytin 으로의전환 Chlorophyl 이염기와반응을하게되면곁가지와포르피린고리의연결하는에스테르결합이가수분해되어마그네슘포르피린화합물인 Chlorophylin 으로변형된다. 한편,Chlorophylin 에물과구리이온을첨가하게되면, 가수분해를통해마그네슘과구리가치환되어수용성염이형성된다. 그리고 Chlorophyl 에열을가하게되면 Turkmen(2005) 4) 의연구에서밝혀진바 3) Lanfer-Marquez, Ursula M., Rosa Barros, and Patricia Sinnecker. "Antioxidant activity of Chlorophylls and their derivatives." Food Research International 38.8 (2005): 885-891. 4) Turkmen, Nihal, et al. "Effects of cooking methods on Chlorophylls, pheophytins and colour of selected green vegetables." International journal of food science & technology 41.3 (2005): 281-288. - 7 -
와같이 Chlorophyl 을 80 에서방치했을때, 중심금속인마그네슘이떨어져나 가게된다. 이에따라 Chlorophyl 에산을처리했을때와마찬가지로 Pheophytin 이형성된다. Spinach Chlorophyla Chlorophylb Pheophytin a Pheophytin b Fresh 24.39±2.00 14.70±0.79 1.64±0.27 0.39±0.17 Boiling 15.51±0.09 10.26±0.24 8.10±0.27 5.27±1.59 Steaming 15.44±0.27 9.94±0.01 7.83±0.21 3.09±0.02 Microwaving 15.47±0.15 9.27±0.12 4.56±0.85 1.73±0.12 표 2. 열에의한시금치속 Chlorophyl 유도체들의조성변화 (mg/l) 3) 다.Chlorophyl 의항산화효과의측정 1)β-carotene 블리칭법 -carotene 블리칭법은물 / 리놀산에멀젼에서 -carotene 의블리칭지연정도를측정하여서항산화효과를측정하는방법이다. -carotene 은항산화제가없는경우리놀산자유라디칼에의해서공격을받아고유의오렌지색이사라진다. 항산화효과측정을위해서 -carotene 용액, 리놀산, 계면활성제에분석물을첨가한다음진공에서건조시킨다. 그리고산소수를첨가한후흔들어주어서리포솜 (l 항산화효과 (IP)osome) 을형성하고 50 에서열을주어 2시간동안산화를시키며 10 분마다 UV-Vis 분광기를사용하여서 470nm 에서흡광도를확인하며블리칭정도를확인한다 (Velioglu etal.,1998). 블리칭이적게될수록첨가한물질의항산화작용이크다고할수있다. -carotene 블리칭법에서에멀젼에사용하는리놀산은불포화지방산으로서 Chlorophyl 의분해를촉진하기때문에 Chlorophyl 의항산화효과을감소시키며 Chlorophylb 는아세톤용액에서 462nm 에서피크를나타내기때문에 447,474nm 에서피크를가지는 -carotene 과간섭을유발한다 (Lanfer-Marquezetal.,2005). 이러한사실들을종합하면, 선행논문에서사용한 -carotene 블리칭법은 Chlorophyl 의항산화성을측정하기에제한적인방법이라고할수있다. 2)DPPH 법 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,C H N O,M/W=394.32g/mol) 는안정한자유라디칼로서 515nm 파장에서특징적인흡수피크를나타내는보라색화합물이다.DPPH 는 ROS 와같은라디칼과반응하여히드라진으로환원된다. - 8 -
OPhROO 2 N Ph N N NO 2 그림 8.DPPH 의라디칼반응그림 9.DPPH 의 UV-Vis 스펙트럼 O 2 N 항산화활성이있는물질과만나면전자를결합에참여시키며라디칼이소멸된 다. 라디칼이소멸될때보라색에서노란색으로색깔이변해 UV-Vis 흡광도측정 을통해항산화능력을측정할수있다. 항산화능력은아래식과같은 DPPH 라 디칼의저해백분율 ( 항산화효과 (IP) 을사용하여서비교할수있다 (Lanfer-Marquezetal.,2005). 항산화효과 (IP) 값이클수록시료가더많은라디 칼과반응한다는뜻이므로항산화정도가더좋다고할수있다. Abst min Abst min IP Abst min 라.Chlorophyl 의소화과정과세포속에서의역할 1) 위와소장에서 Chlorophyl 의소화 소화계에는구강, 식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 이자, 담낭등이존재한다. 먼저, 섭취된음식물은식도를통해위로내려가게된다. 섭취된음식물은위의 ph 를변화시켜염산과펩신을분비한다. 펩신은티로신, 페닐알라닌, 트립토판과비극성아미노산사이의특징적인결합을분해하므로 Chlorophyl 에는큰영향을미치지못한다. 하지만위의낮은 ph 와오랜머무름시간은 Chlorophyl 이 Pheophytin 으로변화하도록유도할수있다. 위를거쳐장으로내려간 Chlorophyl 과 Pheophytin 은이자액과담즙, 장액과함께섞이게된다. 담즙속에는간에서배설을위해흡수한중금속들이포함되어있다. 십이지장을통과하는 Chlorophyl 유도체는담즙속에존재하는금속들과반응하여 Zn-Pheophytin, Fe-Pheophytin 등을형성하게된다. 십이지장을거쳐본격적인소화가진행되는공장, 회장으로간 Chlorophyl,Pheophytin,Metal-Pheophytin 은담즙속의지질에의해미셸을형성한후 ATP 를사용하는엔도시토시스 (endocytosis) 를통해체내로흡수된다. 2) 세포내 ROS 와항산화물질의반응 ( 가 ) 세포내 ROS 의형성원인과작용 세포는꾸준한세포호흡을통해포도당과같은에너지원을 ATP, 크레아틴인산 - 9 -
과같은사용가능한에너지원으로전환한다. 세포호흡에는흡입한산소가꼭필요하며그중 2% 는 ROS 로변환된다.ROS 는활성산소와활성산소에의해산화된 lipidperoxide,peroxyradical 등을포함한다.ROS 가형성되는원인은다양하며제일많이형성되는곳이세포호흡이주로일어나는미토콘드리아이다. 급격한운동에따른 ATP 의감소로미토콘드리아에서의산화적인산화가일어나지않고해당과정만진행되어산물이불안정할경우, 세포호흡억제제가몸속에들어왔을때미토콘드리아의전자그림 10. 세포호흡부산물에의한전달계가도중에멈추는경우에과산화물, 과산화물, 자유라디칼의형성 O - 2 가형성될수있다. 적절한양의 ROS 는백혈구가세균, 바이러스를식세포작용을통해섭취할때세균, 바이러스의세포벽을약화시키는이로운일을할수도있다. 하지만 ROS 는반응성이매우강해과량존재할경우노화와질병의원인이된다. ( 나 )ROS 와항산화물질의반응 ROS 에의한몸의손상을막고적절한수준을유지하기위해우리는다양한항산화물질을생산하거나섭취한다. 일반적으로섭취하는항산화물질에는비타민 C(VitC), 토코페롤 (VitE), 폴리페놀,Glutathione 등이있으며인체내에서합성되는 ROS 분해효소에는 SuperOxideDismutase,peroxidase,catalase 등이있다. VitC 는진화가많이되지않은동물에서는신장에서합성되며동물에서는간에서생성된다. 하지만영장류의경우포도당에서 VitC 를합성하는데필요한 4가지효소중마지막효소가존재하지않아체외에서섭취하여야한다. 체내에흡수된 VitC 는콜라겐합성을유도하며수용성인특징을살려자유라디칼을소거한다. VitE 는 VitC 와반대인지용성항산화제로세포막에일반적으로세포막에위치하여작용한다. 세포막을구성하는불포화지방산의산화를막아세포막의유동성저하를막아주며환원제로작용하여 ROS 를환원시킨다. 이를통해세포내에서생성된 ROS 에의한라디칼연쇄반응을막으며미토콘드리아의유비퀴논과함께항산화작용을나타낸다. Chlorophyl 의경우 VitC,E 와비슷한메커니즘을통해미토콘드리아, 체내대사과정중발생하는 ROS 를제거하여항산화작용을나타내게된다. - 10 -
4. 실험재료준비및분석장비가. 시금치에서 Chlorophyla,b 의추출및분리 이연구에서는 Holden(1965) 5) 이밝혀내고수백회인용되었으며 Lanfer-Marquez(2005) 6) 등이이용한 Chlorophyl 추출방법을따랐다.Chlorophyl 의추출단계는 1차추출액단계,2차추출액단계, 그리고 Chlorophyla 와 Chlorophylb 의분리단계와같이크게세가지과정으로나뉜다. 그림 11.Chlorophyl 의추출방법 먼저 1차추출액단계에서는, 잘게간시금치잎과석영사와 NaHCO 를함께막자사발에넣고갈아준다. 시금치가거의가루가되었을때즈음에는아세톤을붓고,Chlorophyl 을포함한각종색소들을모두녹여낸다.1 차추출액에서감압여과장치를통해이물질을걸러낸다음 1차추출액에석유에테르를첨가한다. 아세톤과각종기타색소들을제거하기위해증류수를첨가후아래의수용성층 ( 물-아세톤용액 ) 을분별깔대기를통해흘려보낸다. 이과정을 3 4회반복하면 Chlorophyl 만이석유에테르층에남아있게되는데, 이를 2차추출액이라고하였다. 마지막으로,Chlorophyl 만이남겨져있는석유에테르층에메탄올을투입하여메탄올과의용해도가더욱높은 Chlorophylb 는메탄올층에용해되어분리되 5) Holden, Margaret. "Chlorophyll bleaching by legume seeds." Journal of the Science of Food and Agriculture 16.6 (1965): 312-325. 6) Lanfer-Marquez, Ursula M., Rosa Barros, and Patricia Sinnecker. "Antioxidant activity of Chlorophylls and their derivatives." Food research international 38.8 (2005): 885-891. - 11 -
고,Chlorophyla 는석유에테르층에남게된다. 각각의 Chlorophyla,b 를회전증발Chlorophyla,b 는아세톤 5ml 에녹여흡광도를측정한다. 측정한흡광도를바탕으로 Chlorophyla,b 의량을정량할수있다. Chlorophyll a,b 정량법 Holden(1965) 4) ( 엽록소함량의단위 :Chl mg / ml ) [chla]=0.0127a 663-0.00269A 645 [chlb]=0.0229a 645-0.00468A 663 A 663 :663nm 의흡광도,[chla]: 엽록소 a의농도 그림 12. 회전증발농축기 사용하는모습 그림 13.Chlorophyl 을 추출하는모습 그림 14. 감압증류기를 사용해 Chlorophyl 을 거르는모습 나. 항산화효과와형광방출량의측정 1)UV-Vis 분광기 UV-Visspectrometer 는자외선, 가시광선그리고근적외선영역에서보이는물체의빛방출에대한흡광도를측정하는장치로써물질의분광학적특성을분석하는장치이다. 이는각종물질의변화를흡광도를통해측정하고예측할수있어 Chlorophyl 과각종포르피린고리를가지고있는유도체들의특징을가장잘보여줄수있다. 특히각종조건 ( 산과염기, 빛, 열등 ) 에서의 Chlorophyl 의변화를측정할때, 각종 Chlorophyl 유도체의전자분포, 중심금속의변화에인한흡광도 peak 의변화와이동을가장쉽게측정할수있다. 그림 15. 본교의 UV-Vis(Cary-60, Agilent) 그림 16. 본교의 UV-Vis 를이용해 측정하는모습 - 12 -
2) 형광분광기 (FluorescenceSpectrophotometer) 형광분광법은전자기분광법의일종으로서시료의형광을분석하는것이다. 가시광선이나자외선의빛을시료에쏘아분자의전자를들뜨게하여바닥상태로떨어질때빛을방출하도록만들어에너지준위의변화등을측정할수있다. 이과정은 Jablonskidiagram 으로쉽게알수있다. 형광분광법에서방출되는빛의다양한진동수를분석함으로서그들의상대적인세기를이용하여에너지준위가결정될수있다. Chlorophyl 의경우 Chlorophyl 을들뜨게하는 400nm 의파장을시료에가해주었을때다양한파장의형광이시료에서방출되는것을확인할수있다. 이것을방출스펙트럼이라고한다. 여기스펙트럼은반대로방출하는빛이일정한파장일때여기상태도다양한파장에서측정된다. 두스펙트럼을비교하여서정보를얻을수있그림 17.Jablonskidiagram 7) 다. 그림 18. 본교의 Fluorescence Spectrophotometer(LS55-PerkinElmer) 그림 19. 결과를해석하는모습 다.Chlorophyl 의중심금속을철로치환한화합물의합성 마그네슘보다더전자를더풍부하게가진구리이온 (Cu ) 이배위된 Chlorophyl 유도체는 Chlorophyl 보다더큰항산화활성을가진다는것이알려져있다 (Lanfer-Marquez etal.,2005). 전자가더많은구리이온 (Cu ) 은마그네슘이온 (Mg ) 보다포르피린구조가쉽게항산화활성을가질수있도록도와주는역할을하는것으로생각된다. Chlorophyl 을염기조건에서금속이온 (Cu 2+,Zn 2+ ) 을첨가하여반응시키면중심 7) http://people.whitman.edu/ dunnivfm/faasicpms_ebook/ch1/1_2_2.html - 13 -
금속이치환된다는사실 (İnanç,2011) 과변화된구조가항산화효과에영향을미친다는사실 (Lanfer-Marquezetal.,2005) 은잘알려져있다. 이번연구에서는선행연구에서시도되지않았던철이온 (Fe 2+ ) 이치환된 Chlorophyl 유도체 (Fe-Pheophorbide) 를합성하고자실험을진행하였다. 먼저 1M NaOH 수용액 10mL 에 FeCl 0.02g 을과량으로넣은다음 Chlorophyl a와 b를각각추가하여 2시간동안마그네틱바를이용하여교반시키면서반응시켰다. 그리고 2000rpm 조건에서 10 분동안원심분리기를작동시켜서반응의부산물로생성된물질들을분리하였다. 그리고 ICP-OES 를측정할때시료내부에유기물이존재하면문제가되기때문에 ICP 분석을위해서용매들을회전감압증류기를이용하여서모두증발시키고디에틸에테르와증류수를순서대로첨가하여서수용액층을추출하였다. 추출한수용액층을 50 배희석한다음본교에있는 ICP-OES(Agilent 사,700seriesICP-OES) 를사용하여서분석하였다. 그림 20. 동일하게합성한다양한금속치환화합물그림 21. 원심분리한모습그림 22. 본교의원심분리기 ICP-OES 는 ICP 와분광기, 두가지구조로나눌수있다.ICP 토치는토치에 의해서아르곤의온도가높아지면아르곤기체는토치를둘러싸고있는방전관에 의해서이온화가된다. 그결과로안정한고온의 7000K 아르곤플라즈마가이과 정에서형성된다. 연동펌프는시료를플라즈마에직접안개와같은형태로분무한다. 시료는분무 되고난즉시전자와이온들과충돌하며전하를띄게된다. 다양한분자들이각각 의원자들로분해되며각자의고유한파장을방출하면분광기에서는빛을다양한 파장으로분리시켜각각의세기가광증폭관에서측정한다. 각스펙트럼의세기는 먼저측정되었던농도를알고있는표준물질의세기와비교하여농도가검정선을 따라서계산된다. ICP-OES 는시료에포함되어있는원소를알아내는정성적인분석과원소의양 을알아내는정량적인분석이모두가능한장비이며이연구에서사용된기기는 ppt(partspertrilion) 단위까지측정할수있는매우정밀한장비이다. 여러가지파장대를통해서분석한마그네슘의농도는 0.004903mg/L 였다. - 14 -
그림 23.ICP 스펙트럼 279.6nm 280.3nm 285.2nm standard1 0.249500 0.249500 0.249500 standard2 0.499000 0.499000 0.499000 standard3 0.998000 0.998000 0.998000 sample 0.005176 0.004956 0.004578 표 3.ICP 마그네슘농도측정 결과 (mg/l) 그림 24. 본교에있는 ICP-OES 로 측정하는모습 또한 UV-Vis 스펙트럼을확인해본결과 420nm 에서독특한흡수피크를나타내 면서 Chlorophyl 이나 Pheophytin 과는구별되는피크를가졌다. 이러한결과들을 통해서 Fe-Pheophorbide 의합성이성공했다고볼수있다. 그림 25.Fe-Pheophorbidea 의 UV-Visspectrum - 15 -
5. 탐구방법및탐구결과 가. 과제 1:pH 및체내환경에서 Chlorophyl 의항산화효과 1)pH 에따른 Chlorophyl 의항산화효과측정 ( 가 ) 탐구목표 Chlorophyl 에산을가해주면 Chlorophyla 가 pheophytina 와 pheophorbidea 이된다는사실은잘알려져있다 (İnanç,2011). 어느정도문제점을내포한 -카로틴블리칭법을개선하기위해다양한 ph 에서 DPPH 법으로 Chlorophyla,b 의항산화효과를측정하였다. ( 나 ) 탐구과정 (1)pH =2,4,7,11 인용액을만들고 ph 미터를이용하여서 ph 를확인한다. (2) 바이알에고정된 ph 를가진용액을 5mL 넣고 Chlorophyla,b 용액 5mL 를각각넣은다음 2시간동안잘교반시킨다. (3)DPPH M를 3mL 에바이알에담은다음합쳐진용액 150 L 를넣고 0 분.30 분일때 UV-Vis 을촬영하여서항산화효과를측정한다. ( 다 ) 탐구결과 그림 26.DPPH 6x10-5 M 3ml 그림 27.pH 에따라변화한 Chlorophyl 과 DPPH 항산화효과 (IP) 를측정한결과 Chlorophyla,b 모두 ph=2 인산성조건에서제 일좋은항산화효과를보였다. 또한 ph 가증가할때항산화효과또한감소하는 경향성을보였다. - 16 -
그림 28.pH 에따른 Chlorophyla,b 의항산화효과비교 먼저 ph=2 에서 Chlorophyla,b 의항산화효과가가장좋은이유는산성조건에서 Chlorophyl 의중심금속인마그네슘이해리되어서더좋은항산화효과를가지는 Pheophytin 으로변화하기때문이다. 또한염기성인 ph=11 조건에서항산화효과가 ph=7 인경우보다증가하는이유는염기에의해서 Chlorophyl 의곁가지에스터가가수분해되어카복시산을형성하여곁가지에의한입체적장애가적어지기때문이라고해석하였다. 2) 체내환경 (invitro) 에서 Chlorophyl 의항산화효과측정 ( 가 ) 탐구목표사람이 Chlorophyl 을음식물의형태로섭취하게되면위를통과하면서마그네슘이온 (Mg ) 가해리하여서 Pheophytin 을형성하게된다. 또한소장을거치면서다양한 ph 조건에서반응하면서구조가변화하게된다. 사람이 Chlorophyl 을섭취하여생성된 Chlorophyl 유도체들의항산화효과와 Chlorophyl 의항산화효과에는어떠한차이가있을지알아보았다. ( 나 ) 탐구과정 (1)pH=2 수용액 10mL 에 Chlorophyla,b 용액 10mL 를첨가하여 2시간동안 200 rpm 으로흔들어주었다. (2)(1) 에서제조한용액 2mL 와아무처리하지않은 Chlorophyl 용액 2mL 를각각 DPPH 용액 1mL 와각각반응시켜항산화효과를측정하였다. (3)(1) 에서제조한용액에 NaHCO 를넣어 ph 를 9로맞추고다시 1시간동안흔 - 17 -
들어주었다. (4) 아무처리하지않은 Chlorophyl 용액을 NaHCO 를사용하여 (3) 과동일한조건으로만들어서 1시간동안흔들어주었다. (5)(3),(4) 의용액을 (2) 에서와동일하게 DPPH 용액을이용하여항산화효과를측정한다. 그림 29. 체내환경을 in vitro 에서설정하기위한조건 ( 다 ) 탐구결과위에서항산화효과가가장좋은것을확인할수있는데이는위에서 Pheophytin 이생성되며산성에서 Chlorophyl 과 Pheophytin 의항산화효과가가장크다는것을알수있다. 소장조건에서는위조건에서생성된 Pheophytin 이동일한조건에서 Chlorophyl 보다항산화효과가더크다는것을확인할수있었다. 그림 30. 체내조건에서의 Chlorophyla,b 의항산화효과 - 18 -
3) 위조건에서시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과측정 ( 가 ) 탐구목표 가-2) 를통해서위조건에서항산화효과가가장좋다는것을알수있었다. 그래서위에서머무른시간에따라서 Chlorophyl 의항산화효과가어떻게변화하는지를확인하고자하였다. ( 나 ) 탐구과정 (1)pH 2를갖는 HCl 용액을 ph 미터를이용해만든다. (2)HCl 용액을 2mL 씩바이알에넣는다. (3)Chlorophyla,b 를 2mL 씩 (2) 에서제작한바이알에각각넣고자석젓개를이용해교반시킨다. (4)Chlorophyla,b 를넣은지 30 분,60 분,90 분,120 분이지나면 150 L 씩바이알에넣은후 DPPH 용액 3mL 를넣는다. (5) 0분,30 분이지나면각바이알에담긴물질을석영셀 (cel) 로옮겨담아 UV-Vis 를활용해 515nm 에서의흡광도를측정한다. ( 다 ) 탐구결과위조건에서 Chlorophyl 이머무른시간이증가할수록항산화효과도증가하는것을확인할수있었다. 위조건은 ph=2 의강한산성조건이기때문에머무른시간이증가할수록 Chlorophyl 이더좋은항산화효과를가지는 Pheophytin 으로변화하는양이증가하기때문이다. 그림 31.pH=2 조건에서시간에따른항산화효과비교 나. 과제 2: 열과온도에따른 Chlorophyl 의항산화효과 1) 열을처리한 Chlorophyl 과시금치의항산화효과측정 - 19 -
( 가 ) 탐구목표 Chlorophyl 은여러개의탄소고리들로이루어진포르피린구조를가지는화합물로다양한 R기를갖는다.Chlorophyl 이열을받으면 Pheophytin 과같은유도체로구조가변화한다는것이보고되었다 (Turkmen,2005). 또한, 시금치에열을가할경우열충격단백질이 Chlorophyl 을포함한광계시스템을보호한다는것이보고되었다 (Heckathorn,1998). 따라서우리는시금치와 Chlorophyl 에각각열을직접가했을때항산화효과에차이가있을거라고판단하여적합한열처리시점에관해탐구하였다 ( 나 ) 탐구방법 (1) 시금치를데치는시간을변화시켜추출한 Chlorophyl 의항산화효과 1 시금치잎 10g 을 2L 비커 6개에각각넣는다. 2 80 C 의물로 0,3,5,10,15,20 분간데친다. 3 석영사 NaHCO 3 를막자사발에넣고시금치와함께간다. 4 녹색물이나올정도로갈린시금치를아세톤 50ml 로두번씻는다. 5 막자사발속아세톤혼합물을감압증류장치를통해걸러낸다. 6 아세톤혼합물 150 L 와 DPPH 3ml 를섞은후항산화효과 (IP) 를측정한다. (2)Chlorophyl 에직접열을가한시간에따른항산화효과 1 Chlorophyla,b5 M 을각각 2.5ml 씩바이알에넣는다. 2 80 의물에서 0,3,5,10,15,20 분간가열한다. 3 가열한 Chlorophyl 용액을상온에서식힌다. 4 Chlorophyla,b2.5mL 와 DPPH 1ml 를섞은후항산화효과 (IP) 를측정한다. ( 다 ) 탐구결과 시금치에열을가한경우 3 분까지는항산화효과가증가하였으나열을가한 시간이증가하며항산화효과가감소하는경향성을보였다. 또한,Chlorophyl 에 그림 32. 열을가한시간에따른시금치 (Spinach) 의항산화효과 - 20 -
그림 33. 열을가한시간에따른 Chlorophyla,b 의항산화효과 직접열을가한경우항산화효과가감소하는경향성을알수있었다. 열을가할경우 Chlorophyl 이 Pheophytin 과같은유도체로변화하여항산화효과가증가한다. 하지만, 강한열이지속적으로가해질경우 Chlorophyl 보다항산화효과가낮은 Chlorophyl 유도체들이형성되거나결합이해리되어항산화효과가오히려감소할수있다. 2) 온도에따른 Chlorophyl 의항산화효과측정 ( 가 ) 탐구목표열을가할경우시간에따라 Chlorophyl 의항산화효과가변화하는것을알수있었다. 따라서시간을동일하게설정하고열의세기를변화시켜온도에따른 Chlorophyl 의항산화효과를측정하였다. ( 나 ) 탐구방법 (1)5 M Chlorophyla,b 를 2.5ml 씩바이알에넣는다. (2)40,60,80 에서 Chlorophyla,b 를 10 분간가열한다. (3) 가열한 Chlorophyla,b 를 DPPH 1ml 와섞은후항산화효과 (IP) 를측정한다. ( 다 ) 탐구결과 Chlorophyl 을서로다른온도에서 10 분간가열한결과전체적으로증가하는경향을볼수있었다. 높은온도에서더많은양의열을받아큰항산화효과를가지는 Pheophytin 으로 Chlorophyl 이변화하였다는것을알수있다.Chlorophyla 의경우 Chlorophylb 와는다르게 80 에서항산화효과가감소하는데, 이는 Chlorophyla 가 b보다내열성이약해구조가잘변형되어 Pheophytin 이외의 - 21 -
Chlorophyl 유도체가형성될수있기때문이다. 그림 34. 가열온도에따른 Chlorophyla,b 의항산화효과 다. 과제 3: 빛노출에따른 Chlorophyl 의항산화효과 1) 빛노출시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과 ( 가 ) 탐구목표 Chlorophyl 은 식물의 광합성에서 매우 중요한 광계의 구성물질 중 하나이다. Chlorophyl 이빛을받게되면들뜬상태의고에너지전자구름이형성된다. 들뜬상 태의 Chlorophyl 은불안정하여기존의 Chlorophyl 보다더좋은항산화물질로작 용할수있다. 따라서빛을받은시간과 Chlorophyl 의항산화효과에는영향이있 을것이라생각했다. ( 나 ) 탐구과정 (1)5 M Chlorophyla 용액 2.5mL 와자석젓개를각각의바이알에넣는다. (2) 교반기위에물이찬수조를놓고, 박스를통해외부빛을차단한후알맞은조도의백열전구로수조를비춘다. (3)(1) 의 Chlorophyl 용액이있는바이알을파라필름으로감싼후 (2) 실험장치의수조안에담근다. (4) 동일한양의빛을받도록교반된 Chlorophyl 용액을각각 20 분,40 분,60 분,80 분,100 분,120 분,140 분후에꺼내어 DPPH 1ml 섞은후항산화효과 (IP) 를측정한다. - 22 -
그림 35.UV 를받으면형광을 방출하는 엽록소의모습 그림 36. 열에의한변화를막기위해 수조를설치하여고안한실험장치 ( 다 ) 탐구결과빛을가해준시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과 (IP) 를측정해보았다. 처음 60 분간 Chlorophyl 의항산화효과 (IP) 에는큰차이가없었다. 하지만, 시간이지날수록항산화효과 (IP) 가급격하게감소하는것을확인할수있었다. 암실속에있던 Chlorophyl 에빛을가해주면항산화효과 (IP) 는전체적으로감소하는경향을보인다. 하지만계속해서빛을받게되면 Chlorophyl 의분해가야기되어항산화효과가줄어든다고해석할수있다. 그림 36. 빛을가해준시간에따른 Chlorophyl 의항산화효과 (IP) 값변화 2) 빛에따른 Chlorophyl 의형광방출량측정 ( 가 ) 탐구목표식물로부터분리된 Chlorophyl 에빛을가하게되면전자가들떠에너지준위가높아지게된다. 들뜬 Chlorophyl 의전자들은에너지를서서히형광으로방출하여바닥상태로향한다. 이때, 광활성화된 Chlorophyl 이방출하는들뜬상태의전자 - 23 -
가많을수록형광의세기가세다는것을알수있다. 따라서 Chlorophyl 에가해 진빛의양과 Chlorophyl 이방출하는형광의세기에대한상관관계를찾고자하 였다. ( 나 ) 탐구과정 (1)6.7 M Chlorophyl 용액 3mL 를각각 20 분,40 분,60 분,80 분,100 분,120 분짜리유리바이알에넣고, 각각의바이알안에자석젓개를넣는다. (2) 교반기위에물이찬수조를놓고, 대부분의빛을차단한후알맞은조도의백열전구로수조를비춘다. (3)(1) 의 Chlorophyl 용액이있는유리바이알을파라필름으로감싼후백열전구로부터복사되는열을차단하기위해이를 (2) 의실험장치의수조안에담근다. (4) 동일한양의빛을받도록저어진 Chlorophyl 용액을각각 20 분,40 분,60 분,80 분,100 분,120 분후에꺼내어형광분광기를이용해형광방출량을측정한다. ( 다 ) 탐구결과시간에따른형광방출량을측정한결과빛을가한지 40 분정도되는시간동안높은형광방출량을보인다. 하지만계속해서빛을받게되면형광방출량이점점줄어들게된다. 이와같이빛에대한노출시간이길수록들뜬상태의 Chlorophyl 의수는증가하나들뜬상태의구조는쉽게파괴될수있어형광방출량이감소하게된다. 그림 38. 빛을가한시간에따른형광방출의변화 - 24 -
라. 과제 4:Chlorophyl 의중심금속치환에따른항산화효과 1) 포르피린구조에다양한금속들이치환된화합물의항산화효과비 교 ( 가 ) 탐구목표 구리, 아연과같은금속들로치환되어있는 Chlorophyl 유도체화합물을합성하 고 Chlorophyl 과항산화효과를비교하고자탐구를진행하였다. ( 나 ) 탐구방법 (1)Chlorophyla,b 5 M 용액 5mL 이들어있는바이알에 1M NaOH 수용액 5mL 를넣어준다. (2)FeCl,CuCl,ZnCl 0.01g 을각각의바이알에첨가하고 2시간동안교반시켜준다. (3) 반응물을코니컬튜브에담아 2000rpm 에서 5분동안원심분리시킨후상층부만마이크로피펫을이용하여서분리하였다. (4) 분리한용액 2mL 에 DPPH 1mL 를넣어서항산화효과를측정한다. ( 다 ) 탐구결과철이온 (Fe ) 이중심금속인 Chlorophyl 유도체 (Fe-Pheophorbide) 의항산화효과가가장좋은것으로나타났다. 그리고그다음으로아연이온 (Zn ), 구리이온 (Cu ) 순으로항산화효과가작아졌다. 철의경우 d오비탈에전자를 6개가지는전자가풍부한금속이기때문에포르피린고리에전자를주는능력이뛰어나서항산화반응의결과로생성되는 Chlorophyl 양이온을잘안정화시키기때문에항산화효과가크다고보았다. 아연이온 (Zn ) 의경우 d오비탈에전자가모두차있기때문에전자는풍부하지만금속이온이매우안정하여서전자를포르피린고리에주는능력이철이온 (Fe ) 보다떨어진다. 구리이온 (Cu ) 은 d오비탈에전자가 9개차있어서전자를포르피린고리에주는능력이가장떨어져서항산화효과가낮다고보았다. - 25 -
그림 39. 중심금속에따른항산화효과 (IP)(%) 2) 체내조건에서 Chlorophyl 의중심금속을철로치환한화합물의 항산화효과비교 ( 가 ) 탐구목표 Chlorophyl 의중심금속이철로치환된 Fe-Pheophorbide 의항산화효과를체내 조건에서측정하였다. 또한이결과를 Chlorophyl 과비교하였다. ( 나 ) 탐구과정 (1) 미리합성한 Fe-Pheophorbide 용액 2mL 시료 3개에체내조건을맞추기위해서 ph=2,ph=9 수용액 2mL 를첨가하고나머지한시료에는식염수 2mL 를첨가한다. (2)2 시간동안교반시키며반응시킨다. (3) 시료용액 2mL 에 DPPH 용액 1mL 를넣어시료들의항산화효과를측정한다. ( 다 ) 탐구결과 Fe-Pheophorbide 화합물의항산화 효과가 전반적으로 Chlorophyl 보다 확연히 좋으며다양한체내조건에서도큰차이가없다는것을다음과같이알수있다. 먼저 Fe-Pheophorbide 의항산화효과의변화가크지않은이유는 Chlorophyl 과 는다르게중심금속이전자가풍부한철이기때문에포르피린고리와강하게결 - 26 -
합을하여서다양한 ph 에서도중심금속이해리하지않기때문이다. 또한 Chlorophyl 보다항산화효과가더큰이유는철이포르피린고리에전자를잘줄수있기때문에포르피린고리에생성되는 -양이온을안정화시킬수있기때문이라고생각된다. 그림 40.Fe-Pheophorbide 과 Chlorophyl 의항산화효과 - 27 -
6. 결론및제언 가. 결론 DPPH 법으로다양한 ph 에서 Chlorophyl 의항산화효과를측정한결과 ph 가낮을수록높은항산화효과를가진다는것을알수있었다. 산에서 Chlorophyl 은중심금속마그네슘이온 (Mg 2+ ) 이해리되어 Pheophytin 이생성된다. 이를통해 Pheophytin 이 Chlorophyl 보다높은항산화효과를가진다는것을알수있었다. 또한, 체내조건의경우에도강한산성을띄는위조건에서항산화효과가가장크게나타났으며위조건에서머무르는시간이길수록항산화효과도증가하였다. 약염기를띄는소장조건에서는위를거치며 Pheophytin 으로변화된경우가변화되지않은 Chlorophyl 보다더큰항산화효과를가졌다. 시금치와 Chlorophyl 를직접가열할때가열한시간에따라변화하는항산화효과를조사하였다. 시금치의경우측정결과 80 의온도에서 3분 5분동안가열할때에가장높은항산화효과를가졌다. 그이유로는식물엽록체속의열충격단백질이광계의보조색소들의탄소-탄소결합해리를막아주어많은양의 Pheophytin 이형성된것으로예상한다. 반면에시금치를 10 20 분의긴시간동안가열하게되면항산화효과가낮아지는경향성을보였다.Chlorophyl 을대신하여변성될수있는단백질, 지질들이긴시간동안모두변성되어탄소-탄소결합해리가 Pheophytin 생성속도에비해빠르게일어난것으로예상된다.Chlorophyl 의경우시금치와는달리대신변성될수있는단백질들이존재하지않아항산화효과가증가하지않고계속감소하는경향성을볼수있었다. 또한 Chlorophyl 의가열온도에따라항산화효과를비교하였다. 그결과높은온도에서가열할수록큰항산화효과를보였다.Chlorophyla 의경우 80 에서항산화효과가감소하였다. Chlorophyl 에빛을가한시간을변화하여이에따른항산화효과의변화를조사하였다. 빛을가한지 60 분간항산화효과 (IP) 와형광방출량은소폭진동하나 60 분이후전체적으로감소하는경향성을보이게된다. 따라서형광의세기와 Chlorophyl 의항산화효과는상관관계를가진다고생각할수있다. 전체적으로보았을때형광방출량과항산화효과의경향성이감소하므로빛에대한노출을최대한줄일때높은항산화효과를얻을수있을것이다. 선행연구에서시도하지않았던 Fe-Pheophorbide 의합성에성공하였고 Zn-Pheophorbide,Cu-Pheophorbide 를합성하여이들의항산화효과를비교하였다. 구리 (Cu ), 아연 (Zn ), 철 (Fe ) 순으로중심금속이치환된 Chlorophyl 유도체들의항산화효과가좋았다. 또한철 (Fe ) 로중심금속이치환된 Chlorophyl 유도체의경우 Chlorophyl 보다항산화효과가더좋았으며다양한체내조건에서도항산화효과가높은수치를유지하였다. - 28 -
나. 제언및연구의제한점 Chlorophyl 의항산화효과측정결과위조건에서항산화효과가가장좋았으며머무르는시간이길수록항산화효과도증가하였다. 그러므로 Chlorophyl 의형태로섭취할때에는공복에섭취하여야 Chlorophyl 이충분히반응하여항산화효과가더높은 Chlorophyl 유도체가형성될수있다. 80 이상의온도에서 3 5분이상시금치를데치게되면오히려 Chlorophyl 의항산화효과가감소하게되므로적절한시간동안열을가해주어야한다. 시금치에들어있는 Chlorophyl 은순수한 Chlorophyl 보다열에의한항산화효과의감소가적다. 그러므로높은항산화효과를얻기위해서는세포내부물질이직접노출되지않도록시금치의엽육이보이지않는상태에서열을가해야한다. 빛에대한노출은 Chlorophyl 의분해를야기하여항산화효과를낮춘다. 따라서최대한빛에대한노출을피한다면높은항산화효과를가지는 Chlorophyl 을섭취할수있다. 중심금속이철 (Fe ) 로치환된화합물의항산화효과가높은편이며체내조건에서도항산화효과가줄어들지않았다.Chlorophyl 유도체가포함된항산화식품을제조할경우이러한금속이온이치환된유도체를사용한다면높은항산화효과를얻을수있다. 다만,Chlorophyl 유도체가운데는알레르기를일으킬수있는물질도포함되어있으므로충분한임상실험이필요하다. Chlorophyl 을이용한항산화식품을제작할경우이연구의실험결과를적용한다면더높은항산화효과를가지도록 Chlorophyl 유도체를형성할수있다. 다만, 이연구의실험은 in vitro 에서진행되었으므로연구에서제시한방법으로 Chlorophyl 을추출하여섭취해서는알레르기등을유발할수있다. 또한 in vivo 에서의쥐실험등후속연구가필요하며의사의임상검증이필요하다. - 29 -
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