Printed in the Republic of Korea ANALYTICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Vol. 28, No. 6, 436-445, 2015 http://dx.doi.org/10.5806/ast.2015.28.6.436 Note ( 단신 ) Analysis of volatile compounds and metals in essential oil and solvent extracts of Amomi Fructus Sam-Keun Lee, Chul Hun Eum 1 and Chang-Gue Son 2 Department of Applied Chemistry, Daejeon University, 62, Daehak-ro, Dong-gu, Daejeon 34520, Korea 1 Korea Institute of Geoscience and Mineral Resources, Daejeon 34132, Korea 2 Liver & Immunology Research Center, Oriental Hospital of Daejeon University 176-9, Daeheung-ro, Jung-gu, Daejeon 34929, Korea (Received November 3, 2015; Revised November 13, 2015; Accepted November 13, 2015) 사인으로부터추출한정유와용매추출물의휘발성물질및금속성분분석 이삼근 음철헌 1 손창규 2 대전대학교응용화학과, 1 한국지질자원연구원지질자원분석센터, 2 대전대학교한의과대학 (2015. 11. 3. 접수, 2015. 11. 13. 수정, 2015. 11. 13. 승인 ) Abstract: Amomi Fructus with anti-oxidative activity was chosen and essential oil was obtained by SDE (simultaneous distillation extraction), and 39 constituents were determined by GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry). Major components were camphor, borneol acetate, borneol, D-limonene and camphene. Three solvent extracts such as hexanes, diethyl ether and methylene chloride from Amomi Fructus were obtained. These were analyzed by GC-MS and 4 more constituents were identified in addition to 39 components discovered in essential oil. Five major components such as camphor, borneol acetate, borneol, D-limonene and camphene were also detected, however the relative peak percents of those components were different from those of constituents in essential oil. To estimate the kind and the amount of materials evaporated at certain temperature and conditions from essential oil and solvent extracts, dynamic headspace apparatus was used and materials evaporated and trapped at certain conditions were analyzed by GC-MS. Recovery yield of SDE method from Amomi Fructus was measured by using camphor and standard calibration solution of camphor methanol solution and, the yield was 82.0%. Content of Hg was measured by mercury analyzer and contents of Cd, Pb, Cr, Mn, Co, Ni, Cu and Zn in Amomi Fructus, essential oils and solvent extracts were determined by ICP-MS (Inductively coupled plasma-mass spectrometer). Pb, Cd and Hg were measured in the concentration of 0.72 mg/kg, <0.10 mg/kg and 0.0023 mg/kg, respectively and these were below permission level of purity test. Contents of Mn, Cu and Zn in Amomi Fructus were 213 mg/kg, 8.29 mg/kg and 31.0 mg/kg, respectively and which were relatively Corresponding author Phone : +82-(0)42-280-2423 Fax : +82-(0)42-280-2425 E-mail : lsk236@dju.kr This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons. org/licenses/ by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 436
Analysis of volatile compounds and metals in essential oil and solvent extracts of Amomi Fructus 437 higher than other metals such as Cr, Co and Ni. Metals such as Mn (0.65 ~ 9.08 mg/kg), Cu (1.16 ~ 4.40 mg/kg) and Zn (1.10 ~ 3.80 mg/kg) in essential oil and solvent extracts were detected. At this point it is not clear that the metals were cross-contaminated in the course of treating Amomi Fructus or metals were contained in Amomi Fructus. The influence evaluation toward biological model study of these metals in essential oil and solvent extracts will be needed. 요약 : 한약재중항산화작용이있다고알려진사인 (Amomi Fructus) 을 SDE (simultaneous distillation extraction) 방법으로정유 (essential oil) 를추출하고 GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) 를이용하여 39 개의성분을규명하였으며, 주요성분은 camphor, borneol acetate, borneol, D-limonene 및 camphene이었다. 유기용매 3가지 ( 헥세인, 다이에틸에터및다이클로로메테인 ) 를이용하여얻은용매추출물에서정유성분이외에추가로 4개의성분을규명하였으며, 주요 5개성분은동일하였으나상대적인면적비율은차이가있었다. 특정온도와휘발조건에서정유와용매추출물에서휘발하는물질들의종류와상대적인비율을측정하기위하여 dynamic headspace를이용하여특정조건에서휘발하는물질들을트랩에포집한후 GC-MS로분석하였다. 사인으로부터 SDE 방법에의해정유를추출하는방법의회수율을장뇌 (camphor) 를이용하여측정하였으며, 장뇌의회수율은 82.0% 이었다. 사인에서 Hg의함량은수은분석기로측정하였으며, Cd, Pb, Cr, Mn, Co, Ni, Cu 와 Zn은 ICP-MS (Inductively coupled plasmamass spectrometer) 로측정하였다. 사인에서 Pb, Cd 및 Hg이각각 0.72 mg/kg, <0.10 mg/kg 및 0.0023 mg/ kg 검출되었으며, 이는순도시험허용기준치이하의값들이었다. 사인에서 Cr, Mn, Co, Ni, Cu와 Zn의함량을조사한결과 Mn (213 mg/kg), Cu (8.29 mg/kg) 및 Zn (31.0 mg/kg) 등이비교적높은함량으로검출되었으며, 정유와용매추출물에서도 Mn (0.65~9.08 mg/kg), Cu (1.16~4.40 mg/kg) 및 Zn (1.10~3.80 mg/ kg) 이검출되었다. 이들금속성분이사인에서기인하는것인지아니면유통과정이나취급과정에서오염된것인지의여부규명이필요하며, 또한이런금속들이생물학적활성연구에어떤영향주는지도규명할필요가있다. Key words: Amomi Fructus, simultaneous distillation extraction, essential oil, solvent extraction, dynamic headspace/gc-ms 1. 서론한약물을이용하여뇌에특이적인항산화소재개발을연구하는연구가다방면에서연구되고있다. 일반적인열수한약추출물은뇌조직에작용하는과정에서뇌혈관장벽 (blood-brain barrier) 을투과하기어려운제한적특징을갖고있다. 이런단점은한약재의정유성분위주의방향성한약물을비강내에직접투여함으로서극복할수있다고알려져있다. 1-5 한약재중에서정유물질들의성분분석은주로 GC- MS (gas chromatography-mass spectrometry) 를이용하며이루어지며, 6-7 GC에시료를주입하는방법은정유를직접주입하는방법을비롯해서다양한방법들이목적에따라보고되어있다. 휘발성물질을함유하는액체나고체시료를용기에넣은뒤시료상층부에휘발한물질을트랩에포집한뒤열탈착해서 GC-MS 에주입하는방법이주종을이루고있으며, 여기에는 SPME (solid-phase micro-extraction), LPME (liquid-phase micro-extraction), purge and trap 방법및 dynamic headspace purge and trap등다양한방법들이보고되어있다. 8-11 정유성분을추출한후이를가지고생물학적효능을연구할목적으로사용하기위해서는일정양이필요하며이런목적으로사용되는방법에는증기증류 (steam distillation, SD), 12 동시증류추출 (simultaneous distillation extraction, SDE), 13 마이크로파추출 (microwave-assisted extraction, MAE), 14 용매추출 (solvent extraction, SE), 15 가온수추출 (superheated water extraction, SWE) 16 및초임계유체추출 (supercritical fluid extraction, SFE) 17 등이있다. 약재정유추출물의화학적조성은약재의생산지, 같은종내에서변이성, 재배조건, 수확시기, 저장시간및가공방법과같은변수에따라차이가있다는것이보고되었으며, 18-19 같은약재의경우에도생물학적활성을가지는물질의양과종류는추출방법에따라달라진다. 또한동 Vol. 28, No. 6, 2015
438 Sam-Keun Lee, Chul Hun Eum and Chang-Gue Son 일한약재일지라도추출방법에따라정유성분의종류와양이다를것이며, 동일한재료에대해서동일한방법으로얻은정유라할지라도생물학적활성연구에적용하는방법에따라유효성분이다를것이다. 예를들어정유를특정용매로희석한희석액을그대로사용하는경우와정유를상온에서질소와같은불활성기체로휘발시켜사용하는경우의적용되는유효성분이다를것이다. 본연구에서는녹각사 (Amomum villosum Loureiro var. xanthioides T. L. Wu et Senjen) 나양춘사 (Amomum villosum Loureiro) 의열매또는씨덩어리인사인 (Amomi Fructus) 의정유물질을질소분위기에서 SDE 방법으로추출하고사인으로부터용매추출법 ( 사용한용매는헥세인, 다이에틸에터및다이클로로메테인 ) 으로추출물을얻었다. 추출물중각각의휘발성성분들을 GC-MS를이용하여규명하고자하였으며, 60 o C에서휘발하는성분들의상대적인비율을 dynamic headspace purge and trap을이용하여비교하였다. 또한사인, 정유및용매추출물의수은농도를수은측정기로측정하였고, Cd, Pb, Cr, Mn, Co, Ni, Cu와 Zn의농도는 ICP-MS를이용하여측정하여결과를비교하였다. 2. 재료및방법 2.1. 재료및시약사인은중국산으로 4 o C에서냉장보관한후사용하였으며분쇄한후체눈크기가 1.18 mm인체로걸러사용하였다. 사용한물은탈이온수를사용하였으며, 헥세인, 다이에틸에터및다이클로로메테인은대정화금의 EP급을구매한후사용직전에증류하여사용하였다. 무수황산나트륨 (99%) 은 Junsei사제품을, 장뇌 (camphor, 순도 96%) 는시그마-알드리치사그리고세라이트는동양제철화학의 Celite 545를각각사용하였다. 금속전처리에사용한 HNO 3 (70-75%) 은동우화인켐사제품을그리고 HClO 4 (GR급, 60%) 는일본 Junsei사제품을사용하였다. 2.2. 정유와용매추출및휘발성물질분석 SDE 방법으로정유를얻기위하여분쇄한사인 60.0 g을플라스크에넣은후탈이온수 800 ml를첨가하고다른플라스크에는헥세인 50 ml를넣은후 SDE장치에연결하고질소분위기에서 6시간동안가열하여정유성분을헥세인층으로이동시켰다. 이용액을무수황산나트륨으로 12 시간건조한후여과하고회전증발기를이용하여헥세인을제거하여연한노란색의정유물질을얻었다. 동일실험을 3번실시하여 Table 1에정리하였다. 정유 1 µl에 40 µl의헥세인을가하여얻은희석액 1 µl를 GC-MS에직접주입하여분석하였다. 또한 dynamic headspace의분석전용용기 (20 ml) 에정유 1 µl를넣은후 60 o C에서 10분간헬륨으로휘발성물질을모은다음 GC-MS로분석하였다. Fig. 1에분석과정을정리하였다. 용매추출물은분쇄한사인 30.0 g을삼각플라스크에넣고헥세인, 다이에틸에터혹은다이클로로메테인 150 ml를넣은후 12 시간방치한후초음파로 20 분간처리하였다. 이용액을 1시간동안상온에서자석교반기를이용하여잘혼합하고여과보조제인세라이트를이용하여여과한후 50 ml의해당용매로세라이크층을세척하였다. 각용액을무수황산나트륨으로 12 시간건조시키고여과한다음회전증발기를이용하여용매를제거하여 3가지의진한노란색의추출액인 HX-EXT( 헥세인추출물 ), ETHER- EXT( 다이에틸에터추출물 ) 및 MC-EXT( 다이클로로 Table 1. Amount of essential oil and solvent extracts by SDE, HX-EXT (hexanes extraction), ETHER-EXT (diethyl ether extraction) and MC-EXT (methylene chloride extraction) from Amomi Fructus No Extraction Used g of Amomum villosum Loureiro Essential oil or extracts, g (recovery yield, %) 1 SDE 60.0 g 0.579 g (0.97±0.11%) 2 HX-EXT 30.0 g 0.442 g (1.47±0.20%) 3 ETHER-EXT 30.0 g 0.553 g (1.84±0.16%) 4 MC-EXT 30.0 g 0.711 g (2.34±0.17%) 5 SDE After HX-EXT, 30 g 0.0423 g (0.14%±0.02%) 6 SDE After ETHR-EXT, 30 g 0.0251 g (0.08%±0.10%) 7 SDE After MC-EXT, 30 g 0.0167 g (0.06%±0.13%) 8 HX-EXT After SDE, 60 g 0.0055 g (0.01%±0.12%) Analytical Science & Technology
Analysis of volatile compounds and metals in essential oil and solvent extracts of Amomi Fructus 439 Fig. 1. Overall analytical procedure for SDE from Amomi Fructus. Fig. 2. Overall analytical procedure for solvent extraction from Amomi Fructus (used solvent: hexanes, diether ether, methylene chloride). 메테인추출물 ) 을각각얻었다. 동일실험을 3번실시하여 Table 1에정리하였다. 정유 1 µl에 40 µl의헥세인을가하여희석한용액 1 µl를 GC-MS에직접주입하여분석하였다. 또한 dynamic headspace의전용용기 (20 ml) 에정유 1 µl를넣은후 60 o C에서 10분간헬륨으로휘발성물질을트랩으로포집한후 GC- MS로분석하였다. Fig. 2에분석과정을정리하였다. 2.3. SDE 방법의장뇌 (camphor) 회수율및장뇌표준용액제조분쇄한사인 40.0 g과장뇌 0.027 g을플라스크에넣은후탈이온수 600 ml를첨가하고다른플라스크에는헥세인 40 ml를넣은후 SDE 장치에연결하고질소분위기에서 6시간동안가열하여정유성분을헥세인층으로이동시켰다. 이용액을무수황산나트륨으로 12 시간건조한후여과하고회전증발기를이용하여헥세인을제거한후연한노란색의정유물질을얻었다. 정유 1 µl에 40 µl의헥세인을가하여희석한용액1 µl를 GC-MS에직접주입하여얻은 TIC (total ion chromatogram) 에서장뇌의양을장뇌의표준용액을만들어정량하였다. 장뇌의표준원액 (2,000 mg/l) 을메탄올로희석한후 500 mg/l 농도의표준용액을제조하였으며이를이용하여검정곡선을작성하고시료분석시사용하였다. 2.4. 용매추출후남은사인으로부터정유추출위의 2.2. 방법으로헥세인, 다이에틸에터혹은다이클로로메테인을사용하여용액추출물을회수한후남은사인을상온에서 12 시간방치하여용매를제거하고플라스크에넣었다. 탈이온수 600 ml를첨가하고다른플라스크에는헥세인 40 ml를넣은후 SDE 장치에연결하고질소분위기에서 6시간동안가열하여정유성분을헥세인층으로이동시켰다. 이용액을무수황산나트륨으로 12 시간건조하고회전증발기를이용하여헥세인을제거하여각각의연한노란색정유물질을얻었다. 정유 1 µl에 40 µl의헥세인을가하여희석한용액 1 µl를 GC-MS에직접주입하여휘발하는물질들을분석하였다. 2.5. GC-MS와 Dynamic headspace purge and trap GC-MS에희석한정유를직접주입한경우 Table 2 과같은조건으로 GC-MS를이용하여분석하였다. Dynamic headspace를이용한경우정유 1 µl를 20 ml 전용용기에넣은후휘발성성분들을 Table 3과같은조건으로포집한후 Table 2와같은조건으로 GC-MS 를이용하여분석하였다. 성분분석은 Wiley7Nist05 질량스펙트럼데이터와보고된자료들을비교해서결 Vol. 28, No. 6, 2015
440 Sam-Keun Lee, Chul Hun Eum and Chang-Gue Son Table 2. GC-MS conditions Gas Chromatography Column Temp Agilent 7890A 50 o C for 0 min 8 o C/min to 200 o C for 0 min. 10 o C/min to 270 o C for 5 min. 20 o C/min to 300 o C for 10 min. Column HP-5MSI (30 m 0.25 mm 0.25 µm film thickness) Split ratio : 10 : 1 Mass Spectrometer Agilent 5975C Ion source temp 230 o C Injector temp 250 o C Scan range 50-550 m/z Table 4. ICP-MS conditions ICP-MS ELAN DRC II (Perkin Elmer) RF power 1250 W Calibration standard 2 10 µg/ml, AccuStandard Plasma Ar gas flow 18 L/min Auxiliary Ar gas flow 1.2 L/min Neubilizer Ar gas flow 0.9 L/min Neubilizer Meinhard type(quartz) Spray chamber Cyclonic Interface cones Platinum Lens voltage 8 V Dwell time 50 ms replicate 3 Detector mode Dual Table 3. Dynamic headspace conditions Dynamic head space HT-3(Teledyne Tekmar) Platen/sample temp. 60 o C Transfer line temp 230 o C Valve oven temp. 63 o C Sweep flow rate 50 ml/min Sweep flow time 10 min. Dry purge 0 min. Desorb temp. 225 o C Trap bake temp. 230 o C Trap bake flow 450 ml/min. 정하였다. 20-21 정유에함유된각성분의상대적인비율은 GC-MS에서얻은 TIC에서해당피크면적을전체피크면적의합을나누어계산하였다. 2.6. 사인과정유및용매추출물의중금속농도측정수은분석기 (MA-2, Nippon instrument, Japan일본 ) 로표준물질 (1000 µg/ml, Waco) 을측정하여검정곡선을그린후시료약 0.05 g의무게를정확히측정한다음수은분석기에넣고가열기화금아말감법으로수은을분석하였다. 사인, 정유및용매추출물의 Cd, Pb, Cr, Mn, Co, Ni, Cu 와 Zn의농도는시료약 0.1 g의무게를정확히측정한다음질산과과염소산을이용하여분해하고 Table 4와같은조건으로 ICP- MS (inductively coupled plasma-mass spectrometer) 를이용하여측정하였다. 이들중금속의농도는표준물질 (10 µg/ml, AccuStandard ) 을측정하여검정곡선을그린후결정하였다. 3. 결과및고찰사인 60.0 g을 SDE 방법으로정유성분 0.579 g을얻을수있었으며 (Table 1), 정유 1 µl에 40 µl의헥세인을가하여희석한용액 1 µl를 GC-MS에직접주입하여얻은 TIC에서 Wiley7Nist05 질량스펙트럼데이터와문헌비교를통해정유성분을분석하였다. 정유에서 39 개의성분을규명하였으며 (Table 5와 Fig. 3), 주요성분 5개와상대적면적비율 ( 해당피크면적을전체피크면적으로나눈값 ) 은다음과같았다 (camphor (CP, 32.3%), borneol acetate (BA, 20.2%), borneol (BO, 8.02%), D-limonene (LM, 4.54%) 그리고 camphene (CAP, 3.35%)). 각피크의상대적면적비율에대한상대표준편차 (relative standard deviation) 의범위는 2.10%~11.2% 이었다. 사인을 SDE 방법으로추출하여성분을분석한보고는없으며, 사인으로부터가압열수추출 (pressurized hot water extraction) 방법으로정유를추출하고이를 headspace-spme (solid phase micro-extraction) 으로성분을분석한보고는있었다. 20-21 이결과와본연구에서활용한 SDE 방법으로얻은정유의성분을비교하면위에서언급한 5종류의주요성분은동일하였으나상대적면적비율이달랐으며다른성분의경우는많은차이가있었다. 20-21 사인 30.0 g에헥세인, 다이에틸에터혹은다이클로로메테인을첨가하여얻은용매추출물의양은각각 0.442 g (1.47%), 0.553 g (1.84%) 및 0.711 g (2.34%) 이었다 (Table 1). 각추출물 1 µl에 40 µl의해당용매를가하여희석한용액 1 µl를 GC-MS에직접주입하여얻은 TIC를 Wiley7Nist05 질량스펙트 Analytical Science & Technology
Analysis of volatile compounds and metals in essential oil and solvent extracts of Amomi Fructus 441 Table 5. Relative contents of volatile constituents in essential oil, HX-extracts, ETHER-extracts and MC-extracts in Amomi Fructus by analyzing TIC obtained from GC-MS No. Retention time(min) Compound Relative contents (%) SDE HX-extracts ETHER- extracts MC-extracts 1 4.96 α-pinene 0.61 0.01 0.02 0.06 2 5.22 Camphene 3.35 0.06 0.11 0.30 3 5.68 β-pinene 0.03 0.01 0.02 0.04 4 5.87 β-myrcene 1.60 0.05 0.06 0.16 5 6.58 D-Limonene 4.54 0.09 0.17 0.46 6 6.64 Cineole 0.71 0.03 0.03 0.06 7 7.64 Terpinolen 0.16 0.01 0.01 0.01 8 7.95 Linalool 2.01 0.33 0.27 0.30 9 8.82 Camphor 32.3 6.95 6.19 7.61 10 8.96 Isobornyl alcohol 0.14 0.03 0.03 0.03 11 9.16 Borneol 8.02 3.39 2.73 2.82 12 9.29 4-Terpineol 0.19 0.03 0.03 0.03 13 9.51 α-terpineol 0.56 0.10 0.08 0.09 14 11.22 Borneol acetate 20.2 4.56 3.71 4.17 15 12.22 α-terpineolacetate 2.16 0.59 0.51 0.49 16 13.40 α-santalene 0.92 0.41 0.39 0.37 17 13.45 β-caryophyllene 1.88 0.84 0.64 0.66 18 13.83 β-santalene 0.31 0.19 0.16 0.15 19 13.88 β-farnesene 0.32 0.33 0.25 0.33 20 13.93 β-sesquiphellandrene 0.36 0.44 0.32 0.34 21 13.98 α-caryophyllene 0.31 0.22 0.18 0.17 22 14.10 Aromadendrene 0.18 0.13 0.11 0.13 23 14.29 α-longipinene 0.31 0.14 0.11 0.11 24 14.34 α-curcumene 0.32 0.27 0.23 0.21 25 14.40 β-cubebene 0.33 0.32 0.23 0.21 26 14.64 α-muurolene 0.71 0.50 0.43 0.36 27 14.75 β-bisabolene 1.59 1.60 1.22 1.07 28 14.86 τ-cadinene 0.66 0.87 0.75 0.68 29 15.01 δ-cadinene 1.51 0.97 0.80 0.43 30 15.10 α-patchoulene 0.40 0.38 0.33 0.16 31 15.22 α-muurolene 0.20 0.18 0.20 0.13 32 15.38 Elemol 0.27 0.43 0.35 0.22 33 15.53 Nerolidol 0.72 0.84 0.72 0.59 34 15.96 Cubenol 0.22 1.11 0.92 0.84 35 16.76 τ-muurolol 1.01 0.72 0.70 0.65 36 16.96 τ-cadinol 1.44 1.15 0.86 0.98 37 17.13 b-bisabolol 2.13 2.06 1.76 1.46 38 17.52 α-santalol 1.55 0.74 0.72 0.52 39 18.16 Xanthorrhizol 0.68 0.85 0.51 0.64 40 19.06 Nootkatone - 1.44 1.60 2.02 41 20.85 Hexadecanoic acid - 5.54 5.10 3.66 42 22.74 Oleic Acid - 11.1 14.6 11.2 43 35.22 τ-sitosterol - 2.62 2.17 2.49 럼데이터와문헌비교를통해성분을분석한결과, 정유성분에서규명한 39 개성분이외에 nootkatone, hexadecanoic acid, oleic acid 및 τ-sitosterol을추가로규명하였으며, 3 개의용매추출물의주요성분 5개와 Vol. 28, No. 6, 2015
442 Sam-Keun Lee, Chul Hun Eum and Chang-Gue Son Fig. 3. Total ion chromatogram of the essential oil from Amomi Fructus (CP: camphor, BA: borneol acetate, BO: borneol, LM: D-limonene, CAP: camphene). 상대적면적비율은다음과같았다 (camphor (CP, 6.19%~7.16%), borneol acetate (BA, 3.71~4.56%), borneol (BO, 2.73~3.39%), D-limonene (LM, 0.09~0.46%) 그리고 camphene (CAP, 0.06~0.30%)). 각피크의상대적면적비율에대한상대표준편차의범위는 3.23%~12.6% 이었다. 정유와용액추출물의 TIC에서주요성분 5 개 (camphor, borneol acetate, borneol, D-limonene, camphene) 의상대적면적비율 ( 상대표준편차 : 4.15%~ 13.2%) 을계산하여 Fig. 4에나타내었다. 정유의경우주요물질의상대적인면적비율이용액추출물의상대적인면적비율보다큰이유는 GC-MS 분석조건 (Table 2) 에서휘발하는양이상대적으로많았기때문이며, 용액추출물의경우 GC-MS 분석조건에서휘발하지않는양이작을뿐아니라전혀휘발하지않는양도많았을것으로판단된다. 특정온도와휘발조건에서정유와용매추출물로부터휘발하는물질들의종류와상대적인비율을측정하기위하여 dynamic Fig. 4. Relative peak percent of five compound (CP: camphor, BA: borneol acetate, BO: borneol, LM: D-limonene, CAP: camphene) in essential oil and solvent extracts (HX-EXT: hexanes extracts, ETHER-EXT: diethyl ether extracts, MC-EXT: methylene chloride extracts) obtained from Amomi Fructus by direction injection into GC-MS. headspace를이용하여특정조건에서휘발하는물질들을트랩에포집한후 GC-MS로분석하였다. 정유와용매추출물의각 1 µl를 dynamic headspace 전용용기에주입하고 60 o C에서 10분간휘발하는물질을포집한후 GC-MS로분리한 TIC에서, 정유시료에서가장많은양의휘발성물질이검출되었으며, 다이클로로메테인추출물 (MC-EXT) 의경우가다음으로많았으며다이에틸에터추출물 (ETHER-EXT) 이다음으로많았고헥세인추출물 (HX-EXT) 에서가장적은양의휘발성물질이양이검출되었다. 이들시료의 TIC에서전체피크의면적비율은다음과같았다 ; SDE:HX-EXT:ETHER-EXT:MC-EXT=6.1:1.0:1.1: 1.7. Dynamic headspace를이용하여얻은정유와용매 Table 6. Relative contents of volatile constituents of essential oil, HX-extracts, ETHER-extracts and MC-extracts by analyzing TIC obtained from dynamic headspace-gc-ms No. Retention time (min) compound Relative contents (%) SDE-HX HX-EXT ETHER-EXT MC-EXT 1 4.96 α-pinene 2.94 0.86 1.12 1.93 2 5.22 Camphene 9.71 3.63 6.76 12.9 3 5.68 β-pinene 0.67 0.33 0.33 0.59 4 5.87 β-myrcene 8.63 2.83 3.82 6.58 5 6.58 D-Limonene 41.6 7.99 12.8 24.7 6 8.82 Camphor 12.9 50.9 50.1 32.7 7 9.16 Borneol 1.86 4.80 3.79 2.55 8 11.22 Borneol acetate 5.54 12.9 10.4 8.22 9 13.45 β-caryophyllene 0.63 1.29 0.72 0.60 10 14.75 β-bisabolene - 0.52 0.41 0.45 Analytical Science & Technology
Analysis of volatile compounds and metals in essential oil and solvent extracts of Amomi Fructus 443 Fig. 5. Summation of total peak area in TIC for four samples (essential oil, HX-EXT: hexanes extracts, ETHER- EXT: diethyl ether extracts and MC-EXT: methylenechloride extracts), respectively. 추출물의성분과상대적인면적비율을 Table 6에나타내었으며각피크의상대적인면적비율에대한상대표준편차 (relative standard deviation) 의범위는 3.82%~13.2% 이었다. 정유와용매추출물의주요성분 5개 (camphor, borneol acetate, borneol, D-limonene, camphene) 의상대적인면적비율을 Fig. 6에나타내었다. 정유를 GC-MS에직접주입하여얻은경우 (Table 5) 와 dynamic headspace를이용하여 60 o C에서 10분간휘발하는물질을포집한후 GC-MS로분석한경우를비교하면검출된성분의양에서많은차이가있었다. 직접주입한경우가장많은성분이 camphor로상대적면적비율이 32.3% 인반면 dynamic headspace 를이용하여분석한경우가장많은성분은 D- limonene으로상대적인비율이 41.6% 이었다. 용매추출물의성분을 dynamic headspace이용하여분석한결과가장성분이많은것은 camphor (32.7%~50.9%) 이었으며두번째로성분이많은성분은 D-limonene (7.99%~24.7%) 이었으며가장적게검출된것은 β- pinene (0.33%~0.59%) 이었다. 이런결과는 dynamic headspace를이용하여휘발하는온도와포집하는시간과같은휘발조건을변경하면각조건에서휘발하는물질의종류와상대적인양을예상할수있으며, 이는휘발조건에따른휘발성물질의종류와양을측정할수있다는측면에서생물학적활성연구에중요한자료가될수있다. 용매추출후회수한사인을 SDE-HX 방법으로정유성분을재추출한결과소량이지만정유를추가로얻을수있었다 (Table 1). 헥세인으로추출한후남아있는사인으로부터정유의회수율은 0.14% 이었으며, 다이에틸에터추출후와다이클로로메테인추출후 Fig. 6. Relative peak percent of five compound (CP: camphor, BA: borneol acetate, BO: borneol, LM: D-limonene, CAP: camphene) in essential oil and solvent extracts (HX-EXT: hexanes extracts, ETHER-EXT: diethyl ether extracts, MC-EXT: methylene chloride extracts) obtained from Amomi Fructus by dynamic headspace- GC-MS. 회수한사인으로부터의회수율은각각 0.08% 와 0.06% 이었다. 이렇게얻은각정유 1 µl에 40 µl의헥세인을가하여희석한용액 1 µl를 GC-MS에직접주입하여얻은크로마토그램을분석한결과구성성분과함량이용매추출과정을거치지않은사인에서 SDE 방법으로얻은정유의구성성분과함량이거의동일하였다. 또한사인을 SDE 방법으로추출한다음사인과물의혼합물에헥세인을넣어헥세인추출물을추출한결과소량의고형성물질을얻었으며회수율은 0.01% 이었다 (Table 1). 따라서사인에서정유성분만을얻을목적이라면 SDE 방법이용매추출법보다효율적임을알수있었다. 사인을 SDE 방법으로정유를추출하는방법의회수율은사인 40.0 g에장뇌 0.027 g을넣은후 SDE 방법으로정유성분을얻어장뇌의회수율을측정한결과 82.0% (0.0212 g) 이었다. 회수율계산은 SDE 방법의정유회수율 0.97% (Table 1) 과장뇌회수율이같다고가정하고계산하였으며장뇌표준용액 ( 농도 500 mg/l) 을사용하여검정곡선을그린후농도계산에사용하였다. 분석실험실수준의청결성을유지하지않고일반적인생물학적활성을연구하는실험실수준으로초자기구들을관리할경우사용하는기기와초자용기로부터금속성분의오염이예상된다. 오염정도를측정하기위하여사인원재료와위의실험방법으로얻은정유와용매추출물에대한중금속성분을측정하였다. 사인과정유및용매추출물의중의 Hg는수은분석기 (MA-2, 일본 ) 로측정하였으며, Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, Cd 및 Pb는 ICP-MS로측정하였다 (Table 7). Vol. 28, No. 6, 2015
444 Sam-Keun Lee, Chul Hun Eum and Chang-Gue Son Table 7. Determination of metals in essential oil, HX-extracts, ETHER-extracts and MC-extracts by mercury analyzer and ICP- MS Concentration, mg/kg Hg* Cr Mn Co Ni Cu Zn Cd Pb SDE-HX <0.001 0.30 0.65 <0.10 <0.10 1.16 1.10 <0.10 0.18 HX-EXT 00.0023 0.32 6.30 <0.10 <0.10 4.40 3.80 <0.10 0.53 ETHER-EXT <0.001 0.34 2.22 <0.10 <0.10 2.60 1.90 <0.10 0.18 MC-EXT <0.001 0.47 9.08 <0.10 0.19 3.43 2.86 <0.10 0.43 Amomi fructus 00.0023 0.40 213 0.14 0.70 8.29 31.0 <0.10 0.72 *: Mercury analyzer 사용한탈이온수와용매추출법에사용한 3개의용매에서는위의금속함량들이검출한계이하로검출되었다. 본연구에서사용한사인에서는 Pb, Cd 및 Hg 이 0.72 mg/kg, <0.10 mg/kg 및 0.0023 mg/kg 이검출되었으며이는순도시험허용기준치이하의값들이다. 중국산사인및한약재의부위별에대해서금속성분에대한보고가있으며, 22 중국산사인에대한 As, Pb, Cd 및 Hg 성분분석보고에의하면이들성분이각각 0.095 mg/kg, 0.044 mg/kg, 4.18 mg/kg 및 0.002 mg/kg 이검출되었다. 23 사인, 정유및 3개의용매추출물에대해서 Cr, Mn, Co, Ni, Cu 및 Zn의함량을추가로검사하였으며, 사인에서 Mn (213 mg/kg), Cu (8.29 mg/kg) 및 Zn (31.0 mg/kg) 이비교적높은함량으로검출되었고정유와용매추출물에서도 Mn (0.65~ 9.08 mg/kg), Cu (1.16~4.40 mg/kg) 및 Zn (1.10~3.80 mg/ kg) 검출되었다. 이들금속성분들이취급과정에서오염된것인지아니면사인에서기인하는것인지에대한자세한조사가필요하며, 특히사인에서검출된 Mn, Cu 및 Zn과같은금속이원재료인사인에서기인하는것인지아니면유통과정이나취급과정에서오염된것인지, 또한이런금속들이생물학적활성연구에어떤영향주는지도규명할필요가있다. 된다. Dynamic headspace를이용하여휘발하는온도와시간과같은휘발조건을변경하여 GC-MS로분석하면각조건에서휘발하는물질의종류와상대적인양을예상할수있으며, 이는휘발조건에따른휘발성물질의종류와양을측정할수있다는측면에서생물학적활성연구에중요한자료가될수있다. SDE 방법으로사인의정유회수율을장뇌를이용하여검사한결과 82.0% 로우수한편이었으며, 휘발성성분이유효성분인경우의모델연구에서는정유추출방법인 SDE 방법이선호되나, 용매추출물에는정유성분이외에다른성분이존재하므로경우에따라서는용매추출물이활성연구에적합할수있다. 사인과정유및용매추출액에대해서 Hg, Cd 및 Pb의함량은모두순도시험허용기준치이하로검출되었다. 그러나사인, 정유및 3개의용매추출물에대해서추가로검사한 Cr, Mn, Co, Ni, Cu 및 Zn의농도를살펴보면사인에서 Mn (213 mg/kg), Cu (8.29 mg/kg) 및 Zn (31.0 mg/kg) 이비교적높은함량으로검출되었으며정유와용매추출물에서도비교적높은양의이들금속들이검출되었다. 이들금속성분의출처에대한규명이필요하며이들금속들의생물학적활성연구에어떤영향을주는지도규명할필요가있다. 4. 결론 감사의글 한약재사인에서휘발성물질을이용한생물학적모델연구에는일정한규모의양이필요하며, 실험결과 SDE 방법과유기용매추출법모두이목적에적합함을알수있었다. 정유와용매추출액의 GC-MS 에의한구성성분은정유에서휘발성물질의양이상대적으로많았으며, 용매추출액에서는분자량이크거나비점이높은물질들이많이검출되었으며일부물질들은분석조건에서휘발하지않은것으로판단 이연구는미래창조과학부한국연구재단 ( 과제번호 : 2015003195) 의연구비로수행되었으며이에감사드립니다. References 1. M. Takahashi, A. Yamanaka, C. Asanuma, H. Asano, T. Satou and K. Kokike, Nat. Prod. Commun., 9(7), Analytical Science & Technology
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