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기영 왕
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1 대한소화기학회지 2010;56:27-32 DOI: /kjg Urea Breath Test 양성인정상성인에서 Polyethylene Glycol (Colyte R ) 투여후직장과말단회장에서배양과 Polymerase Chain Reaction 을이용한 Helicobacter pylori 발견 순천성가롤로병원내과, 진단검사의학과 *, 녹십자의료재단, 전남대학교의과대학생화학교실 김도현ㆍ정홍명ㆍ황영준ㆍ안용수ㆍ문장식ㆍ명보현ㆍ박혁ㆍ정은주ㆍ임윤미오현민ㆍ정희영ㆍ박철 * ㆍ김형락 * ㆍ조은해 ㆍ김호동ㆍ정영도 Culture and Polymerase Chain Reaction of Helicobacter pylori from Rectal and Terminal Ileal Fluid after Polyethylene Glycol (Colyte R ) Ingestion in Healthy Adults with Positive Urea Breath Test Do Hyun Kim, M.D., Hong Myong Jung, M.D., Young Jun Hwang, M.D., Yong Soo Ahn, M.D., Jang Sik Mun, M.D., Bo Hyun Myoung, M.D., Hyeuk Park, M.D., Eun Joo Jeong, Yun Mi Im, Hyun Min Oh, Hui Yeong Jeong, Chul Park*, Hyung Rag Kim*, Eun Hae Cho, M.D., Ho Dong Kim, M.D., and Young Do Jung, M.D., Ph.D. Departments of Internal Medicine and Laboratory Medicine*, Saint Carollo Hosipital, Suncheon, Greencross Reference Laboratory, Yongin, Department of Biochemistry, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea Background/Aims: Helicobacter pylori (H. pylori) transmission route is not yet clearly understood. Isolating H. pylori from stool, saliva, and vomitus is very difficult. However, H. pylori could be cultured from feces in the setting of rapid gastrointestinal tract transit. The aim of this study was to isolate H. pylori by culture and PCR in the rectum and terminal ileum during colonoscopy. Methods: Twenty subjects with positive UBT (urea breath test) were included. We performed polymerase chain reaction (PCR) test and culture of H. pylori with the rectal fluid and terminal ileal fluid during colonoscopy. Results: H. pylori was cultured with rectal fluid from 9 (45.0%) of 20 subjects and with ileal fluid from 11 (55.0%) of 20 subjects. H. pylori was a little more frequently cultured from the terminal ileal fluid than the rectal fluid without statistical significance (p>0.05). PCR test detected flaa (16/20, 80.0% and 17/20, 85.0%), 16S rrna gene (16/20, 80.0% and 17/20, 85.0%), caga (10/20, 50.0% and 12/20, 60.0%), and urec (9/20, 45% and 11/20, 54.5%) from the rectal fluid and the terminal ileal fluid, respectively. The specificity and sensitivity of urec were %. Conclusions: H. pylori could be cultured from the rectal fluid and terminal ileal fluid in the setting of rapid gastrointestinal tract transit. These results suggest of fecal-oral transmission of H. pylori. (Korean J Gastroenterol 2010;56:27-32) Key Words: Urea breath test; Helicobacter pylori; Polyethylene glycol; H. pylori DNA (flaa, 16S rrna gene and caga) 접수 : 2010 년 1 월 28 일, 승인 : 2010 년 5 월 25 일연락처 : 김호동, , 전남순천시조례동 1742 번지성가롤로병원소화기내과 Tel: (061) , Fax: (061) raphael65@hanmail.net Correspondence to: Ho Dong Kim, M.D. Department of Gastroenterology, Saint Carollo Hosipital, 1742, Jorye-dong, Suncheon , Korea Tel: , Fax: raphael65@hanmail.net

2 28 대한소화기학회지 : 제 56 권제 1 호, 2010 서 론 2. 방법 Helicobacter pylori (H. pylori) 는감염의빈도가높고, 소화성궤양과위암의원인으로서중요한임상적의미를가지고있음에도불구하고그전파경로는확실히알려져있지않다. 현재까지나온연구를보면 H. pylori는사람에서사람으로전염되며, 아동기에주로일어난다. 그러나 H. pylori 감염경로, 지속성및감수성차이에대해서는아직논란이많다. 추정되는감염경로는구강에서구강 (oral oral), 위에서구강 (gastro oral), 대변에서구강 (fecal oral) 등이있다. 1-3 이와같이경구감염이가장유력한감염경로이지만 H. pylori가어떻게숙주에서배출되고주위환경에서생존하며언제다시감염을일으키는지아직확실하지않다. 1983년 H. pylori 가위점막에서배양된이후역학및병인에대해많은진전이있었으나전파경로및예방측면에서는아직많은의문점이해결되어야하는상황이다. 특히위점막을제외한사람의체액에서 H. pylori 배양은매우어렵다. 4 7 그래서많은연구에서 polymerase chain reaction (PCR) 을이용하여 H. pylori 를검출하며이검사법은매우민감하고특이도가높은검사법이다. 8,9 H. pylori는소장을통과하는동안사람의담즙과접촉하고약해지기때문에항문에서구강경로는구강에서구강또는위에서구강경로보다흔하지않다고알려져있다. 그러나위장통과시간이짧아진상태에서는 H. pylori가담즙과접촉하는시간이짧아지고또한장내세균에영향을덜받을수있다는가정하에이연구를시작하였고, 지원자에게 polyethylene glycol (PEG, Colyte R ) 투여후인위적으로설사를유발시킨후직장과말단회장에서체액을흡입하여배양과 PCR을시행하였다. 또한 PCR 결과와배양결과를비교하였다. 대상및방법 1. 대상 2007년 3월부터 2007년 9월까지건강검진을위하여순천성가롤로병원을방문한정상성인에서연구의목적과검사과정을설명하고동의서를받았다. 히스타민 2 수용체길항제, proton pump inhibitor, 항생제의최근복용력이있는경우, 65세이상, 임신, 소화성궤양의과거력이있는경우는제외하였다. 35명의지원자에게 13 C Urea Breath Test (UBT) 를시행하였고, 35명중 20명의지원자에서 UBT 양성이나왔으며 20명을대상으로전향적인연구를시행하였다. 대장내시경전처치제로사용되고있는 PEG 4 L를대장내시경전날투여하였다. 대장내시경을삽입후직장에남아있는체액을흡입하였고말단회장에서는세균오염을방지하기위하여멸균소독이된관 (catheter) 를이용하여체액을흡입하여배양과 PCR을시행하였다. 체액을상층액과침사층으로분리하기위하여 3,000 rpm에서 15분간원심분리하였다. H. pylori 배양은 amphotericin B (50μg/mL), nalidixic acid (10.7μg/mL), vancomycin (μg/ml), 그리고소혈청이 10% 첨가된 Mueller Hinton 한천배지에침사층을접종하고 10% 의 CO 2 와 % 습도가유지되는 37 o C 배양기에서 5-7일간배양한다음배양된세균으로부터단일집락을선택하여동일조건으로증균시킨후 Urease, Catalase, 그리고 Oxidase test를시행하여 H. pylori가존재함을확인하였다. PCR을이용한 H. pylori 검출은 caga (348 base pair), urec (315 base pair), flaa (152 base pair), 그리고 16S rrna gene (110 base pair) 4개의다른 primer를사용하였다. QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) 을이용하여 DNA를추출하였다. MPCR Kit (Maxim Biotech, Inc., USA) 를이용하여 DNA 10μL와 Taq DNA polymerase 0.2 μl, Master mixture 40μL를섞어 PCR 반응을실시하였고 PCR 반응은 96 o C에서 1분반응후 94 o C 1분, 58 o C 1분, 72 o C 1분의반응을 35회반복하였다. 최종연장반응은 72 o C에서 10분간시행하였고 PCR 결과물 5μL를덜어내어 ethidium bromide를포함한 2% 아가로즈겔에서전기영동하였다. Marker DNA와비교하여각유전자의밴드유무를판독하였다. 통계프로그램은 SPSS for Window 11 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을사용하였고배양결과와 PCR 결과를비교하여민감도, 특이도, 양성예측도, 그리고음성예측도를알아보았다. 결과 1. 대상환자 35명의지원자들의나이는 UBT 양성인군 36.4±7.7 years, 음성인군 39.6±7.7 years이었다 (p>0.05). 남녀의비도양군간에차이가없었다. 2. 배양직장흡인액에서는 9명 (45.0%), 그리고말단회장흡인액에서는 11명 (55.0%) 에서 H. pylori 가배양되었다. 통계학적으로차이는없었으나말단회장에서 H. pylori 배양이더많은경

Summary of PCR and Culture Results from Rectal Fluid and Terminal Ileal Fluid of 20 Subjects Infected with Helicobacter pylori caga flaa 16S rrna urec Culture caga flaa 16S rrna urec Culture 1 2 3 4

3 김도현외 15 인. UBT 양성인성인에서 Polyethylene Glycol 투여후 H. pylori 의발견 29 Fig. 1. Detection of H. pylori DNA in the rectal fluid and terminal ileal fluid by PCR. M, marker; P, positive control; R, rectal fluid; T, terminal ileal fluid. Table 1. Summary of PCR and Culture Results from Rectal Fluid and Terminal Ileal Fluid of 20 Subjects Infected with Helicobacter pylori caga flaa 16S rrna urec Culture caga flaa 16S rrna urec Culture 향을보였다 (Table 1). 3. PCR 결과직장흡인액에서 flaa 는 20 명중 16 명 (80.0%) 에서양성을보였고, 16S rrna gene 도 16 명 (80.0%) 에서양성을보였다. caga 은 10 명 (50%) 에서양성을보였고, urec 는 9 명 (45%) 에서양성을보였다 (Fig. 1). 직장흡인액에서 PCR 결과는 flaa 와 16S rrna gene 이 caga 와 urec 보다높았다. 말단회장흡인액에서 flaa 는 20 명중 17 명 (85.0%) 에서양성을보였고, 16S rrna gene 도 17 명 (85.0%) 에서양성을보였다. caga 은 12 명 (60.0%) 에서양성을보였고, urec 는 11 명 (55.0%) 에서양성을보였다 (Fig. 1). 말단회장흡인액에서 PCR 결과도 flaa 와 16S rrna gene 이 caga 와 urec 보다높았다. 말단회장흡인액에서 flaa, 16S rrna gene, caga, 그리고 urec 양성률이직장흡인액보다는높았지만통계학적으로차이는없었다 (p>0.05). 4. 배양결과와 PCR 결과비교직장흡인액에서 flaa 와 16S rrna gene 이양성인 16 명을배양결과와비교했을때, 민감도와음성예측도는 % 그

4 30 The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 56, No. 1, 2010 Table 2. Comparison of Different H. pylori DNA in Culture Positive Specimens from the Rectal Fluid Sensitivity Specificity PPV NPV caga flaa 16s rrna urec PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value. Table 3. Comparison of Different H. pylori DNA in Culture Positive Specimens from the Terminal Ileal Fluid Sensitivity Specificity PPV NPV caga flaa 16s rrna urec PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value. 리고특이도와양성예측도는 36.4% 와 56.3% 였다. caga를배양결과와비교했을때, 민감도와특이도는 88.9% 와 81.8%, 그리고음성예측도와양성예측도는 90.0% 와 80.0% 를보였다. urec는배양결과와일치하여민감도와특이도 %, 그리고음성예측도와양성예측도 % 를보였다 (Table 2). 말단회장흡인액에서 flaa와 16S rrna gene이양성인 17명을배양결과와비교했을때, 민감도와음성예측도는 % 그리고특이도와양성예측도는 33.3% 와 64.7% 였다. caga를배양결과와비교했을때, 민감도와특이도는 88.9% 와 66.7% 그리고음성예측도와양성예측도는 75.0% 를보였다. urec는배양결과와일치하여민감도와특이도 % 그리고음성예측도와양성예측도 % 를보였다 (Table 3). 이상의결과로볼때 urec가배양결과와가장잘일치하였다. 고찰 H. pylori의최초발견은십이지장궤양환자의위점막에서균의배양검사에성공하여이루어졌다. 이배양검사는많은노력이필요하고, 특별한도구들과기술이필요하며시간이오래걸려서보통임상에서쉽게시행하기는어려운검사법이다. 10 그러나연구목적을위해서는반드시필요한검사이고이를통해서항생제에대한감수성검사가가능하고 H. pylori 전파경로를밝히는데중요하다. 배양의민감도는 70-95% 정도이고, 특이도는 90% 이상이다. 위점막은시간이지나면기존의점막이떨어져나간후새로운점막으로계속적인재생이되므로위점막의 H. pylori 도점막과같이떨어져장을거쳐대변으로배출되게된다. 그러나이러한 H. pylori는담즙및장내세균들의공격으로부터살아남아야만한다는전제조건이있다. 대변으로배출된 H. pylori는다른사람의위에감염을일으키게되는데그과정은사람들의직접적인접촉이나물또는음식물같은다른매개체를통하여이루어진다고본다. 그러나대변에서 H. pylori 배양은어렵고민감도는낮다. H. pylori 분리배양이어려운이유로서는첫째, H. pylori 는배양조건이까다롭고사람의위점막에서식하지만위점막을제외한사람의체액에서는생존이어렵기때문에세균배양을위해사용하는검 체내에 H. pylori 의숫자가적어배양이어렵다. 둘째, 다른세균에의한성장억제로인해균이존재함에도불구하고배양이안될수도있다. 셋째, 다른세균을억제하기위해서는각종항균제를이용한선택배지를사용할수밖에없는데선택배지의항균제가 H. pylori 성장에억제효과가있다. 그러나위장통과가빠른경우분변에서 H. pylori 가배양되었다는보고가있어저자들은지원자에게 PEG를투여하여인위적으로위대장통과시간을짧게만들었고, 대장내시경을이용하여직장과말단회장흡인액에서검체를배양하였다. 이번연구에서는직장에서는 9명 (45.0%), 그리고말단회장에서는 11명 (55.0%) 이배양되었다. 말단회장에서직장보다더많이배양되었고그이유는대장을통과하는동안 H. pylori 수가감소하고말단회장보다상대적으로세균이많은직장에서는다른세균에의한성장억제로인해균이존재함에도불구하고배양이안될수도있다. 위장통과시간이짧아진경우 H. pylori 가장을통과하는동안생존의가능성이많을것으로생각하며본연구에서통계학적으로차이는없었으나직장보다는말단회장에서 H. pylori 배양의가능성이높았다. 1987년 Mullis와 Faloona가개발한 PCR은검체내의미량의 DNA을단시간에수백만배로증폭시켜검출할수있는방법으로우수한예민성, 검체의다양성등으로감염성질환의진단에많이이용되고있다. 11 H. pylori는 bp 길이의지놈을가지며약 1,500개의유전자를함유한다. 12 이중 47개유전자는세균의생존에필수적인단백질을코딩한다. 1992년처음으로위생검조직에서 16S rrna primer 를이용한 RT (reverse transcription) PCR을시행하여 H. pylori를검출한이후 PCR에대한여러보고가나오고있다. 13 또한 42명에서 16S rrna과 urea primer를이용한 PCR 을시행한다른연구에서 16S rrna PCR 검사는민감도 96%, 특이도 % 라는좋은결과를보였고, urea PCR 검사의특이도는높으나 (%) 민감도는 64% 로낮았다고보고하였다. 14 H. pylori가음성인환자에서 16S rrna gene을이용한연구를보면 11명의대변에서 PCR 음성으로특이도는 % 였다. 15 H. pylori가음성인환자대변에서 caga PCR검사연구에서도특이도 % 을보였다. 16

5 Kim DH, et al. Detection of H. pylori after PEG Ingestion in UBT-positive Healthy Adults 31 직장에서 PCR 결과를볼때 flaa는 20명중 16명 (80.0%) 에서양성을보였고, 16S rrna gene도 16명 (80.0%) 에서양성을보였다. caga은 10명 (50%) 에서양성을보였고, urec는 9명 (45%) 에서양성을보였다. UBT가양성인 20명중 flaa와 16S rrna가가장높게발견되었다. 말단회장에서 PCR결과를보면 flaa는 20명중 17명 (85.0%) 에서양성을보였고, 16S rrna gene도 17명 (85.0%) 에서양성을보였다. caga은 12명 (60.0%) 에서양성을보였고, urec는 11명 (55.0%) 에서양성을보였다. 말단회장에서도 UBT가양성인 20명중 flaa와 16S rrna가가장높게발견되었다. 각각의 DNA를직장과말단회장에서검출률을비교했을떄 flaa, 16S rrna gene, caga, 그리고 urec 양성률이직장보다는말단회장에서높았지만통계학적으로차이는없었다 (p>0.05). PCR법의취약점으로는위양성외에생균과사균의구분이어렵다는것이다. 17 일부환자에서배양은음성이나 PCR에서양성인경우는살아있는 H. pylori 보다는죽어있는 H. pylori 존재를의미할수있겠다. 따라서 PCR 결과만을가지고는살아있는 H. pylori 존재를확인할수는없으므로배양을시행했고배양결과를 PCR결과와비교하였다. H. pylori 전파경로를알기위해서는대변에서 H. pylori 존재를확인하는것이가장좋지만대변에서배양은어렵기때문에, 저자들은말단회장과직장흡인액에서배양과 PCR을시행하였고사람의위에있는 H. pylori가 PEG 투여후일부환자의말단회장과직장에서 H. pylori 존재를확인할수있었다. H. pylori 전파경로를알지못하면치료되었다하더라도재감염을방지할효과적인방법이없어서완전한치료가이루어지기어렵다. 대변에서구강으로전파방법의규명을위해서는우선적으로대변에서 H. pylori 를배양하는것이최우선의과제이므로대변에서 H. pylori 를배양하고자하는많은노력이있었으나이전까지는성공하지못하다가 1992년처음으로성공하였다. 6 이들은잠비아에서 23명의설사를하는소아중 9명의대변에서 H. pylori 배양에성공하였는데배변한지 20분이지나지않은신선한대변을배양에사용하였다. 대상소아에서는대변의장통과시간이매우짧아다른장내세균의공격을적게받고담즙에의한영향을적게받았을것으로예상되어이들이배양에성공하는데기여하였을것으로생각된다. 이후네덜란드에서도 10명중 1명에서배양에성공했다는보고가있다. 18 저자들은 H. pylori 전파경로를간접적으로알아보기위해서지원자들에게연구의목적을설명하고 UBT를시행하였고, UBT 양성인 20명에서 PEG를투여하고대장내시경을시행하였다. 직장과말단회장흡인액에서검체를배양하고 PCR를시행하였으며직장흡인액과말단회장흡인액에서 H. pylori 배양에성공했고배양결과와 PCR 결과를비교하였다. H. pylori DNA (flaa, 16S rrna gene, caga, 그리고 urec) 중 urec가가장배양결과와일치했다. 위장통과시간이빠른경우 H. pylori는직장과말단회장에서생존가능성이높아짐을알수있었다. 그러나 H. pylori 를직장과말단회장에서발견하였다고하여직장과말단회장에서발견된 H. pylori가사람에서배출된뒤에자연환경에서존재하다가다시위로들어가생존할수있는지는알수가없다. 추가적인연구가필요하다고하겠다. 요약목적 : H. pylori 전파경로를간접적으로알아보기위해서위장관통과시간이짧아진경우에말단회장과직장에서 H. pylori 존재를알아보고자하였다. 대상및방법 : 2007년 3월부터 2007년 9월까지건강검진을위하여순천성가롤로병원을방문한정상성인 35명중 20명에서 UBT양성이나왔으며 20명을대상으로대장내시경전처치제인 PEG 4 L를대장내시경전날투여하고대장내시경을삽입후직장에남아있는체액을흡입하여배양과 PCR을시행하였다. 말단회장에서는세균오염을방지하기위하여멸균소독이된관 (catheter) 를이용하여체액을흡입하여배양과 PCR을시행하였다. 결과 : 대장내시경전처치제를투여하고직장 (45.0%) 과말단회장 (55.0%) 에서 H. pylori를배양할수있었다. 말단회장에서 flaa와 16S rrna gene이양성인 17명을배양결과와비교했을때, 민감도와음성예측도는 %, 그리고특이도와양성예측도는 33.3% 와 64.7% 였다. caga를배양결과와비교했을때, 민감도와특이도는 88.9% 와 66.7% 그리고음성예측도와양성예측도는 75.0% 를보였다. urec는배양결과와일치하여민감도와특이도 % 그리고음성예측도와양성예측도 % 를보였다. 이상의결과로볼때 urec가배양결과와가장잘일치하였다. 결론 : 위장통과시간이빠른경우 H. pylori는직장과말단회장에서생존가능성이높아짐을알수있었다. 이는 H. pylori 가대변에서구강으로전파될수있음을시사하는소견이라하겠다. 색인단어 : 요소호기검사, 헬리코박터파일로리균, 폴리에틸렌글라이콜참고문헌 1. Li C, Ha T, Ferguson DA Jr, et al. A newly developed PCR assay of H. pylori in gastric biopsy, saliva, and feces. Evidence of high prevalenceof H. pylori in saliva supports oral transmission. Dig Dis Sci 1996;41: Pytko Polonczyk J, Konturek SJ, Karczewska E, Bielański W, Kaczmarczyk-Stachowska A. Oral cavity as permanent reser-

6 32 대한소화기학회지 : 제 56 권제 1 호, 2010 voir of Helicobacter pylori and potential source of reinfection. J Physiol Pharmacol 1996;47: Gramley WA, Asghar A, Frierson HF Jr, Powell SM. Detection of Helicobacter pylori DNA in fecal samples from infected individuals. J Clin Microbiol 1999;37: Thomas JE, Gibson GR, Darboe MK, Dale A, Weaver LT. Isolation of Helicobacter pylori from human faeces. Lancet 1992;340: Kelly SM, Pitcher MC, Farmery SM, Gibson GR. Isolation of Helicobacter pylori from feces of patients with dyspepsia in the United Kingdom. Gastroenterology 1994;107: Madinier IM, Fosse TM, Monteil RA. Oral carriage of Helicobacter pylori. a review. J Periodontol 1997;68: Luman W, Alkout AM, Blackwell CC, Weir DM, Palmer KR. Helicobacter pylori in the mouth-- negative isolation from dental plaque and saliva. Eur J Gastroenterol Hepatol 1996;8: Lin SY, Jeng YS, Wang CK, et al. Polymerase chain reaction diagnosis of Helicobacter pylori in gastroduodenal diseases: comparison with culture and histopathological examinations. J Gastroenterol Hepatol 1996;11: Falsafi T, Favaedi R, Mahjoub F, Najafi M. Application of stool-pcr test for diagnosis of Helicobacter pylori infection in children. World J Gastroenterol 2009;15: Vaira D, Gatta L, Ricci C, Miglioli M. Review article: diagnosis of Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther 2002;16(suppl 1):S16 S Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987;155: Tomb JF, White O, Kerlavage AR, et al. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 1997;388: Engstrand L, Nguyen AM, Graham DY, el-zaatari FA. Reverse transcription and polymerase chain reaction amplification of rrna for detection of helicobacter species. J Clin Microbiol 1992;30: Peek RM Jr, Miller GG, Tham KT, et al. Detection of Helicobacter pylori gene expression in human gastric mucosa. J Clin Microbiol 1995;33: Kabir S. Detection of Helicobacter pylori in faeces by culture, PCR and enzyme immunoassay. J Med Microbiol 2001;50: Sicinschi LA, Correa P, Bravob LE, Schneidera BG. Detection and typing of Helicobacter pylori caga/vaca genes by radioactive, one-step polymerase chain reaction in stool samples from children. J Microbiol Methods 2003;52: Kim GH, Ok CM, Yu YI, et al. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy specimen by polymerase chain reaction. Korean J Med 1997;52: Namavar F, Roosendaal R, Kuipers EJ, et al. Presence of Helicobacter pylori in the oral cavity, oesophagus, stomach and faeces of patients with gastritis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1995;14:

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