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경아 기
6 years ago
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1 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1 KNUmbl 경북대학교미생물공학연구실 4 장. 발효공정과장치

2 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 미생물의배양형식 1. 액체배양과고체배양가. 액체배양 : 표면배양 (surface culture), 심부배양 (submerged culture) 나. 고체배양 : 밀기울등의고체배지사용 1) 정치배양 : 공기의자연환기또는표면에강제통풍 2) 내부통기배양 ( 강제통풍배양, 퇴적배양 ) : 금속망또는다공판을통해통풍 2. 회분배양, 유가배양, 연속배양가. 회분배양 (batch culture) : 제한된기질로 1회배양나. 유가배양 (fed-batch culture) : 기질을수시로공급하면서배양다. 연속배양 (continuous culture : 기질의공급및배양액회수가연속적진행 steady state( 정상상태 ): 기질및산물농도, 균체량, 균체증식단계등동일 연속배양회분배양정상과정균체적응과정기질배양시간 단단형 (single stage) 다단형 (multistage) 기질배양액기질배양액배양산물생산

2016-09-27 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 3 * 연속배양 Kinetics 1) t시간배양후의전체세포량세포의증식속도 ( 세포량의증가속도 ) : 초기세포의양에비례 dx / dt = µx (dx / dt : 세포량의증가속도, µ : 비증식속도, x : 세포량---g/l or 개 /l) dx / x = µdt t

3 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 3 * 연속배양 Kinetics 1) t시간배양후의전체세포량세포의증식속도 ( 세포량의증가속도 ) : 초기세포의양에비례 dx / dt = µx (dx / dt : 세포량의증가속도, µ : 비증식속도, x : 세포량---g/l or 개 /l) dx / x = µdt t 에대하여적분 t : 0---t, x t : x 0 ---x t (x 0 : 초기 cell mass, x t : t 시간후의 cell mass) X t = x 0 e µt 2) mass doubling time(td)= generation time(h) ln x t / x 0 = µt 에서 x t 가 x 0 의 2배가될때소요된시간 td = ln 2x 0 / x 0 = ln2 /µ = /µ

4 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 4 3) 비증식속도 µ (specific growth rate) ln x t / x 0 = µt x t, x 0 : 실험적으로구하여 t 에대한 ln x t / x 0 를 semilog graph 에 plot ln x t / x 0 slope = μ 4) D: 희석율 (dilution rate, h - ) D = F/V = 1/RT F: flow rate (l/h), V: reactor volume (l), RT: retention time (h) = V/F t 5) 희석율과 µ 와의관계배양조내의세포증가속도 = 0 배양조내 dx / dt = growth - output = 0 µx - Dx = 0 µ = D 비증식속도는 D 에의해조절

5 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 발효공정 1. 발효공정개요 -94 페이지, 그림 4-5 장치살균 종모배양 발효 생산물회수, 제품화 ( 원료주입 - 살균 - 접종 - 증식 ) ( 원료주입 - 살균 - 접종 - 증식및발효 ) * 종모 (starter) : 발효를위한미생물균주를배양한것 - 술의경우주모 ( 밑술, 술밑 ), 식초경우종초, 발효유제품경우유산균균체

6 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 6 2. 발효경과의유형 : primary, secondary metabolites 와약간관련 Type I : 증식관련형 --에너지대사기질의 1차대사경로--분해경로 A --- B --- C P -trophophase( 영양증식기 ) 와 idiophase( 특이생산기 ) 구별무 ( 균의 1 차대사와관련 ) - 균체생산, 에탄올발효, gluconic acid 발효등 Type II : 중간형 에너지대사-기질로부터 1차대사와는다른경로로생성 A --- B --- C 차대사 X --- Y P( 산물 ) : 2차대사산물--합성경로 - 영양증식기와특이생산기약하게구별 - 증식관련형대사물질중대사조절 - 유기산, 아미노산, 핵산관련물질 양 균체 산물 t Type III : 증식비관련형 -- 균의증식이끝난후산물의생성 - 균의 1 차대사와산물의생성이완전히따로진행 - 주로합성경로의중간산물로부터생산 - 항생물질, 비타민, glucoamylase 등 양 균체 산물 * 불명확 : 젖산 - I 와 II 의중간어떤항생물질 - II 와 III 의중간 t

7 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 발효조 ( 배양조, fermentor, bioreactor ) * 발효조기본형식 - 대부분이호기성배양 - 공기공급, 배양액순환및동력절감문제착안 - 공기분산방법 - 교반, 펌프, 고압공기, 기상이용 ( 미생물피막위에공기순환 ) 비교 ) 혐기성배양경우밀폐 ( 산소차단 ), 공기제거 ( 편성혐기성 ) 1. 표준형발효조 : 통기교반형발효조 (STF, stirred tank fermentor 1) 충돌판 (baffle): 용액의회전방지 - 용액혼합유도 2) 교반기 (agitator=impeller): 혼합, 공기세분, 분산 -paddle, propeller, turbine 형 3) 공기취입장치 (sparger): 공기액내분산주입 - 교반기바로밑에부착 4) 기타 : 미생물접종구, 온도조절, ph 전극, 산과알칼리첨가구, 시료채취구

8 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 8 2. Waldhof 형 : 통기회전원판을통해공기주입 - 액의순환및거품의파괴유도 - 기포의기계적처리로동력비절감, 산소의이용효율증가 3. Acetator와 cavitator: 독일의 Frings가고안 공기의자연적흡입유도 1) Acetator 형 : 통기교반조의변형 - aerator 회전으로액과공기흡입및혼합방출 : 축으로부터공기흡입 + 터빈으로부터액흡입 혼합방출 2) Cavitator 형 : Waldhof의변형 - 소형날개고속회전으로 cavitation 유도 Cavitator 형 Waldhof 형

9 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 9 4. 기포탑형 (air lift fermentor): 공기의공급으로기포와배양액이위로상승 - 공기및배양액의순환용이 -SCP 생산에유리 5. 탑발효조 ( 단탑형, tower fermentor): 배지및공기가상승하며발효계속 - 기질소비율향상 - 산물생성기와증식기가다른경우유리 기포탑형 탑발효조

10 4-4. 산소공급 대부분발효과정 : 호기적즉미생물증식및발효에산소요구 영양분 + 산소 균체 + 산물 6.67CH 2 O + 2.1O C 3.92 H 6.5 O CO H 2 O 7.14CH O C 3.92 H 6.5 O CO H 2 O ( 미생물균체 ) 1. 미생물의호흡속도 : Q O2 = 호흡에의한산소의소비속도 O 2 의낮은용해도 (10 ppm), 배양액과접촉면에서만공기용해 - 산소가증식제한인자로작용 - 호기적배양경우미생물호흡속도 = 미생물증식속도 - 세균, 효모 : 점성무, 방선균, 곰팡이 : 점성 ( 발효조건따라변화 ) * Q O2 : 용존산소 (DO) DO 증가에따라증가, 일정범위이상의 DO 에서는일정 - 그 DO 농도를임계산소분압 (critical DO) QO2 DO> 임계산소분압 - 동력비 DO<임계산소분압 - 증식속도 DO DO= 임계산소분압 - 가장유리 critical DO KNU Microbial Biotechnology Laboratory 10

11 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 11 * 용존산소와미생물의호흡속도관계식 : Q O2 = Q m C L / (K o + C L ) Monod 식 : 제한기질과미생물증식속도관계식 - 산소가제한기질로작용 μ = μ m S / (K s + S) 에서 ( 효소의경우 v = V max S / [K m + S]) u - Q O2 비호흡속도 (specific O 2 uptake rate) 로하면 u m - Q m ( 최대 Q O2 ) S - C L ( 액체의 DO 농도 ) K s - K o (O 2 에대한 Michaelis-Menten 상수 )- 최대호흡량 1/2 호흡시액체 DO 농도 2. 산소이동 : 산소물에용해 용액중확산 ( 교반 ) - 세포흡착 ( 액상 - 세포 ) step1 step2 step air bubble O 2 DO O 2 in cell 기상 - 기상은무시, 기상 - 액상이가장결정적 ( 산소의용해 ) * 산소의용해속도 : 기포표면적에비례, 용액의 DO 와포화 DO 차에비례 dc L /dt a(c S - C L ) (C L : DO 농도, CS: 포화 DO 농도, a : 기포표면적 ) dc L /dt = K L a(c S - C L ) = OTR(oxygen transfer rate, mmo 2 /l.hr) K L : 액경막의산소이동계수 - 기경막의산소이동계수 (K g ) 무시 * K L a : 산소이동용량계수 (Volumetric oxygen transfer coefficient) - 기포에서용액으로산소가용해될때두변수 K L 과 a 를합쳐서고려한것

2016-09-27 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 12 4-5. 무균기술 1. 살균가.

2) 연속살균 : 연속살균장치 (continuous sterilizer) 배지를연속적으로공급하면서살균 - 열교환형, 증기취입형연속살균기나.

12 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 무균기술 1. 살균가. 배지 : 증기살균 ( 배지성분변화위험 ) 보통 120, 15~20 분이적합 1) 비연속살균 : 소형발효조내에서살균 승온과냉각에긴시간소요 배지성분파괴위험 살균조건매우중요 2) 연속살균 : 연속살균장치 (continuous sterilizer) 배지를연속적으로공급하면서살균 - 열교환형, 증기취입형연속살균기나. 장치 : 증기살균, 가스살균 (ethylene oxide : 에서비등 ) 예열및예냉 연속살균장치 Plate exchanger type Steam injector-flash cooler type -열교환형연속살균기 -증기취입형연속살균기

13 [ 살균이론 ] 살균속도 -dn/dt = kn [k : 비사멸상수 (specific death rate), N : 생세포수또는양 ] 1/N dn = -k dt t : 0---t, N : N o ---N t N t t N 1 / N dn = - k dt [ln N] t t = -[kt] 0 0 N 0 ln N t - lnn 0 = -kt N 0 -kt = ln N t /N o * Determination of k ln N t / N o = -kt ( 일정살균과정중시간에대한 N 수실험적측정 ) N 온도증가 Ln N t /N 0 slope = -K 고온 : K 증가 t t KNU Microbial Biotechnology Laboratory 13

14 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 여과 : 공기 가. Depth filter : 주로공기처리 % 제균 여과공기 압축공기 유리섬유 충진층 : 섬유상매트릭스 ( 유리섬유, 합성수지 ) - φ 수십 μ 이하 1m 이상설치 ) 살균효과 : 관성충돌, 접촉 ( 섬유간격 ), 확산 ( 브라운운동 ) 나. MF(microfiltration) : pore : φ0.22, 0.45 μ 완전제균가능 - 주로 membrane filter 사용 : cellulose acetate, cellulose nitrate, - 압력손실증가 - 먼저일반적여과후사용 (depth filter) 4-6. 무균조작 : 주입기 ( 밀폐, 무균 ), 세병기 (NaOH 및열수 ), 병 ( 고온상태병입 ) 4-7. 발효공정의계측온도 : 온도계 ph : 복합유리전극 은, 염화은전극에염화칼륨을전해액으로사용 DO : DO meter 용존산소전극사용공기유량 : flowmeter ( 유량을전기적신호로변환 )

15 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 발효공정제어 * 발효공정제어 : 자동화 - 각탱크가 computer 와연결 - 원료공급, 살균, 접종, 발효, 통기등자동조절

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17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 17

18 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 18 * Rapid sampling system *** Rapid sampling system :..\zrapid sampling.mpeg

19 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 고체배양장치 1. 국개법 ( 누룩상자, 국상자 ) : 발효접시에수동식배양 표면의자연공기이용 2. 다단표면통풍식 : 국개법을개량한정치배양 - 다단의국개표면에온도와습도조절된공기공급하면서배양 국개 3. 회전드럼식 : 배양상자를회전원통안에장치 원통의회전에의한혼합효과 - 내부로온도습도조절된공기를공급하면서배양

2016-09-27 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 20 4.

20 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 고체내부통풍식 : 고체통기배양장치 - 다공판배양조아래로온도, 습도조절된공기가공급되어위로배지층통과 5. 밀폐식배양장치 : 원료증자와미생물배양을하나의장치안에서수행 - 선반식, 통기식, 회전드럼식등

week10.hwp

week10.hwp 9 생물반응기 우리는이미 5장발효공학에서발효또는세포배양법에는회분식배양 (batch culture), 연속식배양 (continuou culture), 유가식배양 (fed-batch culture) 이있고발효조의종류에는통기교반형발효조 (tirred tank fermentor), 기포탑형발효조 (air-lift fermentor) 과유동층발효조 (fluidized