하고있다. Factor 검사에대한 NCCLS 지침서에따르면표준물질을이용하여검사전표준곡선 (reference CUfve) 과작업곡선 (working curve) 을작성하여검사하여야하고환자검체와직선성 (linearity), 평행성 (parare11ism), 벗어남 (out

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서빈 강
6 years ago
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1 일상범리검사과획외 XI: 저 134 권저 12 호, 36-41, 2002 Factor VI 검사에 Heparin 이미치는영향에대한증례보고 인제대학교임상병리학과, 울산의대서울아산병원진단검사의학과 l 김승일 최성욱최미옥김천희초 수진지현숙 1 Cases of Factor VI Assay Affected by Heparin. Kim, Seung Il., Choi, Sung Wuk 1, αloi, Mi Ok 1, Kim, Chun Hee 1, Choi, Su Jin 1., Chi, Hyun Sook 1 Department 01 Laboratory M edicine, College 01 M edicine, University 01 Ulsan and Asan M edical Center, Seoul, Korea Clinical Laboratorγ Science, Inje University, Seoul, Korea 1 Factor vm assay is a test for diagnosis of hemophilia A, and a way to monitor after factor replacement therapy and risk assessment of premature atherosc1erotic vascu1ar disease. The purpose of this study was to suggest the cases in which the factor vm assay was affected by heparin contamination in factor vm assay samples drawn from heparin therapy patients. According to the guide for the Factor vm assay in NCCLS (National Committee for Clinical Laboratoη Stan없rds), two types of reference curves are employed, 때 extended curve and a working curve. The reference and patient results should be inspected for out1iers, parallelism, and linearity. We perform a factor vm assay according to the NCCLS guideline 4 point calibration curve and 1: 10, 1:20 di1uted samples for patients. However, 4 cases of heparin contamination showed the reverse resu1t of the patient s s없nple. There was an exact error in linearity and parallelism between the stan없rd curve and patients curve. The dilution used for patients of heparin contamination are 1: 10 to 1:40 때d compare with the calibration curve. We analyzed the hep따in concentration on heparin contaminated plasma. If you assay three di1utions of test plasma on the patients, you could detect the error of the resu1t affected heparin. Key Words : Factor vm assay, Heparin, NCCLS, Parallelism 1. 서론thromboplastin time test) 검사가연장되는경우다음 과정으로시행되며, 검사에영향을주는다양한요 Factor vm 검사는 hemophilia A 를진단하고 factor 인, 즉검체채취, 항응고제, 검체보관, 시약, 검사장 비, 검사자의숙련도등에민감하여검사가까다로 replacement therapy 후경과추적및 premature atherosclerotic vascular disease 의위험도측정으로이용되 고있다 (Eugene L 등, 1997). 혈액응고의내인계경로 의전반적인기능을반영하는뻐 TI (avtivated partial 우므로특히세심한주의가요구된다. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) 에서는이검사를위해검사에자세한지침을제시 36

2 하고있다. Factor 검사에대한 NCCLS 지침서에따르면표준물질을이용하여검사전표준곡선 (reference CUfve) 과작업곡선 (working curve) 을작성하여검사하여야하고환자검체와직선성 (linearity), 평행성 (parare11ism), 벗어남 (outliers) 을확인한후결과를보고하도록하고있다. 본원에서는위지침에따라 Factor VIH 검사시마다 4 포인트의 calibration curve를작성하고환자검체의경우 1: 10, 1:20까지희석하여검사하고있다. 작업곡선과검체희석결과에서평행성을벗어나는사례를발견하였는데이현상이 heparin에의한영향임을확인하였기에이를보고하고자한다. 추후 heparin 사용환자또는 Venous Access Devices (VADs) 를장치하고있는환자의겸체에서 heparin 의오염이의심되는경우결과보고시주의해야하기에소개하고자한다. ll. 재료및밤법 2) 기기및시약 a. Factor VIH 측정자동혈액응고분석기인 STA-compact (DIAGNOSTI CA STAGO, Fr; 때ce) 을이용하여측정하였다. Factor VIH 에 대한 calibrator 는 STA-Unicalibrator (DIAGNO STICA STAGO, France) 을사용하였으며 정도관리 물질로 STA System Control N+P (DIAGNOSTICA STAGO, France) 와표준희석용액 ST A -Owren-Koller (DIAGNOSTICA STAGO, France) 를사용하였다. Factor VIH 측정은 STA De젠cient VIH (DIAGNOSTICA STAGO, France), PTT A (DIAGNOSTICA STAGO, France), STA CaCb 0.025M (DIAGNOSTICA STAGO, France) 을사용하였으며, 동결건조된시약은 3차증류수에녹여실온에서 30분간방치후사용하였다. b. Heparin 측정 Heparin 측정은 Stac10t hep따in (DIANOSTICA STAGO, France) 을사용하였고, ca1ibrator로 heparin 농도가 0.0 IUjml, 0.03 IUjml, 0.6 IUjml 로구성된 Hepanorm H (DIANOSTICA STAGO, France) 를사용 하였다. 측정시약은 human substrate plasma 와약 1. 재료 2002 년 4 월 1 일부터 6 월 30 일까지본검사실에 0.3IU 의 bovine factor Xa, calcium 을포함한 phospho1ipids 성분이포함된 Stac10t heparin (DIANOSTI CA STAGO, France) 을사용하였다. 그리고정도관 factor VIH 검사가의뢰된환자의겸체중평행성에서 리물질로는상용화된 heparin control 을사용하였다. 벗어나는환자의겸제 4 례를재료로하였다. 3) 검사 2. 방법 1) 겸체 Factor VIH Factor VIH측정시사용되는 ST AGO-compact은기기내에시약들을장착한후에표준곡션을그리기위해 STA-Unicalibrator (DIAGNOSTICA STAGO, France) 를사용하여검사한다. ST A -Unicalibrator는표준 검사는 CT AD (citrate theophylline adenosin dipyridamole) 항응고제가들어 있는채혈관에 희석용액에의해 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 으로희석되어 항응고제와겸제를 1 : 9의비율로채혈한후 3,000 rpm에서 15 분간원섬분리하여혈소판결핍혈장 (platelet poor plasma) 을분리하고분리된혈장을 -70 에서급속냉동하여보관하며검사 30분전 37 0C 항온수조에서해동하여검사에사용하였다. 지며희석된검체는 ST A -deficient VIH과각각 1(100 μ): 1 (1 00μ) 로흔합되고 appt 시약 (1 00따 ) 이첨가된다. 3 분후 37 0 C 항온장치에서 0.025M CaCb를첨가하게되고응고되기시작한시간은반응관안구슬을진동하여측정하게된다. 37

3 STAGO-compact내에서응고된시간을 log-log 그래프에서 standard factor vm level(%) 을 X축상에나타내고응고된시간을초 (second) 로 Y축에나타내준다. STA- System Control N+P로정도관리를시행하고환자의겸체는표준희석용액과 1:10, 1:20으로희석된검사를진행하게되며표준곡선에서얻어진그래프에대입하여결과가 factor vm level(%) 로나타난다. 1:10과 1:20으로검사하고 1:10으로검사한결과값과 1:20으로겸사한결과값에 2를곱한값의차이가 20% 이상이날경우 1:40까지검사하여 4를곱한값을구하고세결과중차이가적은두결과의평균값으로결과를보고한다. Heparin측정의검사원리는 antithrombin m 와 heparin의 complex를이용하였다. 체내에서 heparin은 antithrombin II 와결합하여 antithrombin m-heparin complex를형성한다. 이 complex에과량의 Xa를첨가하면 antithrombin m-heprin-xa complex가형성되게되고, 여기에서반응하고남은 residual Xa의 cloting activity를측정하여 heparin level을알아보는것이다. 그러나체내의 antithrombin m 의양에따라서 heparin level 이잘못측정될수있으므로 Staclot he 빠in 시약중 human substrate plasma에과량의때ti thrombin m 와같은인자를첨가하여응고인자에의해올수있는측정오차를방지하였다. 도는 1.59UIfml 였다 ( 정상치 (Table 1). 범위 0.OO-0.10UI/ml) Table 1. πle res버 t of ca않s Factor VIU activity and hep따in concentration 증례 1. 허 공 조 이 Nonnal 100 % 80 ~ 70 홍 ~ 혈중 heparin Factor 때희석배수별 activity (%) 농도 (Ul/m1) 1: :20 1:40 결과 잃 l11 후훨擺 1 :10 1 :20 1 :40 1 :80 다 luöoo Fig. 1. The result of H 버 100 s. ill. 결 과 2. 증례 2 1. 증례 1 환자허 00는 68세여자로 PT 83.7% 1. 14INR, %π 가 69.7sec로 aptt 결과가연장되어있었으며, 혈소판수치는 432,α)()/mm 3 으로정상이었다. Factor vm 검사는검체와희석용액을 1:10, 1:20으로희석하여검사하였고각각 41%, 63% 의결과를얻었다. 두결과값이 20% 이상의차이를보여 1:40으로검체를희석하여 Factor vm을검사한결과 47% 였으며, 환자투약력을조회한결과 heparin 25, 아 )()IU를투여한것을확인하였다 (Fig. 1). 환자의 heparin 혈중농 환자공 00는 68세여자로 PT 91.5% 1.08INR, 뻐TT가 100.5sec로연장된결과를보였으며, 혈소판수치는 228, 아 ] 이mm 3 으로정상이었다. Factor vm 검사는검체와희석용액을 1:10, 1:20으로희석하여검사하였고각각 52%, 55% 의결과를얻었다. 두결과값이 20% 이상의차이를보여 1:40으로겸체를희석하여 Factor vm을검사한결과 29% 였으며, 환자투약력을조회한결과 heparin 25,OOOIU를투여한것을확인하였다 (Fig. 2). 환자의 heparin 혈중농도는 1.22 UI/ml 였다 (Table 1). 38

5mι4l nu nu Qnu ιgu nu $) 7I nu ---> RU nu Fhu nu 4 qu nu nu 끼nu 4--nu nu [J ca 굽 tor 1--- 곰 00 였고각각 57%, 46% 의결과를얻었다.

3. 증례 3 환자조 00 는 31 세남자로판 101.8% 0.991NR, π 가 84. Osec로연장된결과를보였으며, 혈소판수치는 207,α)()/mm 3 으로정상이었다.

두결과 값이 20% 이상의차이를보여 1:40 으로검체를희석 하여 Factor VIH 을검사한결과 33% 였으며, 환자투 약력을조회한결과 heparin 30,OOOIU를투여한것을확인하였다 (Fig. 3). 환자의 heparin 혈중농도는 1.41 Ul/m1 였다 (Table 1).

!-'-calibrator' - 톨 - 조 00 환자이 00 는세여자로 R 90.4 % 1.091NR, 뻐 π 가 11 1. 4sec 로연장된결과를보였으며, 혈소판수치 는 210,α)()/mm 3 으로정상이었다.

00 90 80 효 70 를 60 o 50 tí 40 ~ 30 20 10 O 1 :10 1:20 1:40 다 lution 1:80 - Calibrator,- 톨 - No

4 5mι4l nu nu Qnu ιgu nu $) 7I nu ---> RU nu Fhu nu 4 qu nu nu 끼nu 4--nu nu [J ca 굽 tor 1--- 곰 00 였고각각 57%, 46% 의결과를얻었다. 두결과값이 20% 이상의차이를보여 1:40으로검체를희석하여 Factor vm을검사한결과 46% 였으며, 환자투약력을조회한결과 heparin 25000IU를투여한것을확인하였다 (Fig. 4). 환자의 heparin 혈중농도는 0.94 UI/m1 였다 (Table 1). 1 :10 1 :80 Fig. 2. The result of Kong 00 s coagulation factor 때 coagulation factor. 3. 증례 3 환자조 00 는 31 세남자로판 101.8% 0.991NR, π 가 84. Osec로연장된결과를보였으며, 혈소판수치는 207,α)()/mm 3 으로정상이었다. Factor VIH 검사 는겸체와희석용액을 1:10, 1:20 으로희석하여검 사하였고각각 32%, 1 :20 1 :40 Dilution 35% 의결과를얻었다. 두결과 값이 20% 이상의차이를보여 1:40 으로검체를희석 하여 Factor VIH 을검사한결과 33% 였으며, 환자투 약력을조회한결과 heparin 30,OOOIU를투여한것을확인하였다 (Fig. 3). 환자의 heparin 혈중농도는 1.41 Ul/m1 였다 (Table 1). (영)---> gqmι4l rl nu r nu rnu F 7I nu rf nu t nu nu ι r. nu rt nu 4l nu nu 4. 증례 4 1:10 1:20 1:40 Dilution 1:80 Fig. 3. πle result of Cho 00 s.!-'-calibrator' - 톨 - 조 00 환자이 00 는세여자로 R 90.4 % 1.091NR, 뻐 π 가 sec 로연장된결과를보였으며, 혈소판수치 는 210,α)()/mm 3 으로정상이었다. Factor VIH 검사는 겸체와희석용액을 1:10, 1:20 으로희석하여검사하 효 70 듬 60 o 50 tí 40 tf o 1 :10 1 :20 1:40 Dilution 1:80 i -+- Calibrator [--- 이 00 Fig. 4. 까 le res 띠 t of Lee 00 s coagulation factor 때 coagulation factor VIll 효 70 를 60 o 50 tí 40 ~ O 1 :10 1:20 1:40 다 lution 1:80 - Calibrator,- 톨 - Norrml Fig.5. πle result of no heparin πeatment coagulation factor VIll. N. 고화미 E프 ::;It: Factor vm은 antihemophilic factor (AHF), antihemophilic globulin, anti-hemophilic factor A 또는 Factor VIH:C 라불리워지며 apti 검사에서연장을보이고 뼈뼈19 t않t에서교정이되는경우시행하게된다. 이검사에서 Hemophilia A를진단하고 factor replacement therapy의경과추적, prematui"e atherosclerotic vasc띠ar disease의위험도측정등을할수있다. Factor VIH 검사는검체채취, 항응고제, 검체보관, 시 약제조, 검사장비, 검사자의숙련도등에민감하여 켜를로 39

5 검사가까다로우며 inhibitor의존재등에따라결과의해석이달라질수있으므로특히세심한주의가요구되는검사이다 (Eugene L 등, 1997). 특히 heparin의경우 Factor vm 검사에영향을미치게되는데 heparin에의한영향이나타날가능성이있는경로는경구용약물, 피하주사제또는 VADs (implanted venous acess devices) 에서채혈할경우일어날수있는오염등이며몇몇연구들이 heparin은 PT겸사와 aptf검사에영향을마친다고하였다 (Keller FG 등, 1998) (Merenstein GB, 1971). 특히 Marilyn J. 등 (2α)()) 의연구에의하면소아환자들에서 VAD로채혈하여 Factor vm검사를시행할경우채혈시 10mL 식염수액으로 heparin을제거한후 I On 止혈액을취하여버리고채혈한경우에도 heparin 오염으로인해 5% 는부정확한결과를얻었다고보고하였고 hep따in에대한영향을제거하기위해 heparin 중화제인 heparinase로처리해서검사한결과좋은결과를얻을수있었다고하였다. 원에서는 NCCLS 지침에따라 Factor vm 검사를시행하고있으며 NCCLS 지침서에서제시하는혈액응고검사의방법으로는 inhibitor와 Lupus anticoagulant가없고측정하고자하는응고인자의농도가 0.01 unitsjml(1 %) 이하, 다른응고인자들은 0.5 unitsjml (50%) 이상인결핍혈장을사용하며이미알고있는농도의표준물질을여러단계로희석검사하여표준그래프를그려놓고검체의응고시간에대응하는응고인자농도값을읽어서검사한다. 검사실에서처음응고인자검사하기전, 시약의 Lot, 가자동으로계산되며곡선의 직선성까지확인이 가능하다. 매검사시마다 4 단계의표준곡선을그 리고있으며, 환자의검체는 1:10 과 1:20 으로희석 해서검사하여평균값으로결과를보고하고있으나 만약두결과의차이가 20% 이상차이가있게되면 1:40 까지희석하여검사한다. 이세결과중차이가 적은두결과평균을보고하게된다. 이방법으로 Factor vm 검사를시행하던중표준곡선에대한직 선성과평행성에어긋나는현상을발견하고이에 대해추적한결과공통적으로환자뜰이 heparin 을 투여하고있는사실을발견하고이에대해보고하 고자하였다. Heparin에오염되지않은경우에서나타나는환 자겸체와표준물질의계단희석배수결과인 Fig. 5 에서볼수있듯이직선성과평행성이잘나타나는 반면, 증례 1, 2, 3, 4 에서는환자의 1:10 과 1:20 에서 표준물질의검사와는반대의결과가나타난다 (Fig 1, 2, 3, 4). 즉. 높은희석배수에서오히려낮은희 석배수의결과보다높게나타났다. 환자의약물투 여 여부를조사한결과 heparin 을투여하고있었고 (Table. 1) 환자의검체로부터혈중 heparin 농도를 확인할수있었다. 이로인해 aptt 시간이길어져 있었고, Factor vm 의 결과에서도표준곡선과평행성 에어긋난결과를보였던것으로생각된다. 본증례에서보듯이환자의빠 IT 결과가 Heparin 투여로연장되어있는경우, 혈액응고인자 vm 에 대한검사를의뢰한다면정확한결과를기대하기는 어렵다. 검사실에서는 NCCLS 에서제시한계단희석 장비의변경시, 표준물질의변경시에는 7 단계의 을통해 3 포인트이상검사하여직선성과평행성을 표준곡선을작성하고매검사시마다 3 단계이상의 작업곡선을작성하도록제시하고있으며 X 축에는 activity unit 가섣정되며 100% 또는표준혈장의 % 로 검증한후검사를시행하여, 환자의 heparin 투여여 부를알수있는체계를갖춘다면결과의오류를 막을수있을것이다. 나타낸다. 겸체의응고시간은 Y 축에표시되며각 겸체의응고시간에대응하는 % 또는 activity unit을찾아서결과를얻게된다. 환자나표준물질의결과는 outlier, parallelism, linearity 측면에서반드시검토하도록제시하고있다 (Eugene L 등, 1997). 본원에서는전자동장비인 ST AGO compact을사용하여장비자체에서표준곡션을그리고환자결과 잠고문흰 1. Eugene L, Chales F, Walter Bowie EJ, Caroll JJ, James Day H, Heinrich Joist J, Jane G Lenahan, Richard A Marlar, Douglas A Triplett. H48-A de- 40

6 tennination of factor coagulant activities: approved guide1ine. NCCLS 17: 18, Keller FG, Defazio J, Jenks F, Steiner M, Rodgers J, Ritcbey AK. The use of heparinase to neutralize residual heparin in blood samples drawn through pediatric indwelling central venous catheters. J Pediatr 132(1): , Marilyn J, Manco-Johnson, Rachelle Nuss, Linda J.Jacobson. Heparin neutralization is essential for accurate measurement of factor vm activity and i바다 bitor assays in blood samples drawn 한om implanted enous access devices. J Lμb Clin Med 136:76-79, Merenstein GB. Heparinized catheter and coagulation syudies. J Pediatr 79: , 이범세, 김현경, 김은지, 송운홍. Heparin과 aptf 의상관관계. 대한혈액수혈학회지 3(1): 17-20,

임상병리검사과악외 XI: 저 134 권저 12 호, 9-15, 2002 apti' Mixing Test 의다양한판정방법에대한벼교평가 울산의대서울아산병원진단검사의학과 최미옥 최성욱 김천희 지현숙 Evaluation of Interpretation Methods for a

임상병리검사과악외 XI: 저 134 권저 12 호, 915, 2002 apti' Mixing Test 의다양한판정방법에대한벼교평가 울산의대서울아산병원진단검사의학과 최미옥 최성욱 김천희 지현숙 Evaluation of Interpretation Methods for apti' Mixing Test Choi, Mi Ok., Choi, Seong W, k., Kim,