결과보고서_2010E _최종 (연세대_성백린)._hwp용.hwp

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1 편집순서 1 : 제출문 학술연구용역사업최종결과보고서 과제 번호 2010E 과제명국문영문 주관연구기 기관명 소재지 대 표 관 연세대학교서울시서대문구신촌동산학협력단 134 연세대학교 홍대식 성 명 소속및부서 전 공 연세대학교생명시스템분자바이러스성백린주관연구대학학 책임자 연락처 이메일 blseong@yonsei.ac.kr 연구비 80,000천원 연구기간 명총참여연구 ( 책임연구원: 1 명, 연구원: 1 명, 연구보조원: 5명원보조원: 명) 2010년도학술연구용역사업에의하여수행중인학술연구용역 과제의최종결과보고서를붙임과같이제출합니다. 붙임 : 1. 최종결과보고서 15 부. 2. 전자파일 CD 2 매. 2011년 2월 1일 주관연구책임자성백린 ( 인또는서명) 주관연구기관장홍대식 ( 직인) 질병관리본부장 귀하 - 1 -

2 210 mm 297 mm( 일반용지60g/ m2( 재활용품)) 편집순서 2 : 목차 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문 ( 한글)...1 ( 영문)...2 Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과 제1 장최종연구개발목표...3 제2 장최종연구개발내용및방법...9 제3 장최종연구개발결과...13 제4 장연구결과고찰및결론...43 제5 장연구성과...46 제6 장기타중요변경사항...48 제7 장참고문헌...49 제8 장첨부서류

3 편집순서 3 : 요약문 최종결과보고서요약문 과제명 중심단어신종인플루엔자 (A/H1N1), 저온적응생백신 주관연구기관연세대학교산학협력단주관연구책임자성백린 연구기간 저온적응약독화생백신공여균주 X31 ca를 backbone으로하여 pandemic A (H1N1) 2009 virus (A/Korea/01/2009) 의제조합생백신 (SI ca) 을제작하였다. 이생백신후 보주는모균주의생화학적특성인저온적응, 온도민감성, 그리고약독화형질을그대로 유지하고있었다. 마우스모델을이용하여고농도로접종시도몸무게감소가전혀나타 나지않아그안전성이입증되었을뿐아니라, 혈청내항체 (serum IgG), HI 항체, 그 리고분비항체 (secretory IgA) 까지모두유도할수있는점에서, SI ca 생백신후보 주바이러스가안전성 (safety) 과효능성 (efficacy) 을모두지니고있음을알수있었 다. 특히백신접종후유도된항체는자기바이러스뿐만아니라 이러스와판데믹 2009년유행성독감바 H5N1형제조합바이러스에대한우수한교차면역원성을지니고있었 다. ELISA assay 를통해테스트한결과, 혈청 IgG 와상기도 (nasal wash) 와하기도 (bronchoalveolar fluid) 의분비항체인 IgA 모두 A형독감바이러스에대한교차면역원 성을나타내었다. 이결과는 X31 ca 모균주를이용하여생백신을제작하여사용할경 우여러가지타입의독감바이러스를동시에방어할수있다는점을시사한다. 페렛을 이용하여생백신후보주의안전성과면역원성을테스트한결과도마우스와마찬가지로 독성을전혀띄지않았으며여러장기에서극히제한된증식만을보여줄뿐, 몸무게감 소나체온상승등의감염에의한증상은관찰할수없었다. 백신접종후초기에페렛 의상기도액에서는 innate immune response에관여하는 cytokine의발현이측정되어 바이러스의확산시항체형성에의한방어이외에도확산초기에즉각적인방어능력을부 여할수있는가능성을보여주었다. 따라서, SIca 생백신후보주바이러스는안전성 (safety) 와면역원성 (immunogenicity), 그리고교차면역원성 (cross-reactivity) 등을충분히지닌다는점에 서신종인플루엔자에대한효과적생백신으로사용이가능하다고볼수있다

4 편집순서 4 : 요약문( 영문) Title of Project Key Words Swine influenza, Cold-adapted live vaccine Project Institute Yonsei University Leader Project Period Baik Lin Seong We generated cold-adapted live attenuated vaccine against pandemic A (H1N1) 2009 virus (A/Korea/01/2009) in the background of X-31 ca. This reassortant virus (SIca) found to retain all the biochemical characteristics, such as cold-adaptation, temperature-sensitivity and attenuated phenotype carried by master donor strain. In mice model, immunization with Sica virus did not lead to any clinical symptom but elicited strong systemic and mucosal antibody responses, which made CAsi virus suitable as safe and efficacious live vaccine candidate. Notably, SIca virus induced substantial level of cross reactive antibody responses against seasonal influenza viruses and H5N1 pandemic reassortant viruses, suggesting that SIca virus could also serve as live vaccine against antigenically different influenza A viruses. In addition, the safety and immunogenicity of SIca virus were also analyzed in ferret model. Sica virus showed highly restrictive replication in several tissues in immunized ferrets without any clinical symptoms, but induced robust serum HI and IgG antibodies responses. Moreover, immunization with SIca virus resulted in genes expression related to innate immune response, such as IFN-r and IL-12, which could be beneficial to immediate protection at early stage of viral spread. Taken together, these results support that X-31 ca master donor strain can provide a promising platform for developing safe and effective LAIVs against both homologous and heterologous influenza infection

5 편집순서 5 : 총괄연구과제의연구결과 학술연구용역사업연구결과 제1장최종연구개발목표 목표 연구배경 - 인플루엔자바이러스는오랜기간동안인간과더불어역사를같이한바이러스로매 년사람에게많은경제적, 육체적고통을안겨주는바이러스이다. 1918년에는인플루 엔자의세계적인대유행으로인해 으며현재에도매년전세계적으로는 2000만명이상의사망자를낸역사를가지고있 만명정도의사망자를발생시키고있다 년홍콩인플루엔자의대유행이지난이후인플루엔자대유행의대략적인주기 인 40년이지난현재에이르러북미지역에서신종인플루엔자가전세계로급속도 로전파되고이다. 또한사람간의빈번한전염성을보여주고있는이번바이러스의 출현으로세계보건기구(WHO) 를비롯한전문가들은신종인플루엔자의전세계적인 대유행(pandemic) 을우려하고있는상황이다. - 조류인플루엔자바이러스의경우치사율은높은반면사람간의감염은드물었으나 이번신종인플루엔자의경우 6월 11일부로 WHO가대유행단계를최고단계인 6단 계로격상시켰을뿐만아니라, 최초발생이후단두달여만에 90여국가에서 5만 명이상의감염자와 231명의사망자가발생할만큼사람간의직접전파가매우빈번 하게일어나고있다.. 또한 1918년스페인독감의경우와같이초기감염이후소강상 태를보이다겨울철에유전적변이를통해치사율이급격하게증가된변종바이러스 가다시출현할가능성도존재한다는점에서그어느때보다이에대한대비가시급 한상황이다. 만약이번신종인플루엔자바이러스와치사율이매우높은조류인플루엔 자바이러스간의유전자재조합이이루어진새로운바이러스가발생할수있다. 따라 서이에대한연구가신속히진행되어신종인플루엔자바이러스의유행을효과적으로 제어할수있는백신의개발과치료제개발이절실한시기이다 연구개발의필요성 - 현재유행성인플루엔자뿐만아니라조류인플루엔자와같이대유행가능성이존재 하는바이러스에대해전세계적으로예방백신과치료제의개발에심혈을기울이고 - 3 -

6 있다. 특히최근에발생한신종인플루엔자의전파속도는가공할만한파괴력을지니 고있어 Tamiflu와같은치료제에만의존하기에는치료제부족의문제뿐만아니라내 성바이러스혹은변종바이러스에의해초래될수있는위험성에무방비로노출되어 있는상황이다. - 최근들어저온적응바이러스를필두로하는생백신의개발이점차각광을받는이 유는다음과같다. 첫째, 사백신과달리생백신의경우세포면역을유도시킬수있다. 항체에의한면역만으로는치명적인바이러스의감염에대해효과적인방어를할수 없다. 생백신의경우약독화된바이러스에의한감염으로인해항체면역뿐만아니라 세포면역을활성화시켜이후침입하는바이러스에대해신속하게대응할수있다. 둘째, 사백신의경우충분한방어면역을유도하기위해서는두세번의반복투여가 필요하지만생백신의경우단 1 회의접종으로도이를달성할수있는편리함이있다. 셌째, 주사를사용하여접종하는사백신과달리생백신의경우스프레이형식으로분 사할수있어접종하는사람에게편의를제공할수있다. -이번에발생한 A/H1N1 신종인플루엔자의경우는사람간의전파를막는것이무엇 보다우선순위라는점에서시급한예방접종이절실하다고할수있다. 이를위해서는 사백신뿐만아니라위와같은이점을갖고있는생백신의개발이하루빨리진행되어 야한다. 본연구팀이개발한저온적응백신균주는동물모델에서의유행성독감백신으 로서안전성과방어면역의효과가이미검증된바있다이울러 H5N1형조류인플루 엔자바이러스에대해서도면역원성이검증되었다. 본백신주는유정란에서의고성장 특성으로인해생산성에대해서도장점을지니고있다. 이번에발생한 A/H1N1형신 종인플루엔자에대한생백신균주또한이기술을응용하여신속하고도효율적인생 산이기대된다 연구목적 - 본연구는신종인플루엔자바이러스의세계적인대유행에대비하여예방백신의국 내비축을하기위한연구개발로서기존에연구가많이되어있고현재에도세계여러 국가에서개발을하고있는 고안전성이확보되며 inactivated vaccine 이외에유정란에서생산성이우수하 1회의의접종으로도충분한예방면역을줄수있는생백신을 개발하고생산공정개발, 시제품생산, 임상시험에의한신종인플루엔자 mock up 생 백신의국내제조및허가승인, 생산비축을목표로한다

7 1.2 목표달성도 연구목표 e 달성도 생백신후보주의유전자및항원안정성분석 100% 생백신후보주의교차면역원성분석 100% Ferret model을이용한생백신후보주의저병원성전환분석 Ferret model을이용한생백신후보주의면역원성평가 100% 100% 생백신후보주의속효성면역기작분석 100% 1.3 국내 외기술개발현황 신종인플루엔자의유전자특성 -인플루엔자바이러스는 8개의단일가닥 RNA(ssRNA) 를유전자로지니고있어동일 숙주에두가지이상의바이러스가동시에감염되었을겨우이들간의유전자치환이 매우빈번하게일어나는특성을지니고있다. 신종인플루엔자의경우유전자염기서 열분석결과인간, 조류, 돼지의 3가지유전자가혼합되어있는바이러스라는사실 이밝혀졌다(Fig.1). 특히돼지의경우인플루엔자의 hemagglutinin 단백질의수용체 특이성면에서인간인플루엔자와조류인플루엔자가동시에감염할수있어이들간의 재조합바이러스의출현가능성이매우높은것으로예상되고있다. <Figure 1. Lineage of the 2009 Swine Influenza Virus, Taia T. Wang et al. Unraveling the mystery of swine influenza virus. Cell(2009) > - 5 -

8 신종인플루엔자와조류인플루엔자의특성비교 - 대유행(pandemic) 을일으킬수있는잠재력을지닌바이러스로가장많이지목되고 있는것은조류인플루엔자이다. 따라서전염성이높은신종인플루엔자와치사율이높 은조류인플루엔자의재조합바이러스의출현은무엇보다위협적인요소이다. 현재까 지밝혀진조류인플루엔자와신종인플루엔자의특성을비교해보면전염성과치사율 면에서현저한차이가있다. 특히 PB1-F2라는단백질에의한독성의증가는신종인 플루엔자에서는아직까지발견되지않았다(Table 1). 그러나 RNA 유전자의변이율이 매우높다는점과, 다른바이러스와의재조합으로새로운변종바이러스출현의가능 성이존재한다. <Table 1. Comparison of Avian and Swine Influenza Viruses, Taia T. Wang et al. Unraveling the mystery of swine influenza virus. Cell(2009) > 대유행(pandemic) 대비예방백신( 사백신) 의연구및생산동향 - 신종인플루엔자는최초발생이후단두달여만에 90개국으로급속히퍼져 5만명 이상의감염사례와 230 여명의사망자를발생시키고있다(Figure 2). 현재로서는 Roche사의 Tamiflu(oseltamivir) 와 GlaxoSmithKline사의 Relenza(zanamivir) 등의항 바이러스제로감염자의치료에집중하고있으나, 우려할만한사실은이두가지의항 바이러스제의보유량이전세계적으로약 2억 5천만명 dose 분량밖에없다는것이 다. 이에따라 WHO를비롯한각국전문가들은예방백신의개발에심혈을기울이고 있다. - WHO에따르면유행성인플루엔자의경우현재연간약 6억 8천만명분의백신을 생산할수있으며 2014년까지 14 억명분의백신생산을기대하고있다. 이를조류인 플루엔자, 신종인플루엔자와같이대유행가능성이있는인플루엔자에적용할경우 첫해에전세계인구의약 20% 정도에해당하는 12억명분의백신을제조할수있 다고밝혔다(Figure 3). 그러나이수치는유행성인플루엔자백신생산을대유행바 이러스에대한백신생산으로전면적인교체상황에서만이가능한상황이므로실제로 는이보다훨씬못미칠것이라예상된다. - 백신의부족함을해결하기위한방안도여러가지로제시되고있다. 가장활발히 - 6 -

9 연구되고있는부분이 Adjuvant를백신과함께사용하여적은양으로많은사람들에 게접종할수있는기술이다. 현재 Alum 이나 MF59의면역증강효과는여러가지 사례를통해검증되고있으며이외에다양한종류의 신의부족을다소나마해결할수있는방법으로여겨지고있다. adjuvant들이개발되고있어백 <Figure 2. Map of the Spread of Influenza(H1N1), cited in <Figure 3. Global Pandemic Vaccine Production Capacity, Martin Enserink et al, Devilish dilemmas surround pandemic flu vaccine, Science(2009) > - 7 -

10 생백신연구개발의국내외동향 - 생백신의효능과안전성, 그리고편리성이부각되면서최근몇년동안인플루엔자 에대한생백신의연구와개발이활발히진행되고있다. 생백신의경우안전성면에서 여러가지방법으로약독화방법이연구되고있는데특히, 저온적응(Cold Adaptation) 이가장흔히사용되는방법으로 1985년최초로 A/Ann Arbor/6/60 저온 적응바이러스가개발된후현재까지인플루엔자 주가저온적응생백신균주로개발되었다. B 바이러스를포함한여러가지균 - 국내의생백신개발사례로는연세대학교의본연구팀이개발한유정란에서고성장 특성을지니는 X-31 바이러스의저온적응균주인 X-31 ca 바이러스가유일한경우 이며이기술을이용하여조류인플루엔자(H5N1) 에대한생백신후보균주를제작중 에있다

11 제2장최종연구개발내용및방법 2.1. 마우스모델에서의생백신후보주의면역원성분석 (secretory IgA) 연구내용 - 후보주바이러스접종후 2, 4, 6, 8주후에마우스를 sacrifice하여 nasal wash와 BALF를채쥐하여 ELISA assay 를통해생백신후보주의점막항원성을조사한다 연구방법 * Vaccination 후 NW, BALF 채취 - 5주된 BALB/C 마우스를그룹당 8 마리씩 cage에분리후 1 주일간안정시킨다. - 6주된 BALB/C 마우스에각바이러스를 dose 별로감염시킨다. - 2, 4, 6, 8주차에각 4마리씩의마우스를 sacrifice하여 NW, BALF 를채취한다. * ELISA - 생백신후보주바이러스를 96-well plate에 coating 시킨다. 이때 coating되는바이러스의농도를 10 6 pfu/well 이되게한다. - 다음날 well을 wash buffer로 5회 washing 해준다 ul/well 의 blocking buffer를상온에서 1 시간처리한다. - 3회 washing 한후마우스의 NW, BALF 샘플을 1/10 희석한후 1/2~1/4096 까지희석하여 well에상온에서 1 시간반응시킨다. - Washing 5회를한후 2nd antibody를상온에서 1 시간처리한다. - Washing 5회후 TMB solution을상온에서 30 분간처리한다. - 2N H 2 SO 4 Stop solution을처리한후 ELISA reader를사용하여 450nm에서흡 광도를체크한다. 2.2 Protection against lethal challenge 연구내용및방법 - 후보주바이러스로 vaccination 된마우스에서 8주차의혈청의분리한후방어능 을테스트하기위해 5 LD 50 의야생형바이러스 키다. 이후 2 주일간몸무게변화와생존률을관찰한다. A/Seoul/Y-1/2009 H1N1를감염시 생백신후보주의유전자및항원안정성분석 연구내용 - 수정란을통해생백신후보주의계대배양중항원유전자인 HA, NA 유전자의돌연 변이나아미노산염기서열의변화가생길경우항원성의변화를일으킬수있다. 이 경우후에침입하는야생형바이러스에대한방어능이저하될수있기때문에이를 확인하기위해수정란에서수회의계대배양을실시한후최종계대바이러스의항원 성을확인할필요가있다

12 2.3.3 연구방법 - 실제생산온도인 30도에서생백신후보주바이러스를 0.1 HAU 농도로 10개의수 정란에접종한다. - 4일후 10개의수정란에서 alantoic fluid를확보하여 HA assay 를실시한다. - 이중가장높은 HA titer가보이는샘플을선정하여다음 passage 에사용한다. - 20회의계대배양후각계대별바이러스의 RNA를추출하여 RT-PCR을거쳐 HA, NA 유전자의 full genome 을합성한다. - Full genome sequencing을통해 mutation 의유무를확인한다. - 20th passage 바이러스를 10 5 PFU 로마우스 4마리에접종한후 2주간격으로혈 청을채취하여 HI assay, ELISA assay로 master strain 과의항원성을비교한다. 2.4 생백신후보주의교차면역원성분석 연구내용 생백신후보주와항원성이다른바이러스와의교차면역원성이존재할경우한가 지백신을사용하여여러가지바이러스에대한방어능을제공한다는점에서생백신 으로서매우유용한이점이될수있다. 이를확인하기위해계절형인플루엔자바이 러스 3가지와판데믹 H5N1 인플루엔자바이러스에대한교차면역원성을조사하였다 연구방법 - 백신접종된마우스에서 2-8주차에확보된 serum, nasal wash, BALF의교차면역 원성을테스트한다. - 계절형바이러스 3가지는 A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), B/Brisbane/60/2008 (B) 이며, 판데믹바이러스는 CA-Indonesia/5/2005 (H5N1), CA-Viet Nam/HN31242/2007 (H5N1) 제조합바이러스를사용한다. - ELISA assay를위해서 serum은 1/20, NW, BALF는 1/10로초기희석한후사용 한다. - HI assay를위해서는 serum을 1/4 로초기희석한후사용한다. 2.5 Ferret model을이용한생백신후보주의저병원성전환분석 연구내용 - 동물실험을통해개발된생백신후보주의저병원성과약독화유지여부를분석하고이들의독성을질적, 양적으로평가하여용량설정을위한독성시험을진행한다. 이를위하여백신용량별로투여후체온, nasal discharge, sneezing등의지표를검토한다 연구방법 - Ferret 를모델로하여생산된재조합바이러스를접종하여약독화여부를보기위 하여그룹별로 3마리에 10 3, PFU의생백신후보주바이러스를마취후비 강을통해접종한다. 접종후 2주일간매일 ferret 체중의변화와체온, nasal discharge, sneezing등의 symptom 등을조사한다

13 - 감염후장기내에서얼마나 replication 하는지여부를체크하기위해서 12마리의 ferret을사용하여 10 5 PFU 의생백신바이러스를접종한후 day 1, 3, 5, 7일째에 각각 3마리씩 sacrifice하여 lung, nasal wash, heart, brain, spleen, trachea 를얻 는다. 얻어낸조직을갈아서원심분리를통해서상등액을얻은후에그안에 virus 가 얼마나존재하는지여부를 plaque assay 를통해서조사한다. 2.6 Ferret model 을이용한생백신후보주의면역원성평가 연구내용 - 생백신후보주를접종한 ferret의혈청내에존재하는 HI및 serum IgG 항체의양을 측정함으로서생백신의면역원성을평가할수있다 연구방법 - 생백신을농도별로접종한 ferret에서 1-4주까지 1주일간격으로혈청을분리한다 - 분리한혈청을 4 에서 24시간응고시킨후 12,000 rpm, 4 에서 10분간원심분 리한후맑은상등액만을새튜브로옮긴다. - HI assay를위해서 serum을 1/40 로, ELISA assay시에는 1/160로초기희석한후 실시한다 생백신후보주의속효성면역기작분석 연구내용 - 생백신의페렛에서의속효성면역원성을분석하기위하여 10 5 pfu 접종후, 초반의 innate immunity 기작을분석할수있는 cytokine 들의 level 변화를 monitoring 한 다. 바이러스감염시주요신호전달을담당하고있는 Toll-like receptor를통해유 도되는대표적인 pro-inflammatory cytokine인 INF-r, TNF-a, IL-12 의유도능을확 인한다 연구방법 연구에서확보된 nasal wash 안의유전자발현을측정한다. - Nasal wash 로부터 total RNA 를추출한다. - 백신군의 INF-r, IL-2, 4, 6 의유도능을확인하기위하여각 cytokine에특이적인 primer와 SYBR Green I (Takara) 을이용하여 real-time reverse transcriptase PCR (RRT-PCR) assay를수행하고 Ct value 를기준으로유전자발현량을측정한다

14 제3장최종연구개발결과 * 1 차년도보강실험 (Supplementary data) S.1 마우스모델에서의생백신후보주의면역원성분석 S.1.1 Serum IgG antibody level - 1 차년도연구수행내용과연결되는부분으로서, 1차년도연구기간중에생백신후 보주바이러스를 10 3, 10 4, 10 5 PFU 농도로 vaccination 한후, 2 주, 4 주, 6주의 serum을확보하여그안의 IgG 항체의양을 ELISA assay 를통하여확인하였다. 1차 년도연구종료후 8주의 serum을확보하여마찬가지로 ELISA assay를통하여 IgG 항체의양을분석하였다. Figure 1. CASI 바이러스접종후 8주후혈청내 IgG 항체 - Figure 1 에서와같이, 8주의항체의양도 2-6주의항체의양과마찬가지로접종농 도가높을수록많은양의항체가유도됨을알수있다. Figure 2. 생백신접종후기간별 serum IgG titers

15 Figure 3. 생백신접종후기간별혈청내 HI titers - Figure 차년도연구결과와종합하여볼때, serum IgG의경우바이러스접 종후 2-8주사이에는혈청내 IgG 항체의양이꾸준히증가하는모습을보이는반면 HI 항체는 6주까지증가하다가 8 주에서감소하는형태를띄고있다. 특히 A/Ann Arbor/6/60 (AA) 를이용하여제작한다른생백신의결과와비교할경우, 한번의백 신접종으로유도할수있는 다. HI titer 값은본생백신의경우가훨씬높음을알수있 Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccine against the 2009 pandemic A H1N1 in Mice and Ferrets, Vaccine, 29, (2011) S.1.2 Secretory IgA antibody level - 생백신으로써의효능을살펴보기위해서는실제바이러스의감염루트인호흡기관 점막조직에서의 secretory IgA antibody의유도능력을측정하는것은필수적인사항 이다. 따라서생백신바이러스를 PBS, 10 3, 10 4, 10 5 PFU 농도로접종한후 2주간 격으로 sacrifice 하여 Nasal wash (NW) 와 bronchoalveloar fluids (BALF) 안의 secretory IgA antibody의양을 ELISA assay 를통해측정하였다

16 Figure 3. 생백신접종 2주후 secretory IgA 항체의유도 Figure 4. 생백신접종 4주후 secretory IgA 항체의유도 Figure 5. 생백신접종 6주후 secretory IgA 항체의유도

17 Figure 6. 생백신접종 8주후 secretory IgA 항체의유도

18 Figure 7. 생백신접종후 secretory IgA 항체의유도 (Summary (O.D))

19 Figure 8. 생백신접종후 secretory IgA 항체의유도 (Summary (IgA titer)) - Figure 3-6 은생백신후보주를마우스를농도별로접종시킨후각각 2, 4, 6, 8 주후에 Nasal wash와 BALF 안의 IgA 항체의양을 ELISA assay를통해측정한결 과이다. 각주차의결과에서모든 vaccination 그룹에서 control 그룹보다많은양의 항체가유도됨을알수있고, 또한 vaccination dose-dependent 형태로항체양이증 가됨도볼수있다. - Figure 7-8 은 IgA 항체의양을기간별로나타낸결과이다. 4주까지증가하다가 6 주부터는감소하는형태를보이고있다. 특히 10 5 PFU 그룹에서는 2주차에서도거의 최고레벨의항체의양이유도되었음을알수있다. Figure 1-2에서 serum IgG의경 우 6주까지항체가증가하였다가 8 주에감소하는것과는다른모습이다. 또한농도와 주차에상관없이 BALF에서 NW보다많은양의 IgA 항체가유도되었다. - 아래의그림은 AA를이용하여제작한생백신을 2번접종한후 2주후의 secretory IgA 레벨을나타낸다. Nasal lavage의결과를살펴보면약 100의 IgA titer를알수 있는데, 본생백신 1회접종후 4주후에는약 150의 titer를보여 1회의접종만으로 도충분한양의항체가형성됨을확인할수있다. Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccine against

20 the 2009 pandemic A H1N1 in Mice and Ferrets, Vaccine, 29, (2011) S.1.3. Protection against lethal challenge Figure 9. 생백신후보주바이러스의방어능력 - Figure 9 에서와같이생백신접종후 2-8주간혈청을확보한후야생형신종인플 루엔자바이러스 A/Seoul/Y-1/2009 H1N1 5 LD50 (1 x 10 3 PFU) 를감염시킨후 2 주동안몸무게 ( 위) 와생존률 ( 아래) 을관찰하였다. 생백신바이러스로 vaccination 시킨마우스에서는몸무게감소가전혀보이지않은반면, PBS를주입한대조군그 룹은몸무게가급격히줄어들기시작하여감염후 8일만에 7마리의마우스모두죽었 다. 이결과로앞에서확인된항체형성능력을기반으로생백신후보주바이러스의방

21 어능력이우수함을알수있다. * 2 차년도연구결과 생백신후보주의유전자및항원안정성분석 수정란에서의계대배양을통한유전자안정성및생산성분석 - 1차년도에서는제작된생백신후보주바이러스를수정란에서 10회의계대배양을 통해항원유전자인 hemagglutinin (HA) 와 neuraminidase (NA) 유전자의변이가발 생하는지를확인하였다. 2차년도에는이에이어 10회의추가계대배양을계획하여총 20 회의계대배양을실시하였다. 표1. 20회계대배양후 HA와 NA 항원유전자의변이비교도 passage Nucleotide Amino acid Gene No. site before after site before after HA 751 CAA CGA 240 Gln Arg 6 NA 384 GAA GAG CGT AGT 319 Arg Ser 7 - 수정란에서총 20회의계대배양을한후각계대의바이러스의 HA 와 NA 유전자 의 RNA를추출하여 cdna 형태로전환시킨후전체의염기서열을분석한결과, 표1 과같이 HA 유전자에서는 6번째계대배양후 1 군데의염기서열의돌연변이가발생 했으며, 이로인해 240번째아미노산이 Gln 에서 Arg 으로치환되었다. NA의경우 7 번째에서 2군데의염기서열의돌연변이가발생했으며이중한군데는아미노산서열 이변하지않았으나나머지한군데의돌연변이로인해 319째아미노산이 Arg에서 Ser 으로치환되었다. 2차년도에추가적으로실시한 10회의계대배양에서는두유전자 모두염기서열변화가전혀발견되지않았다. 이는수정란에서바이러스의우수한유 전적안정성을보여준다

22 11' 12' 13' 14' 15' 16' 17' HA titer 18' 19' HA titer (log2) Passage # 20'

23 - 수정란에서총 20회의계대배양을거치면서각계대별수정란에서의 HA titer를 측정한결과 11회부터 16회까지서서히증가하다가 17회부터는 3 칸 ( 약 8 배정도) 의 증가를보였다. 그이후 20회까지높은 titer 를유지하는모습이다. 따라서수정란의 계대배양을통해뚜렷한생산성의증가를얻을수있었다 계대배양바이러스의항원안전성분석 - 20회의수정란계대배양을거친바이러스를 10 5 PFU 의농도로마우스에접종시 킨후 2-8주차의혈청을분리하여 serum HI, IgG 항체의양을 master strain과비교 하였다. Figure 10. 생백신후보주바이러스의항원안정성 - 각주차에분리한마우스의혈청에대해 master strain 바이러스를 antigen으로사 용하여 HI assay와 ELISA assay를실시한결과 Figure 10의결과에서 20회의수정 란계대배양을거친바이러스의 serum HI, IgG 항체의양은 master strain과비슷하 였다. 즉 passage 6, 7 에서발생한 HA, NA 유전자및아미노산서열의돌연변이로

24 인한항원성의변화는거의없었음을알수있다. 3.2 생백신후보주의교차면역원성분석 유행성, 판데믹인플루엔자에대한 cross reactive Hemagglutinin inhibition - (HI) activity 생백신후보주바이러스의유행성인플루엔자바이러스에대한교차면역원성을분 석하기위해 KCDC로부터분양받은 2009년유행성독감바이러스 3종과 X31 ca 를 백본으로하여제작된판데믹 H5N1 제조합바이러스에대해 serum HI 항체를측정 하였다. Figure 11. Cross-reactive HI titer against A/Brisbane/59/2007 (H1N1) Antiserum: from mice vaccinated with CA-SI 10 5 PFU or PBS, 2, 4, 6, 8 week Virus: A/Brisbane/59/2007 (H1N1) - 먼저각주차별혈청의 A/Brisbane/59/2007 (H1N1) 에대한 cross reactivity를측 정하기위해 HI assay를실시하였으나 Figure 11과같이모든주차의혈청에서 negative 한결과를얻었다

25 Figure 12. Cross-reactive HI titer against seasonal and pandemic H5N1 viruses Antiserum: from mice vaccinated with CA-SI 10 5 PFU or PBS, 6 week Virus: A/Brisbane/10/2007 (H3N2), B/Brisbane/60/2008 (B), CA-Indonesia/5/2005 (H5N1), CA-Viet Nam/HN31242/2007 (H5N1) - 6주차혈청만을사용하여나머지 4개의바이러스에대한 HI assay를실시한결과 Figure 12와같이 negative 한결과를얻었다 유행성, 판데믹인플루엔자에대한 cross reactive serum IgG antibody - Cross reactive serum IgG antibody 한후생백신후보주바이러스로 혈청을사용하여 의유무를조사하기위해각바이러스를코팅 vaccination ELISA assay 를실시하였다. 시킨마우스에서각주차별로확보한

26 Figure 13. Cross-reactive serum IgG antibody titer against A/Brisbane/59/2007 (H1N1) Figure 14. Cross-reactive serum IgG antibody against A/Brisbane/10/2007 (H3N2)

27 Figure 15. Cross-reactive serum IgG antibody against B/Brisbane/60/2008 (B) Figure 16. Cross-reactive serum IgG antibody against A/Indonesia/5/2005 re (H5N1)

28 Figure 17. Cross-reactive serum IgG antibody against A/Viet Nam/HN31242/2007 re (H5N1)

29 Figure 18. Cross-reactive serum IgG antibody titer against seasonal influenza Figure 19. Cross-reactive serum IgG antibody titer against pandemic influenza - Figure 의결과에서알수있듯이, IgG 항체의경우 B/Brisbane/60/2008 (B) 바이러스를제외한 4 개의바이러스에대해상당한양이측정되었다. Figure 18에 서와같이백신바이러스와같은 H1N1 바이러스에대해서가장맣은양의항체가측 정되었고 H3N1 바이러스에대해서는약 1/10 정도로측정되었다. 그러나 Figure 19 의결과를보면 Indonesia H5N1 바이러스에대해서는거의 H1N1 바이러스만큼많 은양의항체가측정되었고 Viet Nam strain 에대해서도상당한양이검출되었다. 이 는아마도 N1 에의한효과라고예상된다

30 Immunogenicity and protective efficacy of an elastase-dependent live attenuated swine influenza virus vaccine administered intranasally in pigs, Vaccine, 28, (2010) - Elastase-dependent live attenuated swine influenza vaccine의경우에 H1N1, H3N2 swine influenza 바이러스에대한교차면역원성을테스트하였는데, 본생백신 의 cross-reactive serum IgG titer 가훨씬높음을알수있다. 또한신종인플루엔자 생백신과 H5N1 형판데믹바이러스에대한교차면역원성을테스트한사례는본연 구과제가처음이기때문에상당한의미가있다고볼수있다 유행성, 판데믹인플루엔자에대한 cross reactive IgA antibody - Nasal wash 및 BALF의 cross reactive secretory IgA antibody에대해서는 B/Brisbane/60/2008를제외한나머지 4개의바이러스를사용하여 ELISA assay를실 시하였다. Figure 20. Cross-reactive nasal wash IgA antibody gainst A/Brisbane/59/2007 (H1N1)

31 Figure 21. Cross-reactive BALF IgA antibody against A/Brisbane/59/2007 (H1N1) Figure 22. Cross-reactive nasal wash IgA antibody against A/Brisbane/10/2007 (H3N2)

32 Figure 23. Cross-reactive BALF IgA antibody against A/Brisbane/10/2007 (H3N2) Figure 24. Cross-reactive NW IgA antibody against A/Indonesia/5/2005 re (H5N1)

33 Figure 25. Cross-reactive BALF IgA antibody against A/Indonesia/5/2005 re (H5N1) Figure 26. Cross-reactive NW IgA antibody against A/Viet Nam/HN31242/2007 re (H5N1)

34 Figure 27. Cross-reactive BALF IgA antibody against A/Viet Nam/HN31242/2007 re (H5N1) Figure 28. Cross-reactive nasal wash IgA antibody titer against seasonal influenza

35 Figure 29. Cross-reactive nasal wash IgA antibody titer against pandemic influenza Figure 30. Cross-reactive BALF IgA antibody titer against seasonal influenza

36 Figure 31. Cross-reactive BALF IgA antibody titer against pandemic influenza - Figure 은각바이러스별 NW, BALF cross-reactive IgA 항체의양을측정 한결과이다. Figure 은이결과를종합한것으로, NW, BALF 공통적으로 H1N1과 Indonesia H5N1 바이러스에대한항체가비슷한수준으로높게측정되었으 며, 상대적으로 H3N2와 Viet Nam H5N1 바이러스에대한항체의양은그보다적었 다. 이결과는 serum IgG 의결과와비슷한형태를띄는것이다. - 위결과를종합해볼때, 비록 HI titer 는나오지않았으나, serum IgG, NW IgA, BALF IgA 항체는 4개의 A형바이러스에대해 cross reactivity 가존재하였다. 이는 X31 ca 를백본으로하여제작된 SI ca 바이러스를생백신으로사용하였을때, 신종 인플루엔자이외에계절형인플루엔자나판데믹의가능성이있는 자바이러스에도효과가있음을보여준다. H5N1 조류인플루엔

37 Immunogenicity and protective efficacy of an elastase-dependent live attenuated swine influenza virus vaccine administered intranasally in pigs, Vaccine, 28, (2010) - 역시 Elastase-dependent live attenuated swine influenza vaccine의경우와비교 해보면, Nasal wash의 IgA 는거의비슷한수준을보이고, BALF IgA는본생백신의 경우보다높았다. 하지만본연구에서는 IgA 항체가가자기자신바이러스에대한항 체가와거의비슷한수준으로높게나왔다는점에서우수성을보인다고할수있다. 3.3 Ferret model 을이용한생백신후보주의저병원성전환분석 생백신후보주접종후몸무게및체온변화 - Ferret 모델에서생백신후보주바이러스의독성을분석하기위해 10 3, 10 4, 10 5 PFU, PBS (negative control) 의농도로각 3마리씩비강접종한후 2주간몸무게와 체온을측정하였다

38 Figure 32. Ferret 모델에서의생백신후보주의독성테스트 - Figure 32와같이모든 vaccination 그룹에서 PBS 그룹과비슷하게몸무게감소나 체온상승등의 clinical symptom이보이지않았다는점에서생백신후보주바이러스의 약독화및저병원성특성을유지하고있음을알수있다 생백신바이러스유전자복제및장기별복제 - Ferret의비강을통해생백신으로 vaccination 시킨후상기도에서의바이러스의증 식은 IgA 등의항체유도에필수적인조건이다. 이를확인하기위해생백신접종후 초기에 nasal wash sample을확보하여 X31 ca 바이러스의 M viral RNA copy수를 real-time PCR 을통해측정하였다

39 Figure 33. Ferret 모델에서의생백신후보주의유전자복제 - Figure 33과같이백신접종후 day 1부터백신 dose-dependent 한모습으로 X31 ca M gene의 viral RNA copy 수가증가하는것을알수있다. 모든그룹에서 day 5까지증가하다 day 7 째감소하는패턴을보이고있다. 주목할만한결과는 10 3 PFU의농도로접종하였을경우에도 day 1을제외하고바이러스의유전자의양 이 10 4, 10 5 PFU 접종그룹과비슷해지고있다는점이다. 이결과는 10 3 PFU의접종 농도만으로도충분한면역유도능력을보일수있다는가능성을나타낸다. - 생백신바이러스의 ferret에서의각장기별증식력을측정하여저병원성을자세히 살펴보기위해 12마리의 ferret에생백신바이러스 10 5 PFU 로접종한후 day 1 부 터 2일간격으로 3마리씩 sacrifice하여각장기를분리한후 plaque assay를통해 바이러스의 titer 를측정하였다. Figure 34. Ferret 모델에서의생백신후보주의장기별증식력

40 - Figure 34와같이 lung, nasal wash, trachea, brain, spleen, heart에서날짜별 viral titer 를측정한결과, nasal wash에서만 day3, 5 에각각 ferret 1마리에서 3000 PFU/ml 이하의바이러스가검출되었다. Lung을포함한다른조직에서는 detection limit (1.301) 이하였다. 이는생백신바이러스가상기도에서만매우약한정도의증식 력을지니고있다고할수있다. 또한 brain, spleen, heart의조직에서바이러스검 출이안되었다는점에서생백신후보주의저병원성과안전성을동시에확인할수있 었다. 3.4 Ferret model 을이용한생백신후보주의면역원성평가 HI assay 결과 - 생백신후보주바이러스를농도별로접종시킨후 1주일간격으로 4주까지혈청을 확보하여 HI assay 를실시하였다. (Initial dilution=1/40) NC Dilution (log2) PBS 10 3 PFU 10 4 PFU 10 5 PFU Figure 35. Serum HI assay (1 week)

41 Figure 36. Serum HI assay (2 week) Figure 37. Serum HI assay (3 week)

42 Figure 38. Serum HI assay (4 week) Figure 39. Ferret serum HI titers

43 - Figure 은각주차별 serum HI assay 결과이다. Figure 37에서 HI titer는 모든 vaccination 그룹에서 2주까지증가하다가 3주부터감소하는형태를보이고있 다. 다만, 10 3, 10 4 PFU 접종그룹이 10 5 PFU 접종그룹에비해많거나비슷한양의 항체가를보이고있다. 이결과는 Figure 38에서 10 3, 10 4 PFU 접종그룹의포함된 ferret의몸무게가상대적으로 40% 정도무거운결과때문인것으로예상된다. 결과 적으로모든그룹에서 40이상의 HI titer 가측정되었다. - AA 를이용한생백신의경우, 1 회접종후 3주후의 HI titer가약 100 정도이지만 본연구결과에서는 1,000-2,000의훨씬높은 titer가관찰되어서로다른실험조건을 감안하더라도, 상당히높은수준의면역원성을지닌다고볼수있다. Figure 40. Weight change after vaccination Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccine against the 2009 pandemic A H1N1 in Mice and Ferrets, Vaccine, 29, (2011)

44 3.4.2 Serum IgG (ELISA) Figure 41. Ferret serum IgG Figure 42. Ferret serum IgG titers - Figure 39 는각주차별 serum IgG ELISA assay 결과이다. Figure 40에서모든 vaccination 그룹에서 3주까지증가하다가 4 주부터감소하는형태를보이고있다. 다 만, 10 3 PFU 접종그룹에서측정된많은양의항체가는 HI titer의결과와같은이유

45 로설명될수있다. 3.5 생백신후보주의속효성면역기작분석 Cytokine level - 분석 생백신접종후초기아직항체형성이되지않은시기에도백신바이러스의접종 을통해 innate immune response를유도할수있다면이는 wild type의바이러스의 확산초기에방어할수있는이점이될수있다. 이를검증하기위해생백신 10 5 PFU 로접종한후 2일간격으로 nasal wash sample을확보하여그안에 IFN-r, IL-2, IL-4, IL-6등 innate immune response 및 cell-mediated immunity와관련된 cytokine의발현 level 을측정하였다. Figure 43. 생백신접종후 cytokine 발현 level - Figure 43과같이생백신접종후 IFN-r 만이유의성있게측정되었다. IL-2, 4, 6 은 PBS 그룹과비교했을경우미미하게증가하였다. IFN-r의경우 Th1 cell을경유하 는 CTL response와관련되어있다는점에서생백신에의해항체형성뿐만아니라 cell-mediated immune response 도유도됨을예상할수있었다. T

46 제4장연구결과고찰및결론 - 수정란에서총 20회의계대배양중 HA와 NA 항원의아미노산변이가각각 1개씩발견 되었다. 또한이바이러스의항원성은 HI, ELISA assay 결과 master strain과비슷한결 과를보여생백신후보주바이러스의유전적및항원안정성은매우우수하다고평가할 수있다. 또한 20회의계대배양을거치면서 HA titer가약 10배정도로증가하여생산성 의증가를가져왔다. - 생백신으로접종된마우스의혈청, nasal wash, BALF의 IgG 및 IgA 항체는그자신바 이러스뿐만아니라, 유행성및판데믹인플루엔자바이러스와도높은교차면역원성을보 여주었다. 특히 H3N2 보다 H5N1 바이러스에대해더많은교차면역원성을보여이후 판데믹에대한효과적인생백신으로사용될가능성을보여주었다. 특히기존에개발된다 른생백신의교차면역원성연구결과와비교하였을경우에도훨신더높은항체가를보여 본생백신후보주의높은교차면역원성을입증할수있었다. 다만 HI assay의경우 titer 가전혀측정되지않아이를더구체적으로증명하기위해서 microneutralization assay 가진행중에있으며더나아가마우스모델에서의방어능테스트에서도그효과를입증 할필요가있다. - 생백신을통한교차면역원성은항체에의해유도되는것이외에도주로 T cell에의해매게되어진다고알려져있으므로백신이접종된마우스의면역세포를직접분석하여교차면역의메카니즘을규명하기위한추가적인연구가필요할것이다. - Ferret을이용하여생백신접종후 2 주간체온및체중변화를관찰한결과, 백신비접 종대조군과생백신접종군모두정상범위내의결과를나타내었으며, 임상증상및폐사 또한관찰할수없었다. 그러므로, 본연구에사용된생백신은페렛에비강경로로접종 하였을때매우높은안전성을보이는것으로평가된다. - Ferret 접종후비강으로부터의생백신바이러스의증식을살펴본결과비강내에서바이 러스의유전자복제가잘이루어지고있는것으로확인되었으며, 잔여바이러스의경우 nasal wash 에서만미미한수준의바이러스가검출될뿐, 그이외에장기에서는바이러스 의 shedding 이전혀일어나지못했다. 이는생백신접종후항체반응을유도한후체내 에서바이러스가급격히제거됨을의미하여이는생백신의면역원성과안전성을동시에 충족시킬수있는우수한조건이될수있다. - Ferret 생백신접종후 1주간격으로 4주차까지채혈을통해 serum 을분리하여 HI assay와 ELISA assay 를통해면역원성을분석해본결과, 매우높은 HI, serum IgG titer 를확인할수있어높은수준의면역원성을확인할수있었다. - 생백신의속효성면역원성분석에서는 INF-r 의발현이증가되는경향을보여, 백신접종 후항체생성뿐만아니라 T cell-mediated immune response 유도가능성을보여주었지 만, IL-2, 4, 6의 cytokine의경우는발현 level 이미미하였다. 현재 TNF-a, IL-10,

47 IL-12, TGF-b 등의발현 profile 도테스트진행중에있다. - 현재건국대학교수의과대학의 ABSL3 시설을이용하여백신접종된 ferret의야생형신 종인플루엔자바이러스(A/Seoul/Y-1/2009 H1N1) 에대한 protection 테스트가진행중 에있어이를통해면역원성과방어능을효과적으로증명할수있을것으로기대된다. - 결론적으로, 본연구과제를통해제작된신종플루약독화생백신후보물질 SI ca 바이러 스는모균주 마우스및 X-31 ca 가지니고있는고성장성과저온적응형질을모두지니고있으며, ferret 모델에서고농도로접종하였을경우에도감염에따른몸무게감소나체 온상등등의독성을전혀보이지않을만큼뛰어난안전성을보여주었다. 백신접종된 동물모델에서는혈청및점막조직에서많은양의항체가생성되어야생형바이러스에대 한방어능을보여주었다. 주목할만한사실은, H1N1 신종플루생백신과계절형및 H5N1 형의판데믹바이러스사이에교차면역원성의가능성을지니고있다는점이다. 특 히 IgA 항체의경우자기자신바이러스에대한항체가와거의비슷한수준을보인다는 점은본생백신을통해계절형뿐만아니라판데믹바이러스에대한방어도가능하다는 장점을지닐수있다. 추후실제바이러스를이용한증식억제능력이나동물모델을통한 감염모델을통해이와같은교차면역원성을자세히규명할예정이다

48 제5장연구성과 5.1 활용성과 과제명 과제책임자성명 / 소속 / 전공 가연구논문 번호논문제목저자명저널명집( 권) 페이지 Impact factor 1 2 나학술발표 국내 / 국외 SCI 여부 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지국내 / 국제 1 2 다지적재산권 번호출원 / 등록 1 2 라정책활용 특허명 출원( 등록) 인출원( 등록) 국출원( 등록) 번호 IPC분류 기타관련정책에활용예를구체적으로기술함. 마타연구차기연구에활용 타연구및차기연구에활용된예를구체적으로기술함. 바언론홍보및대국민교육 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 사기타 임상시험, 관련 DB 구축, 워크샾또는심포지움개최등의경우구체적으로기술함

49 5.2 활용계획 - 신종인플루엔자대유행시초동대응요원에적용가능한백신제형적용가능 - 신종인플루엔자대유행의위급상황을대비한백신으로생산비축 - Reverse genetic system을이용하여다른바이러스에대한유전자를삽입하여다른호흡기성바이러스에대한복합백신으로의활용. - 기존 3가형유행성독감백신으로의개발 - 교차면역원성과선천면역유도능기반으로 H5N1 판데믹확산시활용가능한백신으로개발

50 제6장기타중요변경사항 - 해당사항없음

51 제7장참고문헌 1. Payungporn S, Panjaworayan N, Makkoch J, Poovorawan Y: Molecular characteristics of the human pandemic influenza A virus (H1N1), Acta Virol, 54: , (2010) 2. Girard MP, Tam JS, Assossou OM, Kieny MP: The 2009 A (H1N1) influenza virus pandemic, Vaccine. 28: (2010) 3. Chen Z, Wang W, Zhou H, Suguitan AL Jr, Shambaugh C, Kim L, Zhao J, Kemble G, Jin H: Generation of live attenuated novel influenza virus A/California/7/09 (H1N1) vaccines with high yield in embryonated chicken eggs, J Virol, 84:44-51, (2010) 4. Masic A, Booth JS, Mutwiri GK, Babiuk LA, Zhou Y: Elastase-dependent live attenuated swine influenza A viruses are immunogenic and confer protection against swine influenza A virus infection in pigs, J Virol, 83: , (2009) 5. Bodewes R, Rimmelzwaan GF, Osterhaus AD: Animal models for the preclinical evaluation of candidate influenza vaccines, Expert Rev Vaccines, 9:59-72, (2010) 6. Current status of live attenuated influenza virus vaccine in the US. Belshe RB. Virus Research Jul;103(1-2): Wang TT, Palese P: Unraveling the mystery of swine influenza virus, Cell, 137:983-5, (2009) 8. Enserink M, Kaiser J: Swine flu outbreak. Devilish dilemmas surround pandemic flu vaccine, Science, 324:702-5 (2009) 9. Bodewes R, Rimmelzwaan GF, Osterhaus AD: Animal models for the preclinical evaluation of candidate influenza vaccines, Expert Rev Vaccines, 9:59-72, (2010) 10. Chen Z, Santos C, Aspelund A, Gillim-Ross L, Jin H, Kemble G, Subbarao K: Evaluation of live attenuated influenza a virus h6 vaccines in mice and ferrets, J Virol, 83:65-72, (2009) 11. van der Laan JW, Herberts C, Lambkin-Williams R, Boyers A, Mann AJ, Oxford JAnimal models in influenza vaccine testing: Expert Rev Vaccines, 7:783-93, (2008) 12. Webby RJ, Perez DR, Coleman JS, Guan Y, Knight JH, Govorkova EA, McClain-Moss LR, Peiris JS, Rehg JE, Tuomanen EI, Webster RG: Responsiveness to

52 a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines, Lancet, 363: (2004) 13. Min JY, Chen GL, Santos C, Lamirande EW, Matsuoka Y, Subbarao K: Classical swine H1N1 influenza viruses confer cross protection from swine-origin 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection in mice and ferrets, Virology, 408:128-33, (2010) 14. Dürrwald R, Krumbholz A, Baumgarte S, Schlegel M, Vahlenkamp TW, Selbitz HJ, Wutzler P, Zell R: Swine influenza A vaccines, pandemic (H1N1) 2009 virus, and cross-reactivity, Emerg Infect Dis, 16: , (2010) 15. Vincent AL, Ciacci-Zanella JR, Lorusso A, Gauger PC, Zanella EL, Kehrli ME Jr, Janke BH, Lager KM: Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs, Vaccine, 28:2782-7, (2010)

53 제8장첨부서류 - 해당사항없음