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정헌 증
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1 편집순서 1 : 겉표지 ( 뒷면) ( 측면) ( 앞면) 학술연구용역사업최종결과보고서 과 제 명 역유전학방법에의한저병원성조류인플루엔자재조합바이러스의확보및면역학적특성분석 Construction of low pathogenic influenza viruses using reverse genetic methods and evaluate their immunogeicity 2 0 주 의 ( 주의내용기재 ) 0 8 주관연구기관 : 충북대학교 ( 글 14 point 고딕체) 질병관리본부 질병관리본부

2 편집순서 3 : 목차 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문 ( 한글) 최종결과요약문 ( 영문) 최종결과요약문 Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과 제1장최종연구개발목표제2장최종연구개발내용및방법제3장최종연구개발결과제4장연구결과고찰및결론제5장연구성과제6장참고문헌 제7장첨부서류

3 편집순서 4 : 요약문 최종결과보고서요약문 과제명 역유전학방법에의한저병원성조류인플루엔자재조합바이러스의확보및면역학적특성분석 중심단어 역유전학방법, 조류인플루엔자, 재조합바이러스 주관연구기관 충북대학교 주관연구책임자 최영기 연구기간 목표: 본연구실은국내에서발생가능한조류인플루엔자바이러스들의 screening을위해지속적인 가금및야생조류로부터조류인플루엔자바이러스의분리를해다수의조류인플루엔자바이러스의대 한유전자를확보하기위해여러기관과협력으로연구를수행중에있음. 이들국내분리조류인플 루엔자바이러스중 인체감염이가능할것으로추정되는조류인플루엔자를선별하여, 역유전자방법 으로선별된바이러를이용하여저병원성의조류인플루엔자재조합바이러스 clone을확보하여재조합 바이러스를생산하는방법을확립하고자하였음. 세부연구방법 H1, H2, H3, H5, H7, H9 및 N1, N2, N7의혈청형을가진조류인플루엔자로부터 RNA의추출및 reverse transcription에의한cdna의확보및rna Pol1- driven vector에의 cloning HA 절단부위를포함한바이러스단백질 coding region에변이를도입한수정란에서의유전적변형 고생장백신균주확보 8개의 plasmid DNA의 total transfection에의한재조합바이러스 rescue 의최적화조건을확립함. 공여바이러스 (A/PR/8/34) internal gene cdna와 H1, H2, H3, H5, H7, H9 및 N1, N2, N7 virus의 HA 및 NA cdna의 total transfection에의한 infectious 재조합바이러스백신주를 rescue 함. 상기바이러스의세포배양및수정란에서의 titer를 HI assay, cytotoxic effect 및 pfu 등의인자 로결정함. 연구의진척도 1차년도추진계획이었던 reverse genetic system을이용한재조합바이러스방법의확립및이를이용 한재조합바이러스생산방법을표준화하였음. 기존의본연구실의기분리된조류인플루엔자바이러스들중에서 1차년도의연구계획이었던조류인플 루엔자의인체예비백신균주생산을위한 H1, H2, H3, H5, H7, H9 hemaglutination (HA) 유전자국 내야생조류에서분리한바이러스로부터확보하였음. 기존의본연구실의기분리된조류인플루엔자바이러스들중에서 1차년도의연구계획이었던조류인플 루엔자의인체예비백신균주생산을위한 N1, N2, N7의 Neuramidase (NA) 유전자와이외의 N2 및 N9 의유전자를 국내야생조류에서분리한바이러스로부터확보하였음. 상기확보된 HA 그리고 NA유전자와 PR8 공여바이러스의내부유전자를이용, 역유전자방법을이용 하여 H1N1, H1N2, H1N7, H3N2, H5N1, H5N2, H5N7, H7N1, H7N2, 및 H7N7subtypes의재조합바이러스 를 1 개씩생산하였음. *2 차년도과제와연계하여항원성분석실험을수행하고자함. -1-

4 편집순서 5: 요약문( 영문) Summary Title of Project Key Words Construction of low pathogenic influenza viruses using reverse genetic methods and evaluate their immunogeicity Reverse genetic method, avian influenza virus, recombinant virus Institute Chungbuk National University Project Leader Young-Ki Choi Project Period Objectives: We have been carrying out the research projects regarding avian influenza virus isolation and genetic characterization from wild migratory birds and domestic poultry with many collaborating institutes. Therefore, the main objects of this research project are; first, screening the viruses which have any potential threat to human infections among our isolates; second, obtaining the selected clones of isolates, and then producing the recombinant avian influenza viruses by reverse genetic method. Methods: RNA extraction from the H1, H2, H3, H5, H7, H9, N1, N2, and N7 subtypes of avian influenza viruses, RT reaction for cdna and then cloning into RNA Pol1- driven vector. In case of HPAI, removal of connecting peptide on HA segment to produce the high viral titer strains in embryonated eggs. Establish the standard procedures for infectious recombinant virus rescue by 8 plasmid co-transfection into cells. Rescue the recombinant viruses of H1, H2, H3, H5, H7, H9, N1, N2, and N7 subtypes of avian influenza viruses containing 6 internal genes of PR/8/34 virus. Determine the viral titer of the rescued virus by HI, CPE and PFU assays. Results We set up the reverse genetic methods for avian influenza virus rescue and standardized the protocol for recombinant viruses using A/PR/8/34 virus. We successively selected H1, H2, H3, H5, H7, and H9 subtypes from our previous virus isolates and cloned into phw2000 vector. We successively selected N1, N2, and N7 subtypes from our previous virus isolates and cloned into phw2000 vector. We produced the H1N1, H1N2, H1N7, H3N2, H5N1, H5N2, H5N7, H7N1, H7N2, and H7N7subtypes of recombinant viruses containing the 6 internal genes of A/PR/8/34 vaccine parental virus. -2-

5 편집순서 6 : 총괄연구과제의연구결과 학술연구용역사업연구결과 제장최종연구개발목표 목표 가. 연구목표 : 신종인플루엔자대유행대비신속한백신후보주제조기술확보및항원성평가 목표1: Reverse genetics system 을이용한신종인플루엔자대비백신후보주확보 (1 차년도) 목표2: 확보한백신후보주의실험동물을통한항원성및면역학적특성분석 (2 차년도) 나. 연구배경및연구의목적 조류인플루엔자에의한인체감염은 1997 년도홍콩에서발병이후최근베트남, 인도네시아등동남아시아국가와중국에서발병사례가증가하고있으며주요원인은 H5N1형바이러스로밝혀지고있음. 현재의조류인플루엔자가인체간전염이시작될경우전세계적으로인명폐해와공황상태및경제마비를야기할수있음을 WHO 가지속적으로경고하며국제적인대책마련을촉구하고있음. 1918년도전세계적으로 5000 만명의사상자를기록한스페인독감도현재유행하는 H5N1형조류인플루엔자와유전적으로유사함이밝혀짐. 아직전세계적으로효과적인예방백신이없으며현재사용중인치료제인타미플루는공급이부족하고생산에막대한비용이요구되며또한최근에타미플루내성바이러스가발견되어조류인플루엔자팬데믹의발생시이를제어할기술이전세계적으로부재함. 조류인플루엔자와인체독감동시감염시두가지바이러스사이유전자의교환으로사람에감염될수있는변종이출현할가능성이높아지고있음. 한국은자체적인방역대책에도불구하고동남아조류인플루엔자발생지역과지역적으로근접하여일단유사시큰폐해를볼수있는가능성이높아지고있음. -3-

철저한방역대책에불구하고 2006-2007년국내가금과야생조류에서고병원성의 H5N1 바이러스분리가분리됨으로, 막대한경제적손실초래. 조류인플루엔자의확산시전세계경제적폐해발생예상.

6 철저한방역대책에불구하고 년국내가금과야생조류에서고병원성의 H5N1 바이러스분리가분리됨으로, 막대한경제적손실초래. 조류인플루엔자의확산시전세계경제적폐해발생예상. 국가간교역, 통상문제발생, 국제경제마비에의한경제적폐해가예견됨 최근 A/H5N1 에의한인체감염및사망사례가전세계적으로보고되고있으며, 세계보건기구에서도새로운형태의인플루엔자바이러스에대한대유행을경고하고있고각국에서는이에대한대비책을수립할것을권고하고있음. 이에본연구에서는인체감염이확인된고병원성조류인플루엔자바이러스및조류에는저병원성이지만인체감염위험가능성이있는아형에대한유전자확보및특성분석을통하여백신제조에사용될 reverse genetics법에신속하고직접적으로적용될수있는인플루엔자바이러스유전자 library 를구축하고자함. < 국내조류인플루엔자발생> 다. 국내조류인플루엔자바이러스연구에대한문제점 상기표에나타나있는것처럼해외의연구동향은조류인플루엔자전체에대한연구를바탕으로 2003, 2006년가금류에서분리한 H5N1 고병원성인플루엔자바이러스를중심으로농가의 재발방지와 H5N1바이러스의 monitering 위주로연구가수행되고있음. -4-

7 그러나우리나라조류에상재하고있는조류인플루엔자바이러스에대한전체적유전정보및혈청학적연구가부족한상태임. 미국의 USDA, CDC, WHO 에서연구하고있는조류인플루엔자바이러스의경우, 대부분 Hong Kong 과동남아지역에서발병하고있는바이러스 (H5N1, H9N2) 를대상으로연구하고있는것으로국내상재해있는바이러스와는혈청학적뿐만아니라유전학적으로상이한바이러스이기때문에이들외국기관에서 vaccine이개발된다하더라도국내바이러스와교차면역을일으킬수있을지는의문임. 그러므로국내조류인플루엔자바이러스에대한정보뿐만아니라이정보를이용한국내상황에맞는조류인플루엔자바이러스의백신개발연구가절실히요구됨. 1.2 목표달성도 1차년도추진계획이었던 reverse genetic system을이용한재조합바이러스방법의확립및이를이용한재조합바이러스생산방법을표준화하였음. 조류인플루엔자바이러스중 1차년도의연구계획이었던조류인플루엔자의인체예비백신균주생산을위한 H1, H2, H3, H5, H7, H9 hemaglutination (HA) 유전자국내야생조류에서분리한바이러스로부터확보하였음. 조류인플루엔자바이러스중 1차년도의연구계획이었던조류인플루엔자의인체예비백신균주생산을위한 N1, N2, N7의 Neuramidase (NA) 유전자를국내야생조류에서분리한바이러스로부터확보하였음. 상기확보된유전자를재조합바이러스생산을위한역유전학방법이용을위한 Vector에 cloning 하였음 -5-

8 1.3 국내 외기술개발현황 가. 국내. 외연구동향및기존연구의문제점 조류인플루엔자바이러스의사람감염가능성이고조되면서미국의 US Department of Agriculture (USDA), Centers for Disease Control and Prevention (CDC), World Health Organization (WHO) 협력기관들은경쟁적으로사람에게감염가능한바이러스에대한연구및백신개발을서두르고있는상황이다 (Chen, Subbarao et al., 2003). 해외연구동향 USDA : Hong Kong 분리바이러스와미국내분리바이러스를대상으 로 reverse genetic system 을이용한양계백신개발연구수행중. 연구수행중인바이러스의 subtype H5N1, H9N2 WHO와 CDC : 1997년 Hong Kong 분리바이러스와최근동남아시아, 특히베트남에서분리된 H5N1 바이러스를이용하여인체백신개발을위해유전자분석및동물실험을통한백신바이러스선별과효율성실험수행중이며, 항바이러스신약개발연구도활발히수행중. H5N1 항바이러스신약개발 WHO : 1980년대중반부터북아메리카에야생하는이동철새에서조류인플루엔자바이러스의지속적인분리및유전자분석으로북아메리카대륙에존재하는조류인플루엔자 data base 구축을통해조기인플루엔 H1- H15 N1-N9 전subtype -6-

9 자경보시스템체제구성 중국 : 중국은조류인플루엔자바이러스의 epicenter로불리며 WHO 와연계하여여러 poultry와사람에서분리되는인플루엔자바이러스의유전자분석과동물실험을통해동남아시아에전체에걸친인플루엔자바이러스의 monitering system 구축중 H1- H15 N1-N9 전subtype 일본 : 시베리아및중국과지리적으로근접한상황에맞추어 WHO collaborating center를주축으로여러대학과연구기관에서매년이동철새및일본내발생하는인플루엔자바이러스의유전적, 혈청학적변화를 monitering 하고있음. H1- H15 N1-N9 전subtype 한국 : 국립보건원과수의과학검염역원등에서 2003년발생한조류독감바이러스의재발방지를위해조류인플루엔자바이러스의지속적인혈청학적조사가진행중임 H5N1 나. 국내외정책상황 WHO: H5N1 조류인플루엔자에의한인체감염확산가능성지속적경고. 최근 Global Influenza Preparedness Plan (May 2005) 발표하였으며팬데믹발생시전세계적으로 5억의인구가감염되고 만명이사망할것으로예측하고있음. 미국: 조류인플루엔자팬대믹대비총 71 억불 ( 약 7.5 조원) 의국가 R&D 예산요청. UN정상회의에서 International Partnership on Avian and Pandemic Influenza(IPAPI) 설립촉구 중국: 약 20 억위안 ( 약 2500 억원) 의국가예산마련 태국: 동남아시아조류인플루엔자퇴치기금 1 억바트 ( 약 25 억원) 출연 한국: 반기문외교통상부장관이 UN총회에서조류인플루엔자대비국제협력표명 세계은행: 조류인플루엔자퇴치를위해쓸수있도록최대 5억달러준비중 아시아개발은행: 조류독감확산을막기위해 5,800만달러의보조금을분배할계획 다. 연구결과가국내 외기술개발현황에서차지하는위치등을기술 본연구결과에서확립한역유전학방법을이용한재조합바이러스재조방법은미국등선진국 등에서주로사용되고있는방법임. -7-

본연구를통해조류인플루엔자를고전적인방법이아닌역유전학방법을이용하여재조합바 이러스를생산하는방법을확립하였음. 이는국내에서도국외의우수연구기관들에서만가능 했던재조합조류인플루엔자바이러스의생산을국내의연구실에서빠르고정확한백신생산 균주를확보할수있음을나타내는매우중요한결과임. 제장최종연구개발내용및방법 2 가.

10 본연구를통해조류인플루엔자를고전적인방법이아닌역유전학방법을이용하여재조합바 이러스를생산하는방법을확립하였음. 이는국내에서도국외의우수연구기관들에서만가능 했던재조합조류인플루엔자바이러스의생산을국내의연구실에서빠르고정확한백신생산 균주를확보할수있음을나타내는매우중요한결과임. 제장최종연구개발내용및방법 2 가. 지속적야생조류로부터의조류인플루엔자바이러스분리 국내발생가능한바이러스들의 screening을위해지속적인가금및야생조류로부터조류인플루엔 자바이러스의분리를통해다수의조류인플루엔자바이러스의대한유전자를확보하기위해연구 수행중 바이러스분리장소 1. 철새도래지 ( 천수만, 풍세천및여러하천과강변) 2. 가금사육농장( 닭, 오리) 주1-2 회시료채집 (10월말부터익년 3 월까지) 종란접종을통한바이러스분리및RT-PCR을통한 subtype 및유전자분석 특이유전자 cloning 을통해재조합바이러스의생산. 조류인플루엔자 바이러스의 신속한 진단과 아형구별을 위해 기존의 본 연구실에서 확립되었던 multiplex-rt PCR방법을이용하여분리된바이러스의정확한 subtype 을결정하였음. 그림1. 야생조류의분변으로부터분리된바이러스의아형구별과진단방법모식도 상기방법은야생조류의분변을항생제가포함된수송배지에서상층액을 11일령의수정란에접종 -8-

11 후 48시간동안바이러스배양후 HA test 를통해바이러스존재여부를확인. 바이러스존재가확인된수정란배양액을이용하여상기 multiplex RT-CR 방법으로유전자를증폭한후 1% agarose gel에서확인하면각 subtype 별로 size가다른증폭 DNA를확인하여어떠한 subtype 의바이러스가분리되고있는지빠른시간에확인할수있는방법이다. 나.Reverse genetic system 및classical method에이용한재조합바이러스생산 1). Reverse genetic system 을이용한백신주개발장점. 대부분의 H5N1 바이러스는수정란독성으로인하여생장이매우낮은단점이있어백신의대량생산에문제점이존재한다. 이러한천연형 H5N1 바이러스백신의단점을유전적변이를통하여보완함으로써백신생산수율및항원성을극대화한다. 유전적으로재조합하는시간이첨가되므로( 약 1-6 개월), 일단발병한상황에서는이용하기힘든단점이있으나, 백신생산의준비기간이있으면가장효율적인방법으로제시되고있다. 바이러스분리후각유전자 segment들을 cloning 하여보관할수있으므로 sample의보관과이 동이자유롭다. 고병원성의바이러스의경우라도 HA gene중의 Connecting peptide를제거하여항원성을변형시키지않고도저병원성의바이러스로의전환이가능하여수정란에서높은바이러스 titer를얻을수있다. Cloning된각분절을이용하여 FDA에서백신모체로권장하고있는 PR8/30 바이러스와의재조합바이러스를생산하여 wild virus 를이용한경우보다허가받는데용이하다. 새로운변형바이러스가출현시, 직접바이러스를분리하지않고도유전자분석결과만을가지고도point mutation 방법을이용하여빠르게백신을준비할수있다. 2). Reverse genetic system 을이용한백신주개발단점. Reverse genetic system을이용한바이러스를재조합할경우 human 293T 세포주를이용하는경우 tumor 세포주이기때문에인체백신으로사용하기곤란한점이있음. 그러므로초기바이러스분리부터인체백신으로허가된인체백신생산가능한 Vero 세포주나 primary chicken firbroblast 세포주이용하도록미국 FDA 에서권장하고있음. Reverse genetic system은 human Pol 1과 Pol II promotor를사용하기때문에 Vero 세포주를이용할경우 293T 세포주를이용하는것보다효율이떨어질수있음. 이를극복하기위해서는인체백 신생산가능한 Vero cell을이용한효율적인바이러스생산방법과 primary chicken cell을이용한 -9-

12 pure 한인플루엔자바이러스획득방법을확립되어야함. 세부연구방법 H1, H2, H3, H5, H7, H9 및 N1, N2, N7의혈청형을가진조류인플루엔자로부터 RNA의추출및 reverse transcription에의한 cdna의확보및 RNA Pol1- driven vector에의 cloning 고병원성의 H5 바이러스의경우 HA 절단부위의 mutation을갖는 HA clone 확보 HA 절단부위를포함한바이러스단백질 coding region에변이를도입한수정란에서의유전적변형 고생장백신균주확보 cdna의 total transfection 에의한재조합바이러스백신주에대한역유전학기술확립. 8개의 cdna의 total transfection에의한 infectious 바이러스 rescue 의최적화조건을확립함. 공여바이러스 (A/PR/8/34) internal gene cdna와 H1, H2, H3, H5, H7, H9 및 N1, N2, N7 virus의 HA 및 NA cdna의 total transfection에의한 infectious 재조합바이러스백신주를 rescue 함. 상기바이러스의세포배양및수정란에서의 titer를 HI assay, cytophatic effect 및 PFU 등의인 자로결정함. 그림 2. 고전적방법과역유전학방법을이용한인플루엔자바이러스의재조합바이러스생산방법의모식도 -10-

13 제장최종연구개발결과 3 가. 유전자확보현황본연구실에서기분리한조류인플루엔자바이러스로부터본연구과제수행을위해선별한바이러스 subtype과유전자확보결과 본연구과제의 1차목표인국내분리조류인플루엔자바이러스로부터 6종의 HA 유전자, 3종의 NA 유 전자를확보하여재조합바이러스생산을위한 plasmid cloning은 100% 완료한상태임 나. 선택한유전자의분자유전학적특성 국내에서분리한 6종의 HA유전자와 3종의유전자의전체염기서열분석을통하여본연구에서선 택, 재조합바이러스생산을위한유전자의분자유전학적기원을알아보기위하여지금까지보고된 유전자정보중가장유사한바이러스와의 homology 를표시하였음. -11-

14 1) HA 유전자 H1 HA 유전자 (A/Wild bird/korea/w107/06 [H1N3]) 가장유사한바이러스는 A/pintail/Shimane/324/98(H1N9) 와유전자가 96% 동일 H2 HA 유전자 (A/Wild bird/korea/w139/06 [H2N3]) 가장유사한바이러스는 A/mallard/Netherlands/13/99(H2N2) 와유전자가 96% 동일 -12-

15 H3 HA 유전자 (A/Wild bird/korea/w128/06 [H3N8]) 가장유사한바이러스는 A/mallard/Maryland/1235/2006(H3N6) 와유전자가 98% 동일 H5 HA 유전자 (A/Wild bird/korea/w81/05 [H5N2]) 가장유사한바이러스는 A/duck/Jiang Xi/1850/2005(H5N2) 와유전자가 98% 동일 -13-

16 H7 HA 유전자 (A/Wild bird/korea/w44/05 [H7N3]) 가장유사한바이러스는 A/duck/Jiang Xi/1742/03(H7N7) 와유전자가 97% 동일 H9 HA 유전자 (A/Wild bird/korea/w71/05 [H9N1]) 가장유사한바이러스는 A/duck/Hokkaido/9/99(H9N2) 와유전자가 97% 동일 -14-

17 2) NA 유전자 N1 NA 유전자 (A/Wild bird/korea/w24/05 [H6N1]) 가장유사한바이러스는 A/duck/Eastern china/103/2003(h1n1) 와유전자가 98% 동일 N2 NA 유전자 (A/Wild bird/korea/w08/05 [H9N2]) 가장유사한바이러스는 A/goose/Gui Yang/3799/2005(H5N2) 와유전자가 97% 동일 -15-

18 N7 NA 유전자 (A/Wild bird/korea/w184/07 [H7N7]) 가장유사한바이러스는 A/duck/Mongolia/583/02(H4N7) 와유전자가 96% 동일 본연구과제를위하여선택한국내분리바이러스와 GenBank data저장된바이러스와의유전자비교 -16-

다. 확보한 plasmid clone을이용하여만들어진재조합바이러스의 subtypes Reverse genetic 방법을이용한재조합바이러스생산 * 재조합바이러스를만드는일은 2단계에서마무리되어질부분이었지만 1차년도과제에서이미재 조합바이러스의목표치의약 50% 이상이역유전학방법을이용하여만들어진상태임.

19 다. 확보한 plasmid clone을이용하여만들어진재조합바이러스의 subtypes Reverse genetic 방법을이용한재조합바이러스생산 * 재조합바이러스를만드는일은 2단계에서마무리되어질부분이었지만 1차년도과제에서이미재 조합바이러스의목표치의약 50% 이상이역유전학방법을이용하여만들어진상태임. 상기확보된 HA 그리고 NA유전자와 PR8 공여바이러스의내부유전자를이용, 역유전자방법을이용하여 H1N1, H1N2, H1N7, H3N2, H5N1, H5N2, H5N7, H7N1, H7N2, 및 H7N7subtypes의재조합바이러스를 1개씩 생산함. 그리고나머지 H2N1, H2N2, H2N7, H3N1, H3N7, H9N1, H9N2, 및 H9N7subtype의재조합바이러스는 HA와 NA 의조합이잘맞지않는것으로판단되며, 적합한 HA와 NA유전자를좀더 screening하여새로운균주 의유전자를이용할예정임. * 본연구과제는총 2 년의연구계획으로이루어졌으며, 본연구과제에서 rescue한바이러스는 2 차년도에연계하여실험동물( 마우스) 에백신실험을통하여각바이러스의항원성과면역원성등의실험을수행할계획임. -17-

20 라. Reverse genetic 방법을이용한재조합바이러스생산방법의개선연구 재조합바이러스의생산이 monkey유래의 Vero cell line에서이루어지기때문에 human유래의 PolI, PolII promoter를사용하여바이러스를 rescue 하는데효율적인문제점이있으것으로사료됨. 그러므로중국에서는 chicken 유래의 PolI, PolII promoter를이용하여바이러스를 primary chicken cell line에서 rescue 하려는시도를하고있으며, 일본과미국에서는인플루엔자바이러스가가장잘자라는 MDCK (canine kidney cell line) 을이용한 canine PolI, PolII promoter를개발하여좀더높은효율의재조합바 이러스를만들기위한여러노력을기울이고있음. 그러므로본연구에서는 Vero cell의 genomic DNA를추출하여 18S유전자의 promoter region과 28S 3'end의 terminator region을상기그림과같은방법으로증폭하여 screening 하고자하였음. 일반적으로 human 의유전자와다른영장류(monkey) 의유전자는많은부분이비슷한것으로알려져있지만아 직까지 Vero cell 유래의 18S 및 28S 의유전자는밝혀지지않았음. 그러므로 huaman 유전자를바탕으로 18S 및 28S 의유전자부위를밝혀야하는문제점을가지고있음. 본연구분야는아직세부적자료를확보하지못하였으나, 2차년도에연계하여지속적으로연구를수행하고자함. -18-

21 제장연구결과고찰및결론 4 가. 연구배경과중요성 1) 조류인플루엔자에의한인체감염의주요원인은 H5N1, H7N7, 그리고 H9N2형바이러스로밝혀지고 있으며, 전세계적으로인명폐해와공황상태및경제마비를야기할수있음을세계보건기구 (WHO) 가 지속적으로경고하며국제적인대책마련을촉구하고있음. 2) WHO에서는 H5N1 조류인플루엔자에의한인체감염확산가능성지속적경고. 최근 Global Influenza Preparedness Plan (May 2005) 발표하였으며팬데믹발생시전세계적으로 10만명이사망할것으로추 정되는등막대한인명피해는물론심각한사회경제적위기를초래할우려가있음을경고함 3) 한국은자체적인방역대책에도불구하고동남아조류인플루엔자발생지역과지역적으로근접하여 일단유사시큰폐해를볼수있는가능성이높아지고있음. 4) 현재사용중인타미플루치료제는공급이부족하고생산에막대한비용이요구되며, 또한최근에 타미플루내성바이러스가발견되어조류인플루엔자 인예방백신이전세계적으로부재함. pandemic 발생시이를제어할기술이나효과적 5) 이에본연구에서는인체감염이확인된고병원성조류인플루엔자바이러스및조류에는저병원성 이지만인체감염위험가능성이있는아형에대한유전자확보및특성분석을통하여백신제조에사 용될 reverse genetics법에신속하고직접적으로적용될수있는인플루엔자바이러스유전자 library 를구축하고자하였음. 나. 결론및고찰 1) 1차년도추진계획이었던 reverse genetic system을이용한재조합바이러스방법의확립및이를이용 한재조합바이러스생산방법을표준화하였음. 하지만아직까지재조합바이러스의생산이 monkey유래의 Vero cell line에서이루어지기때문에 human유래 의 PolI, PolII promoter를사용하여바이러스를 rescue 하는데효율적인문제점이있으것으로사료됨. 그러므로중국에서는 chicken 유래의 PolI, PolII promoter를이용하여바이러스를 primary chicken cell line에서 rescue 하려는시도를하고있으며, 일본과미국에서는인플루엔자바이러스가가장잘자라는 MDCK (canine kidney cell line) 을이용한 canine PolI, PolII promoter를개발하여좀더높은효율의재조합바 이러스를만들기위한여러노력을기울이고있음. 그러므로본연구에서는 monkey유래의 Vero cell line을바이러스를 rescue하는주요 target세포로사용하기 위하여 Vero cell에서 total genomic DNA를추출하여 human 유전자염기서열을이용하여 Poll 및 PolII region 을증폭하고자하였으나, human의유전자와 Vero cell에서추출한 DNA사이의낮은 homology 때문에좀 -19-

22 더다각적인접근방법이필요할것으로보임 (Southern blot, 다양한 degeneration primer를이용한 nested PCR 방법등등). 본연구과제또한 2 차년도에연계하여연구를수행하고자함. 2) 조류인플루엔자바이러스중 1차년도의연구계획이었던조류인플루엔자의인체예비백신균주생산을 위한 H1, H2, H3, H5, H7, H9 hemaglutination (HA) 유전자와 N1, N2, N7의 Neuramidase (NA) 유전자를 국내야생조류에서분리한바이러스로부터확보하였음. 하지만본연구과제의연구기간과연구비의제한에의하여각 subtype별로 1-2개정도의유전자만을선 별하여전체유전자 library가아닌우선적으로지금까지인체감염가능성이높은 subtype에한하여 library 를만들기로계획하였음. 하지만일본의북해도대학및여러기관에서는 H16종 N9종의총 144개의 subtype을가지는바이러스 library를만들기위하여 10에서 15 년의연구기간을가지고지속적으로연구를수행하고있으며, 선택 유전자의종류도한 subtype에서여러개를선택하여 HA 및 NA 단백질의기능이잘어우러진바이러스를 생산하기위하여꾸준한연구가진행중임. 그러므로본연구과제도 1-2년의짧은기간에완성되기힘 든연구과제이며지속적인연구를통하여새로운바이러스에대한 사료됨. update를하는것이바람직할것으로 3) 본연구과제에서확보된 HA 그리고 NA유전자와 PR8 공여바이러스의내부유전자를이용, 역유전자방 법을이용하여 H1N1, H1N2, H1N7, H3N2, H5N1, H5N2, H5N7, H7N1, H7N2, 및 H7N7subtypes의재조합바 이러스를 1개씩의 rescue 하였음. 이렇게생산된재조합바이러스는 2차년도의연구과제기간동안마우 스를이용한동물실험에서항체형성능력을확인할예정임. 하지만, H2N1, H2N2, H2N7, H3N1, H3N7, H9N1, H9N2, 및 H9N7subtype의재조합바이러스는아직 rescue 되지못했음. 이는아마도인플루엔자바이러스의감염과전파에깊이관여하는 HA와 NA단백질의 기능이서로잘맞지않아재조합바이러스의생산이불가능하거나어려운것으로판단되기때문에, 적 합한 HA와 NA유전자를좀더 screening 하여새로운균주의유전자를이용할예정임. -20-

23 제7장참고문헌 Human infection with swine influenza virus--wisconsin. MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep. 37: Cheung, C. L., J. M. Rayner, G. J. Smith, P. Wang, T. S. Naipospos, J. Zhang, K. Y. Yuen, R. G. Webster, J. S. Peiris, Y. Guan, and H. Chen Distribution of amantadine-resistant H5N1 avian influenza variants in Asia. J.Infect.Dis. 193: Choi, Y. K., T. K. Kim, C. J. Kim, J. S. Lee, S. Y. Oh, H. S. Joo, D. N. Foster, K. C. Hong, S. You, and H. Kim Activation of the intrinsic mitochondrial apoptotic pathway in swine influenza virus-mediated cell death. Exp.Mol.Med. 38: Claas, E. C., A. D. Osterhaus, B. R. van, J. C. De Jong, G. F. Rimmelzwaan, D. A. Senne, S. Krauss, K. F. Shortridge, and R. G. Webster Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351: Gambaryan, A. S., A. B. Tuzikov, N. V. Bovin, S. S. Yamnikova, D. K. Lvov, R. G. Webster, and M. N. Matrosovich Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken and receptor specificity of the 1997 H5N1 chicken and human influenza viruses from Hong Kong. Avian Dis. 47: Gillis, J. S An avian influenza vaccine for humans targeting the polymerase B2 protein inside the capsid instead of hemagglutinin or neuramidase on the virus surface. Med.Hypotheses 66: Kim, T. K., J. S. Lee, J. E. Jung, S. Y. Oh, S. Kwak, X. Jin, S. Y. Lee, J. B. Lee, Y. G. Chung, Y. K. Choi, S. You, and H. Kim Interferon regulatory factor 3 activates p53-dependent cell growth inhibition. Cancer Lett. 242: Kim, T. K., J. S. Lee, S. Y. Oh, X. Jin, Y. J. Choi, T. H. Lee, E. Lee, Y. K. Choi, S. You, Y. G. Chung, J. B. Lee, R. A. DePinho, L. Chin, and H. Kim Direct transcriptional activation of promyelocytic leukemia protein by IFN regulatory factor 3 induces the p53-dependent growth inhibition of cancer cells. Cancer Res. 67: Krug, R. M Virology. Clues to the virulence of H5N1 viruses in humans. Science 311: Mast, E. E., M. W. Harmon, S. Gravenstein, S. P. Wu, N. H. Arden, R. Circo, G. Tyszka, A. P. Kendal, and J. P. Davis Emergence and possible transmission of amantadine-resistant viruses during nursing home outbreaks of influenza A (H3N2). Am.J.Epidemiol. 134: Mo, I. P., Song, C. S., Kim, K. S., and Rhee, J. C. An occurrence of non-highly pathogenic -21-

24 avian influenza in Korea. In. In "Proceedings of the Forth International Symposium on Avian Influenza" (United Sates Animal Health Association), Tallahassee, FL, Rose printing company. Ref Type: Conference Proceeding 12. Obenauer, J. C., J. Denson, P. K. Mehta, X. Su, S. Mukatira, D. B. Finkelstein, X. Xu, J. Wang, J. Ma, Y. Fan, K. M. Rakestraw, R. G. Webster, E. Hoffmann, S. Krauss, J. Zheng, Z. Zhang, andc. W. Naeve Large-scale sequence analysis of avian influenza isolates. Science 311: Peiris, J. S., W. C. Yu, C. W. Leung, C. Y. Cheung, W. F. Ng, J. M. Nicholls, T. K. Ng, K. H. Chan, S. T. Lai, W. L. Lim, K. Y. Yuen, and Y. Guan Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease. Lancet 363: Shih, S. R., C. N. Lee, H. R. Tsai, G. W. Chen, and K. C. Tsao Amantadine-resistant influenza A virus in Taiwan. J.Formos.Med.Assoc. 100: Song, M. S., T. K. Oh, H. J. Moon, D. W. Yoo, E. H. Lee, J. S. Lee, C. J. Kim, G. J. Yoo, H. Kim, and Y. K. Choi Ecology of H3 avian influenza viruses in Korea and assessment of their pathogenic potentials. J.Gen.Virol. 89:

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발간등록번호 3. 보고서요약서 보고서요약서 - 2 - - 3 - 4. 국문요약문 - 4 - 5. 영문요약문 < SUMMARY > - 5 - 6. 영문목차 < CONTENTS > - 6 - - 7 - 7. 본문목차 목차 - 8 - - 9 - 제 1 장. 연구개발과제의개요 - 10 - - 11 - - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 -