366 조용곤 김정현 김달식외 2 인 항암화학요법직후 [3, 7] 에는망상혈소판이감소되며, 항암요법후골수기능이회복 [3, 6] 되거나조혈모세포성장인자치료후 [8, 9] 에는혈소판수가증가하기수일전에증가된다고하였다. 또, 전자간증 [] 이나만성혈소판증가와관련된혈전증 [11

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태준 태
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1 대한진단검사의학회지 : 제 2 권제 6 호 2 Korean J Lab Med 2; 2: 진단혈액학 혈소판감소증의감별진단에유용한망상혈소판백분율의측정법 조용곤 1,2 김정현 2 김달식 1,2 최삼임 1,2 이혜수 1,2 전북대학교의과대학진단검사의학교실 1, 전북대학교임상의학연구소 2 Quantitation of the Percentage of Reticulated Platelets to Diagnose the Cause of Thrombocytopenia Yong Gon Cho, M.D. 1,2, Jung Hyun Kim, M.T. 2, Dal Sik Kim, M.D. 1,2, Sam Im Choi, M.D. 1,2, and Hye Soo Lee, M.D. 1,2 Department of Laboratory Medicine 1, Chonbuk National University Medical School; Research Institute of Clinical Medicine 2, Chonbuk National University, Jeonju, Korea Background : Since reticulated s (RP), known to be newly released from megakaryocytes in the bone marrow into the blood, contain RNA in their cytoplasm, we can detect them by staining RNA remnants with fluorescent dyes and performing flow cytometric analysis. We attempted to search for the best conditions in quantitating the percentage of RP (RP%) to identify causes of thrombocytopenia. Methods : The RP% were measured on venous blood samples collected in EDTA from 63 normal controls and 48 thrombocytopenic patients. The thrombocytopenic patients were divided into two groups according to the causes: hypoplastic and destructive. The RP% was determined by a flow cytometric analysis with anti-cd41a and thiazole orange (TO) as a fluorochrome. Results : In patients with their count less than 9 /L, the RP% of two patient groups showed a significant difference. The RP% and count were correlated directly in the hypoplastic group, but inversely in the destructive group. According to the results of ROC curve, the best conditions in quantitating RP% to identify the cause of thrombocytopenia was to apply a 2% threshold of TO positivity among gated s; its sensitivity and specificity were 93.3% and 83.3%, respectively.w Conclusions : The RP% is considered to be a good marker for differentiating destructive from hypoplastic thrombocytopenia and monitoring of the destructive thrombocytopenic patient having normal bone marrow such as idiopathic thrombocytopenic purpura. For the accurate measurement of the RP%, the condition of 2% TO threshold is considered to be appropriate. (Korean J Lab Med 2; 2: 36-72) Key Words : RP%, Thiazole orange, Thrombocytopenia 서 론 망상혈소판은골수거핵세포에서생산되어혈중으로유리되는 접수 : 24년 11월 2일접수번호 : KJLM186 수정본접수 : 2년 월 일교신저자 : 이혜수우 전북전주시덕진구금암동 전북대학교병원진단검사의학과전화 : , Fax: leehs@chonbuk.ac.kr * 본논문은전북대학교병원임상연구소의학술연구비지원에의하여연구되었음. 미성숙한혈소판으로세포질내에 RNA를함유하고있어, 세포내의 RNA를염색할수있는 thiazole orange (TO) 나 auramine O (AO) 로염색한후유세포분석기를이용하여그수를측정할수있다. Kienast 등 [1] 에의해 TO를이용한망상혈소판의측정이시행되었고, 혈소판감소증환자에서그임상적유용성이처음으로보고되었다. 이후이들의연구방법을변형한많은연구가시행되었고 [2-6], 그결과망상혈소판은특발성혈소판감소성자반증 [4] 이나본태성혈소판증다증 [6] 과같이혈소판의회전율이증가된상황에서증가된다고보고되었다. 반면, 골수기능부전이나 36

2 366 조용곤 김정현 김달식외 2 인 항암화학요법직후 [3, 7] 에는망상혈소판이감소되며, 항암요법후골수기능이회복 [3, 6] 되거나조혈모세포성장인자치료후 [8, 9] 에는혈소판수가증가하기수일전에증가된다고하였다. 또, 전자간증 [] 이나만성혈소판증가와관련된혈전증 [11], 그리고심장색전에의한허혈성발작 [12] 등에서도망상혈소판의증가가관찰되었다. 그러나, TO를이용한망상혈소판의참고범위는검체나측정방법에따라매우다양하여표준화가요구되어왔다. 이러한요구에부응하여망상혈소판내의 RNA를염색하기에적합한 TO 농도를구하거나 [13], thrombin receptor activating peptide (TRAP) 또는 RNAse를사용하여 TO 양성기준치를설정한후측정하는방법 [, 14] 들이시도되었으며, 이가운데가장많이도입한 TO 양성기준은 1% 이었고, 최근 Wang 등 [14] 이항암요법후혈소판회복여부를판정하는데있어서 2% 기준을적용하였다. 이에저자들은혈소판수가정상인대조군과감소된환자를대상으로 1% 와 2%, 두종류의 TO 양성기준을적용하였을때얻어진각각의망상혈소판백분율이혈소판감소의원인을감별진단하는데있어서어떠한진단적유용성을보이는지살피고, 더욱유용한기준을얻고자하였다. 대상및방법 1. 대상대조군은 24년 3월부터 9월까지전북대학교병원에내원한비혈액질환자중에서혈액검사결과가정상치를벗어나지않은 63명 ( 남자 3명, 여자 28명 ) 을대상으로하였다. 환자군은동일기간동안전북대학교병원에서혈액검사를시행하여말초혈액의혈소판수가 9 /L 미만인환자 48명 ( 남자 21명, 여자 27명 ) 을대상으로혈소판의생성저하에의한군 (21명) 과말초에서의혈소판파괴증가에의한군 (27명 ) 으로나누었다 (Table 1). 또한환자군중에서혈소판수가 9 /L 미만인군과 9 /L 이상인군으로구분하여혈소판감소정도에따른망상혈소판백분율의차이를비교하였다. 2. 혈소판및관련지표의측정대조군및환자군의정맥으로부터얻은 3-4 ml의혈액을 ED- TA 시험관 (Vacutainer, Becton Dickinson Vacutainer Systems, Franklin Lakes, USA) 에넣은후자동혈구계산기 (Gen-S, Coulter Electronics, Miami, USA) 를이용하여전혈구계산을시행하고, 혈소판수와평균혈소판용적 (MPV), 그리고혈소판분포계수 (PDW) 를확인하였다. 3. 망상혈소판의측정망상혈소판의측정은 Wang 등 [14] 의방법에준하였다. 이미채혈한 EDTA 전혈 L를동량의 2% paraformaldehyde 용액으로 22 에서 6분간항온배양하여고정하였고, 사용된 2% paraformaldehyde 용액은 배농축된 ph 7.4 PBS (GIBCO, Grand Island, USA) ml에 paraformaldehyde powder (EM grade, Polyscience, Warrington, USA) 2 g을넣고용해하여제조하였다. 고정된검체중에서먼저 L를취하여 PE 로표지된항-GPIIb/IIIa (CD41a) 단클론항체 (Pharmingen, San Diego, USA) 2 L와 PBS 3 L를첨가하여 37 에서 3분간항온배양하고, 다른 L는혈소판의 RNA성분을파괴하기위하여 RNAse (Promega, Madison, USA) 1 U로전처리함과동시에항-GPIIb/IIIa 단클론항체 2 L를첨가하여 37 에서 3분간항온배양하였다. 염색을위해서 RNAse를처리한검체와처리하지않은검체각각의 L에 TO (Retic-COUNT, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, USA) 9 L를첨가하여 22 에서 6분간항온배양하였다. RNAse에의해파괴되지않는혈소판내핵산성분이형광염색후배경형광을나타내게되므로, RNAse를처리하지않은동일검체에서얻어진결과로부터미리 RNAse를처리한검체에서얻어지는결과를배제함으로써 RNA를세포질내에실제로갖고있는망상혈소판을정확하게산정하고자하였다. 혈액검체는채혈된지 4시간이내의전혈을사용하였으며, 염색이끝난검체는즉시유세포분석기 (FACScan, BD Biosciences, Mountain View, USA) 를이용하여측정하였다. 혈소판들은크기와 PE 양성에의해동정하였고, 검체당 만개의입자를수집하였다. Table 1. Causes of thrombocytopenia in two patient groups Cases No. of cases Hypoplastic group (n=21) Aplastic Anemia 12 Chemotherapy 6 MDS* 3 Destructive group (n=27) ITP 16 Liver Cirrhosis 6 DIC Abbreviations: MDS, Myelodysplastic Syndrome; ITP, Idiopathic Thrombocytopenic Purpura; DIC, Disseminated Intravascular Coagulation. 4. 망상혈소판백분율의산정 FSC/SSC와 FL1 (TO)/FL2 (GPIIb/IIIa-PE), 두개의 dotplot에서혈소판의위치에영역 (R1, R2) 을설정하였다. TO 양성혈소판을정의하기위해서먼저 RNAse로처리된검체로부터얻은결과를분석프로그램 (WinMDI, The Scripps Research Institute, La Jolla, USA) 을이용하여 FSC/SSC 및 FL1 (TO)/FL2 (GPIIb/IIIa-PE) plot에서큰산란도를보이며 RNAse에반응하지않은비특이적인형광들은배제하면서, 영역 R1과 R2를통

혈소판감소증의감별진단에유용한망상혈소판백분율의측정법 367 control RNAse (+) RNAse (-) 1%, R2 2%, R2 1%, R1&R2 2%, R1&R2.99 2.9 1.

After the region in FSC/SSC and FL1/FL2 plot for RNAse treated sample was defined.

To obtain RP% with non-rnase treated sample, the same regions and TO thresholds were applied.

threshold with R1 and R2, (3) 2% TO threshold with R2 only, and (4) 2% TO threshold with R1 and R2.

RNAse를처리하지않은검체로부터영역 R1과 R2를통해얻어진형광을역시 FSC/FL1 (TO) plot에표현하고, RNAse로처리한검체에서설정된 TO

적절한유세포분석조건을구하기위해영역 R1과 R2의조건을모두충족시키는입자들을혈소판으로정의하고 1% 와 2% 두종류의 TO 양성기준을적용하여구한망상혈소판백분율과영역

. 통계처리망상혈소판백분율의대조군과환자군사이의평균값비교와환자군의혈소판감소정도에따른망상혈소판백분율의평균값비교는독립표본 t 검정을이용하였고, 유세포분석조건에따른결과의비교는대응표본 t

또, 혈소판감소증의원인감별을가장잘나타내는망상혈소판백분율의 cut-off 값을구하고, 각각의기준에대한진단적유용성을비교하기위해 receiver operating characteristic

3 혈소판감소증의감별진단에유용한망상혈소판백분율의측정법 367 control RNAse (+) RNAse (-) 1%, R2 2%, R2 1%, R1&R2 2%, R1&R patient 4 RNAse (+) RNAse (-) Fig. 1. Scheme of analysis of reticulated s using a flow cytometer. After the region in FSC/SSC and FL1/FL2 plot for RNAse treated sample was defined. TO thresholds were set at 1% and 2% for FSC/FL1 plot. To obtain RP% with non-rnase treated sample, the same regions and TO thresholds were applied. The analysis were performed according to four conditions: (1) 1% TO threshold with R2 only, (2) 1% TO threshold with R1 and R2, (3) 2% TO threshold with R2 only, and (4) 2% TO threshold with R1 and R2. 해얻은형광들을 FSC/FL1 (TO) plot에서표현하여기준선상위의형광이전체의 1% 또는 2% 가되는횡축을설정하고이를 TO 양성의기준선으로삼았다. RNAse를처리하지않은검체로부터영역 R1과 R2를통해얻어진형광을역시 FSC/FL1 (TO) plot에표현하고, RNAse로처리한검체에서설정된 TO 양성기준을적용하여기준선상위의혈소판을대상검체의망상혈소판으로정의하고, 총혈소판에대한백분율을망상혈소판백분율로산정하였다. 적절한유세포분석조건을구하기위해영역 R1과 R2의조건을모두충족시키는입자들을혈소판으로정의하고 1% 와 2% 두종류의 TO 양성기준을적용하여구한망상혈소판백분율과영역 R2의조건만을충족시키는입자들을대상으로두종류의 TO 양성기준을적용하여구한망상혈소판백분율을비교하였다 (Fig. 1).. 통계처리망상혈소판백분율의대조군과환자군사이의평균값비교와환자군의혈소판감소정도에따른망상혈소판백분율의평균값비교는독립표본 t 검정을이용하였고, 유세포분석조건에따른결과의비교는대응표본 t 검정을이용하였으며, 환자군에서혈소 판수와망상혈소판백분율사이의상관성은 Spearman 상관계수로비교하였다. 또, 혈소판감소증의원인감별을가장잘나타내는망상혈소판백분율의 cut-off 값을구하고, 각각의기준에대한진단적유용성을비교하기위해 receiver operating characteristic (ROC) 곡선을이용하였다. 결과 1. 혈소판수및관련지표대조군의평균혈소판수는 272.6±.7 9 /L이었고, MPV는 7.6±.9 fl, PDW는 16.1±.8% 이었으며, 남녀간에통계적으로유의한차이는없었다. 환자군의평균혈소판수는 46.8±27. 9 / L이었고, 이가운데생성저하군의평균혈소판수는 38.1± /L, 파괴증가군의평균혈소판수는 3.4±2.4 9 /L로써, 두군간에통계적으로유의한차이는없었다 (P=.4). 환자군의 MPV는 8.1±1. fl이었고, 생성저하군에서는 7.±1.1 fl, 파괴증가군에서는 9.±1.1 fl를보여두군간에유의한차이를나타내었고 (P=.1), 대조군과는생성저하군의경우유의하게낮

4 368 조용곤 김정현 김달식외 2 인 은결과를, 파괴증가군은유의하게높은결과를보였다. 환자군의 PDW는 16.8±.9% 이었고, 생성저하군과파괴증가군의결과는각각 16.7±.9%, 16.8±.9% 로그차이가뚜렷하지않았지만, 대조군과는두군에서모두유의하게높은결과를보였다 (Table 2). 2. 유세포분석조건에따른망상혈소판백분율의비교 혈소판영역 R1으로취한입자들은 FL1/FL2 plot에표현하였을때모두항-gpiib/iiia 항체의 PE 형광에음성과양성의위치에동시에분포되었고, R2로취한입자들을 FSC/SSC plot에표현하였을때 FSC와 SSC가큰입자들이 R2 영역에다수포함됨을알수있었다 (Fig. 2). 63명대조군의 RNAse를처리한검체에서 TO 양성기준을상위 1% 가되도록설정하였을때혈소판영역 R1과 R2를모두충족시키는입자들의평균망상혈소판백분율과 R2만을충족시키는입자들의평균망상혈소판백분율은각각 6.68±2.2% 와 4.91±1.41% 이었고, 2% 가되도록설정하였을때의평균망상혈소판백분율은각각.31±2.99% 와 8.4± 2.17% 로 TO 양성기준이커질수록산정되는망상혈소판백분율 결과는증가되었고, 같은기준에서산정된결과는 R1 과 R2 영역을 Table 2. s, mean volume, and distribution width in the controls and patients s ( 9 /L) MPV (fl) PDW (%) Controls (n=63) 272.6±.7 7.6± ±.8 Patients (n=48) 46.8± ± ±.9 hypoplastic (n=21) 38.1± ±1.1* 16.7±.9 destructive (n=27) 3.4±2.4 9.±1.1, 16.8±.9 *, significantly lower than controls;, significantly higher than controls;, significantly different between two patient groups. Abbreviations: HPV, mean volume; PDW, distribution width. 모두취한경우가 R2만을취한경우보다높게나타났다. 환자군에서도대조군과같은결과를보였는데, 1% 기준으로산정된평균망상혈소판백분율은 R1과 R2 영역을모두취한경우가.96± 8.11%, R2 영역만을취한경우가.3±3.66% 이었고, 2% 기준으로산정된평균망상혈소판백분율은각각 1.69±8.94%, 8.62 ±.4% 이었다. 유세포분석조건별평균망상혈소판백분율을대응표본 t 검정으로분석한결과, 2% 기준으로산정된결과가 1% 기준으로산정된결과에비하여유의하게높았고, 같은기준에서 R1과 R2 영역을모두취한경우와 R2 영역만을취한경우를비교하였을때 R2 영역과 R1 영역을함께취한경우가 R2 영역만을취한경우에비하여유의하게높았다 (P=.1). 3. 혈소판감소의원인에따른망상혈소판백분율의비교 유세포분석조건별결과를가지고생성저하군과파괴증가군을비교하였을때 R2 영역만을 1% 기준으로산정한경우를제외한나머지세가지조건에서두군간에유의한차이를나타내었다. 또한대조군의결과와비교하였을때파괴증가군의결과는모든 Table 3. Comparison of the percentage of reticulated s between the controls and patients according to conditions of flow cytometric analysis Condition Controls (n=63) Patients (n=48) RP% (%) Hypoplastic (n=21) Destructive (n=27) 1%, R2 4.91±1.41.3± ± ±3.88 1%, R1&R2 6.68±2.2.96± ± ±8.96, 2%, R2 8.4± ± ±4.2*.11±.18, 2%, R1&R.31± ±8.94.3± ±9.6, *, significantly lower than controls;, significantly higher than controls;, significantly higher than hypoplastic group. Values are the Mean±S.D. Control Patient RNAse (+) RNAse (+) RNAse (-) RNAse (-) Fig. 2. Comparison of the distribution of events gated in each region between a control and a patient. FSC/SSC plot diagram shows events gated by R2 and the particles not included in the R1 area are green, but the particles included in the R1 area are red. In case of patient, RNAse sensitive particles with green color are more than in case of control and they have high FSC and SSC height. FL1/FL2 plot diagram shows ecents gated by R1.

5 혈소판감소증의감별진단에유용한망상혈소판백분율의측정법 369 조건에서대조군에비해유의한차이를보인반면, 생성저하군의결과는 R2 영역만을 2% 기준으로산정한경우를제외한나머지세가지조건에서유의한차이를보이지않았다 (Table 3). 4. 혈소판감소정도에따른망상혈소판백분율 환자군중에서혈소판수가 9 /L 이상인경우는모두 21 예이었고, 9 /L 미만인경우는 27예이었다. 혈소판수가 9 /L 미만인환자중에서유세포분석조건별로산정된평균망상혈소판백분율은생성저하군과파괴증가군간에유의한차이를보인반면, 혈소판수가 9 /L 이상인경우는모든조건에서유의한차이를보이지않았다 (Table 4). 각환자군에서의혈소판감소정도에따른평균망상혈소판백분율은혈소판감소의원인에따라각기다른양상을나타내었다. 혈소판생성저하군에서는 R2 영역만을 1% 기준으로산정한경우를제외한나머지세가지조건에서는혈소판수가 9 /L 이상인환자들의결 1%, R2 1%, RR1&2 2%, R2 2%, R1&R Hypoplastic r=.43, P=.7 r=.7, P= r=.613, P= r=.96, P= Fig. 3. Correlation between blood counts and the percentage of reticulated s in the patients of hypoplastic group (n=21) and destructive group (n=27). The statistical analysis was performed by using a bivariate correlation analysis (r, Spearman s rho Correlation Coefficient). 2 1 Destructive r=-.3, P= r=-.471, P= r=-.39, P= r=-.377, P= 과가 9 /L 미만인환자들의결과보다유의하게높았다. 혈소판파괴증가군에서는혈소판수가 9 /L 이상인환자들의결과가 9 /L 미만인환자들의결과보다낮았고, R1과 R2 영역을모두취하여 2% 기준으로산정한경우는그차이가통계적으로유의하였다 (Table 4). 혈소판수와망상혈소판백분율의상관성은혈소판감소의원인에따라상이한결과를나타내었다 (Fig. 3). 생성저하군에서는혈소판수와망상혈소판백분율간에비례관계를나타내었고, 파괴증가군에서는역상관관계를나타내었다.. 망상혈소판백분율의진단적유용성 평균망상혈소판백분율의결과가혈소판수가 9 /L 이상인경우모든조건에서생성저하군과파괴증가군간의차이가유 Table 4. Comparison of the percentage of reticulated s by the counts of the patients and the conditions of flow cytometric analysis *, significantly higher than result of patients with their count less than 9 /L;, significantly lower than result of patients with their count less than 9 /L;, significantly higher than hypoplastic group. Ture Positive Rate (Sensitivity) RP% (%) Hypoplastic Destructive < 9 /L > 9 /L < 9 /L > 9 /L 1%, R2 3.79± ± ± ±2.44 1%, R1&R2.19± ±4.17* 17.6±.7.9±4.33 2%, R2 4.89± ±3.79* 11.74± ±3.44 2%, R1&R2 7.91± ±.22* 22.78± ± Cut-off value (%) Sensitivity (%) Specificity (%) False Positive Rate (1-Specificity) Source of the Curve 1%, R2 2%, R2 1%, R1&R2 1%, R2&R2 Fig. 4. Receiver operating characteristic curve of the percentage of reticulated s in thrombocytopenic patients with their counts less than 9 /L. The number on each curve indicates a point with highest in Y-axis (true positive rate) and most left in X-axis (false positive rate).

6 37 조용곤 김정현 김달식외 2 인 의하지않았고, 9 /L 미만인경우에만두군간의차이를구별할수있었기때문에, 혈소판수가 9 /L 미만인환자들의결과만을가지고혈소판감소의원인을감별진단하는데에합당한유세포분석조건을구하고자하였다. 각유세포분석조건별로산정된망상혈소판백분율을 ROC 곡선을이용하여분석한결과, R1과 R2 영역을모두취하여 2% 기준으로분석한경우가혈소판감소의원인을감별하는데있어서가장높은민감도와특이도를나타내었다 (Fig. 4). 고찰망상혈소판은골수거핵세포로부터혈중으로유리되는신생혈소판으로세포내에 RNA 성분을갖고있으며 [1, 2, 4, 1], 혈소판회전율을반영한다고보고되었다 [7-9, 16]. 또한망상적혈구가적혈구조혈의평가지표로사용되듯이혈소판회전율을반영하는망상혈소판을혈소판조혈의평가지표로사용하자는주장이제기되었다 [17]. 그러나정상인에서의평균망상혈소판백분율이보고자에따라.4% 에서 2% 까지매우다양하게보고됨으로써 [1, 2, 4,, 18-21], 정확한측정법에대하여는아직논란의여지가남아있다. 이는망상혈소판의측정에사용된검체나염색시약의차이일수도있고, 같은검체라도정상치에차이를보이는점을미루어볼때유세포분석시적용한 TO 양성의기준의차이일수도있다. 염색을위한형광색소로는흔히사용되는 TO는 RNA와결합하면 3, 배의형광증폭을나타낼뿐아니라, 유세포분석기에서사용되는 488 nm의청색 argon laser에의해형광의최고점이녹색을띄므로오렌지색의 PE 표지항체나적색의 Per/CP 표지항체와함께다색으로이용될수있고, 또한지방친화성 (lipophilic) 이있어살아있는세포의세포막을자유롭게통과하기때문에염색을위한세포의보정이필요없다는장점을갖고있다. AO도망상혈소판의측정에이용될수있고, 세포내 RNA를염색시키는데걸리는시간이짧은장점을갖고있어자동화측정기기를통한연구에사용될수있지만 [7], TO와같이 RNA와결합후높은형광을발하지못하므로망상혈소판과같이세포내 RNA의양이적은경우는검출하는데한계를나타내는단점이있다. 실제로정상인에서 TO를이용하여측정된망상혈소판백분율이대략 % 정도인반면, AO를이용하여측정된망상혈소판백분율은.98% 로매우낮았다 [22]. 그러나 TO를이용하여측정된결과중에도 AO를이용한결과보다낮거나비슷한보고가있어 [17, 18], TO 양성의기준설정에따라보고자마다다양한결과를보고한것으로생각되었다. 기존의연구에서 TO 양성혈소판동정을위한기준설정은두가지의방법으로이루어졌는데, 첫째는같은검체에서형광염색을하지않은대조군을만들어 FL1-히스토그램상에서기준선의우측으로약 1% 의혈소판이포함되도록기준선을정의하고염색이이루어진검체에적용하여기준선우측의혈소판을망상혈소판으 로산정하는방법이고 [1, 3, ], 둘째는정상대조군의 TO로염색한혈액검체에서 SSC/FL1 (TO) plot 상에혈소판결과를표현하여약 1% 의혈소판이포함되도록가상의영역을설정하여이를기준영역으로정의하고그기준을환자군의검체에적용하는방법이었다 [7, 8, 1]. 여기에서임의적으로설정된 1% 는기기의착오 (noise) 를계산하여설정한것으로보고자에따라 % [18],.%[] 또는 2%[14] 로설정하기도하였다. 본연구에서적용한 1% 와 2% 의 TO 양성기준에따른평균망상혈소판백분율은대조군이나환자군에관계없이기준이높을수록높게측정되는경향을나타내었다. 혈소판영역적용에따른결과는 TO 양성기준의차이에관계없이 FL1/FL2 plot에서정의된영역 (R2) 만을취한경우보다 FSC/SSC plot에서정의된영역 (R1) 까지함께취한경우의망상혈소판백분율이더욱높았다. 이는 R2 영역만취하여 TO 양성기준을설정하게되면크기로인하여비특이적인 TO 형광이큰혈소판들이배제되지않고 RNAse를처리한검체의 TO 양성기준설정에영향을주어상대적으로높은기준이설정됨으로써, RNAse를처리하지않은분석검체에적용시 RNA를가지면서크기가크지않은망상혈소판들은기준치상위의영역에포함되지않게되어상대적으로낮은결과를나타낸것으로생각되었다. 분석프로그램을이용하여각영역에포함된입자들의분포를비교한결과 FSC/SSC plot의 R1 영역에포함된입자들은 FL1/FL2 plot에서혈소판으로인지하게하는 FL2 형광에음성과양성영역에모두나타났고, FL1/FL2 plot의 R2 영역에포함된입자들은 FSC/SSC plot에서 FSC와 SSC가큰영역에다수가포함되는양상을보였다 (Fig. 2). 혈소판감소의원인에따른두환자군간평균망상혈소판백분율의차이는특징적으로잘나타났지만, 유세포분석조건에따라약간의차이가있었다. 즉, 생성저하군에서의평균망상혈소판백분율은 R2 영역만을 2% 기준으로분석한경우대조군의결과에비해낮았으나, 나머지세조건에서는대조군의결과와비슷하였고, 파괴증가군에서는모든조건에서대조군의결과에비해높은수치를나타내었다 (Table 3). 이는혈소판회전율이증가하는질환에서시행된다른연구자들의결과와대체로일치하는소견이었고 [1, 12, 13, 17, 19], 혈소판회전율이감소하는경우에서는보고자마다상이한결과를보였다. 따라서, 망상혈소판백분율은혈소판회전율이증가되는특발성혈소판감소성자반증이나, 파종성혈관내응고증, 전자간증등의질환의진단에는유용한반면, 혈소판회전율이감소되는재생불량성빈혈이나골수이형성증후군과같은질환의진단에는그유용성을말하기어렵다고생각된다. Fujii 등 [23] 은 62예의특발성혈소판감소성자반증환자를대상으로혈소판감소정도에따라세군으로나누어망상혈소판백분율을측정한결과, 3 9 /L 미만인군과 3-9 /L 군의경우에는대조군에비해통계적으로유의하게높은결과를보인반면 9 /L 이상인군에서는대조군에대한망상혈소판백분율의차이가통계적으로유의하지않았다고보고하였다. 이는망상혈소판백분율이말초혈액내의혈소판수에따라골수내

7 혈소판감소증의감별진단에유용한망상혈소판백분율의측정법 371 에서의혈소판조혈의활성도를반영하는것을의미한다. Kienast 등 [1] 도파괴증가에의한혈소판감소증의회복에따라말초혈액내의망상혈소판수가점차감소되어정상치에도달하는것을보고하였다. 즉, 골수기능이정상이면서혈소판감소증이있는환자에서는혈소판감소의정도가망상혈소판백분율에영향을줄것으로생각된다. 본연구에서도생성저하군에서혈소판수가 9 /L 미만으로감소되지않은경우의망상혈소판백분율은그렇지않은경우에비해유의하게높았고, 파괴증가군중에서혈소판수가 9 /L 미만으로감소된환자의평균망상혈소판백분율이그렇지않은환자의결과에비해높았고, 이는다른연구자들의결과와일치하는소견이었다 [17, 23]. 또한혈소판수와망상혈소판백분율의상관성도두군간에서로다른양상을나타내었다 (Fig. 3). 이는망상혈소판백분율이생성저하군에서는골수기능의회복을반영하고, 파괴증가군에서는말초에서회복되는혈소판에의해골수기능이억제되는것을반영한다. ROC 곡선을이용하여기준치를설정한보고들 [3, 2, 21] 에서는파괴증가에의한혈소판감소증의진단에있어서망상혈소판백분율의민감도와특이도를각각 88% 와 % 로보고하여우수한지표임을주장하였다. Rinder 등 [4] 은생성저하에의한혈소판감소증환자의평균망상혈소판백분율에 2배의표준편차를더한값 (M+2SD) 이상을기준으로설정하여특발성혈소판감소성자반증의진단에적용하였을때그민감도와특이도가각각 83% 와 97% 로우수하다고하였다. 본연구에서는혈소판수가 9 /L 미만으로감소된환자에서 ROC 곡선을이용하여혈소판감소의원인을진단하는데적합한유세포분석조건을구한결과, R1과 R2 영역을모두취하여 TO 양성기준을 2% 로적용하였을때가장높은민감도와특이도를나타내었으며, 그수치는각각 93.3% 와 83.3% 이었다 (Fig. 4). 나머지세조건의결과는민감도와특이도가낮아임상적으로적용하기어렵다고생각되었다. 이상의결과로혈소판감소증의원인을감별진단하는데있어서 TO를이용한망상혈소판백분율의측정은골수검사에앞서혈소판감소의원인을진단할수있는유용한검사방법이지만, 정확한측정을위해서는적절한혈소판영역을정의하여거대혈소판을배제하도록유세포분석조건을설정하는것이중요하며, 나아가기존의연구에많이사용된 1% 의기기오차를 2% 로증가시킴으로써혈소판감소환자에서망상혈소판백분율의증감을민감하게측정할수있을것으로생각된다. 그러나, 기존의연구에서다양하게보고된참고범위의표준화를위해추후더욱많은검체를대상으로지속적인연구및임상적인적용을구체화시키기위한검사의자동화가필요하다고생각된다. 요약배경 : 망상혈소판은골수거핵세포에서생산되어혈중으로유 리되는가장미성숙한혈소판으로세포질내에 RNA를함유하고있으며, 세포내의 RNA를염색할수있는 TO로혈소판을염색하여유세포분석기를이용하여그수를측정할수있다. 저자들은정상인과혈소판감소증환자를대상으로망상혈소판을측정하고, 유세포분석조건에따른망상혈소판백분율을구하여, 혈소판감소의원인을감별진단하는데있어서적합한유세포분석조건을찾고자하였다. 대상및방법 : 혈액질환이없고혈액검사상혈소판수가정상인 63명을대조군으로하고, 혈소판수가 9 /L 이하로감소된환자 48명을환자군으로하여 EDTA 혈액 3 ml를채혈하고, 혈소판수와망상혈소판을측정하였다. 환자군은생성저하군과파괴증가군으로나누었다. 망상혈소판은전혈을 PE로표지된항-GPIIb/ IIIa 단클론항체와형광색소인 TO로염색한후유세포분석기를이용하여측정하였고, RP% 는혈소판수에대한 TO 양성혈소판수의백분율로정의하였다. 결과 : 혈소판수가 9 /L 미만으로감소된환자들에서두환자군의평균망상혈소판백분율은뚜렷한차이를보였으며, 각환자군에서혈소판감소정도에따른망상혈소판백분율은생성저하군의경우혈소판수가커질수록증가되었고, 파괴증가군은혈소판수가커질수록감소되었다. ROC 곡선을이용하여혈소판감소증환자에서원인을감별진단하기위한망상혈소판백분율의기준치를계산해본결과, R1과 R2 영역을함께취하여 2% 의기준을적용하는것이진단목적의망상혈소판백분율의적용에합당하였고, 이때의민감도와특이도는각각 93.3% 와 83.3% 이었다. 결론 : 망상혈소판백분율은골수의혈소판회전율을반영하는좋은지표로생각되며, 골수기능이정상이면서혈소판감소가심할수록월등하게증가되므로혈소판회전율이증가된혈소판감소증의진단및추적감시에유용할것으로생각되며, 정확한측정을위해서유세포분석시거대혈소판을배제하면서 2% 정도의 TO 양성기준을적용하는것이합당하리라생각된다. 참고문헌 1. Kienast J and Schmitz G. Flow cytometric analysis of thiazole orange uptake by s: a diagnostic aid in the evaluation of thrombocytopenic disorders. Blood 199; 7: Ault KA, Rinder HM, Mitchell J, Carmody MB, Vary CP, Hillman RS. The significance of s with increased RNA content (reticulated s). Am J Clin Pathol 1992; 98; Richards EM and Baglin TP. Quantitation of reticulated s: methodology and clinical application. Br J Haematol 199; 91: Rinder HM, Munz UJ, Ault KA, Bonan JL, Smith BR. Reticulated s in the evaluation of thrombopoietic disorders. Arch Pathol Lab Med 1993; 117: Robinson MS, Mackie IJ, Khair K, Liesner R, Goodall AH, Savidge

8 372 조용곤 김정현 김달식외 2 인 GF, et al. Flow cytometric analysis of reticulated s: evidence for a large proportion of non-specific labelling of dense granules by fluorescent dyes. Br J Haematol 1998; : Romp KG, Peters WP, Hoffman M. Reticulated counts in patients undergoing autologous bone marrow transplantation: an aid in assessing marrow recovery. Am J Hematol 1994; 46: Watanabe K, Kawai Y, Takeuchi K, Ikeda Y, Kubota F, Nakamoto H. Automated measurement of reticulated s in estimating thrombopoiesis. Eur J Haematol 199; 4: O Malley CJ, Rasko JE, Basser RL, McGrath KM, Cebon J, Grigg AP, et al. Administration of pegylated recombinant human megakaryocyte growth and development factor to humans stimulates the production of functional s that show no evidence of in vivo activation. Blood 1996; 88: Nomura S, Dan K, Hotta T, Fujimura K, Ikeda Y. Effects of pegylated recombinant human megakaryocyte growth and development factor in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura. Blood 22; : Rinder HM, Bonan JL, Anandan S, Rinder CS, Rodrigues PA, Smith BR. Noninvasive measurement of kinetics in normal and hypertensive pregnancies. Am J Obstet Gynecol 1994; 17: Rinder HM, Schuster JE, Rinder CS, Wang C, Schweidler HJ, Smith BR. Correlation of thrombosis with increased turnover in thrombocytosis. Blood 1998; 91: Nakamura T, Uchiyama S, Yamazaki M, Okubo K, Takakuwa Y, Iwata M. Flow cytometric analysis of reticulated s in patients with ischemic stroke. Thromb Res 22; 6: Matic GB, Chapman ES, Zaiss M, Rothe G, Schmitz G. Whole blood analysis of reticulated s: improvements of detection and assay stability. Cytometry 1998; 34: Wang C, Smith BR, Ault KA, Rinder HM. Reticulated s predict count recovery following chemotherapy. Transfusion 22; 42: Ault KA and Knowles C. In vivo biotinylation demonstrates that reticulated s are the youngest s in circulation. Exp Hematol 199; 23: Do JH, Park JS, Park TH, Lee EY, Son HC, Kim SH, et al. Clinical usefulness of measurement of reticulated s in idiopathic thrombocytopenic purpura. Korean J Clin Pathol 1999; 19: ( 도정화, 박정선, 박태희, 이은엽, 손한철, 김순호등. 특발성혈소판감소성자반증에서 Thiazole Orange 염색에의한망상혈소판측정의임상적유용성. 대한임상병리학회지 1999; 19: ) 17. Ken T, Ichiro F, Tadashi K, Junjiro T, Wataru H, Koji N, et al. Clinical application of reticulated analysis using the Matic-modified thiazole orange method and flow cytometry. Rinsho Ketsueki 2; 41: Consolini R, Calleri A, Bengala C, Legitimo A, Conte PF. Evaluation of thrombopoiesis kinetics by measurement of reticulated s and CD34+ cell subsets in patients with solid tumors following high dose chemotherapy and autologous peripheral blood progenitor cell support. Hematologica 21; 86: Saxon BR, Blanchette VS, Butchart S, Lim-Yin J, Poon AO. Reticulated counts in the diagnosis of acute immune thrombocytopenic purpura. J Pediatr Hematol Oncol 1998; 2: Peterec SM, Brennan SA, Rinder HM, Wnek JL, Beardsley DS. Reticulated values in normal and thrombocytopenic neonates. J Pediatr 1996; 129: Joseph MA, Adams D, Maragos J, Saving KL. Flow cytometry of neonatal RNA. J Pediatr Hematol Oncol 1996; 18: Oster G. Dye binding to high polymers. J Polymer Sci 19; 16: Fujii T, Shimomura T, Fujimoto TT, Kimura A, Fujimura K. A new approach to detect reticulated s stained with thiazole orange in thrombocytopenic patients. Thromb Res 2; 97:

대한진단검사의학회지제 27 권제 1 호 2007 Korean J Lab Med 2007;27:1-6 원저 진단혈액학 미성숙혈소판분획을이용한혈소판감소증진단법의임상적유용성 조용곤 1,2 이재현 1 김달식 1,2 이혜수 1,2 최삼임 1,2 전북대학교의과대학진단검사의학교실

대한진단검사의학회지제 27 권제 1 호 2007 Korean J Lab Med 2007;27:1-6 원저 진단혈액학 미성숙혈소판분획을이용한혈소판감소증진단법의임상적유용성 조용곤 1,2 이재현 1 김달식 1,2 이혜수 1,2 최삼임 1,2 전북대학교의과대학진단검사의학교실 1, 전북대학교임상의학연구소 2 Clinical Usefulness of the Simple