현재국내에서는신종인플루엔자의유행이종료되었지만 2010 년 8월 WHO의신종인플루엔자현황에의하면오스트레일리아, 뉴질랜드, 중국, 가나, 케냐, 타이등의국가에서계절인플루엔자와신종인플루엔자가함께유행하는양상을보이고있어검사실진단을위한방법들의비교검토는매우중요한부분이라고생각된다.

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1 원저 Lab Med Online Vol. 1, No. 1: 26-34, January 2011 임상미생물학 한국에서의 2009 신종인플루엔자 A 의임상양상과다양한진단방법들의비교 Clinical Characteristics and Comparison of the Various Methods Used for the Diagnosis of the New Influenza A Pandemic in Korea 권민정 이창규 노경호 남명현 윤수영 임채승 조윤정 김영기 이갑노 Min Jung Kwon, Chang Kyu Lee, Kyoung Ho Roh, Myung Hyun Nam, Soo Young Yoon, Chae Seung Lim, Yun Jung Cho, Young Kee Kim, Kap No Lee 고려대학교의과대학진단검사의학교실 Department of Laboratory Medicine, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea Background: Laboratory diagnosis of new influenza A (H1N1) is crucial for managing patients and establishing control and prevention measures. We compared the diagnostic accuracies of the real time RT-PCR (rrt-pcr) test recommended for the confirmation of the new flu and the viral culture method used conventionally for viral disease with that of the rapid antigen test (RAT). Methods: We performed RAT, R-mix culture, and real-time PCR by using 861 respiratory samples collected from December 2009 to January 2010 and evaluated the abilities of these methods to detect new influenza A. The relationship among the positive rates of RAT, grades of culture, and the cycle threshold (Ct) values of rrt-pcr was also evaluated. Results: Of the 861 patients, 308 (35.8%) were diagnosed with new influenza A. The sensitivities, specificities, positive predictive values, and negative predictive values of the tests were respectively as follows: 59.7%, 99.5%, 98.4%, and 81.6% for RAT; 93.2%, 100%, 100%, and 96.3% for R-mix culture; and 95.8%, 100%, 100%, and 97.7% for rrt-pcr. Samples with weak positive grade in culture and those with Ct values of in rrt-pcr showed positivities as low as 25.3% and 2.3% in RAT, respectively. The hospitalization rate and death rate of the confirmed patients were 3.2% and 0.3%, respectively, and gastrointestinal symptoms were observed in 7.2% of the patients. Conclusions: R-mix culture and rrt-pcr tests showed excellent reliability in the diagnosis of new influenza A and could be very useful, especially for samples with low viral load. Key Words: New influenza, Rapid antigen test, Culture, Real-time RT-PCR 서론 인플루엔자는겨울에서초봄사이전연령층에걸쳐발생하는 전염성이높은호흡기질환으로지속적인항원변이를통해주기적 Corresponding author: Chang Kyu Lee Department of Laboratory Medicine, Korea University College of Medicine, Anam-dong 5-ga, Seongbuk-gu, Seoul , Korea Tel: , Fax: cklee@korea.ac.kr Received: October 1, 2010 Revision received: October 23, 2010 Accepted: October 25, 2010 This article is available from , Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 인인플루엔자유행을일으킨다 [1, 2]. 2009년 4월중순미국에서돼지유래인플루엔자 A (H1N1) 바이러스에의한사람감염이처음으로확인된이후이로인한감염자와사망자가전세계적으로발생함에따라 2009년 6월 11일 WHO는공식적으로 21세기최초의인플루엔자대유행을선언하였다 [1]. 국내에서도 9월이후환자들이폭발적으로증가하여사회경제적으로심각한문제들을야기하였다. 인플루엔자감염은다른바이러스나세균에의한호흡기증상과감별이쉽지않아임상적인진단이어려우며, 유소아, 노인및만성질환을앓고있는사람들에게입원과사망률을증가시키는등치명적인결과를초래할수있으므로검사를통한조기확진이매우중요하다 [3, 4]. 조기확진을통하여불필요한검사와치료를지양하고항바이러스제를신속히투여하여임상증상을호전시킬수있으며치명적인합병증을막을수있다. 동시에빠른역학조사를통해질병의통제를기대할수있다 eissn

2 현재국내에서는신종인플루엔자의유행이종료되었지만 2010 년 8월 WHO의신종인플루엔자현황에의하면오스트레일리아, 뉴질랜드, 중국, 가나, 케냐, 타이등의국가에서계절인플루엔자와신종인플루엔자가함께유행하는양상을보이고있어검사실진단을위한방법들의비교검토는매우중요한부분이라고생각된다. 국내와국외에서신종인플루엔자의진단과관련된여러문헌이보고되었지만바이러스배양과실시간중합효소연쇄반응검사 (real time RT-PCR, rrt-pcr) 를동시에시행한예는거의없고, 임상양상을같이조사한논문은많지않다. 이에저자들은신종인플루엔자거점병원을방문한환자들을대상으로신종인플루엔자 A (H1N1) 확진환자의임상적특징을살펴보고신속항원검사, 실시간중합효소연쇄반응검사및바이러스배양검사를서로비교평가하였다. 대상및방법 1. 대상 2009년 12월부터 2010년 1월까지서울시에위치한한신종인플루엔자거점병원에서신종인플루엔자의감염이의심되어검사를시행한환자를대상으로하였다. 해당기간동안총 861명의환자가연구에포함되었으며의무기록을통하여성별, 연령등의기본적인적사항과발현증상, 체온, 환자와의접촉여부및만성질환병력에대하여조사하였다. 2. 검사방법모든대상환자에게신속항원검사와실시간중합효소연쇄반응검사및바이러스배양검사를시행하였다. 검체는면봉으로비인두가검물을채취하였다. 하나의면봉검체는외래진료소와응급실에서신속항원검사를위하여사용되었고, 다른면봉검체는바이러스배양검사와실시간중합효소연쇄반응검사를위한것으로검체채취후 Universal transport medium (UTM) 운반배지 (Copan, Healthlink, Diagnostic Hybrids Inc., Athens, OH, USA) 에넣은후신속히진단검사의학과검사실로운반하였다. 입원한환자들에서는비인두흡인법으로채취된검체를이용하였다. 1) 신속항원검사 SD BIOLINE Influenza Ag (Standard Diagnostics, Inc., Yongin, Korea) 키트를이용하여신속항원검사를시행하였다. 비인두검체면봉을시약내에포함된희석액 300 μl가담긴시험관속에넣었다. 5회이상잘섞은후면봉을꺼내고테스트스트립을시험관에담그고제조사의지침에따라 15분후최종판정하였다. 2) 바이러스배양검사인플루엔자바이러스배양을위해서 R-mix Too (Diagnostic HYBRIDS, OH, USA) 세포를이용하였고, 선별과확진을위해서는 D 3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening & ID kit (Diagnostic HYBRIDS) 를이용하였다. UTM 배지에수송된비인두검체를 1분간진탕하고 5분간원심분리한후상층액을회수하여접종원으로사용하였다. -80 에보관하였던 R-mix Too 세포주를 37 항온수조에서빠르게해동시킨후 planting medium과함께 24 well plate에서배양하였다. R-mix cell이 70% 이상자랐을때 planting medium을제거하고 refeed medium 0.5 ml를첨가한후, 준비된검체를 0.2 ml씩접종하여 5% CO 2, 37 에서 24시간동안배양하였다. 이후 24 well plate의 cover-slip 에부착된세포들을슬라이드에옮겨 3-4 방울의 DFA 선별시약으로 30분동안반응시킨후 200배배율의형광현미경에서밝은녹색으로형광염색된세포의유무를관찰하였다 [5, 6]. 전체현미경시야에서양성세포가 5개미만이면 1+, 시야당양성세포가 1-5개이면 2+, 시야당양성세포가 6-20개면 3+, 시야당 20개이상이면 4+ 로판독하였다. 양성으로나올경우인플루엔자특이 A, 또는 B DFA 시약을떨어뜨려바이러스의종류를확인하였고음성으로나올경우보관된또다른 well을 24시간더배양하여형광염색과정을반복한후최종판정하였다. 3) 실시간중합효소연쇄반응검사실시간중합효소연쇄반응검사는 AccuPower New Influenza A (H1N1) Real time RT-PCR Kit (Bioneer Co., Deajeon, Korea) 와 Exicycler 96 Real time Quantitative Thermal Block (Bioneer) 를이용하였다. 수송배지에운송된검체를 ExiPrep Viral DNA/RNA Kit (Bioneer) 를이용하여 RNA을추출하였다. PCR premix가담긴 well에 IPC 1 μl와 DEPC (diethyl pyrocarbonate) 처리된증류수 44 μl을넣은후추출된 RNA 5 μl를첨가하여총반응액이 50 μl 가되게하였다. PCR 증폭을위하여 45 에서 15분간역전사반응을거친후 95 에서 5분간전변성 (pre-denaturation) 반응, 95 에서 5초간변성반응, 55 에서 5초간결합반응과연장반응을 40 회반복하였다. RNA 내부양성대조물질 (IPC, Internal positive control) 의증폭산물을통하여핵산추출과 PCR 과정이적절한지판단하였고인플루엔자 A의기질단백질 M 유전자와신종인플루엔자에특이적인혈구응집소유전자의증폭유무에따라실시간중합효소연쇄반응검사의결과를분석하였다. 제조사가권장한대로 FAM 형광 ( 신종인플루엔자혈구응집소유전자 ) 의 cycle threshold (Ct) 값이 37 미만이면서 FAM 형광의 ΔRn값이 2,500 이상이고, TAMRA 형광 (IPC) 의 Ct값이 36 미만이면서 TAMRA 형광의 ΔRn 값이 2,000 이상인것을신종인플루엔자 A (H1N1) 로진단하였다. 27

3 검사를시행할때마다신종인플루엔자양성대조물질과음성대조물질이각각두개씩포함시켰다. 4. 분석신종인플루엔자의최종확진은실시간중합효소연쇄반응검사또는배양검사가양성일때로하였다 [7]. 확진환자들의특성은명목변수의경우빈도와백분율로, 연속변수의경우중앙값과범위로표현하였다. 검사방법의유용성을평가하기위하여 3가지진단방법들의민감도, 특이도, 양성예측치, 음성예측치를구하였다. 아울러배양결과의등급과실시간중합효소연쇄반응검사의 Ct값들에따른각검사들의양성률을비교하였다. 결과 1. 대상환자들의특성 인플루엔자검사를시행한환자는총 861명으로 0세부터 97세까지전연령층에분포하였고평균나이는 20.1세 ( 중앙값 10.0세 ) 였으며성별은남성 424명 (49.2%), 여성 437명 (50.8%) 이었다. 증상발생후진료소를방문하기전까지의기간은증상발생당일부터 7일까지였고내원하기까지평균 1.6일이소요되었다. 검사자들의 92.1% (793명 ) 는외래에서진료를받았으며, 7.9% (68명) 는병세가위중하여외래진료를거쳐입원하였거나, 기존질병으로인해이미입원중인환자들이었다. 신종인플루엔자로확진된경우는총 308명으로 35.8% 의양성률을보였으며, 외래환자중의양성률은 37.6% (298/793), 입원자중의양성률은 14.7% (10/68) 였다. 이들의성별비는남성 152 명 (49.4%), 여성 156명 (50.6%) 이었다 (Table 1). 확진환자의연령은 0세부터 71세사이에분포하였으며평균나이는 16세 ( 중앙값 8.5세 ) 이었고 7세미만이확진자의 44.8% 를차지하였다. 임상증상으로는열감 (88.3%) 을가장많이호소하였으나실제로체온이 37.8 이상으로측정된경우는 162명 (52.6%) 이었다. 그밖에기침과가래 (72.1%), 콧물과코막힘 (44.8%), 근육통 (39.0%), 인후통 (37.7%), 두통 (28.6%) 의증상들이흔하게나타났으며소수에서구토 (3.6%), 복통 (1.0%), 설사 (2.6%) 의소화기계증상과호흡곤란 (1.3%) 증상을호소하였다. 6명은내원당시특별한임상적증상이없었음에도불구하고신종인플루엔자양성으로확인되었는데이들은모두가족이나동료들중열이났거나신종인플루엔자로확진을받은사람과접촉한후본인의요청으로검사를시행한경우였다. 신종인플루엔자확진환자중고위험군 [7] 에속하는환자들은 28.2% (87/308) 였으며, 5세미만의소아 74명 (85%), 임산부 5명 (6%), 만성신장질환자 4명 (4%) 과기타 65세이상노인, 만성간, 폐질환자, 악성종양환자가각각 1명씩이었고, 이들중 7명 (8.0%) 이입원 Table 1. Demograpnic and clinical characteristics of 308 patients with confirmed new influenza A (H1N1) Variables 하였다. 고위험군에속하지않고평소건강하였던사람이입원한 경우는 1.4% (3/221) 였다. 전체입원환자중 9 명은평균 12 일간재 원후퇴원하였고나머지 1 명은사망하였다. 2. 진단방법들의평가 Case No. % Gender Male Female Treatment type Outpatients Hospitalized Underlying condition Previously healthy High-risk group* Age(yr) > Symptoms Febrile sense Cough/sputum Rhinorrhea Myalgia Sore throat Headache Vomitting Abdominal pain Diarrhea Dyspnea No symptom *High-risk group includs patients with age above 65 yr, age below 5 yr, malignancy, pregnancy, chronic diseaes of liver, kindey and lung. 신속항원검사의경우 861 명중 187 명의환자에서양성을보여 21.7% 의양성률을보였다. 배양검사의양성률은 33.3% (287/861) 이 었고, 실시간중합효소연쇄반응검사는 34.3% (295/861) 이었다 (Table 2). 신종인플루엔자확진환자 308 명을기준으로하였을때, 신속항원검사는 184 명의환자에서인플루엔자양성반응이나타 나 59.7% 의민감도를보였으며특이도, 양성예측치와음성예측치 는각각 99.5%, 98.4%, 81.6% 였다. 바이러스배양검사에서는 308 명 중 287 명의환자에서신종인플루엔자로판정되어 93.2% 의민감도 를보였으며, 특이도와양성예측치는 100.0%, 음성예측치는 96.3% 였다. 실시간중합효소연쇄반응검사의경우민감도, 특이도, 양성 예측치와음성예측치는각각 95.8%, 100.0%, 100.0%, 97.7% 였다. 실시간중합효소연쇄반응검사와배양검사가동시에양성또는 음성인경우는각각 274 예, 553 예로서로 96.1% 의일치율을보였 28

4 Table 2. Performance of three tests for new influenza A (H1N1) New influenza A (H1N1) confirmation* Rapid antigen test Culture rrt-pcr Positive Negative Positive Negative Positive Negative Positive (98.4%) 124 (18.4%) 287 (100%) 21 (3.7%) 295 (100%) 13 (2.3%) Negative (1.6%) 550 (81.6%) (96.3%) (97.7%) Total Sensitivity 59.7% 93.2% 95.1% Specificity 99.5% 100.0% 100.0% PPV 98.4% 100.0% 100.0% NPV 81.6% 96.2% 97.4% *Positive confirmation for new influenza A (H1N1) was made when the specimen was positive in either realtime RT-PCR or culture. Negative confirmaton for new influenza A (H1N1) was made when the specimen was negative in both real-time RT-PCR and culture. Abbreviations: PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value. Table 3. Summary of results from rrt-pcr, R-mix culture and rapid antigen test Group rrt-pcr Culture RAT No. Final interpretation All true positive False negative in RAT False negative in culture and RAT False negative in rrt-pcr and RAT False negative in rrt-pcr False negative in culture False positive in RAT All ture negative Abbreviations: RAT, rapid antigen test; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value. 다 (Table 3). 실시간중합효소연쇄반응검사, 배양, RAT 검사법이모두양성이 거나음성인경우는전체의 84.8% (730/861) 를차지하였다. 서로간 에결과가일치하지않는경우는모두 15.2% (131/861) 였는데실시 간중합효소연쇄반응검사과배양이동시에양성이면서신속항원 검사가음성인경우가 94 예였으며, 실시간중합효소연쇄반응검사 는양성이었지만배양과신속항원검사가음성인경우는 20 예였다. 배양검사에서인플루엔자 A 에양성이고실시간중합효소연쇄반 응검사검사는음성인 4, 5 군은총 13 예였다. 실시간중합효소연쇄반응검사의 Ct 값에따른신속항원검사의 양성률은 구간에서 93.3%, 구간에서 95.2% 이었고, 구간부터는현저히낮은 51.2%, 구간에서 2.3% 로집계되 어 Ct 값이큰검체에서낮은양성률을보였다 (Table 4). 바이러스 배양검사는실시간중합효소연쇄반응검사의 Ct 값이 25 미만인구 간에서는 100% 양성률을보였고, 구간에서 95.3%, 구 간에서 65.9% 였다. 실시간중합효소연쇄반응검사에서자동분석 프로그램의양성판정기준을벗어난 3 예가있었는데, 1 예는 Ct 값 37.74, Rn 값은 2,199 이었고다른 1 예는 Ct 값 37.78, Rn 값은 1,148 이었으며나머지 1 예는 Ct 값 37.49, Rn 값은 1,448 이었다. 그러나 Table 4. Comparison of R-mix culture and rapid antigen test results based on Ct values of rrt-pcr among the confirmed new influenza A patients Ct values No. R-mix culture Rapid Antigen test Positive No. (%) Positive No. (%) rrt-pcr 15-< (100.0) 14 (93.3) 20-< (100.0) 99 (95.2) 25-< (95.3) 66 (51.2) 30-< (65.9) 1 (2.3) 37-<38 3* 3 (100.0) 1 (33.3) Undertermined (100.0) 3 (23.1) *The culture test results in this group are composed of two cases of 1+ grade and one case of 2+ grade; The culture test results in this group are composed of eleven cases of 1+ grade, 2 cases of 1+ grade and 2 cases of 2+ grade. Table 5. Comparison of rrt-pcr and rapid antiten test results based on the grades of R-mix culture results among the confirmed new influenza A patients Culture No. rrt-pcr Rapid Antigen test Positive No. (%) Positive No. (%) Culture grade* (100.0) 70 (92.1) (97.8) 72 (78.3) (95.8) 23 (47.9) (87.3) 18 (25.3) *There were 21 cases of negative culture results, though not presented in the table. Among these cases, all 21 were positive by rrt-pcr and only 1 tested positive by rapid antigen test. PCR 증폭곡선을로그화면 (log view) 로전환하여살펴보았을때 형광신호강도의상승이신종인플루엔자확진환자의전형적인증 폭곡선과유사한패턴을보였고, 배양검사에서모두약양성, 신속 항원검사에서양성밴드가나타나최종적으로신종인플루엔자양 성으로판단하였다. 바이러스배양검사의등급에따른비교에서 신속항원검사의양성률은배양등급에일치하는결과를보였고 4+ 등급은 92.1%, 3+ 등급은 78.3%, 2+ 등급은 47.9%, 1+ 등급은 25.3%, 음성은 4.8% 로나타나비례적으로낮아졌다 (Table 5). 29

5 고찰 신종인플루엔자 A (H1N1) 바이러스는북미의돼지, 사람및조류바이러스와유라시아의돼지바이러스에서유래된유전자들이재편성되어혼합된신종바이러스로 [8] 인류의대부분이이바이러스에노출된적이없기에단시간에전세계적인대유행을일으키게되었다. 신종인플루엔자의두드러진인구학적특성은소아와젊은성인에서환자들이집중적으로발생하고있는점이다 [9-11]. 이번연구에서도대부분의확진환자가 40대미만에분포하였고연령의중앙값이 8.5세였다. 최근 Hancock 등은 1950년대이전에출생한사람들의경우 1980년이후에출생한사람들에비해신종인플루엔자 A (H1N1) 에대한교차반응항체가발견되는비율이 8배이상높고, 이로인하여저연령층의감염률이높고고연령층의감염률이낮다고보고하였으며그기전으로젊은연령층은신종인플루엔자 A (H1N1) 에노출된경험이없어면역이형성되지않았으므로감염에취약한반면, 노령층은과거에신종인플루엔자바이러스와유전적, 항원적으로밀접한관련이있는인플루엔자 A (H1N1) 바이러스에감염또는백신접종경로를통해노출된경험이있어신종인플루엔자 A (H1N1) 에대해서도어느정도의방어면역을가지고있기때문이라고설명하였다 [12]. 신종인플루엔자에서는위장관증상이환자의 10-25% 에서발생하여계절인플루엔자와구별된다고알려져있는데 [1] 이번연구에서도 7.2% 의환자에서복통, 구토, 설사등의위장관증상을보였다. 신종인플루엔자의양성률을살펴보았을때외래환자의경우 37.6% (298/793) 이었지만고위험군환자들이있는입원환자에서는그보다더낮은 14.7% (10/68) 로나타났다. 이는기존입원환자들이감염이외에도여러가지요인들로인해발열증상이생길수있어, 인플루엔자에의한발열과구분하기어렵고, 확진자로밝혀질경우치명적인합병증이발생할위험성이높고, 병원내의집단발병위험성때문에실제적으로신종인플루엔자일가능성이적은환자들이다수포함되었기때문으로생각된다. 양성률이낮아도입원환자들에서신속한인플루엔자음성의결과는다른열성질환과의감별에도움을줄뿐아니라불필요한항바이러스제의투여를막을수있다. 입원환자들중양성으로확진된 10명의환자들의의무기록을검토하였을때 7명이신종인플루엔자감염시합병증이발생할위험이높은위험인자를 1개이상가지고있는것으로밝혀져상세가위중한입원환자에서고위험군이과반수이상의높은비율로발견되었다고보고한기존의문헌자료와일치하였다 [1, 13]. 이들의경과를추적한결과 9명은치료후퇴원하였지만 1명은결국사망하였다. 사망자는제4형콩팥요세관산증으로진단받은병력있는 67세의남자환자로어지러움과쇠약을주소로외래진료를받던중, 갑작스럽게호흡곤란증상을호소하여코삽입관 (nasal cannula) 을통해산소투여를실시하였으나, 저산소혈증이호전되지않아바로기관내삽관후중환자실로옮겨졌다. 이후소변감소증 (oliguria) 과저혈압이발생하였고, 인공호흡기를통한기계적조절환기 (controlled mechanical ventilation) 에도산소포화도는호전되지않았다. 응급으로시행한가슴 X-선촬영에서양쪽폐아래엽의혼탁과함께다발성폐렴의소견이확인되었고, 급성호흡곤란증후군양상을띈패혈쇼크진단하에치료를시작하였다. 이튿날환자의비인두흡인물에서시행한실시간중합효소연쇄반응검사에서신종인플루엔자양성결과가확인되었고, 혈액배양검사에서폐렴알균이동정되었다. 결과확인후바로항바이러스제를투여하였으나, 환자는급성호흡곤란증후군에서호전없이빠르게악화되었고, 결국패혈쇼크에의한다발장기부전으로사망하였다. 호흡기바이러스는세균과중복감염을잘일으키는데, 바이러스에의한호흡상피세포의파괴가세균의유착을용이하게한다는점, 바이러스에의해유도된면역억제상태가세균의중복감염을야기한다는점, 바이러스감염에대한염증반응이세균에대한수용체를증가시킨다는점이그원인으로알려져있으며, 특히인플루엔자는 neuraminidase가있어서폐렴알균의유착을더욱증가시키는것으로보고되어있다 [14, 15]. Flahault [16] 는신종인플루엔자에서의급성호흡곤란증후군의발생률이계절인플루엔자에비해 배더높은것으로보고하였다. Perez-Padilla 등 [13] 은호흡기합병증이동반된신종인플루엔자감염사례에관하여조사하였는데대상환자모두흉부 X- 선소견에서양쪽폐하엽에서반점성폐포성혼탁 (patchy alveolar opacity), 간질성혼탁이흔히관찰되었으며사망자 ( 대상환자의 38.9%) 의폐조직검사에서광범위한폐포손상, 유리질막 (hyaline membrane) 의비후와섬유아세포의증식등이확인되어, 조직학적으로도급성호흡곤란증후군에합당한소견을보였다. Perez- Padilla 등 [13] 은신종인플루엔자감염환자에서콧물, 두통, 근육통, 열, 호흡곤란등이갑자기시작되었을때급성호흡곤란증후군으로진행하는경우가많았으므로증상의갑작스런발현을신종인플루엔자의나쁜예후인자로보고하였는데이번연구에서발생한사망자도호흡곤란증상이갑자기발병한후급성호흡곤란증후군으로진행한경우였다. Garske 등 [17] 의신종인플루엔자의위중도평가에서입원율과사망률을조사하였는데미국의경우각각 8.9%, 0.57% 캐나다는 9.2%, 0.4%, 영국은 3.4%, 0.12% 로나타났다. 이번연구에서는확진자중 10명이입원하였는데, 그중신종인플루엔자감염이입원의원인인경우가 7명이었고이중 1명이사망하였으므로신종인플루엔자바이러스로인한입원율과사 30

6 망률은각각 2.27% (7/308) 와 0.3% (1/308) 로집계되었다. 신종인플루엔자의진단을위한방법들의평가에서신속항원검사는시행방법이간편하고 분만에결과확인이가능하므로일선진료현장에서유용하게사용할수있는장점이있는반면신종인플루엔자 A와계절인플루엔자 A를감별하지못하는단점이있다 [9]. SD BIOLINE Influenza 신속항원검사는대부분은 5분이내에밴드가나타났지만 8예는 15분까지기다린후희미한양성밴드를확인할수있었다. 따라서처음에음성처럼보이는경우이더라도반드시검사의지침에따라충분한시간동안테스트스트립이반응하도록한후최종결과를판독하는것이중요하다. 최근여러종류의인플루엔자신속항원검사들이널리이용되고있는데이들의정확도를평가한문헌자료에의하면이검사들의인플루엔자바이러스에대한민감도는 10-90% 로다양하게보고되었다 [9-11, 18, 19]. Yoo 등 [20] 은동일한신속항원검사시약을사용하여인플루엔자를진단한연구에서인플루엔자 A형에대한민감도는 61.9%, B형에대한민감도는 54.5% 로평가하여인플루엔자의형 (type) 에따른민감도의차이를보고하였고, Weinberg 등 [21] 은계절인플루엔자 A에대한신속항원검사, 쉘바이얼배양및전통배양검사의민감도가바이러스의유행연도에따라달라지는현상을보고하였다. Mackie 등 [22] 이현장검사실의간호사들이시행한신속항원검사결과와 DFA 검사결과를비교하였을때 306예중 27예의검체가불일치하는결과를보였는데검사실소속직원이신속항원검사를다시시행한결과 27예중 16예의결과가 DFA 검사와일치하는것으로나타났다. 이번연구가진행되던시기는신종인플루엔자에대한검사량증가로인하여여러과에소속된의료인력이검사에참여하였기때문에검사자에따른오차도있었으리라생각된다. 한편 Chan 등 [19] 이계절인플루엔자 A와신종인플루엔자 A를대상으로 5종의신속항원검사를비교한연구에의하면동일한바이러스농도에서신종인플루엔자 A (H1N1) 와계절인플루엔자 A (H1N1) 의양성률은비슷하다고보고하였다. 실시간중합효소연쇄반응검사를기준으로하였을때신속항원검사의전체적인민감도는 61.4% 였다. Ct값에따라신속항원검사의양성률을비교하였을때 Ct값 25 미만인검체들은 90% 이상양성으로나타났지만 Ct값이 구간에서는 51.2%, 구간에서 2.3% 의양성률을보여 Ct값이큰검체에서신속항원검사의검출률이매우낮게측정되었다. 이처럼높은 Ct에서신속항원검사의양성률이급격히감소하였는데이는표적유전자의기하급수적인증폭이라는 PCR 검사의특성이반영된것으로보인다. 배양검사를기준으로하였을때신속항원검사의전체적인민감도는 64.1% 로약간증가하였지만통계적유의성은없었다. 배양검사를기준으로하였을때신속항원검사의양성률은비례적으로감소하였다. Daisy 등 [23] 은신속항원검사에서양성으로확인되기위하 여 100,000개 1,000,000 개이상의인플루엔자바이러스입자가필요한반면 R-mix 신속배양의경우진단에필요한최소인플루엔자바이러스의입자가 10여개라고민감도의차이를설명하였다. 이번연구에사용된 D 3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening & ID kit (Diagnostic HYBRIDS) 검사는 R-mix 세포주를이용한신속배양법으로배양 1-2일내에결과의확인이가능하기때문에 5-6일이상걸리던전통배양법에비하여결과보고까지걸리는시간이훨씬단축되었다 [6, 24]. 뿐만아니라 Barenfanger 등 [6] 은 R- mix 신속배양법이호흡기바이러스의진단에있어전통배양법과견줄만한민감도를보인것으로보고하였으며 George 등 [25] 은접종한지 24시간에서인플루엔자 A의검출에대한 R-mix 신속배양검사의민감도가전통적인배양법에비해매우우수하다고보고하였다 H1N1 Influenza Emergency Use Authorization (EUAs) 가제공한자료에서는 Influenza A/California/07/2009 바이러스를포함한 4종류의신종인플루엔자바이러스를여러배율로희석하여접종한후 D 3 Ultra 2009 H1N1 Influenza A virus ID kit와이번연구에사용한 D 3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening & ID kit 사이에 well 당검출되는양성세포의수를비교한결과모든배율의희석검체에서두키트사이의결과가유사하게나타났다. 이번연구에서배양검사의민감도, 특이도, 양성예측치, 음성예측치는매우우수하였다. 바이러스배양검사는배양세포를이용한자연증폭시스템을이용하므로민감도와특이도가높은검사로바이러스진단검사의표준검사로사용되어왔다. 따라서신속항원검사와실시간중합효소연쇄반응검사의정확성을평가하기위한비교검사로서유용한가치가있다고생각된다. 실시간중합효소연쇄반응검사는이번신종인플루엔자의대유행에서확진을위해권고된검사의하나로결과의신뢰도가높고, 한번에여러검체를동시에검사할수있으며 RNA 추출부터결과보고까지소요되는시간이 4-5시간으로짧다. 이번연구에서사용된 AccuPower New Influenza A (H1N1) Real-Time RT-PCR kit (Bioneer) 는 Exicylcer 96 Real-Time Quantitative Thermal Block 장비에적합하도록구성된검사인데핵산증폭반응이일어날때장비의광학부가검체에서나오는형광을실시간으로측정하여컴퓨터로전송하면자동분석소프트웨어가양성대조물질과내부표준물질의시그널을평가한후이들이유효 (valid) 할경우, 제조사의지침에따라 Ct값과 ΔRn값두가지기준으로결과를자동판독한다. 신속항원검사, 바이러스배양검사및실시간중합효소연쇄반응검사에서결과의불일치는보이는경우는 132예였다 (Table 3). 2군에속하는 94예의검체들은실시간중합효소연쇄반응검사와배양검사는모두양성인데신속항원검사만음성으로나타났다. 이들의평균 Ct값은 29.0이었는데 Table 5에의하면 Ct값 30을경계로신속항원검사의민감도가 51.2% 에서 2.3% 로급격히저하함을볼 31

7 수있다. 배양검사에서도 2군의평균배양검사등급은 2+ 이었다. 따라서바이러스농도가낮은검체들에서신속항원검사가음성을보임을알수있었다. 3군의경우실시간중합효소연쇄반응검사결과만양성인경우로 20예의검체가이에속하였는데평균 Ct값이 32.5 로바이러스농도가낮은검체에서배양검사와신속항원검사가음성으로나옴을볼수있었다. 4군과 5군은실시간중합효소연쇄반응검사는음성, 배양검사양성인그룹으로 13예가있었는데이들중 9예는배양검사의등급이 1+ 등급으로대부분바이러스농도가낮은검체들이었다. 이경우계절인플루엔자의가능성을배제하기위해남은검체를이용하여 Seeplex FluA ACE Subtyping 시약 (Seegene, Seoul, Korea) 으로아형분석을시행하였고, 다른실시간중합효소연쇄반응시약인 FluA New H1N1 real time Detection (Seegene) 시약을이용하여검사하였을때, 계절 influenza H1, H2, H5에모두음성이었고, 신종 influenza A (H1N1) 에모두양성이었다. 그리고 4, 5군의배양검사에서대부분 1+ 양성이었다는것을고려할때, 검체내에바이러스농도가적은상태에서억제인자들로인하여최적의 PCR반응이일어나지않았을가능성도있다 [26]. IPC는실제로양성이었지만양성대조보다도더낮은농도로바이러스가있거나, IPC반응과경쟁적인관계에서반응이억제되어위음성을보였을수도있다고생각된다. 그래서일부검사자들은검체에서보다예민한검출을위해서 IPC를빼고증폭하는경우도있다 [26]. Vandesompele 등은 one step rrt-pcr 은 RNA의역전사와 cdna의증폭에필요한모든재료들이함께전처리되어있기때문에노동력절감과검체오염을줄이는장점이있지만두가지반응이하나의반응 well에서일어나므로각각의반응에대한최적환경 (optimization) 을분리해서제공하기어려운단점이있음을지적하였다 [26]. 인플루엔자의정확한아형분석이어려울때, 결과가불일치하거나위양성의가능성이있을경우염기서열분석을시행할수있다 [11]. 6군은 3군과더불어배양검사가음성이고실시간중합효소연쇄반응검사가양성이었다. 이들에속한 21예검체의형광증폭곡선을확인하고 Seeplex FluA ACE Subtyping 키트 (Seegene) 로재검한결과모두신종인플루엔자양성으로확인되었다. 7군은배양과실시간중합효소연쇄반응검사는음성이면서신속항원검사만양성이어서신속항원검사의위양성으로생각되었는데문헌에의하면빌리루빈, 헤모글로빈과같은비특이적인물질이위양성을일으킬수있는원인으로알려져있다 [27, 28]. 이번연구에서실시간중합효소연쇄반응검사가가장우수한검사수행능을보였지만낮은바이러스농도의검체들에서는검사방법들간의불일치가발생함을알수있었다. 대규모의 antigenic drift 혹은 shift가있을경우알려진염기서열 에기초한시발체를이용한 PCR에서는검출이되지않을수있으므로확인을위해서는배양법이필요하다. 1997년홍콩에서발견된조류인플루엔자 A도배양검사에서먼저확인되었기에인체감염을일으키는새로운아형의 H5N1 바이러스를규명해낼수있었다 [29]. 따라서전반적인신속성, 정확성, 자동화, 한번에다량의검체를처리할수있는장점때문에실시간중합효소연쇄반응검사가권장되지만인플루엔자의형별분류가어려울때, 역학적인감시목적, 백신주의선택등의이유로바이러스배양은여전히중요한검사법중의하나이다. 또한인플루엔자와다른호흡기바이러스가같이유행하고있는경우에는인플루엔자를동정하는실시간중합효소연쇄반응검사보다는다른호흡기바이러스들을동시에검출할수있는배양검사가유용하게사용될수있으리라생각된다. 빠른시간내에결과를확인해야하는응급실에서는시행과정과결과해석이간편한신속항원검사가여전히유용하게사용될수있으리라생각된다. 다만아직증상이명확하지않은입원환자들이나중증환자들, 감염환자와접촉자들에있어서는바이러스농도가낮으리라생각되므로이들에서는실시간중합효소연쇄반응검사나배양검사가보다유용하리라생각된다. 요약 배경 : 신종인플루엔자 A (H1N1) 의검사실진단은환자관리와유행대책수립에매우중요하다. 연구자들은확진을위해서실시간중합효소연쇄반응검사와바이러스감염질환의표준검사로사용되어왔던배양검사를신속항원검사와함께비교하였다. 방법 : 2009년 12월부터 2010년 1월에걸쳐얻어진총 861예의호흡기검체를이용하여신속항원검사, R-mix 신속배양검사, 실시간중합효소연쇄반응검사를동시에시행하여그성적을구하였고, 배양결과등급과실시간중합효소연쇄반응검사의 cycle threshold (Ct) 값에따른신속항원검사결과와의관계를조사하였다. 결과 : 861명중 308명 (35.8%) 이신종인플루엔자 A (H1N1) 로확진되었고, 이용된검사들의민감도, 특이도, 양성예측치, 음성예측치는신속항원검사가 59.7%, 99.5%, 98.4%, 81.6%, R-mix 배양검사가 93.2%, 100%, 100%, 96.3%, 실시간중합효소연쇄반응검사가 95.8%, 100%, 100%, 97.7% 였다. 신속항원검사의양성률은배양이약양성인경우는 25.3%, 실시간중합효소연쇄반응검사의 Ct값이 30-37인경우에는 2.3% 로매우낮았다. 신종인플루엔자확진환자중입원율은 3.2% 였고, 사망률은 0.3% 였고, 위장관증상은 7.2% 에서관찰되었다. 결론 : R-mix 배양검사와실시간중합효소연쇄반응검사는신종인플루엔자의진단에매우좋은성적을보였으며, 특히낮은농도의 32

8 바이러스검체에서유용한검사였다. 참고문헌 1. Kim WJ. Epidemiology, clinical manifestations, and management of pandemic novel influenza A (H1N1). Korean J Med 2009;77: Taubenberger JK and Morens DM. The pathology of influenza virus infections. Annu Rev Pathol 2008;3: Neuzil KM, Zhu Y, Griffin MR, Edwards KM, Thompson JM, Tollefson SJ, et al. Burden of interpandemic influenza in children younger than 5 years: a 25-year prospective study. J Infect Dis 2002;185: McBean AM, Babish JD, Warren JL. The impact and cost of influenza in the elderly. Arch Intern Med 1993;153: Treanor JJ. Respiratory infections. In: Richman DD, Whitley RJ, et al. eds. Clinical Virology. 2nd ed. Washington D.C.: ASM press, Barenfanger J, Drake C, Mueller T, Troutt T, O Brien J, Guttman K. R- Mix cells are faster, at least as sensitive and marginally more costly than conventional cell lines for the detection of respiratory viruses. J Clin Virol 2001;22: WHO. Human infection with pandemic (H1N1) 2009 virus: updated interim WHO guidance on global surveillance. csr/disease/swineflu/who_case_definition_swine_flu_2009_04_29. pdf (Updated on July 2009). 8. Garten RJ, Davis CT, Russell CA, Shu B, Lindstrom S, Balish A, et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science 2009;325: Herzum I, Lutz T, Koch F, Geisel R, Gehrt A. Diagnostic performance of rapid influenza antigen assays in patients infected with the new influenza A (H1N1) virus. Clin Chem Lab Med 2010;48: Biggs C, Walsh P, Overmyer CL, Gonzalez D, Feola M, Mordechai E, et al. Performance of influenza rapid antigen testing in influenza in emergency department patients. Emerg Med J 2010;27: Hwang YS, Kim KH, Lee MA. Evaluation of the efficacies of rapid antigen test, multiplex PCR, and real-time PCR for the detection of a novel influenza A (H1N1) virus. Korean J Lab Med 2010;30: Hancock K, Veguilla V, Lu X, Zhong W, Butler EN, et al. Cross-reactive antibody response to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus. N Engl J Med 2009;361: Perez-Padilla R, de la Rosa-Zamboni D, Ponce de Leon S, Hernandez M, Quinones-Falconi F, Bautista E, et al. Pneumonia and respiratory failure from swine-origin influenza A (H1N1) in Mexico. N Engl J Med 2009;361: Peltola VT and McCullers JA. Respiratory viruses predisposing to bacterial infections: role of neuraminidase. Pediatr Infect Dis J 2004;23: S Hament JM, Kimpen JL, Fleer A, Wolfs TF. Respiratory viral infection predisposing for bacterial disease: a concise review. FEMS Immunol Med Microbiol 1999;26: Flahault A. First estimation of direct H1N1pdm virulence: From reported non consolidated data from Mauritius and New Caledonia. PLoS Curr 2009;RRN Garske T, Legrand J, Donnelly CA, Ward H, Cauchemez S, Fraser C, et al. Assessing the severity of the novel influenza A/H1N1 pandemic. BMJ 2009;339:b Ginocchio CC, Zhang F, Manji R, Arora S, Bornfreund M, Falk L, et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. J Clin Virol 2009;45: Chan KH, Lai ST, Poon LL, Guan Y, Yuen KY, Peiris JS. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J Clin Virol 2009;45: Yoo Y, Sohn JW, Park DW, Kim JY, Shin HK, Lee Y, et al. Clinical evaluation of the SD Bioline influenza virus antigen test for rapid detection of influenza viruses A and B in children and adults during the influenza season. Clin Vaccine Immunol 2007;14: Weinberg A, Mettenbrink CJ, Ye D, Yang CF. Sensitivity of diagnostic tests for influenza varies with the circulating strains. J Clin Virol 2005; 33: Mackie PL, McCormick EM, Williams C. Evaluation of Binax NOW RSV as an acute point-of-care screening test in a paediatric accident and emergency unit. Commun Dis Public Health 2004;7: Daisy JA, Lief FS, Friedman HM. Rapid diagnosis of influenza A infection by direct immunofluorescence of nasopharyngeal aspirates in adults. J Clin Microbiol 1979;9: Gavin PJ and Thomson RB. Review of rapid diagnostic tests for influenza. Clin Applied Immunol Rev 2004;4: St George K, Patel NM, Hartwig RA, Scholl DR, Jollick JA, Kauffmann LM, et al. Rapid and sensitive detection of respiratory virus infections for directed antiviral treatment using R-Mix cultures. J Clin Virol 2002; 24: Mackay IM. ed. Real-time PCR in microbiology from diagnosis to characterization. 1st ed. Norkolk: Caister Academic Press; 2007: Ashihara Y, Kasahara Y, Nakamura RM. Immunoassay and immunochemistry. In: McPherson RA, Pincus MR, et al. eds. Henry s clinical 33

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