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1 다이옥신 분석법 ( 동위원소희석및 HR-GC/MS 에의한 Tetrathrough Octa-Chlorinated Dioxins 및 Furans 분석법 ) 적용범위 : 본분석법은동위원소희석및고분해능기체크로마토그래프 / 질량분석기 (HR-GC/MS) 를이용하여환경시료및생체시료중의다이옥신분석에적용되며, 미국환경보호청 (US EPA ) 에서사용하는방법으로 Tetra-through Octa- Chlorinated Dioxins and Furans by Isotope Dilution HRGC/ HRMS 를번역한것이다. 원저 : Method 1613, Revision B : Tetra- through Octa-Chlorinated Dioxins and Furans by Isotope Dilution HRGC/HRMS U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water Engineering and Analysis Division (October 1994) 본분석법은미국 EPA 의승인을받아농림부국립수의과학검역원에서번역하였습니다.

2 목 차 개요 (I ntroduction) 1. 0 적용범위 (Scop e and ap p lication) 분석법요약 (Sum m ary of m ethod) 용어정의 (Def initions) 시료오염과방해물질 (Contam ination and interf erences) 실험실안전 (Saf ety ) 기구와재료 (A p p aratus and m aterials) 시약과표준물질 (Reagents and standards) 시료수집, 보존, 보관및보존기간 (Sample collection, preservation, storage, and holding times) 품질인증 / 품질관리 (Quality assurance/quality control) 보정 (Calib ration) 시료전처리 (Sam p le p rep aration) 추출과농축 (E xtraction and concentration) 추출물정제 (E xtract cleanup ) HR-GC/MS 분석 (HR-GC/MS analy sis) 시스템과실험실성능 (Sy stem and lab oratory p erf orm ance) 정성분석 (Qualitativ e determ ination) 정량분석 (Quantitativ e determ ination) 혼합시료의분석 (A naly sis of com p lex sam p les) 오염방지 (P ollution p rev ention) 폐기물관리 (W aste m anagem ent) 분석법성능 (Method p erf orm ance) 참고문헌 (Ref erences) 표와그림들 (Tab les and Figures) 용어풀이 (Glossary ) 24 5

3 Method , Rev ision B ( 동위원소희석및 HR-GC/MS 에의한 Tetrathrough Octa-Chlorinated Dioxins 및 Furans 분석법 ) 개 요 Method 1613은동위원소희석및고분해능기체그로마토그래피 / 질량분석법을이용하여수용성시료, 고체시료및생체시료에서 2,3,7,8- 치환된 4염화 ~ 8염화 dib enzo-p-dioxin 및 dibenzofuran 의이성질체분석을위해미국환경보호청의과학기술사무국 (Office of Science and Techonology) 에서만들었다.

4 1. 0 적용범위 (Scop e and ap p lication) 1.1 본분석법은고분해능기체크로마토그래프 / 질량분석기 (HR-GC/MS) 를이용하여물, 토양, 저니토, 슬러지, 생체시료및기타시료에서 4염화 ~ 8염화 dibenz o-p-dioxin(cdds) 및 dib enzofuran(cdfs) 의측정을위한것이다. 본분석법은미국환경보호청, 산업체, 사설연구소및학회에발표된분석법에근거하였다 ( 참고문헌 1~6). 1.2 본 분석법에 의해 표 1에 수록된 17종의 2,3,7,8-치환 CDDs/CDFs를 분석 할 수 있으며 특히 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin(2,3, 7, 8-TCDD) 와 2, 3, 7, 8-tetrachloro-dibenzofuran(2,3, 7, 8-TCDF) 의 개별분석을 위해 상세히 설 명되어있다. 1.3 본 분석법의 검출한계 (detection lim its) 와 정량한계 (quantitation lev els) 는 기기상의 한계보다는 방해물질의 농도에 좌우된다. 표 2의 최소농도 (minimum levels, MLs) 는 방해물질이 존재하지 않을 때 측정가능한 CDDs/ CDFs의 농도이다. 본 분석법에서 2,3, 7,8-TCDD에 대한 분석법의 검출한 계 (Method Detection L im it, MDL ) 는 4. 4 p g/l (p arts-p er-quadrillion, ppq) 이다. 1.4 본분석법의 GC/MS 부분은 HR-GC/MS 전문분석자나공인된사람의철 저한감독하에서만이용한다. 본분석법을이용하는모든실험실은 9. 2 장을 이용해만족스런결과를낼수있다는능력을입증하여야한다 본분석법은실제실험을근거로만들어졌으며, 본분석법에수록된모든실행기준이충족된다면방해물질제거, 분석비용절감등을위하여본분석법을변경하여도된다 장에시험방법의동등성 (method equivalency) 확립을위한조건을수록하였다.

5 1.6 기술된허용범위를넘어서는분석법의변경은 4 0 CFR 및 에근 거한대체분석법의적용및승인을받아야하는주요변경사항으로간주 된다 분석법요약 (Sum m ary of m ethod) 시료의전처리, 추출및분석에대한방법을요약한흐름도 (flow charts) 를수 용성및고체시료는그림 1, 복합시료는그림 2, 생체시료는그림 3 에나타 내었다. 2.1 추출 (Extraction) 수용성시료 (1% 이하의고형물을함유하는시료 ) 2,3,7,8- 치환 CDDs/CDFs 중 15 종의동위원소표지화합물 (LCS) 을시료 1 L 에첨가하고, 다음세가지방법중하나를이용하여시료를추출한다 육안으로보이는입자가존재하지않는시료는분액여두에서메틸렌 클로라이드로추출또는 장의고상추출법 (solid-phase extraction) 으로추출한다. 추출물은정제를위해농축한다 육안으로입자가보이는시료는유리섬유필터로진공여과한다. 필터는 Soxhlet/Dean-Stark(SDS) 추출기 ( 참고문헌 7) 로추출하고, 여과액은메틸렌클로라이드를이용해분액여두에서추출한다. 정제전에메틸렌클로라이드추출물을농축하여 SDS 추출물과혼합한다 시료는고상추출 (SPE) 디스크위에얹은유리섬유필터를통해진 공여과한다. 필터와디스크는 SDS 추출기에서추출하고추출물은 정제를위해농축한다.

6 2.1.2 고체, 반고체및복합시료 ( 생체시료제외 ) 고체 10g( 건조중량 ) 을포함하는시료에 LCS를첨가한다. 복합시료는압력여과하여모든수용성액체는버린다. 굵은입자의고체들은가루로만들거나균질화한다. 복합시료중비수용성액체들은고체와혼합해 SDS 추출기에서추출한다. 추출물은정제를위해농축시킨다 어류및기타생체시료 (Fish and other tissue) 시료를다음둘중하나의방법으로추출한다 Soxhlet 또는 SDS 추출시료 20g을균질화한후 10g 을취해 LCS 를가한다. 시료는황산나트륨과혼합하여 시간동안건조되도록둔후 Soxhlet 추출기에서메틸렌클로라이드 : 헥산 (1:1) 으로 18~24 시간동안추출한다. 추출물을증발건조시킨후지방함량을측정한다 염산분해 (HCl digestion) 시료 20g을균질화한후 10g을병에취하여 LCS를가한다. 평형에도달하면염산 200 ml와메틸렌클로라이드 : 헥산 (1:1) 200 ml를가하고병을 12~24 시간동안교반시킨다. 추출물을증발건조시킨후지방함량을측정한다. 2.2 정제과정의효율을측정하기위하여추출후각추출물에 37 Cl 4 - 표지 2,3,7,8-TCDD(CSS) 를가한다. 시료정제에는산및 / 또는염기를이용한역추출과겔침투 (gel p erm eation), 알루미나, 실리카겔, 플로리실및활성탄소크로마토그래피등이있다. 2,3,7,8- 이성질체또는다른특정이성질체나동족체를더분리하려면 HPLC를이용할수있다. 생체시료추출물들은위에언급한방법으로정제하기전에추출방법에따라 anthropogenic 분리컬럼, 산성실리카겔흡착또는황산및염기역추출방법으로정제할수있다.

7 2. 3 정제후추출물을거의건조될때까지농축한다. 기기내부표준물질 (I SS) 은시료를 GC에주입하기직전에각추출물에첨가한다. 분석대상물질들은 GC 에의해분리되고 HRMS( 분해능 >1 0, 000) 로검출된다. 각분석물질에대하여두개의정확한질량 / 전하비 (exact m/z) 를모니터링한다. 2.4 각 CDD/CDF 에대한 GC 머무름시간 (retention time) 과두개의 exact m/z 의이온량비 (ion-abundance ratio) 를순수한표준품의 GC 머무름시간과두개의 exact m/z 의이론적또는분석에서얻어진 (acquired) 이온량비와비교하여확인할수있다. 2,3,7,8- 치환이아닌이성질체및동족체는머무름시간및이온량비가미리정해진범위내에서일치할때확인된다. 2,3,7,8-TCDD 와 2,3, 7, 8-TCDF 이성질체의확인은다른 4 염화이성질체와이들을분리할수있는 GC 컬럼을이용하면된다. 2.5 정량분석은선택이온유형 (selected ion current profile, SICP) 면적을이용 한다음세가지중의하나의방법으로실시한다 동위원소표지된유사물질이있는 15 개의 2, 3, 7, 8- 치환 CDD/CDF( 표 1 ) 의 경우, GC/MS 를 calibration 하고동위원소희석법 (isotope dilution technique) 을이용하여각물질의농도를측정한다 ,2, 3, 7,8, 9-HxCDD, OCDF 및동위원소표지화합물의경우, GC/MS 를 calib ration 하고내부표준법 (internal standard technique) 을이용해농도를 측정한다 ,3,7,8 치환이아닌이성질체와치환된염소수가같은모든동족체의 경우 ( 즉, 총 TCDD), 그농도는같은 CDD/CDF 의 calibration 에서얻 은 resp onse factors 를이용하여구한다 분석의질은재현성있는 calibration 과추출및정제테스트를통하여확인한다.

8 3. 0 용어정의 (Def inition) 본분석법의후반부에있는용어풀이에설명되어있다 시료오염과방해물질 (Contam ination and I nterf erences) 4.1 용매, 시약, 초자및기타시료전처리과정에필요한기구가크로마토그램해석오류의원인이되는불순물생성또는베이스라인상승을일으킬수있다 ( 참고문헌 8~9). 특정시약의선택및초자기구를이용한용매의증류가필요할수도있다. 가능하면시약은추출하거나용매로헹군후사용한다. 4.2 초자는시료를오염시킬수있을뿐만아니라분석대상물질이초자표면에 흡착되어손실될수있기때문에올바른초자세척은매우중요하다 초자는사용후곧바로용매로헹군후세제로세척한다. 세제에담궈약 30 초간초음파처리하면세척이쉬워진다. 분리부가있는초자, 특히 fluoropolymer 코크가달린분액여두는반드시분해하여세제로세척한다 초자는세제로세척한후메탄올, 온수의순으로즉시헹구어낸다. 온 수로헹군다음에는메탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드순으로헹군다 초자세척과정의일부로초자를오븐에서 baking 해서는안된다. Baking 은매우오염된시료를사용한후에는허용되나, 반복적으로초자를 b ak ing 하게되면초자표면에 CDD/CDF 가비가역적으로흡착할수있는활성위치 (active site) 가형성될수있기때문에최소한으로줄인다 Soxhlet 기구는사용직전톨루엔으로약 3 시간동안미리추출한다 ( 장 ~ 장 ). 분액여두는메틸렌클로라이드 / 톨루엔 (80/20) 으로 2 분간흔들어세 척한후다시순수한메틸렌클로라이드로 2 분간흔들어준다.

9 4.3 Reference matrix method blank 를먼저분석하여분석에사용되는모든재 료에방해물질이존재하지않음을확인한후에일련의시료 ( 최대 20 개의 시료 ) 를분석한다 Reference matrix 는시료의 matrix 와가능한한유사한것을사용한다. Reference matrix 는검출될정도의 CDD/CDF 가함유되지않는것이이상적이지만, 분석할시료에서예상되는농도의방해물질은함유해야한다. 예를들어, 시료에 pentachloronaphthalene 이함유되어있을것으로예상될때 pentachloronaphthalene 을함유하는사람의지방조직을정제시스템용 reference 시료로사용할수있다 시료 matrix 와유사한 reference matrix 를구하지못할경우, 물시료에는 reagent water(7.6.1 장 ) 를, 흙시료는놀이터모래 (7.6.2 장 ) 나백석영모래 (7.3.2 장 ), 종이또는유사물질은여과지 (7.6.3장), 생체시료는옥수수기름 (7.6.4장) 등을비슷한 matrix 로이용할수있다. 4.4 시료에서함께추출되는방해물질은시료채취장소와시료종류별로매우다양하다. 방해물질들이 CDD/CDF 보다훨씬고농도 (10 의몇승배이상 ) 로존재할수도있다. 가장빈번하게발견되는방해물질은 chlorinated biphenyls, methoxy biphenyls, hydroxy diphenyl ethers, benzyl phenyl ethers, polynuclear aromatics, pesticides 등이다. 본분석법에서는극히미량의 CDD/CDF 를측정되기때문에방해물질의제거가필수적이다. 1 3장에제시된정제과정을거쳐방해물질을감소또는제거할수있으므로표 2에제시된농도의 CDD/CDF 를신뢰할만한수준으로분석이가능하다. 4.5 초자기구와각시료의처리단계를구분하기위해사용하는모든초자기구에번호를매긴다. 이는각시료에대하여가능성있는오염원의추적, 오염이심한시료와관련되어별도의세척이필요한초자의확인과, 초자의폐기시기를결정하는데도움을줄것이다.

10 4.6 생체시료의정제 : 생체시료에함유된지방은시료의 CDD/CDF 분석시방해물질로작용할수있다. 생체시료의종류와부위에따라지방함량은매우달라진다. 지방은유기용매종류에따라다른용해도를보이며시료추출물의정제에사용되는컬럼크로마토그래피정제로는부족할정도로많은양이존재할수도있다. 지방은 13.7 장에나와있는지방제거과정후최소한알루미나 ( 장 ) 또는플로리실 (13. 8장 ), 그리고탄소 (1 3.5 장 ) 정제를통해제거되어야한다. 이러한방해물질을모니터링할때 chlorodiphenyl ethers 의 exact m/z 에피크가검출되면알루미나및 / 또는플로리실정제로제거한다 실험실안전 (Saf ety ) 5.1 본분석법에사용되는모든화합물이나시약에대한독성또는발암성은정확히규명되어있지않지만모든화학물질은건강상위해를줄수있는물질 (potential health hazard) 로서취급되어야한다. 이런물질에대한노출은가능한한줄이도록한다 ,3,7,8-TCDD 는 동물심험을 통해 좌창유발성 (acnegenic), 발암성 (carcinogenic) 및 기형발생성 (teratogenic) 이 있는 것으로 알려져 있다. 2,3,7,8-TCDD 는 물에는 약 200p p t, 유기용매에는 % 까지 용해된다. 2,3,7,8-TCDD의 독성학적 및 물리적 성질을 감안할 때 모든 CDD/CDF 는 취급방법, 주의 사항 및 관련 위험성을 완전히 숙지한 전문인력에 의해서만 다루어져야 한다 실제실험을위하여실험실에서는본분석법상의희석된표준용액을구매하는것이바람직하다. 그러나, 1차용액을조제한다면후드내에서조제해야하며, 고농도를취급할때에는 NIOSH/MESA 에서인가한유독가스방독면을착용해야한다.

11 5. 2 실험실은본분석법에명기된화학물질의안전한취급에관한 OSHA 규정파일을비치해야하며 MSDS(material safety data sheet) 참고파일도분석에관계하는모든사람이이용할수있어야한다. 또한, 실험실에서는본분석법을사용하는모든분석자의건강진단을실시하고그결과를분석자에게알리도록한다. 실험실안전에대한추가정보는참고자료 10장 ~13 장에서얻을수있다. 참고자료 13 의후반부에수록된참고문헌과서적목록은특히일반적인실험실안전에관해나와있다 CDD/CDF 및이들이들어있을것으로의심되는시료들은방사성물질또는전염성물질을취급할때와동일한방법으로다룬다. 환기가잘되고접근이통제되는실험실이필요하다. 특정실험실조건에대한건강위해성평가는컨설팅전문실험실이나복지부또는노동부로부터도움을받을수있으며이중다수가산업보건서비스를제공한다. CDD/CDF 는동물실험에서대단히독성이높다. 각실험실은이러한물질들의취급에대한엄격한안전프로그램을개발해야한다. 참고자료 2와 14에언급한내용을따를것을적극권장한다 설비 (Facility) : 미세한가루와같은시료 ( 먼지, 흙, 건조시약 ) 를취급할때모든조작 ( 시료용기로부터시료덜기, 무게측정, 운반, 혼합 ) 은잘밀폐된글러브박스나적절한공기의흐름이있는후드내에서실시한다. 실험실환기시스템으로다량의손실이발생해서는안된다. 분석및동물실험에일반적으로사용되는희석용액의취급은사고의경우외에는흡입으로인한위해는없다 보호구 (Protective equipment) : 1회용비닐장갑, 앞치마, 실험복, 보안경, 마스크, 글러브박스또는방사성동위원소작업용후드등을사용하여야한다. 에어로졸이나먼지가발생할수있는작업시활성탄필터가장착된방독면을착용한다. 시력보호용장비 ( 안면보호구 ) 는오염된시료나순수한분석용표준품을다룰때착용한다. 라텍스

12 글러브는손이노출되는것을방지하기위해주로사용된다. 고농도의 CDD/CDF 가함유되어있다고의심또는알고있는시료를취급할때는 라텍스글러브속에다른장갑을더끼도록한다 훈련 (Training) : 작업자들은오염된장갑과외투를겉표면을건드리지 않고벗는알맞은방법을익혀야한다 개인위생 (Personal hygiene) : 모든작업후및휴식전 ( 커피, 점심및 교대 ) 에손과팔을철저히씻어야한다 제한 (Confinement) : 표지판을붙여격리시킨작업구역, 전용초자및 기구, 실험대위의플라스틱흡수지등은오염을막는데도움이될것 이다 유출기체 (Effluent vapors) : GC 와강력한 MS 펌프로부터유출된시료 ( 시료주입방법에서일부는나뉘어배출되는시료또는검출기를통과한후의시료 ) 는활성탄컬럼을통과시키거나 CDD/CDF 증기응축을위해오일이나비등점이높은알콜을넣은트랩을통해잡는다 폐기물취급 (Waste Handling) : 오염폐기물발생을최소화하는것이 좋다. 쓰레기통안에비닐백을넣어사용하도록한다. 청소부나취급자등 은폐기물의안전취급에대한훈련을받도록한다 오염제거 (Decontamination) 사람에대한오염제거 (Decontamination of personnel) : 순한비누를 사용해충분히문질러준다 초자, 기구및표면 (Glassware, tools, and surfaces) : Chlorothene NU

13 Solvent 는효과가좋으면서독성이가장낮은용매이다. Chlorothene 으로헹구고세제와물로세척함으로서충분히세정된다. 먼저초자를용매로헹구었으면세척한물은그대로하수구에버려도된다. 폐기물처리비용이문제된다면폐용매를줄이는것이좋다 세탁 (Laundry) : 오염된옷가지는비닐봉지에모은다. 옷봉지를운반및세탁하는사람에게유해성에대해알려주고적절한취급법을교육시켜야한다. 만약세탁하는사람이문제발생의가능성을알고있다면옷에손을직접대지않고도세탁기에넣을수있을것이다. 다른세탁을위해사용하기전에세탁기를물로만한번돌려준다 와이프테스트 (Wipe tests) : 작업대표면과도구의청결도를측정하는유용한방법으로여과지로표면을닦아보는방법이있다. 닦아낸여과지를추출후 GC/ECD 로분석하면검출한계인 0.1 μg /wipe 를얻을수있다. 이방법으로훨씬더낮은검출한계도얻을수있다. 분석결과가 0.1μg /wipe 보다작다면충분히깨끗하다고볼수있다. 이보다높으면청소가필요하다. 10 μg /wipe 이상이면심각한위험이있다고보고더사용하기전에장비와작업공간을즉시청소해야하며, 작업중허용할수없는일이있었음을나타낸다 테이블이나 wrist-action shak er : 생체시료의추출을위해테이블이나 wrist-action shaker 를사용할때추출병이파손되거나산과인화성유기용매가누출될가능성이있다. 병의파손이발생했을경우산과용매가확산되는것을방지하기위해 shaker 주변을 2중으로봉쇄하는것이좋다. 또한 shaking action의속도와강도는파손의가능성을최소화하도록조절한다.

14 6. 0 기구와재료 (A p p aratus and m aterials) N ote : 상표명, 공급처, 부품번호등은특별한내용없이설명을목적으로사용되었다. 여기에명시된것과달리동등한성능을나타낼수있는어떠한기구나물질도사용가능하다. 본분석법에서요구하는성능에맞추는일은실험실의책임이다. 6.1 개별시료또는혼합시료의시료채취를위한장비 시료병과마개 액체시료 ( 물, 슬러지및고체를 5% 이하로함유하는유사물질 들 ) : 나사형마개가있는최소용량 1.1-L 의갈색유리시료병 고체시료 ( 토양, 저니토, 슬러지, 종이펄프, 여과찌거기, 퇴비및 고체를 5% 이상함유하는유사물질들 ) : 최소용량 500 ml의입구가 넓은갈색유리시료병 만약갈색병이없으면, 시료를빛으로부터차단한다 병마개 : 시료병에고정되게실로연결한다. 마개는안쪽부분이 fluoropolymer 로되어있어야한다 세척 시료병은세제로세척한후사용하기전에용매로헹군다 마개안쪽의 liner 는세척액으로씻고 reagent water(7.6.1 장 ) 로

15 헹군후용매로헹구고, 사용전에약 200 에서최소 1 시간동 안가열한다 장치의구성 : 자동또는수동연결시스템으로위에언급된방법에따라유리용기들의세척과정을거쳐각시료병이세척되도록한다. 시료채취기에 p eristaltic p um p 가사용된다면압축용실리콘고무관의길이를최소화하여사용한다. 사용전에, 고무관은메탄올로잘세척하고시료오염을최소화하기위해 reagent water 로반복해서세척해야한다. 유량변화측정기 (integrating flow meter) 는일정비율로혼합시료를포집하기위해사용된다. 6.2 유리기구세척을위한장치 : 위쪽에후드가달린실험실개수대 6.3 시료전처리용장비 아래의시료전처리장비가모두들어갈수있을만한크기의실험실용 흄후드 글러브박스 ( 선택사항 ) 생체시료균질화기 : 스테인레스스틸로된 Macro-shaft 와 Turbo-shear b lade 가있는 V irtis Moder 4 5 Macro 분쇄기 (Am erican Scientific Products H 수준의것 ) 육류분쇄기 : 내부판에 3~5 mm의구멍이있는것으로 Hobart 또는 동등품 수분 (%) 측정용장비

16 오븐 : 110 ± 5 의온도를유지할수있는것 데시케이터 저울 분석용 : 0.1 mg까지잴수있는것 Top loading : 10 mg까지잴수있는것 6.4 추출용기구 물시료 혼합유리전극이있는 ph 미터 ph 범위가넓은 ph paper (Hydrion papers 또는동등품 ) L 메스실린더 액체 / 액체추출 : fluoropolymer 코크가달린 250-, 500-, 2000 ml의 분액여두 고상추출 유리여두, frit support, clamp, adapter, stopper, filtration flask, 그리고 vacuum tubing 등으로이루어진 1L 여과장치 ( 그림 4). 폐수시료용기구는 90 또는 144 mm disk 를사용할수있는것. 음용수또는고체함량이적은시료는더작은 disk 을사용해야한다.

17 진공장치 (Vacuum source) : Shutoff 밸브와진공게이지를갖춘 25 in. Hg 압력을유지할수있는 vaccum source 유리섬유여과지 : Whatman GMF 150 ( 또는동등품 ), 1 micron pore size, 장에있는여과장치에맞는것 Octadecyl(C 18 ) 이결합된 silica 를포함하는균일한불활성의고상 추출 disk(fisher Scientif ic F ( 또는동등품 ), 장에있 는여과장치에맞는것 Soxhlet/Dean-Stark (SDS) 추출기 ( 그림 5) : 여과물과고체 / 슬러지 시료를위한장치 Soxhlet : 50 mm ID, 용량 200 ml로서 500 ml플라스크 (300 ml평면플 라스크대신 500 ml둥근바닥플라스크가달린것을제외한 Cal-Glass LG-6900 또는동등품 ) 가달린것 Thimble : Soxhlet 에맞는 (Cal-Glass LG 또는 동등품 ) 수분트랩 : Soxhlet 에맞고 fluoropolymer 코크가있는 Dean Stark 또는 B arret 전열기 : 500 ml둥근바닥플라스크에맞는반구형의것 (Cal-Glass LG 또는동등품 ) 가변변압기 : 110 volt, 10 amp 로 Powerstat ( 또는동등품 ) 생체시료추출용기구

18 추출용병 ( 염산분해 / 추출의경우 ) : Fluoropolymer liner 마개가있는 입구가넓은 500~600 ml의투명유리병 역추출용병 : Fluoropolymer liner 마개가있는입구가좁은 ~ 200 ml투명유리병 교반기 : 격렬한교반이가능한 wrist-action 또는 platform-type 의 회전교반기 (Sybron Thermolyne Model LE "Big Bill" rotary /shak er 또는동등품 ) 동시에 4~9 개시료교반이가능한 shaker table 부착용 rack 비이커 : 400~500 ml Spatulas : 스테인레스스틸 6.5 여과기구 Pyrex glass wool : 최소한 3 시간동안 SDS 로용매추출된것 N ote : Glass wool 을가열하면활성위치가 CDD/CDF 를비가역적으로흡착할 수있다 유리깔대기 : 125~250 ml 유리섬유여과지 : 장의 glass funnel 에맞는 Whatman GF/D ( 또 는동등품 )

19 6.5.4 건조된컬럼 : Coarse-glass frit 이나 glass-wool plug 가부착된 15~ 20 mm ID 의 Pyrex 크로마토그래피용컬럼 Buchner 깔대기 : 15cm 유리섬유여과지 : 장의 Buchner 깔대기에맞는것 여과용플라스크 : 1.5~2.0L 로곁가지가달린것 압력여과기구 : Millipore YT HW 또는동등품 6.6 원심분리기구 원심분리기 : 최소한 5, 000rp m 에서 500 ml원심분리병이나 15 ml원심분 리관을회전시킬수있는것 원심분리병 : 500 ml로원심분리기에맞으며나사형마개가있는것 원심분리관 : 12~15 ml로원심분리기에맞으며나사형마개가있는것 6.7 정제기구 자동겔침투크로마토그래프 (Automated gel permeation chrom tograp h) : Analytical Biochem ical L ab, Inc, Colum b ia, MO, Model GPC Autop rep 2 또는동등품 컬럼 : 길이 600~700 mm, 25 mm ID 로 70g 의 SX-3 Bio-beads 로충진 된것 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 또는동등품 )

20 Syringe : 10 ml용으로 Luer fitting 된것 Syringe 필터홀더 : 스테인레스스틸및유리섬유또는 fluoropolymer 필터 (Gelman 4310 또는동등품 ) UV 검출기 : 254nm, 전처리용또는준전처리용 flow cell (Isco, Inc., Typ e 6 ; Schm adzu, 5mm p ath length; Beck m an-altex 1 52W, 8μl micro-prep flow cell, 2mm path; Pharmacia UV-1, 3mm flow cell; LDC Milton-Roy UV-3, monitor #1203 ; 또는동등품 ) 역상 HPLC 컬럼오븐및검출기 : 235nm 에서 0.02 AUFS 로운영되는 Perkin- Elmer Model LC-65T 또는동등품 Injector : Sample loop 가 50μL 인 Rheody ne 또는동등품 컬럼 : 50 에서메탄올 isocratic effluent 2.0 ml /min 으로운영되는 직렬로연결된두개의 6.2 mm x 250 mm Zorbax-ODS 컬럼 (DuPont instrum ents Div ision, W ilm ington, DE, 또는동등품 ) 펌프 : Altex 110A ( 또는동등품 ) 피펫 일회용파스퇴르피펫 : 길이 150 mm 5 mm ID (Fischer Scientific A, 또는동등품 ) 일회용혈청 (serological) 피펫 : 10 ml (6 mm ID)

21 6.7.4 유리크로마토그래피용컬럼 길이 150mm 내경 8mm (Kontes K , 또는동등품 ), coarse-glass frit 또는 glass-w ool p lug 가있는 250 ml용량의 reserv oir 길이 200mm 내경 15mm, coarse-glass frit or glass-wool plug 가 있는용량 250 ml의 reservoir 길이 300mm 내경 22mm, coarse-glass frit or 300 ml용량의 reserv oir, glass 또는 fluorop oly m er 마개 생체시료추출물의 batch silica 정제용교반기 기계적교반기 : Corning Model 320 또는동등품 병 : 500~600 ml의입구가넓고투명유리로된것 오븐 : 흡착제의가열과저장을위해 105~250 범위에서일정온도 (±5 ) 를유지할수있는것 6.8 농축장치 회전증발기 : B uchi/b rinkm an-am erican Scientific N o. E 또는 동등품, 온도변화가가능한 water bath 를갖춘것 회전증발기에대한진공원은증발기와진공게이지에 shutof f -valve 를 갖춘것

22 순환펌프와냉각기는증발기냉각을위한물사용량이많을것이므로 수돗물을사용하도록한다. 물온도와압력의변화는일정하지않은 분석결과를만들수있다 둥근바닥플라스크 : ml그리고 500 ml또는더큰것, 회전증발기 에맞는 ground-glass fitting 을갖춘것 Kuderna-Danish (K-D) 농축기 농축관 (concentrator tube) : 10 ml, 검량된것 (Kontes K , 또는동등품 ), Ground-glass stop p er( 크기 19 /22 joint) 는추출물의 증발을방지하기위해사용 증발플라스크 (Evaporation flask) : 500mL (Knotes K 또는동등품 ), 스프링을갖춘농축관에연결됨 (Kontes K 또는동등품 ) Snyder 컬럼 : Three-ball macro (Kontes K , 또는동 등품 ) Boiling chips Glass or silicon carbide : 대략 10/40 mesh, 메틸렌클로라이드로 추출하고최소 1 시간동안 450 에서건조 Fluoropolymer ( 선택사항 ) : 메틸렌클로라이드로추출 Water bath : Concentric ring cover 가있는가열가능한것, Fume hood 안에설치가능하며온도를 ±2 로유지할수있는것

23 6.8.3 Nitrogen blowdown apparatus : 온도범위 30~60 에서조절가능한 water bath 를갖출것, (N -E v ap, Organom ation Associate, I nc, South B erlin, MA, 또는동등품 ), fume hood 안에설치 시료병 (sample vials) Amber glass, fluoropolymer-lined 나사형마개를갖춤, 용량 2-5mL Glass, 0.3 ml, conical, fluoropolymer-lined 나사형또는 crimp 형마개 6.9 기체크로마토그래프 : Capillary column 을위한 splitless 또는 on-column 주입구, 등온유지온도프로그램을갖추고 10 장에서제시하고있는모든성 능명세사항을만족시켜야한다 CDD/CDF 와 2,3,7,8-TCDD 분리용 GC 컬럼 : 길이 60 ±5m, 0.32 ± 0.02 mm I D ; 0.25 μm 5% p heny l, 9 4 % methyl, 1 % vinyl silicone b onded-p hase fused-silica cap illary 컬럼 (J &W DB -5 또는동등품 ) ,3,7,8-TCDF 분리용 GC 컬럼 : 길이 3 0 ± 5m, 0.32 ± 0.02 mm ID ; 0.25 μm b onded-p hase fused-silica cap illary 컬럼 (J &W DB -225 또는동 등품 ) 6.10 Mass Spectrometer : 28~40eV electron impact ionization, 약 1 초동안고 분해능 ( 10,000) 으로반복적으로최소 12 exact m/z 를선택적모니터링할 수있고, 10 장의성능스펙을모두만족시켜야한다 GC/MS interface : MS 는 GC 와의연결에서 capillary column 의끝이이 온원의 1cm 이내에이르도록연결되어야한다. 전자또는이온 beams 을 가로막지않아야한다.

24 6.12 Data system : MS 데이타를모으고기록하고저장할수있는것 7. 0 시약과표준물질 (Reagents and standards) 7.1 ph 조절과역추출 수산화칼륨 : reagent grade KOH 20g 을 ml reagent water 에녹인다 황산 : Reagent grade (sp ecific grav ity 1. 84) 염산 : Reagent grade, 6N 염화나트륨 : Reagent grade, reagent water 로 5%(w/v) 용액을조제 할 것 7.2 용액의건조와증발 용액건조 : Reagent grade 의과립형무수황산나트륨 (Baker 3375 또는동등품 ) 을메틸렌클로라이드 (20 ml /g) 로헹군후, 400 에서최소 1 시간동안가열하고데시케이터에서방냉한후, 습기가들어가지못하게미리세척해놓은유리병에넣어나사형마개로막아보관할한다. 가열후황산나트륨이회색을나타내면 (crystal matrix 안에탄소가있기때문 ) 사용에부적절하므로버린다. 메틸렌클로라이드추출 ( 단순헹굼에반해 ) 과저온가열로사용에적합한황산나트륨을만들수도있다 생체시료건조 : Reagent grade, 분말형태의무수황산나트륨은위에서언 급한대로취급보관한다 정제된질소기체

25 7.3 추출 용매 : 아세톤, 톨루엔, 사이클로헥산, 헥산, 메탄올, 메틸렌클로라이드 및노난 ; 방해물질배제를위해증류한잔류농약분석용 백색석영모래, 60/70 mesh : Soxhlet/Dean-Stark 추출용 (Aldrich Chemical, Cat. No 또는동등한것 ). 450 에서최소 4 시간동안가열 7.4 GPC 보정용액 : 300 mg / ml옥수수기름, 15 mg / ml bis(2-ethylhexyl) p hthalate 1. 4 mg / ml p entachlorop henol, 0.1 mg / ml p ery lene, 0. 5 mg / ml sulfur 를포함하는 용액을조제한다. 7.5 시료정제용흡착제 실리카겔 활성실리카겔 : ~200mesh, Supelco ( 또는동등품 ), 메틸렌클로라이드로헹구고, 180 에서최소 1 시간동안가열, 데시케이터에서방냉후미리세척해둔병에담아수분이들어가지못하도록나사형마개로막아보관한다 산성실리카겔 (30% w/w) : 44.0g의진한황산과 g 활성실리카겔을깨끗한용기에넣고혼합한다. 덩어리들이균일한혼합물이될때까지막대로젖는다. 병에담아 fluoropolymer-lined 나사형마개로막아보관한다 염기성실리카겔 : 1N 수산화나트륨 30g 과활성실리카겔 g 을 깨끗한용기에넣어완전히혼합한다. 덩어리들을균일한혼합물이

26 될때까지막대로젖는다. 병에담아 fluoropolymer-lined 나사형마 개로막아보관한다 Potassium silicate ~0 ml의평면바닥플라스크에서고순도수산화칼륨 (Aldrich 또는동등품 ) 56g 을메탄올 300 ml에녹인다 실리카겔 g 과 stirring bar 를넣고, hot plate 에서 60~70 로 1 ~ 2 시간동안교반한다 액체를버리고 potassium silicate 를메탄올 ml로두번헹군 다음, ml메틸렌클로라이드로한번헹군다 용매로헹군알루미늄호일위에 potassium silicate 를펼쳐놓고 후드에서 2~4 시간정도건조시킨다 ~250 에서하룻밤동안활성화시킨다 알루미나 : 9.3 장의동위원소표지된화합물의회수율을위한성능스펙을충족시킬수있다면염기성또는산성알루미나를시료추출물정제에사용할수도있다. 최초정밀도및회수율 (9.2장 ) 과진행중의정밀도및회수율 (15.5 장 ) 측정에사용되는시료를포함한모든시료에동일한알루미나를사용해야한다 산성알루미나 : Supelco C ( 또는동등품 ). 130 에서최소 12 시간동안가열하여활성화시킨다 염기성알루미나 : Supelco C ( 또는동등품 ). 600 에서최소 24

27 시간동안가열하여활성화시킨다. 또는공기유속이약 400cc/minute, 650~700 의 tube furnace 에서가열하여활성화시킨다. 분석물질의머무름용량이줄어들수있으므로 700 이상으로는가열하지않는다. 마개가있는플라스크에넣어 13 0 에서보관한다. 가열한지 5일이내에사용한다 탄소 Carbopak C : Supelco 또는동등품 Celite 545 : Supelco 또는동등품 Carbopak C 9.0g 과 Celite g 을 18% w/w 혼합물이되도록 완전혼합한다. 혼합물을 1 30 에서최소 6 시간동안활성화시킨다. 데시케이터에보관한다 Anthropogenic 분리컬럼 : 장의컬럼을아래쪽부터다음의순서로 충진한다 실리카겔 2g ( 장 ) Potassium silicate 2g ( 장 ) 과립형무수황산나트륨 2g (7.2.1 장 ) 산성실리카겔 10g ( 장 ) 과립형무수황산나트륨 2g

28 7.5.5 플로리실컬럼 플로리실 : 60~ mesh, Floridin Corp ( 또는동등품 ). 500g 을 24 시간동안 Soxhlet 추출한다 눈금이있는 serological 피펫 ( 장 ) 의가는쪽끝에 glass wool p lug 를삽입한다. 플로리실 1. 5g( 약 2 ml ) 과그위에약 1 ml의황산나 트륨 (7.2.1 장 ) 을채우고 glass wool plug 를충진한다 오븐에서 130~150 로최소 24 시간동안활성화시키고 30 분간방 냉한다. 방냉한지 9 0 분이내에사용한다. 7.6 Reference Matrices : 본분석법을이용했을때 CDD/CDF 및방해물질이 검출되지않는 matrices 물 (Reagent water) : 시중에판매되는물또는활성탄에통과시킨물 고형물함량이높은 reference matrix : 놀이터모래또는이와유사한것. 메틸렌클로라이드로추출하거나 450 에서최소 4 시간동안가열해서 준비한다 종이 reference matrix : 유리섬유필터 Gelman type A 또는동등품. 테 스트에사용할종이의표면적과비슷하게하기위해종이를자른다 생체시료 reference matrix : 옥수수유또는다른식물성기름. 메틸렌 클로라이드로추출하여준비할수있다 Other matrices : 본분석법은 9. 2 장에나온테스트를실시함으로써어떤 reference matrix 에서도검증될수있다. Matrix 에 CDD/CDF 가전혀

29 없는것이이상적이나 reference matrix 내에 CDD/CDF 의기본함유량이표 2에나온최소농도의 3배를넘어서는안된다. Reference matrix 의 CDD/CDF 바탕값이낮을경우, 첨가량 (spike level) 대바탕값비가 1:1 에서 5:1 ( 참고문헌 15) 범위에들도록 9.2 장에사용되는첨가량을증가시킨다. 7.7 Standard solution : 순도, 농도, 품질이입증된용액또는혼합물을구입하거나, 순도와조성이알려져있는물질로조제한다. 만약화합물의순도가 98% 이상이면, standard 의농도를계산하기위한무게보정없이사용해도된다. 사용하지않을경우에는 fluoropolymer-lined 나사형마개를씌운바이알에넣어어두운곳에서실온보관한다. 용액의높이를바이알에표시하여증발에의한용매의손실정도를알수있도록한다. 만일용매가손실되었다면다른표준용액을사용하도록한다. 7.8 Stock solution 조제 : 노난을용매로아래방법에따라조제하거나희석액 (Cambridge I sotop e L ab oratories (CI L ), W ob urn, MA, 또는동등품 ) 을구입한다. 5 장에있는안전상주의사항과 장에있는권고사항을준수한다 농도를알고있는기준물질적당량을용매에녹인다. 예를들면, 1 ~ 2mg 2,3, 7,8-TCDD 를 10 ml ground-glass-stoppered 용량플라스크에유효숫자 3자리까지재고, 노난으로표시선까지채운다. TCDD 가완전히녹은다음용액을 fluoropolymer-lined 마개를씌운깨끗한 15 ml유리병에옮긴다 Stock standard solution 은검량선용또는성능테스트용표준품으로조 제하기전에변질가능성을체크해야한다. 검량선작성용표준품의정 확성을결정하는데쓰이는표준품은 CIL 등에서구입한다.

30 7.9 PAR Stock Solution 모든 CDDs/CDFs : 7. 8 장에있는용액을이용하여, CDDs/CDFs 가표 3 에있는농도가되도록 PAR stock solution 을조제한다. 희석하면용 액은 7.14 장에있는농도의 PAR 이될것이다 ,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 만분석할경우에는, 이화합물만을함유 하는 PAR stock solution 을조제한다 동위원소표지화합물첨가용액 (L abeled-com p ound sp ik ing solution) 모든 CDDs/CDFs : Stock solution 이나구입한혼합물로부터동위원소 표지된화합물이표 3 의농도가되도록노난에녹여만든다. 사용전 아세톤으로희석한다 ( 장 ) ,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 만분석할경우, 이화합물만을함유하는 동위원소표지화합물용액을조제한다. 사용전아세톤으로희석한다 ( 장 ) 동위원소표지 화합물 용액의 충분한 양을 ( 장 또는 장 ) 아 세톤으로 50 배 희석하여 첨가용액을 조제한다. 각 시료에 필요한 희석 용액의 양은 1.0 ml이나, 하루에 사용할 양 이상으로 많이 만들지 않도록 한다 정제용표준물질 : 37 Cl 4-2,3,7,8-TCDD 를표 3의농도가되도록노난으로조제한다. 정제과정의효율을측정하기위해정제하기전모든추출물에정제용표준물질을첨가한다 내부표준물질

31 모든 CDDs/CDFs : 내부표준물질용액이 13 C 12-1,2,3,4-TCDD 와 13 C 12-1,2,3,7,8,9- HxCDD 를표 3 의농도로함유하도록노난을이용해조제한다 ,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 만을측정할경우, 만을함유하는내부표준물질용액을만든다. 13 C 12-1,2,3,4-TCDD 7.13 검량선작성용표준품 (CS1 ~ CS5) : 노난을용매로 7.9 장~7.12장에나온용액들을혼합하여표 4에있는 5개의검량선작성용용액을만든다. 이용액들을이용하여 relativ e resp onse(lab eled to nativ e) 와 resp onse factor를농도의함수로측정할수있다. CS3 는보정의검정 (calibration v erification, VER) 에이용된다. 2,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 만을측정할때에는, 이들에맞는적당한용액들을혼합한다 정밀도및회수율 (PAR) 표준물질 : 최초 (9.2장 ) 및분석중 (15.5 장 ) 의정밀도와회수율측정에사용된다. 각시료 batch 의각 matrix 에사용할정밀도및회수율표준물질 (7.9.1 장또는 7.9.2장 ) 10μl를아세톤으로 2.0 ml되게희석한다. 1ml씩이각 batch의각 matrix 용 blank 및 OPR에필요하다 GC Retention Time Window Defining Solution and Isomer Specificity Test Standard : 다이옥신과퓨란이성질체에대하여머무름시간의시작과끝을결정하고 2,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 의측정에쓰이는 GC 컬럼의이성질체특이성 (isomer specificity) 을증명하기위해쓰인다. 표준품은적어도표 5 에나와있는화합물 (CI L EDF-4006 또는동등품 ) 들은함유해야한다. 2,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 만측정하는경우에는 window-defining 화합물을측정할필요가없다. 이경우, 표 5에열거된가장근접하게용출되는이성질체를함유하는 isomer-specificity 테스트표준품 (CI L E DF 또는동등품 ) 을사용할수있다.

32 7.16 QC check sample : QC check sample은 calibration standard와관계없는 source 로부터얻어야한다. Check sample 이, 테스트중인시료의 matrix 와유사한 matrix 에이미알고있는농도로 CDDs/CDFs 를함유하는인증된 reference m aterial이면이상적이다 용액의안정성 : 정량분석이목적 (7. 9 장 ~ 장 ) 인표준품용액은주기적 으로분석하고, 더사용하기전에 reference standard(7.8.3 장 ) 와비교하여 성분분석을해야한다 시료수집, 보존, 보관및보존기간 (Sample Collection, P reserv ation, storage, and Holding Tim es) 8.1 일반적인시료채취법 ( 참고문헌 16) 에따라시료를갈색유리병에채취한다. 흐름이있는수용성시료는자동샘플링장치를사용하여냉각된병에채취한다. 고체시료는입구가넓은병을이용해일반적인시료채취법 (grab sample) 으로채취한다. 8.2 수용성시료는시료채취후실험실에도착할때까지 0~ 4, 어두운곳에둔다. 수용성시료에잔류염소가존재하면, 시료 1L당 80 mg의티오황산나트륨을첨가한다. EPA method 330.4와 를이용하여잔류염소량을측정할수있다 ( 참고문헌 17). 시료의 ph가 9 보다크면, 황산으로 ph를 7~9 에맞춘다. 고체, 반고체, 오일상및복합상시료는시료채취후실험실에도달할때까지 4 이하, 어두운곳에둔다. 수용성시료는어두운곳에서 0~4 로보관한다. 고체, 반고체, 오일상태, 복합상및생체시료의경우 -1 0 이하, 어두운곳에서보관한다. 8.3 어류및생체시료 어류는아마도현장에서씻고, 다듬는등여러방법이진행될것이다.

33 실험실은아마도어류전체, 다듬은어류, 또는다른형태의생체시료를분 석용으로받게될것이다 현장에서채취한생선은시료채취후실험실에도달할때까지알루미늄 호일에싸서 4 이하로유지해야한다 실험실에서는시료를접수해사용할때까지 -10 이하어두운곳에서 보관한다. 사용하지않은시료는 -10 이하어두운곳에서보관한다. 8.4 보존기간 CDDs/CDFs 를포함하는수용성, 고상, 반고상, 생체시료, 또다른여러시료와관련하여최대보존기간이증명된바는없다. 만일 0~4, 어두운곳에서저장하고위에주어진조건으로보존된다면, 수용성시료는아마도 1년까지보존될수있을것이다. 유사하게 <-10, 어두운곳에서저장된다면고상, 반고상, 여러상태의생체시료도 1년까지보존될수있을것이다 시료추출물은분석전까지 -10 이하, 어두운곳에보관한다. 시료추 출물은 -10 이하의어두운곳에두면 1 년까지보관이가능하다 품질인증 / 품질관리 (Quality assurance/quality control) 9. 1 본분석법을사용하는모든실험실은공식적인 QA 프로그램 ( 참고문헌 18) 을실시하도록한다. 이프로그램의최소필요사항은우선실험실의능력을보이는것, 데이타의질을평가하고기록하기위해동위원소표지된화합물을첨가한시료를분석하는것, 지속적인분석능력테스트로써표준품과 blank 를분석하는것등으로구성된다. 분석결과가본실험법상의분석능력특성을만족시키는지알기위해, 실험실의분석능력을확립된분석능력기준과비교한다.

34 만일본분석법이물이외의시료 ( 예를들면, 토양, 여과물, 퇴비, 생체시료 ) 에 적용되면, 가장적절한대체 reference matrix(7.6.2 장 ~7.6.5 장 ) 는모든성능 시험에서 reagent water matrix(7.6.1 장 ) 로바꿀수있다, 분석자는본분석법으로수용할만한정확도과정밀도를이끌어낼수 있는능력을우선증명해야한다. 이능력은 9.2 장에기술되어있는대 로확립된다 분석기술분야의발전을감안할때, 시료 matrix 의방해물질을극복하기위해서, 분석자는분리능력을향상시키거나측정비용을낮추기위한어떤선택사항들을받아들여야한다. 이런선택사항은추출방법의변화, 농축, 정제과정, 그리고컬럼과검출기의변화등을포함한다. 분광학적또는면역학적기법과같은대체방법 (Alternate determination techniques) 과분석능력의저하를가져오는변화는허용되지않는다. 본분석법에제시된기술이외의분석기술을사용하려면, 이런분석기술은대상분석물질에대하여본분석기법의특성과같거나더나은것이어야한다 본분석법을수정할때에는항상 9. 2 장에있는절차를반복해야한다. 만약변경에의해본분석법의검출한계가영향을받는다면, 실험실에서는 MDL (40CFR Part 136, Appendix B) 이규제치 (regulatory compliance level) 의 1/3이나본분석법 ML의 1/3 ( 어떤것이더높건간에 ) 보다낮다는것을입증해야한다. 변경함으로써보정이영향을받는다면, 분석자는 10장에따라기기를다시보정해야한다 본분석법에대한수정사항을기록하여보존해야한다. 기록사항에는 최소한다음의내용이포함되어야한다 분석과수정을실시한분석자와분석과변경을참관하고증명할 QC 직원의이름, 직함, 주소, 전화번호

35 분석오염물질의명칭과 CAS 등록번호목록 수정이유에대한설명 다음내용을포함하는수정된분석법과본분석법을비교하는 모든 QC 테스트결과 a) 보정 (10.5장~10.7장) b) 보정 검증 (15.3장) c) 초기 정밀도와 회수율 (9.2장) d) 동위원소표지 화합물의 회수율 (9.3장) e) Blank 분석 (9.5장) f) 정확도 평가 (9.4장) 분석자외에다른검토자가최종결과에대한성과물 ( 피크의높이, 면적, 또다른요소등의 signal) 추적함으로서각측정의타당 성을갖는다고인정하는자료들은다음과같다. a) 시료 번호 등 표식 b) 추출 날짜 c) 분석 날짜와 시간 d) 분석 순서 / 시료분석의 시간상 순서 e) 시료의 무게 또는 부피 (11장) f) 각 정제 단계 전 추출물 부피 (13장) g) 각 정제 단계 후 추출물 부피 (13장) h) 기기주입 전 최종 추출물 부피 (14장) i) 기기주입량 (14.3장) j) 시료나 추출물의 희석을 구별하는 희석 데이터 (17.5장) k) 기기 및 기기운영 조건

36 l) 컬럼 ( 규격, 액상, 고상지지체, 필름두께등 ) m) 기기운영조건 ( 온도, 온도프로그램, 유속 ) n) 검출기 ( 종류, 운영조건등 ) o) 크로마토그램, 프린터테이프, raw data의기록물 p) 정량분석보고서, data system output, 그리고 raw data를결과에연결시키는다른 data 오염이없다는것을증명하려면 method blank 를분석해야한다 (4.3 장 ). Method blank 의분석방법과기준은 9.5 장과 15.6 장에나와있다 실험실은모든시료들에동위원소표지된화합물을첨가해야하는데이는분석성능을모니터링하기위한것이다. 이테스트는 9. 3 장에제시되어있다. 이런첨가법은전형적인시료분석성능을나타내주며, 시료들은허용한계내에서분석작업이되도록희석한다. 희석과정은 장에나타나있다 분석진행단계에서보정의검증과진행중의정밀도및회수율분석을 실시함으로써분석시스템이조절되고있음을보여주어야한다. 방법은 15.1 장 ~15.5 장에나와있다 실험실은분석자료의질을알아보기위한기록들을유지해야만한다. 정확한사항들은 9.4 장에나타나있다. 9.2 초기정밀도와회수율 (IPR) : 수용할만한정확성과회수율산출능력을확 립하기위해, 다음의작업을수행해야한다 고체함량이적은 ( 수용성 ) 시료의경우, 11장~18장에나온방법대로희석된동위원소표지화합물첨가용액 (L CS) 과정밀도및회수율표준품 (PAR)(7.14장) 을주입한 4개의 1L reagent water를추출, 농축, 분석한다. 시료 matrix 가다른경우, 해당 reference matrix 4 개 (7.6 장 ) 를사용한

37 다. 이테스트에는시료전처리의모든단계, 즉시료조제 (11 장 ), 추출 (12 장 ) 및정제 (1 3 장 ) 가포함된다 개의분석결과로부터, 동위원소표지동족체가있는 CDDs/CDFs의경우동위원소희석법으로, 그리고 1,2, 3, 7,8, 9-HxCDD, OCDF 및동위원소표지된화합물의경우내부표준물질법을이용해각화합물에대한추출중의평균농도 (X) 와농도의표준편차 (s) 를 ng/ ml로계산한다 각 CDD/CDF 와동위원소표지화합물의 s 와 X 를표 6 에나온초기정밀도와회수율에대한한계치와비교한다. 2,3,7,8-TCDD 와 2,2,7,8-TCDF 만측정할경우, s 와 X 를표 6a 에나온초기정밀도와회수율에대한한계치와비교한다. 모든화합물들의 s와 X가수용기준 (acceptance criteria) 을만족한다면, 시스템분석능력이갖추어진것으로보고 blank 와시료에대한분석을시작할수있다. 그러나하나의 s라도정밀도한계를넘거나, 하나의 X라도정확도의범위를벗어나면, 그화합물에대한시스템분석능력은수용할수없다. 문제점을정정하고다시테스트한다 (9. 2 장 ). 9.3 같은 matrix 상에서의 method performance 를평가하기위해희석된 LCS ( 장 ) 를모든시료에첨가한다 모든시료를 11 장 ~18 장에있는방법에따라분석한다 내부표준물질법 (17.2 장 ) 을이용해 LCS 와 CSS 의퍼센트회수율을계산 한다 ,3,7,8- 치환 CDDs/CDFs 모두를측정할때에는각동위원소표지된화합물의회수율은표 7에있는한계내에들어야하고, 2,3, 7, 8-TCDD와 2, 3, 7,8-TCDF만측정할때에는표 7a의한계내에들어야한다. 화합물의회수율중이한계를벗어난것이존재한다면그화합물에대한

38 method performance 는받아들일수없다. 그러한문제를해결하기위 해, 물시료는희석하고, 토양, 슬러지, 저니토등 matrix 는 18.4 장에따 라더적은양으로재분석해야한다. 9.4 시료중동위원소표지화합물의회수율을평가하고그기록을보존한다 Matrix 종류 ( 물, 토양, 슬러지, 펄프등 ) 에따른 5개의시료를분석하여동위원소표지화합물이 9. 3장의테스트를통과하면, 동위원소표지화합물에대해서만평균퍼센트회수율 (R) 과퍼센트회수율의표준편차 (S R ) 를계산한다. 평가결과는각 matrix 에대해퍼센트회수율범위 R-2S R 에서 R+ 2S R ) 로표시한다. 예를들면, 만약펄프시료 5개의분석결과 R=90%, S R =10% 라면, 회수율범위는 70~110% 로표시한다 정기적으로 ( 예를들어, 매 5~10 개분석후 ) 각 matrix 에대하여동위원 소표지화합물에대한정확도평가를업데이트한다. 9.5 Method blanks : 오염되지않았다는것을나타내기위해 reference matrix m ethod blank 를분석한다 각시료단위 ( 시료는 12시간단위로추출하며최대 20 개시료를한과정에서동시에추출할수있음 ) 마다 method blank 를조제, 추출, 정제, 농축한다. method blank 의 matrix 는시료 matrix 와동일해야한다. 예를들면, 1-L의 reagent water blank( 장 ), high-solid reference matrix b lank (7.6. 2장 ), p ap er m atrix b lank ( 장 ), tissue b lank (7.6. 4장 ) 또는 alternative reference matrix blank(7.6.5 장 ) 등. 오염되지않았음을보여주기위해 OPR 분석직후곧바로 blank 분석을실시한다 ,3,7,8- 치환 CDD/CDF( 표 1) 가최소농도 ( 표 2) 또는규정치 (regulartory compliance) 의 1/3 보다높을경우, 또는각염소치환수준마다 blank 에

39 서방해작용의가능성이있는물질이표 2의 ML 로검출될경우 ( 표 1에나와있지않은화합물에대해내부표준물질 13 C 12-1,2,3,4-TCDD 의 response factor 를 1이라고가정할때 ) 그시료단위와관련된 blank 가오염되지않았음을입증할때까지시료분석을중지한다. 시료분석결과를규정치를만족시키는목적으로 (regulatory compliance purpose) 보고하려면모든시료는오염되지않은 method blank 를사용하여야한다. 9.6 QC Check Sample : 검량선작성용표준품의정확성과분석과정의전체적 신뢰도를입증하기위해주기적으로 QC Check Sample(7.16 장 ) 을분석한다. 적 어도 4 달에한번은 QC Check Sample 을분석하는것이좋다. 9.7 실험기구가적절히보정되고그상태가유지된다면본분석법상의스펙 (specifications) 을충족시킬수있다. Calibration(10 장 ) 과 calibration verification (1 5.3 장 ), 그리고 initial(9. 2장 ) 및 ongoing(15. 5장 ) p recision & recov ery 용으로동일한표준물질을사용하여가장정밀한결과를얻도록한다. GC/MS 기기를본분석법상의 CDDs/CDFs 분석에알맞게설치하여조건을설정한다면, 가장재현성있는결과를얻을수있을것이다. 9.8 특정한프로그램의요구조건에따라서는, 시료채취기술의정밀도를결정하기위해서는반복실험을위한현장시료 (field replicates) 를채취하고, 분석의정확도를결정하기위해서는내부표준법의사용을위한동위원소표지화합물을첨가한시료들이필요하다 보정 (Calib ration) 장의내부표준물질의최소머무름시간과표 2 의 CDDs/CDFs 의상대 머무름시간을만족시키기위해필요한운영조건을설정한다.

40 추천하는 GC 운영조건 Injector temperature : 270 Interface temperature : 290 Initial temperature : 200 Initial time : 2min Temperature program : 200~220, at 5 /min 220 for 16min 220~235, at 5 /min 235 for 7min 235~330, at 5 /m in N ote : 컬럼을포함, GC 를 ion source 에연결하는모든부분들은휘발성이적은 화합물의응축을막기위해분석하는동안에는위에명시된 interface 온도이상을유지해야한다. 화합물의분리와감도를위해 GC 조건을최적화한다. 일단최적화되 면, 모든표준품, blank, IPR, OPR, 시료를동일한 GC 조건으로분석 해야한다 Mass sp ectrom eter (MS) 분해능 : CDDs/CDFs의 순수한 표준품을 단 독으로 또는 비슷한 시간에 용출되는 성분끼리 방해작용이 없는 혼합 물 형태로 주입함으로서 표 8의 두개의 exact m/z 에서 분해능 10,000 으로 표 3의 모든 분석대상물질에 대해 선택적이온유형 (SICP) 을 얻는다 CDDs/CDDs 의분석시간은 mass spectrometer 의 long-term mass stablilty 를초과할수도있다. 기기가고분해능모드에서운영되기 때문에, 수 ppm (e.g. 5ppm in mass) 의 mass drift 로도기기운영

41 에심각한악영향을미칠수있다. 따라서 mass-drift 보정이필요하고여기에 PFK의 lock-mass m/z가사용된다. 표 8과같이 lock-mass m/z 는각 descriptor( 염소치환수의종류에따른그룹별질량 scan data 수집을위한범위 ) 내에서모니터된 exact m/z 따라다르다. 분석시 HRMS로주입되는 PFK의양을조절하여가장큰 lock-mass m/z signal(descriptor 의수에상관없이 ) 의크기가주어진검출파라미터에서의 full-scale deflection 의 10% 를초과하지않게한다. 이러한조건하에서, 분석중발생할수있는감도의변화를가장효과적으로모니터할수있다. N ote : 과량의 PFK ( 또는다른 reference substance) 는 noise 문제를발생시키며 ion source 를오염시켜 source 세척을자주해야한다 HRMS 에분석중간에분해능을체크할수있는기능이있다면, 재 분석시간절약을위해분해능이 10,000 이하로떨어질때분석을 종료해도무방하다 PFK molecular leak을사용하여, m/z (PFK) 나 m/z 304 (TCDF 로부터 ) 에근접한다른 reference signal 에서최저분해능 10,000 (10% valley) 을얻을수있도록기기를튜닝한다. 각 descriptor ( 표 8) 에대해서, descriptor의 mass 범위에있는 3~5 개의 reference peak의분해능과 exact m/z를측정, 기록한다. 분해능은 10,000 이상이고, 측정된모든 exact m/z 와이론적 m/z ( 표 8) 사이의편차는 5 ppm보다작아야한다 이온량비, 최저농도, signal-to-noise 비율, 절대머무름시간 : HR-GC/MS 기기성능에맞게주입량을 1 μl나 2 μl에서선택한다 장의 GC 조건 을이용한 CS1 검량선작성용표준용액 ( 표 4) 1 μl또는 2 μl를주입한다.

42 2,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 만측정할경우, 아래의기기운영조건과 스펙을적용하여분석한다 각분석대상물질의 SICP 면적을측정하고, 표 8 에명시된 exact m/z 에서의이온량비를계산한다. 계산한비율을표 9 의이론적비율과비 교한다 각 descriptor 에서모니터링되는 exact m/z 가표 9에나와있다. 모든 CDDs/CDFs 가검출되는지를확인하기위해각그룹또는 descriptor 를 GC 머무름시간의함수로써연속측정한다. 각 descriptor 에대해추가로 m/z 를측정할수있으며, 주어진머무름시간 window 에서모든 CDDs/CDFs 의 m/z 를모니터링할수있다면, m/z 를표 8의 5개이상의 descriptor 로도나누어질수있다. 2,3,7,8-TCDD 와 2,3,7,8-TCDF 만측정할경우, descriptor 를수정하여 4염화, 5염화동족체, diphenyl ethers, 그리고 lock m/z에대한 exact m/z 만포함하도록수정하면된다 Lock m/z를제공하는 PFK를이용하여 MS를 mass-drift 보정모드에서운영한다. 각그룹의 m/z 에대한 lock-mass 는표 8에나와있다. 모든 lock mass 를모니터링해야하며 lock mass 는각 retention time window 에서 ±20% 이상변해서는안된다. Lock mass가 20% 이상달라지면기기의감도를떨어뜨릴수있는 coeluting 방해물질이존재함을나타내는것이다. 시료추출물일부를다시주입하는것으로는문제가해결되지않으며방해물질을제거하기위해추출물을추가로정제해야한다 CS1 표준품에있는모든 CDDs/CDFs 와동위원소표지화합물의이 온량비는표 9 에있는 QC 범위내에들어야한다. 그렇지않을경우, MS 를보정하고, m/z 비율이명시된범위에들때까지반복테스트

43 한다. MS 를보정하여분해능이변화되었다면, 반복테스트를거치기 전에분해능을조절하여야한다 ( 장 ) HR-GC/MS 기기가표 2의최소농도를만족시킴을입증한다. CS1 검량선작성용표준품에있는모든 CDDs/CDFs와동위원소표지화합물의피크들은 signal-to-noise 비 (S/N) 가 10.0 이상이어야한다. 그렇지않을경우, 기기를보정하고표 2의최소농도를만족시킬때까지반복테스트를실시한다 C 12-1,2,3,4-TCDD(7.12 장 ) 의절대머무름시간은 DB-5 column 에서 25 분을넘고, 13 C 12-1,2,3,4-TCDD 의머무름시간은 DB-225 column 에서 15분을넘는다. 그렇지않을경우, GC 온도프로그램을조정하고, 위에나온최소머무름시간기준을충족시킬때까지반복테스트를실시한다 머무름시간의범위 : 10.1 장에있는최적화된온도프로그램을이용해서 window def ining 혼합물 (7. 15 장 ) 을분석한다. 표 5 에 window-def ining 화합물들의용출순서 ( 처음 / 마지막 ) 가나와있다. 2, 3, 7, 8, -TCDD 와 2, 3, 7, 8- TCDF 만분석할경우에는이테스트를할필요가없다 Isom er Sp ecificity 장에나온방법과시료분석을위한최적조건 ( 장 ) 을이용하여 isom er sp ecificity 테스트표준품 (7.1 5 장 ) 을분석한다 그림 6 과 7 에서처럼각각의컬럼에서 2,3,7,8-TCDD 및 TCDF 에가장 가깝게용출되는 GC 피크사이의 percent valley 를계산한다 가장가깝게용출된이성질체들과 2,3,7,8- 치환이성질체사이의 valley

44 높이가 25% ( 그림 6 과 7 에서 x/y 로계산됨 ) 보다작아야한다. Valley 가 25% 를넘으면분석조건을바꾸고반복테스트를실시하거 나 GC 컬럼을교체하고다시보정한다 ( 장 ~10.7 장 ) 동위원소희석법에의한보정 : 동위원소희석법보정은, 동위원소표지화합물을추출단계전에시료에첨가하는 15개의 2,3,7,8- 치환 CDDs/CDFs 에사용된다. 각 CDDs/CDFs 화합물에대한 reference 화합물이표 2에나와있다 분석할화합물의농도범위를포함하는검량선을준비한다. Relative response (RR) (labeled to native) 대표준용액의농도를그리거나직선회귀를이용하여계산한다. Relative response 는아래방법에따라결정한다. 검량점을 5개잡는다 동위원소표지동족체에대한 CDD/CDF 의 response 는각검량선작성용 표준품에대하여표 8 에나와있는 p rim ary 와 secondary exact m /z 의 area resp onse 를이용해서다음과같이계산한다. RR = (A1 n+a2 n ) C l (A1 l +A2 l ) C n A1 n 와 A2 n = CDD/CDF에대한 primary 와 secondary m/z's의면적 A1 l 와 A2 l = 라벨된화합물에대한 p rimary 와 secondary m/z 's 의면적 C l = 검량선작성용표준품 ( 표 4 ) 에서의동위원소표지화합물의농도 C n = 검량선작성용표준품 ( 표 4) 에서의 native 화합물의농도 동위원소희석법을이용한분석시스템을보정하려면, 1 4 장에있는방 법과 장, 표 2 의조건을사용해서 10.2 장과같은양의검량선작 성용표준품 CS1~CS5 ( 장과표 4 ) 를주입한다. 각농도마다 relativ e

45 resp onse(rr) 을계산한다 직선성 : 어떤화합물에대한 relative response가 5점보정범위에걸쳐서일정하다면 ( 변이계수가 20% 보다작으면 ), 그화합물에대해평균 relative response를사용할수있다. 그렇지않을경우는, 그화합물에대한완전한검량선을 5점보정전범위에걸쳐사용해야한다 내부표준물질에의한보정 : 1, 2,3,7, 8,9-HxCDD ( 장 ), OCDF ( 장 ), 2,3,7,8- 치환이아닌화합물의분석및실험실통계 (9.4 장과 장 ) 를위 한동위원소표지화합물측정에내부표준물질법을적용한다 Response factor : 다음공식으로부터구한 response factior (RF) 를이용 하여보정한다. RF = (A1 s+ A2 s ) C is (A1 is +A2 is ) C s A1 s 와 A2 s = CDD/CDF에대한 primary와 secondary m/z's의면적 A1 is 와 A2 is = 내부표준물질에대한 p rimary 와 secondary m/z ' s 의면적 C is = 내부표준물질의농도 ( 표 3) C s = 검량선작성용표준물질에서화합물의농도 ( 표 4) N ote : 37 C 4-2,3,7,8-TCDD 에는한개의 m /z 가있다. 표 8 을참고 내부표준물질법에의해서분석시스템을보정하려면, 14장에있는방법과 장과표 2에있는조건을이용해서검량선작성용표준물질 CS1 ~ CS5 (7.13 장과표 4) 1.0 μl또는 2.0 μl를주입한다. 각농도에서 resp onse factior(rf) 를계산한다.

46 직선성 : 5 점보정범위에걸쳐화합물에대한 resp onse f actor(rf) 가일정하다면 ( 변이계수가 35% 보다적은 ), 그화합물에대해서평균 response factor 를사용할수있다. 그렇지않은경우, 5점범위에걸쳐그화합물에대한완전한검량선을사용해야한다 Com b ined calib ration : CDDs/CDFs와동위원소표지화합물및내부표준물질을포함하는검량선작성용표준품 (7.13장과표 4) 을이용한하나의분석세트로동위원소희석법과내부표준물질법을위한검량선을작성할수있다. 이검량선들은보정검증표준품 (VER, 표 4) 를분석함으로써각변동사항 (15.3장) 에대해검증된다. 보정검증기준 (15.3 장 ) 이하나라도충족되지않는다면재보정을해야한다 Data 저장 : MS data 는수집, 기록, 보관되어야한다 Data 수집 : 각 exact m/z 에서의 signal 은모니터링되는동안반복해서 수집되고 mass 저장장치에저장되어야한다 Response factor 와다중점 (multi-point) 보정 : 데이타시스템은 resp onse factor ( 동위원소희석법에대한 resp onse factor) 자료와다중점검량선을기록하고유지하는데사용된다. 상대표준편차 ( 변이계수 ) 의계산은보정의직선성을테스트하는데에사용된다. 초기분석능력 (9.2 장 ) 과진행중의분석능력 (15.5장 ) 에대한통계는기기의데이타시스템이나별도의컴퓨터시스템에서계산및유지된다 시료전처리 (Sam p le P rep aration) 11.1 시료전처리는시료의물리적성상을변경하여 CDDs/CDFs 가효율적으로 추출되도록하는과정이다. 일반적으로, 시료는효율적인추출이가능하도 록액상또는미세하게분쇄된고상이어야한다. 표 10 에다양한 matrix 의

47 시료추출을위한상 (phase) 과권장시료량이나와있다. CDDs/CDFs 가고농도로함유되어있다고알고있거나예상되는시료에대해서는, 전체시료에대한대표성이있는최소량의시료를사용해야한다 (17.5 장 ). 모든시료에대해서, 시료조제과정에서의오염과손실을체크하기위해 blank 와 IPR/OPR 는시료와동일한과정으로전처리한다 입자를함유한시료는 11.2 장과 11.3 장에나와있는과정을이용해 p ercent solid 와 p article siz e 를측정한다 수용성시료 : CDDs/CDFs 가부유입자에결합될수있으므로액체시 료의전처리는고체함량에따라달라진다 육안으로보이는입자가존재하지않는수용성시료는 11.4 장에따라 전처리하고, 12.1 장과 12.2 장의분액여두법또는 SPE 법을이용해 직접추출한다 육안으로보이는입자및 1% 이하의부유고형물 (suspended solid) 을함유하는수용성시료는 11.4장의방법으로전처리한다. 전처리후, 시료를 12.1 장의 SPE 법을이용해직접추출하거나 장에따라여과한다. 여과후, 입자와필터는 12.3 장의 SDS 방법으로추출하고여액은 장의분액여두법으로추출한다 % 이상의고체를함유하는수용성시료의경우, 11.5 장의고체 건조중량 10g 이나올만큼충분한양의시료를사용한다 고체시료는 11.5 장의방법으로조제한후 12.3 장의 SDS 법으로추출한다 복합상시료 : CDDs/CDFs 를함유하는상은 11.6 장의압력여과및원 심분리를이용해 non-cdd/cdf 상으로부터분리한다. 복합상시료에

48 유기물상이존재하는경우 CDDs/CDFs 는유기물상에위치하게된다 다양한시료상의분쇄, 균일화, 혼합법이 11.7 장에나와있다 생체시료 : 어류등생체시료의시료전처리방법이 장에나와있다 부유고형물의함량 (%) 측정 N ote : 여기서사용하는시료일정량은시료의고형물함량을측정하는데이용되는것이지 CDDs/CDFs 의농도를측정하는데이용되는것이아니다 수용성상이대부분을차지하는수용성액상과복합상시료 GF/D 필터 (6.5.3 장 ) 를데시케이터에서건조시키고유효숫자 3 자리 로중량을측정한다 잘혼합된시료 10.0±0.02 ml를필터로여과한다 필터를 110±5 에서약 12 시간동안건조시키고데시케이터에서 방냉한다 다음과같이고체함량을계산한다. % solid = 건조후 sample aliquot 의무게 (g)-filter 의무게 (g) 10g 주된상이수용성이아닌비수용성액상, 고상, 반고상시료와복합상 시료들 ( 생체시료는제외 )

49 시료 5~10g 을무게를잰비이커에서유효숫자 3 자리로측정한다 ±5 에서최소 12 시간동안건조시키고, 데시케이터에서방냉 한다 다음과같이고체함량을계산한다. % solid = 건조후 sample aliquot 의무게건조하기전 sample aliquot 의무게 11.3 입자의크기측정 장의건조한시료를후드나글러브박스안에서필터나알루미늄 호일위에펼쳐놓는다 시료의입자크기를측정한다. 가장큰입자의크기가 1 mm보다크면, 11.7 장에있는방법을이용해추출전에 1 mm미만으로줄인다 % 이하의부유고형물을함유하는수용성시료의전처리 육안으로보이는입자가존재하지않는시료는아래의방법에따라전처리하고 장의분액여두법또는 장의 SPE 법을이용해서직접추출한다. 육안으로보이는입자및 1% 이하의부유고형물을함유하는수용성시료는아래의방법으로전처리하고, 12.2 장의 SPE 법을이용하거나, 장의여과법을추가하여전처리한다. 여과가끝나면필터와입자를 SDS 추출 (12.3장) 하고여액은분액여두추출 (12.1 장 ) 한다. SPE 과정을거친후에는필터와 disk 를 SDS 추출한다 시료및 QC 시료의조제

50 Reference 용으로시료병에시료의높이를표시한다. 시료와시료 병의중량을 ±1g 까지잰다 희석된 LCS( 장 ) 1.0 ml를시료병에첨가한다. 병뚜껑을닫고 시료를조심스럽게흔들어섞는다. 가끔씩흔들어주면서시료가 평형에도달할때까지약 1~2 시간동안놓아둔다 시간단위로추출되는개별시료또는시료단위 ( 최대 20 개 ) 용으 로, 2 개의 1.0L reagent water 를깨끗한시료병이나플라스크에넣 는다 희석된 LCS( 장 ) 1.0 ml을두개의 reagent water aliquot 에주입 한다. 둘중의하나는 method blank 로이용한다 ml의 PAR 표준품 (7. 14 장 ) 을다른 reagent water aliquot 에주입한 다. 이 aliquot 은 OPR (15.5 장 ) 로사용한다 SPE를사용할경우, 시료에메탄올 5ml를넣고뚜껑을닫고시료가완전히섞이도록흔든다음 12.2 장에따라추출한다. SPE를사용하지않고육안으로보이는입자가없다면, 12.1장에따라추출한다. SPE를사용하지않고육안으로관찰되는입자가존재하면, 다음장에있는입자의여과방법에따라진행한다 입자의여과 Buchner funnel(6.5.5 장 ) 를깨끗한여과용플라스크위에장착한다. 플라스크에진공을걸고, 시료병속의입자가전부떠오르도록시료를흔들면서, 병속의내용물전부를 Buchner funnel에부어유리섬유필터로여과한다.

51 시료병을약 5 ml의 reagent water 로두번헹구어서남은입자를 모두필터에옮긴다 소량의 reagent water 를이용해 Buchner funnel 벽면의입자들을 헹구어낸다 빈시료병의무게를 ±1g 까지잰다. 빈시료병의무게와전체무게의 차이로시료의무게를측정한다. 나중에사용하도록병을보관한다 장의분액여두법을이용해서여액을추출한다 장의 SDS 방법을이용해서입자를포함한필터를추출한다 % 이상의고체를함유한시료의조제 잘섞어놓은시료 ( 같은 matrix type) 를깨끗한비이커나유리병에고상 건조중량 10g(11.2 장에있는고체측정을기본으로 ) 이나올정도의충 분한양의무게를잰다 희석된 LCS( 장 ) 1.0 ml를시료에첨가한다 시간단위로추출되는개별시료또는시료단위 ( 최대 20 개 ) 용으로, 알맞은 reference matrix(7.6 장 ) 를깨끗한비이커나유리병에 10g 씩 2 개의무게를잰다 희석된 LCS( 장 ) 1. 0 ml를각 ref erence matrix 에첨가한다. 한개는 method blank 로사용한다. PAR 표준품 (7.14 장 ) 1.0 ml를다른 reference matrix 에첨가하여 OPR(15.5 장 ) 로사용한다.

52 ~2 시간동안저어준후평형이되게한다 여분의물은버린다. 물을제거하려면시료를유리섬유필터로여과하고, 수용성액체는버린다 시료에 1 mm보다큰입자가있으면 ( 장에서측정 ), 후드에서시료를 깨끗한알루미늄호일위에펴놓는다. 시료가건조되면분쇄하여입자 크기를줄인다 (11.7 장 ) 장의 SDS 법으로시료와 QC aliquot 을추출한다 복합상시료 장이나 장에서측정된 percent solid 를이용해서, 시료부피를 고체중량 10g 이되도록최고 1L 까지측정한다 장의시료를 Whatman GF/D 유리섬유여과지 (6.5.3 장 ) 를이용해 압력여과한다. Blank 와 OPR 도 GF/D 를이용해압력여과한다. 필요하면 상을분리하고고체를침전시키기위해여과전시료를원심분리한다 수용액상은버린다. 비수용성액체를버리고, 고상과의혼합 ( 장 ) 을위 해시료에서여과된최대량또는 10g 을남겨둔다 시료중에 1mm보다큰입자 (11.3.2장에서측정 ) 가존재하거나건조시킬수있는시료의경우, 후드에서깨끗한알루미늄호일위에시료와 QC 용시료를펴놓는다. 건조된후또는건조할수없는시료의경우, 11.7장의방법으로입자의크기를줄이고, 12.3 장의 SDS 법으로추출한다. 시료와 QC 시료에 1mm보다큰입자가없으면, 입자를추출하고 장의 SDS 법으로바로추출한다.

53 11.7 시료분쇄, 균질화, 또는혼합 : 1mm가넘는입자를포함하는시료 ( 장 ) 는분쇄, 균질화또는혼합이필요하다. 입자를 1mm이하로줄이는방법은 matrix 에따라다르다. 일반적으로, 딱딱한입자는막자사발을이용해분쇄한다. 부드러운입자들은 Wiley mill 이나육류분쇄기에서분쇄또는균질화하거나믹서를이용한다 각 matrix 별입자크기를줄이는방법은 9.2 장의테스트를통해검증한 후에이용하도록한다 분쇄, 균질화, 또는혼합법을사용할때에는실험실주변의오염을방지 하기위해글러브박스나후드에서실시한다 분쇄 : 어떤종이와펄프, 현탁액, 그리고무정형의고체들은 Wiley mill 이나육류분쇄기에서분쇄할수있다. 시료의온도를낮추어냉동하거나드라이아이스나액체질소온도까지낮추면분쇄하기가더쉬워진다. 깨끗한분쇄기에서 장이나 장의시료를분쇄한다. 시료온도가 50 를넘지않게한다. 깨끗한분쇄기를사용해 blank 와 reference matrix 를분쇄한다 균질화또는혼합 : 효과적으로분쇄되지않는입자나분쇄후에도 1mm가넘는입자는고속으로균질화또는혼합함으로써크기를줄일수있다. 시료, blank, OPR의경우 장또는 장의방법으로입자나필터를균질화또는혼합한다 장의 SDS 법으로추출한다 어류등생체시료 : 생체시료를전처리하기전분석할조직을명확히결정 해야한다. 어류조직분석에는일반적으로껍질을벗기지않은생선, 껍 질을벗긴생선, 먹을수있는생선토막 ( 현장이나실험실에서토막낸것 ),

54 특정기관등이필요하다. 적당한조직이결정되면, 시료를균질화한다 균질화 시료는 냉동 상태로 균질화 하는 것이 좋다. 분석에 적합한 생체시 료를 얻기 위해 생선을 절단해야할 경우, 사용하지 않은 시료는 나 중에 사용할 수 있도록 깨끗한 유리병에 빨리 다시 냉동하여 저장 한다 분석에는 생체시료 10g(wet weight) 이 필요하다. 그러므로 적어도 생체시료 20g 을 균질화해서, 만약 재분석이 필요할 경우 나머지 균 질화한 시료를 재추출할 수 있게 한다. 어류 전체를 분석할 경우 통째로 균질화 한다 시료는균질화기 (6.3.3 장 ) 를이용하거나육류분쇄기 (6.3.4 장 ) 로분쇄한 다. 너무커서분쇄기에맞지않는시료는작게자른다. 완벽하게균 질화하기위해 3 번분쇄한다 균질화된 생체시료 약 10g(wet weight) 을 무게를 잰 깨끗한 400~ 500 ml 비이커에 옮긴다. HCl 분해 / 추출을 위해, 무게를 아는 깨끗한 500~600 ml 입구가 넓은병에 시료를 옮긴다. 10mg 정도까지 무게를 기록한다 균질화된시료의남은것은 fluoropolymer-lined 마개가있는깨끗한 병에옮긴다. 병을닫고생체시료를 -10 이하로보관한다. 균질화 하지않은시료는원래의용기에넣어서 -10 이하로보관한다 QC aliquots

55 약 10g의유성액상 reference matrix(7.6.4 장 ) 를 400~500ml비이커에넣어서 method blank 를만든다. HCl 분해 / 추출을위해서, reference matrix 를 500~600 ml입구가넓은병에옮긴다. 10mg정도까지무게를기록한다 추출방법에따라, 약 10g의유성액상 reference matrix(7.6.4장 ) 를 400~500 ml비이커또는입구가넓은병에넣어서정밀도와회수율측정을위한시료를마련한다. 10mg정도까지무게를기록한다. 초기정밀도및회수율테스트를실시할경우, 네개의시료를사용한다. 진행중에정밀도및회수율테스트를실시할경우, 한개의시료를사용한다 표준품첨가 LCS( 장 ) 1.0 ml를시료, blank, OPR 시료에첨가한다 PAR 표준품 (7.14 장 ) 1.0 ml를 OPR 시료에첨가한다 장에따라시료를추출한다 추출과농축 (E xtraction and concentration) 추출방법에는분액여두법 (12.1장) 과수용성액체를위한고상추출법 (12.2장) ; 고체, 필터, SPE disk 용 Soxhlet/Dean-Stark 법 (12.3 장 ) ; 생체시료용 Soxhlet 추출법 ( 장 ) 과 HCl 분해법 (14. 2장 ) 등이있다. 산 / 염기역추출 (1 2. 5장 ) 은추출물의최초정제에사용된다. 대량농축과정은회전증발 (12.6.1장), heating mantle( 장 ) 그리고 Kuderna- Danish(K-D) 증발과정 (12.6.3장) 등이포함된다. 소량농축에는질소를불어넣어농축하는방법 (1 2.7 장 ) 을이용한다.

56 12.1 여액및육안으로보이는입자가없는수용성시료의분액여두추출법 표준품을첨가한시료 ( 장 ) 또는여액 ( 장 ) 을 2L 분액여두에 붓는다. 병이나플라스크를 reagent water 5 ml로헹구어분액여두에 옮긴다 메틸렌클로라이드 60ml를빈시료병 (12.1.1장) 에넣고, 잘닫은다음 60 초동안흔들어서내부를헹군다. 용매를분액여두에옮기고, 주기적으로내부의기체를빼내면서 2분동안흔들어추출한다. 유기층과수용액상이분리되도록최소 10분간방치한다. 에멀전이형성되어용매층의 3분의 1이상을차지하면, 완벽한층분리 ( 아래의 Note 를볼것 ) 를위해기계적방법을쓴다. 용매로헹군유리깔때기를통해메틸렌클로라이드추출물을용매로헹군농축장치 (12.6장) 에옮기는데이때깔때기에는깨끗한유리섬유필터를깔고약절반을과립형무수황산나트륨 (7.2.1장) 으로채운다. N ote : 에멀전이형성되면, 분석자는완벽한층분리를위해기계적방법을써야한다. 시료에따라최적의방법이다르지만, glass wool 여과, 층분리 pap er 사용, 원심분리, 얼음이들어있는 ultrasonic bath 사용, NaCl 첨가등의물리적방법을쓸수있다. 에멀전형성을억제하기위해고상추출등다른기법을사용할수도있다. 9장에있는조건을충족시키기만한다면다른방법을사용해도무관하다. 유기물용존함량이높은 ( 예, 제지공장배출수 ) 수용성시료전처리경험으로추출전시료를산성화함으로써에멀전형성을줄일수있었다. 제지산업에서사용하는방법은배출수시료 1L에최대 400 ml의에탄올을첨가하여에멀전의형성을줄이는것이다. 그러나, EPA의연구에따르면그효과가시료희석의결과일수도있으므로 reagent

57 water 의첨가도같은작용을할수있음을보여준다. 층분리완료를위해서는여전히기계적방법이필요하다. 산성화나에탄올첨가의경우, 동일한방법을사용하는 9.2장의처음시작방법을실행해보아야한다 물시료를메틸렌클로라이드 60ml로두번더추출한다. 황산나트륨을통과시켜농축기에받는다. 세번째추출후에, 분액여두를메틸렌클로라이드 20 ml이상으로헹구고, 헹군액을황산나트륨을통과시켜농축기에받는다. 이헹굼작업을두번이상반복한다. 이추출물을입자추출물과혼합하려면, 황산나트륨이든깔때기를보관한다 장에있는대규모농축방법중하나를이용해추출물을농축한다 육안으로보이는입자가있는시료추출물 ( 장 ) 의경우, 헥산 으로농축된추출물의최종부피를약 10 ml로맞추고, 250 ml분액 여두에옮긴후, 12.5 장의방법으로역추출한다 수용성여액추출물 ( 장 ) 의경우, 입자의 SDS 추출물 ( 장 ) 을첨가하기위해농축기기를보관한다 % 이하의고체 ( 참고문헌 19~20) 를함유하는시료의 SPE Disk preparation SPE 디스크를필터홀더 ( 그림 4) 의바닥에놓고, 톨루엔으로적신다. GMF 150 필터를핀셋으로 SPE 디스크위에서들고톨루엔으로적신다음, 필터와 disk 사이에공기가들어가지않게하면서필터를 SPE 디스크위에올려놓는다. 필터와 SPE 디스크를 1L 유리 reservoir 와진공여과플라스크사이에놓고클램프로집는다.

58 여과플라스크의옆면을 squeeze bottle이나 syringe를사용해톨루엔 15ml로헹군다. Drip tip 에용매가몇방울나타날때까지일시적으로진공을걸어준다. 진공을해제하고필터 / 디스크를약 1분간적신다. 다시진공을걸어톨루엔전부를필터 / 디스크를통과시킨다. 아세톤약 15ml로세척과정을반복하고, 필터 / 디스크를공기중에서건조시킨다 메탄올약 15 ml에필터 / 디스크가약 1분간다시적신다. 진공을걸어메탄올을필터 / 디스크에통과시키는데이때메탄올을약 1mm높이로필터위에남게한다. 이시점부터는추출이끝날때까지디스크가마르지않게한다 Reservoir 에 reagent water 50 ml를두번붓고필터 / 디스크를헹구며 이때필터의표면에물층을남긴다 추출 LCS 첨가 시료 ( 장), blank( 장 ) 또는 IPR/OPR 시료 ( 장 ) 를 reservior 에 붓고 진공을 걸어 추출을 시작한다. 추출 을 10분 내에 완료하기 위해 진공을 맞추어준다. 고농도의 입자 ( 부 유성 고체 ) 를 포함하는 시료의 경우, 여과 시간이 8시간 이상 걸릴 수도 있다 모든시료를필터 / 디스크를통과시키기전에, 시료병을약 50ml reagent water 로헹구어고체를모두제거하고, reservior 에붓는다. 필터 / 디스크를통과시킨다. 고체가보이지않을때까지 reagent water 로헹군다 시료와헹군액을필터 / 디스크를통과시키기전에, reservior 의옆면을

59 소량의 reagent water 로헹군다 필터 / 디스크를건조시킨다음, 필터와디스크를제거해서유리 Petri dish 에올려놓는다 장에따라필터와디스크를추출한다 입자를함유하는시료, 필터및디스크의 SDS 추출 깨끗한추출용 thimble( 장 ) 에 1 00/200 mesh 실리카 ( 장 ) 5. 0g 과 그위에석영모래 (7.3.2 장 ) g 을채운다. N ote : 추출이진행되는과정중에는실리카층을섞지말것 Thimble 을깨끗한추출장치에놓는다. 톨루엔 30~40 ml를 receiver 에, 200~250 ml를플라스크에넣는다 톨루엔이끓을때까지플라스크를가열해서초자를미리추출한다. 응 축기의 tip 에서 receiver 로초당 1~2 방울의톨루엔이떨어지도록적절 히조절한다. 기구를최소 3 시간동안추출한다 예비추출한기구를방냉시켜분해한다. Thimble 을톨루엔으로헹구어서 공기중에서말린다 장, 장, 장, 장, 장, 장의수분이있는시료, 필터및디스크와 장의비수용성액체를 thimble 에넣고, 덩어리가큰것들은조심스럽게부수면서, 깨끗한금속스패츌러를이용해모래층과섞는다 미리추출해놓은 SDS 기구를다시조립하고, receiver 와환류플라스

60 크에톨루엔을새로채워넣는다. Heating mantle 에전원을넣고환류를시작한다. 수분제거로톨루엔유속이받는제한이줄어들때까지, 환류속도를용매가모래및실리카층을통하여스며드는 (percolation) 속도와맞도록조절한다. 추출시작처음 2시간동안은거품이생기는지자주점검한다. 거품이생기면가라앉을때까지환류속도를줄인다 Receiv er 에물이차면, 1 ~ 2 시간과 8~ 9 시간사이또는이보다빨리 물을빼낸다. 시료를총 16~24 시간동안환류한다. 기구를방냉하여 분해한다. 모인물의총부피를기록한다 증류플라스크를떼어낸다. Dean-Stark receiver 에서물을빼내고추 출물이담긴플라스크에 receiver 에있는톨루엔을더한다 장의대규모농축방법중하나를이용하여다음과같이추출물을 농축한다 % 이하의고체 ( 장 ) 를함유하는수용성시료입자의추출물 장또는 장의회전식증발농축기나 heating mantle 을 이용해서추출물을약 5 ml까지농축한다 황산나트륨 ( 장 ) 을통과한추출물을보관해둔 ( 장 ) 기구 에전부옮기고톨루엔높이까지다시농축한다 헥산으로약 10 ml로맞추어 250 ml분액여두에옮긴다음역추출 (12.5 장 ) 로진행한다 입자 (11.5 장 ~11.6 장 ) 또는 SPE 필터및디스크추출물 : 장 또는 장의회전식증발농축기나 heating mantle 을이용해서

61 약 10 ml까지농축하고, 250 ml분액여두로옮긴다음역추출 (12.5 장 ) 로진행한다 생체시료의추출 : 생체시료추출에는 2 가지방법이있다 Soxhlet 추출 ( 참고문헌 21) 분말형무수황산나트륨을 30~40g 을각비이커 ( 장 ) 에넣고 잘섞는다. 비이커를알루미늄호일로덮고 12~24 시간동안평형이 되게한다. 응집되지않도록추출전에다시섞어준다 Soxhlet 기구를조립하고, 장~12.3.4장과동일한방법으로예비추출한다. 단, 예비추출과헹굼을위해메틸렌클로라이드 : 헥산 (1:1) 을사용하는것과석영모래를사용하는것은제외하며, 원한다면 Dean-Stark 수분트랩도생략해도된다 예비추출된 Soxhlet 기구를재조립하고메틸렌클로라이드 : 헥산을 환류플라스크에새로채워넣는다 시료 / 황산나트륨혼합물 ( 장 ) 을 Soxhlet thimble 에옮기고, thimble 을 Soxhlet 에넣는다 혼합용매로비이커를여러번헹궈 thimble 에넣는다. Thimble/ receiv er 를용매로채운다. 1 8~ 24 시간동안추출한다 추출후, 기구를방냉하고분해한다 추출물을대규모농축장치 (12.6 장 ) 에모두옮기고, 건조될때까지 농축한다. 다시사용하기위해보관한다.

62 질소를불어넣어농축하는 (blowdown) 방법 (12.7장) 과온도 60 의수욕조를사용해용매를농축한다. Receiver 의중량을재서기록한다음, blowdown 기구에 receiver 를다시장착하고항량에도달할때까지잔류물을농축한다 Percent lipid 측정 : 지방함량측정은 EPA 의 National Dioxin Study ( 참고문헌 22) 와동일한용매 ( 메틸렌클로라이드 : 헥산 ) 를이용한생 체시료추출법을이용해지방함량이그연구와일치하도록한다 Receiver 에있는잔류물을헥산으로다시용해시키고 CSS(7.11 장 ) 1.0 ml를첨가한다 비등석을농축기구에담은채로, 잔류물 / 헥산을 anthropogenic isolation colum n( 장 ) 이나산성실리카겔정제 ( 장 ) 용병에옮긴다. 완전히옮기기위해몇번헹구어낸다. 필요하다면모든물질이다시녹았음을확실히하기위해 receiver를초음파세척하거나약하게가열한다. Receiver 를건조시킨다. Receiver 와비등석의중량을잰다 다음과같이유효숫자세자리에가장근접하게지방함량을계산 한다. 지방함량 (%) = 잔류물의무게 (g) 생체시료의무게 (g) Blank, IPR 또는 OPR 시료의지방함량은측정하지않는다 HCl 분해 / 추출과농축 ( 참고문헌 23~26)

63 시료와 QC 시료 ( 장 ) 에 6N HCl 200 ml와메틸렌클로라이드 : 헥 산 (1:1) 200 ml를넣는다 각병을막고 1~3 번정도흔든다. 후드에서뚜껑을약간열어압 력을뺀다. 병을 10~30 초동안흔든후발생된기체를제거한다 뚜껑을잘닫고교반기위에놓는다. 교반기동작과속도를맞춰서산, 용매, 생체시료가일정한움직임을갖게한다. 그러나, 병이교반기에서떨어질정도의과격한동작은피한다. 12~ 24 시간동안흔들어준다 분해후에, 병을교반기에서빼낸다. 병을가만히세워용매와산 층이분리되도록한다 용매를, 약 10g의입상무수황산나트륨 (7.2.1장) 을담은유리섬유필터 (6.5.2 장~6.5.3 장 ) 를댄깔때기에통과시켜대규모농축기 (12.6 장 ) 에옮긴다. 병을헥산 25 ml로헹구고황산나트륨을통과시켜농축기에옮긴다 장의대규모농축법을사용해서용매가거의건조될때까지농축 한다 질소 blowdown 기구 (12.7장) 와 60 의 수욕조를 이용해 용매를 완전히 제거한다. Receiver 의 중량을 재서 기록하고 receiver 를 blowdown 기구에 다시 장착하여 항량에 도달할 때까지 잔류물을 농축한다 Percent lipid 측정 : 지방함량측정은 EPA 의 National Dioxin Study ( 참고문헌 22) 와동일한용매 ( 메틸렌클로라이드 : 헥산 ) 를이

64 용한생체시료추출법을이용해지방함량이그연구와일치하도록 한다 Receiver 의잔류물을헥산으로다시용해하고, CSS (7.11 장 ) 1.0 ml를 용액에첨가한다 Receive에비등석이들어있는상태로잔류물 / 헥산을입구가좁은 ~200 ml병에옮긴다. 최대 70 ml의헥산으로여러번헹궈서모든물질을완전히옮긴다. Receiver 를건조시킨다. Receiver 와비등석의중량을잰다 장에따라 percent lipid 를계산한다. Blank, IPR 또는 OPR 시료는지방함량을측정할필요가없다 장에따라추출물을정제한다 염기와산을이용한역추출 CSS (7.11 장 ) 1.0 ml를 장, 장, 또는 장의시료와 QC 추출물이들어있는분액여두에첨가한다 수산화칼륨용액 (7.1.1 장 ) 50 ml로추출물을층분리시킨다. 분액여두안에발생된기체를후드안에서주기적으로빼내면서 2분간흔든다. 수층를분리하여버린다. 수층의색이없어질때까지최대 4번의염기세척을반복한다. 추출물과염기의접촉시간을최소화해서 CDD/CDF 의분해를방지한다. 동위원소표지화합물의회수에대한스펙들을충족시키고, 9.2장의방법을이용하여수용할만한분석성능을증명한다면, 더강한수산화칼륨용액을역추출에이용해도된다.

65 염기와같은방법으로염화나트륨용액 (7.1.4 장 ) 50 ml에대해추출물 을층분리한다. 수층은버린다 염기와같은방법으로추출물을황산 ( 장 ) 50 ml에대해층분리한다. 수층에색이없어질때까지최대 4 번반복해서산세척을한다 염화나트륨용액으로층분리를반복하고수층은버린다 추출물을 7~10cm 의과립형무수황산나트륨 (7.2.1장) 이담긴 drying column을통과시킨다. 용매 30~50 ml로분액여두를헹구고, drying column 을통과시킨다. 각추출물을둥근바닥플라스크에모은다. 시료와 QC 시료를 12.6 장~12.7 장에따라다시농축하고 13 장에따라정제한다 대규모농축 : 톨루엔추출물을회전식증발농축기나 heating mantle 을이 용해농축한다. 메틸렌클로라이드나헥산추출물은회전식증발농축기, heating m antle, 또는 Kuderna-Danish ap p aratus 를이용해농축한다 회전식증발농축기 : 추출물을둥근바닥플라스크에넣어농축한다 회전식 증발농축기를 제조사의 설명서에 따라 조립하고 수욕조를 45 로 맞춘다. 매일 깨끗한 추출용 용매 ml를 농축해서 회전 증발기를 미리 씻어놓는다. 필요하다면 오염여부 점검을 위해 농 축된 용매와 catch 플라스크에 있는 용매를 모두 보관한다. 시료와 시료 사이에 용매 2~3ml로 feed tube를 헹궈서 폐용매 용기에 버 린다 시료추출물이든둥근바닥플라스크를회전증발기에부착한다. 서서히시스템에진공을걸고, 시료플라스크를회전시키기시작 한다.

66 플라스크를수욕조로내리고, 15~20 분내에농축을완료할수있도록회전속도와온도를조절한다. 적정농축속도에서는 receiving 플라스크로흐르는용매의속도는일정하지만, 추출물이눈에보일정도로끓지는않을것이다. N ote : 농축속도가너무빠르면분석물질이손실될수있다 농축플라스크속액체의양이약 2ml정도가될때, 수욕조에서플라스크를빼고회전을멈춘다. 천천히조심스럽게 system 에공기를넣는다. 밸브를너무빨리열어서시료가플라스크밖으로넘치지않도록한다. Feed tube 를용매약 2ml로헹군다 역추출또는대규모농축과용매치환을하려면 장을진행한다 Heating mantle : 추출물을둥근바닥플라스크에서농축한다 깨끗한비등석한두개를둥근바닥플라스크에넣고, three-ball m acro Snyder column 을연결한다. 컬럼위에서부터용매 1ml정도를가하여컬럼을미리적신다. 둥근바닥플라스크를 heating mantle 에올리고, 15~20 분동안가열하여농축을완료한다. 적정증류속도가되면컬럼의 ball 이활발하게부딪히지만, chamber 가넘치지는않을것이다 액량이약 10 ml가되면, 둥근바닥플라스크를 heating mantle 에서 내려용매를옮긴후약 10 분간방냉한다. Snyder 컬럼을떼어내 고소량의용매로유리이음부를헹구어 receiver 에담는다 역추출또는대규모농축및용매치환을하려면 장를진행한다.