<BEC8C0FCBCBABEE0B8AEBDC3C7E8C7D8BCB3BCAD28A5B5292DBCF6C1A4332E687770>

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1 발간사 의약품의치료효과와무관하게나타나는약물의부작용과다른장기에나타날수있는잠재적인약력학효과들을조사하기위한안전성약리시험은의약품의개발또는인허가시에수행되는시험이며, 국제적으로 ICH 가이드라인 S7A, S7B의내용이통용되고있습니다. 또한, 식품의약품안전처에서는 2013년 10월 의약품등의약리시험기준 고시개정을통해안전성약리시험에대한시험기준과방법에관한국제기준을도입을명문화하고품목허가신청또는임상시험계획승인신청시시험결과를제출받아심사하고있습니다. 그동안식품의약품안전평가원에서는안전성약리시험에대하여 ICH 가이드라인 S7A, S7B의해설서, 필수안전성약리시험인중추신경계, 호흡기계, 심혈관계에대한해설서및면역계등에대한추가시험법해설서를발간하였습니다. 안전성약리추가시험은필수안전성약리시험또는반복투여독성시험에서평가하지않은타기관계의기능에대해약물부작용등염려의소지가있는경우, 잠재적으로유해한약력학적영향을평가하기위한시험으로이번에발간되는해설서에는자율신경계, 내분비계, 근골격계에대하여안전성약리추가시험에대한시험방법, 약물등에관한내용을담았습니다. 앞으로발간된안전성약리시험에대한해설서가안전성약리시험을수행하는시험자, 제약회사관계자및인허가담당자들에게많이활용되어, 국내신약개발인프라확충에도움이되기를바랍니다. 식품의약품안전평가원장왕진호

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3 Contents 제1장자율신경계 1 제1절자율신경계안전성약리시험 3 제2절자율신경계안전성약리추가시험 10 제3절자율신경계에영향을주는약물및사례 34 제4절참고문헌 44 제2장내분비계 47 제1절내분비계안전성약리시험 49 제2절내분비계안전성약리추가시험 78 제3절내분비계에영향을주는약물및사례 84 제4절참고문헌 89 제3장근골격계 93 제1절근골격계안전성약리시험 95 제2절근골격계안전성약리추가시험 98 제3절근골격계에영향을주는약물및사례 108 제4절참고문헌 114

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5 제 1 장 자율신경계 제1절자율신경계안전성약리시험 3 제2절자율신경계안전성약리추가시험 10 제3절자율신경계에영향을주는약물및사례조사 34 제4절참고문헌 44

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7 제 1 장 자율신경계 Chapter 01 자율신경계 제 1 절 자율신경계안전성약리시험 < 그림 1-1> 자율신경계 (Autonomic Nervous System) 의작용부위. (Brad Huber's Anthropology 342:Human Behavior and Evolution) 3

8 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 자율신경계는소화, 순환, 체온조절, 생식, 호흡등생명유지에필수불가결한기능을지배하는신경계이며주된지배장기는내장의평활근, 심근및각종분비선으로구성되어있다. 자율신경계는교감신경과부교감신경으로나눌수있으며체내여러기관은두신경의조화로운지배를받아원활한기능을하고있다.( 그림1-1) 기능적으로는한쪽이촉진적이면다른쪽은억제적으로작용하므로길항적이중지배를받고있다고할수있다. 각반응에대하여두신경계의기능중어느것이우위에있느냐에따라지배기관의기능을조절하게된다. 교감신경절후섬유에서유리하는신경자극전달물질은노르에피네프린으로아드레날린성신경이라부르며부교감신경절후섬유는교감신경절과마찬가지로아세틸콜린이신경자극전달물질로서콜린성신경이라고한다. 자극에의해신경말단으로부터유리되는각각의전달물질과특이적으로상호작용을하는특정한분자가세포표면에있으며이것을수용체라한다. 즉아드레날린수용체및아세틸콜린수용체와의상호작용에의해여러현상이유발된다. 오늘날수용체에관한연구가발전되어이들교감신경효과를특이적으로억제하는길항약이발견되었으며, 노르아드레날린성수용체에는각각의길항약에선택적으로결합하는알파수용체및베타수용체가있으며각각의아류형수용체또한존재함이밝혀졌다. 부교감신경효과도무스카린성아세틸콜린수용체와니코틴아세틸콜린수용체에의한작용으로구별된다. 무스카린성아세틸콜린수용체및니코틴성아세틸콜린수용체또한각각에대하여아류형수용체들이밝혀지고있다. 자율신경계시험은주로맥박, 혈압, 위장관기능및땀분비등으로체크할수있으며, 다양한이상증상이나타날때주로발견되는증상으로는아래의표와같은것들이있다.( 표1-1) 다소의환자에서는아래현상들이가끔씩간헐적으로조금씩나타날경우가있으나어떤환자의경우에는빈도가높게심하게나타날경우도있다.( 표1-2) 4

9 제 1 장 자율신경계 < 표 1-1> 자율신경이상증의증상 자율신경이상증 (Dysautonomia) 의증상 - 빈맥 (Tachycardia) - 서맥 (Bradycardia) - 심계항진 (Palpitation) - 심각한 혈압 강하 (Dangerously low blood pressure) - 기립성 조절장애 (Orthostatic intolerance) - 피로 (Fatigue), 운동불내성 (Exercise intolerance) - 어지럼증 (Dizziness), 졸도 (Fainting) - 위장관 장애 (Gastrointestinal problems) - 콧물 (Nausea) - 불면증 (Insomnia) - 짧은 호흡 (Shortness of breath) - 불안 (Anxiety) - 경련 (Convulsions) - 인지 기능장애 (Cognitive impairment) - 편두통 (Migraines) - 무뇨 또는 빈뇨 (Bladder urgency of frequency) - 복강 출혈 및 천공 (Visual blurring or tunneling) - 음식 섭취 후 복부 팽창 또는 경련 (Bloating or cramping after meals) - 피부색 변화 (Skin color changes) - 비정상적 발한 (Abnormal sweating) < 표 1-2> 자율신경이상증의증상빈도 Symptom Fr equency 기립성저혈압 (Postural hypotension) 94% 어지럼증 (Lightheadedness), 졸도 (Fainting), 시야협소 (Dimness of vision), 허약 (Weakness), 불안정한걸음걸이 (Unsteady gait), 운동성실신 (Exercise syncope) 비뇨기계기능장애 (Urinary dysfunction) 65% 야뇨 (Nocturia), 무뇨 (Urgency), 스트레스성요실금 (Stress incontinence) 성기능장애 (Sexual dysfunction) 51% 발기부전 (Impotence), 성욕상실 (Loss of libido), 역행성사정 (Retrograde ejaculation) 장관기능장애 (Bowel dysfunction) 30% 출혈성설사 (Intermittent diarrhea), 야행성설사 (Nocturnal diarrhea) 땀분비감소 (Decreased sweating) 11% 5

10 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 위와같이임상적으로자율신경의기능이상이오면자율신경이상증 (Dysautonomia) 이발생하고이러한자율신경이상증의임상적증거 (Clinical evidence of dysautonomia) 들이많은부분에서발견되었고또한연구되고있다.( 표1-3) 자율신경계는교감신경계와부교감신경계로나누어지며자율신경이상증에부교감신경계가간혹관련이있기는하나교감신경계비정상적기능이더많이관련되어있다. 기립성저혈압은종종자율신경이상증에대한동의어로사용되기도하나이것은가장극단적인증상이며, 대부분의환자에서발생하지만자율신경이상증의모든면을설명하지는못한다. 자율신경계기능장애는단순하나의질병과정이아니다. 자율신경이상증은여러다른퇴행성신경질환의부분으로신경이손상된일차적자율신경이상증, 비신경계질환과관련있는이차적자율신경이상증및약물부작용으로나타날수있는자율신경이상증으로분류하여나타낼수있다. 6

11 제 1 장 자율신경계 < 표 1-3> 자율신경이상증의원인에따른분류 원발성 (Pr imar y) - 가족성자율신경이상증 (Famil ial dysautonomia, r il ey-day syndr ome) - 특발성기립성저혈압 (Idiopathic orthostatic hypotension, progressive autonomic f ail ure) - 다장기위축증 (Multiple system atrophy with autonomic failure, shy drager syndrome) - 파킨슨병과동반한자율신경계이상 (Parkinson's syndrome with autonomic failure) 이차성 (Secondar y) - 아밀로이드증 (Amyloidosis) - 면역계 신경병증 (Autoimmune neuropathies) 길랑-바레 증후군 (Guillain Barré syndrome) 중증근무력증 (Myasthenia gravis) 류마티스양 관절염 (Rheumatoid arthritis) - 암성 자율신경병증 (Carcinomatous autonomic neuropathy) - 중추신경계 질환 (Central nervous system diseases) 시상하부 병변 (Hypothalamic lesions) 후두와 종양 (Posterior fossa tumors) 척수공동증 (Syringomyelia) 제 3기 매독으로 인한 척수로 (Tertiary syphilis tabes dorsalis) 베르니케 증후군 (Wernicke's syndrome) - 당뇨 (Diabetes mellitus) - 대사성 질환 (Metabolic diseases) 파브리병 (Fabry's disease) 포르피린증 (Pernicious anemia) 탄제르병 (Tangier disease) - 약물로 인한 경우 알콜 (Alcohol) 항우울제 (Antidepressants)i 혈압 강하제 (Hypertensive drug) 항정신병제 (Antipsychotic drug) 자율신경계는신체의모든조직과기관에신경분포되어있다. 대부분의기능은의식의정상영역밖에있으며교감신경과부교감신경의균형을통하여생리기능을조절하기위하여빠르게반응한다. 자율신경이상증이나타나면이기능은비정상적으로더이상제기능을발휘할수없으며심할경우생명에위협을줄정도로긴급상황이발생된다. 이러한빠른반사신경은혈압등과같이순간조절을위하여신속한대응기전으로작용한다. 7

12 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 또한자율신경부전증의일차적신경병변의증상들은매우조심스럽게평가되어야하고각각분리되어평가되어야하며, 일차적자율신경이상증은다음과같은세세하게분리된진단방법으로진단되어야한다.( 표1-4) < 표 1-4> 주요일차적자율신경이상증의분별진단 점진적자율신경장애 (Pr ogr essive autonomic f ail ur e ) - 느린 진행 (Slowly progressive) - 자율신경이상증이먼저, 그리고 우세하게 나타남 (Dysautonomic symptoms occur early and predominate) - 증상의조절이비교적 쉬움 (Symptom control is relatively easy) - 치매를 동반하지 않음 (No dementia) 다장기위축 (Mul tipl e system atr ophy) - 보다빠른진행 (More rapidly progressive) - 파킨슨병증상과자율신경이상증이초기에같이나타남 (Parkinson's and dysautonomic symptoms both present early) - 진행되면감각계, 수의운동계의증상이나타남 (Sensory or voluntary motor system symptoms may devel op) - 다양한증상에약물의모순되는효과가나타나대증적약물치료가어려움 (Difficult to manage because of conflicting effects of drugs on different aspects of illness) - 치매를동반하지않음 (No dementia) 파킨슨병 (Par kinson' s syndr ome ) - 느린진행 (Slowly progressive) - 자율신경증상이후기에발생하며정향반사장애가동반됨 (Dysautonomic symptoms occur late, righting reflex problems may be confusing) - 후기에치매발생 (Dementia a common late manifestation) 이차적으로오는자율신경이상증의경우진성당뇨병처럼질병의초기진행단계에서자율신경이상증상을나타낸것이며내장기능에대한자율신경이상증의효과라고할수있다. 기립성저혈압과체위성실신의발생은약물의주된부작용이며이러한부작용은환자의내성능력이떨어져환자를위험에빠뜨릴수있으므로적절한치료처방의사용을어렵게만든다. 8

13 제 1 장 자율신경계 체위성실신을일으키는약물들은많으며또한다양하다.( 표1-5) 다소의약물들은자율신경계를통하여그효과를나타내지만다른약물들은자율신경기능을손상시켜이러한부작용를초래한다. 이러한약물들의공통점은자율신경억제또는부피고갈을통한체위성증상을유발하여심장박출량및심장전부하를감소시킨다. Hydralazine 및 minoxidil과같이말초혈관저항을감소시키는약물들은기립성저혈압을발생시키지않는다. 다른이차적자율신경이상증의경우는상대적으로드물게나타난다. < 표1-5> 자율신경이상증기립성저혈압을일으키는약물들 Alcohol Guanethedine Pronestyl Alpha-methyldopa Isoniazid Quinidine Barbiturates l-dopa Tricyclics Bethanidine MAO inhibitors Trimethaphan Clonidine Mecamylamine Reserpine Dibenzyl ine Phenothiazines Vincristine Guanabenz Phentolamine Guanadryl Prazocin 개발되었거나개발중인많은약물에있어서의도적이든의도적이지않든간에자율신경계에대하여많은작용이나타나고있으며개발약물의부작용을줄이려면이러한효과를보다체계적으로살펴보아야만한다. 약물의자율신경계에대한영향은주로다음과같은항목을평가하여자율신경계관련약물의부작용을예측할수있을것이다. - 자율신경계관련수용체결합시험 - in vivo 및 in vitro 효능약및길항약에대한기능적반응 - 자율신경계의직접자극및심혈반응측정 - 압반사테스트 - 심박동수변이 9

14 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 제 2 절 자율신경계안전성약리추가시험 1. 자율신경계관련수용체결합시험자율신경계의수용체는크게아드레날린성수용체및아세틸콜린성수용체의두가지로분류된다. 이중아드레날린성수용체는주로교감신경계와연관이있으며무스카린성아세틸콜린수용체는주로부교감신경계와연관이있다. 각각의수용체에대한미세분류및관계된이차전달계는아래의표와같다.( 표2-1) < 표2-1> 자율신경계관련수용체 Famil y Receptor Coupl ing α1a Gq/11 α1b Gq/11 α1d Gq/11 α2a Gi/o Adrenergic α2b Gi/o α2c Gi/o β1 Gs β2 Gs β3 Gs, Gi/o M1 Gq/11 M2 Gi/o Muscarinic M3 Gq/11 M4 Gi/o M5 Gq/11 10

15 제 1 장 자율신경계 1.1 관련수용체결합스크리닝시험먼저일반적으로많이사용되는부분은다양한수용체에대하여관련성여부를살피는과정으로써 off-target 프로파일을스크리닝하는방법이다. 일정한농도로약물을처리하고관련이의심되는수용체결합시험을진행하여각수용체에대해관련여부, 즉약물이각수용체를활성화시키는지억제시키는지의여부를연구하는것이다. 일반적으로다양한연구기관에서수용체결합시험에대하여다양한프로그램을제공하고있다. 하나의예를들어자세히살펴보면아래와같다. <PROGRAME - 기질물질들의프로파일 > 부작용데이터베이스를통하여약물정보프로그램이구축되었으며이를전제로하여프로파일툴박스을제공하여준다. 이프로그램은약물의작용및부작용의중요매개물질에대하여 in vitro 시험내에서잘규명되어있으며이미시장에나온약물및참조약물과같은기질의물질로구성되어있다. 각각의물질에대한프로파일자료를제공하며또한그외의다양한물질에대한프로파일도제공받을수있다. 시험방법및해석은다음과같다. 1 주로관련이의심되는수용체를선택하여수용체의반응액을준비한다. 2 수용체결합시험을진행하고자하는물질을약 10 μm 정도의농도로고정하고복수로시험을진행한다. 3 위농도에서특정수용체에대하여약 30% 보다큰억제결과가보이면그수용체에대하여세가지농도를추가설정하여복수로추가시험을진행한다. 4 한농도및세가지농도의수용체결합스크리닝시험을통하여얻은결과 75% 보다큰억제결과를보이면 IC 50 /K i 값을구하기위하여아홉가지의농도까지확대하여시험을더진행하며이시험을통하여해당물질에대한해당수용체결합시험의세밀한정보를얻는다. 11

16 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 1.2 수용체세부결합시험수용체-리간드반응을분석하는데에는필터 (Filtration) 분석시험및신틸레이션근접분석시험 (Scintillation proximity assay, SPA) 의전형적인두가지방법이있다. 두방법모두방사성으로표지된리간드 (Radio-labeled ligands) 를사용한다. 방사성표지를사용하지않는수용체결합시험은현재그가능성이꾸준히연구되고있다. SPA 비드를사용하는 SPA 분석에대한대략적인방법은아래와같다.( 그림2-1) 1 방사성표지리간드, 표적수용체, SPA 비드및시험하고자하는물질을농도별로반응용기플레이트에넣고적정시간반응시킨다. 2 마이크로플레이트신틸레이션카운터를이용하여반응물을측정한다. 3 Total binding, nonspecific binding의차이를이용하여분석한다. 4 포화결합시험, scatchard plot 및동종, 이종경쟁시험등을통하여수용체결합파라미터 (K d, K i, IC 50 등 ) 를구한다. < 그림 2-1> SPA 형태를위한분석법개발단계모식도 12

17 제 1 장 자율신경계 1) 신틸레이션근접분석시험의개념 SPA 시험법은결합과비결합방사성표지리간드를분리할필요가없다. 따라서스크리닝적용법에따라수정이가능하다. 아래는 125 I 방사선표지리간드를사용한표준수용체결합 SPA의도식이다.( 그림2-2) < 그림 2-2> 표준수용체결합 SPA 도식 다음은 SPA 분석포맷에서 SPA 비드종류, 사용플레이트종류등을선택하는방법을설명한것이다. NSB(Non-specific binding) 의최소화조건뿐만아니라온도, 완충용액, 배양시간및비드함량등각각의항목에대한최적의조건을잡아실험하는것이좋다. 하나의일례를들어보면아래와같이각조건 ( 배양시간및비드함량을기준으로설명하고있다.) 에따라최적의조건을하나하나찾아나가야된다. 먼저배양시간의경우를살펴보면, 셋업조건및결과분석방법은아래와같다. 1 Setup:Total binding(receptor + radioligand + SPA beads) 및 nonspecific binding(receptor + radioligand + excess unlabeled competitor + SPA beads) 을마이크로플레이트신틸레이션카운터에서반복적으로측정하여여러시간에따라측정한다. 2 Results Analysis:Total, NSB 및 specific binding(total binding - NSB) 을시간에따라그려본다. 평형상태 (Steady state) 의경우, 저농도의방사성리간드에서는도달하는데긴시간이소요되기때문에신호강도가허락하는한방사성리간 13

18 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 드의농도를 K d 보다낮은농도에서실시한다. 리간드파괴를막기위하여방사성리간드결합의총농도는가해준농도의 10% 미만이되게하여야한다. 이조건에맞지않으면수용체의농도를낮추어야만한다. 또한, 안정된신호및안정된신호가어느정도유지되는지를파악해야한다. 신호는수용체 / 리간드와비드의셋팅조건의조합으로이루어진다. 균일한신호를얻기위하여적정반응시간을찾아야하며많은경우에있어서 8~16시간이적합하다. 예비시험에따라다르겠지만 SPA 비드는약 0.125~0.5 mg정도가주로사용된다. 아래는그시험의예이다.( 그림2-3) < 그림 2-3> 배양시간에따른결과분석방법 비드함량의셋업조건과결과분석은아래와같다. 1 Setup:Total binding(receptor + radioligand + SPA beads), nonspecific binding(receptor + radioligand + excess unlabeled competitor + SPA beads) 및 non-proximity effects(radioligand + SPA beads를다양한 SPA 비드수준 (0.125~1.5 ml ) 에서적정배양시간과수용체농도를두고측정한다. 2 Results Analysis:Total, NSB, NPE 및 specific binding(total-nsb) 를 SPA 비드용량에따라그려본다. 14

19 제 1 장 자율신경계 < 그림 2-4> 비드양의셋업조건에따른결과분석방법 이상적으로는 NPE(Non-proximity effects) 신호가무표지경쟁물질 (Unlabeled competitor) 의존재하에서비특이적신호와동일하여야한다. SPA 비드는 0.35~0.5 mg수준이가장좋은신호를제공한다.( 그림2-4) 2) 결합파라미터를알기위한시험의종류방사성리간드의평형해리상수 (K d ) 또는무표지물질의평형해리상수 (K i ) 는적정한조건하에서이루어져야한다. 방사성리간드의 K d 를구하기위한수용체친화력을결정하는방법에는포화결합시험 (Saturation analysis), 동종경쟁결합시험 (Homologous competition binding assay) 및다양한방사성리간드농도의결합속도관련시험 (Association rate at various radioligand concentration) 이있다. 이중에서이종경쟁결합시험 (Heterologous competition binding assay) 은무표지물질에대한수용체의친화력 (K i ) 을결정할때사용된다. 1 포화결합시험평형포화결합시험 (Saturation binding) 은다양한방사성리간드의농도에서총및비특이적결합의정도를측정한다. 평형해리상수또는방사성리간드의친화력 (K d ), 수용체결합부위의최대개수 (B max ) 등이비선형회귀분석방법을이용하여특이적결합으로부터산출된다. 요구조건은다음과같다. 15

20 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 비선형회귀분석방법으로적절한곡선을얻기위해서포화결합시험에사용하는방사성리간드농도범위는전형적으로 1/10~10의 K d 범위를사용한다. 또한비특이적결합을결정하기위해서는비표지화합물의고농도 (1000 x K i or K d value) 를사용한다. 이상적으로는비표지화합물은구조적으로방사성리간드와달라야하며비특이적결합은시험에사용된고농도에서전체결합에 50% 미만이되어야한다. One-site binding hyperbola 비선형회귀분석 (i.e. GraphPad Prism TM ) 을사용하여특이적결합에대한 K d 는아래와같은식으로계산할수있다. B max :The maximal number of binding sites (pmol/ mg ), K d(nm, pm, etc.):the concentration of radioligand required to reach half-maximal binding. 포화결합데이터에서는아래분석계산리스트를통하여결과가산출된다. a) 각각의방사성리간드혼합물의분획을감마카운터나 LSC로측정하여각 well당총방사능량을측정한다. 필요하면아래와같은공식으로 DPM을환산하여준다. DPM = CPM/Efficiency b) 결합자료 (Total bound, NSB) 를 CPM에서 DPM으로계산한다. c) DPM으로특이적결합을계산한다. Specific bound = Total Bound - NSB d) Unbound (Free) DPM 을계산한다. Free = Total Added - Total Bound e) 방사성리간드의특이적활성 (DPM/fmol) 및사용된샘플의부피를사용하여 free DPM 을농도단위 (i.e. nm) 로환산한다. f) DPM/fmol로표시되는특이적활성및분석 well당mg단위로가해준수용체의양을사용하여 total bound, NSB and specific bound를 DPM에서 pmol/ mg units으로환산한다. g) Y축에 bound(in pmol/ mg ), X축에 free concentration of radioligand(in nm) 로자료를그린다. h) Single site binding(hyperbola) 에대한비선형회귀분석을이용하여 K d 및 B max 를구한다. 16

21 제 1 장 자율신경계 2 동종경쟁결합시험동종경쟁결합시험 (Homologous competition) 은사용된방사성리간드와동일한비표지물질을사용하여농도반응곡선을그려나타낸다. 동종경쟁결합시험이 K d 및 B max 를구하기위하여아래조건을만족한다면포화결합시험의대체로사용할수있다. 125 I 방사성리간드를사용한다면될수있는한방사성표지가되지않은 I-리간드를사용하여야만한다. 가정은다음과같다. a) 수용체는방사성리간드와비표지된리간드에대하여동일한친화력을갖는다. b) 상호작용이없어야한다. c) 리간드결핍이없어야한다 ( 가해준방사성리간드의 10% 미만으로결합되어야한다 ). d) 비특이적결합은표지된리간드의농도에따라일정해야된다. 농도-반응곡선은이상적으로비표지된리간드의농도가 81배 ( 약 2로그정도 ) 증가할수록 90% 특이적결합에서부터 10% 특이적결합으로감소하여야한다. 동종경쟁결합시험에서 IC 50 이방사성리간드농도의 2배와 10배사이에있다면맞게디자인된것이다. 동종경쟁결합시험의자료분석및 K d 및 B max 를구하기위하여두가지방법이사용될수있다. 아래의결과분석부분을참조한다.( 그림2-5) 1 Setup:Binding(Receptor + radioligand + SPA beads) 방사성리간드한고정농도 ( K d ) 및적정한반응배양시간, 수용체농도및 SPA비드용량을사용하여비표지된경쟁물질의여러농도별로측정한다. 어떤경우 (3H-label with low specific activity) 에는 K d 보다더높은농도가필요하다. Total binding은경쟁물질부재에의하여결정된다. Nonspecific binding(receptor + radioligand + excess unlabeled competitor + SPA beads) 을고려한다. 2 Results Analysis 1: 비표지된경쟁물질의각농도에대하여 specific bound (Bound - NSB) 를그려본다. 아래식을이용하여 % specific bound로환산한다. 17

22 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) < 그림 2-5> 동종경쟁결합시험결과예시 Step 1. Four-parameter logistic 비선형회귀분석 (i.e. GraphPad Prism TM ) 으로알려진 sigmoidal dose-response(variable slope) 을사용하여 IC 50 을구한다. 계산식은아래와같다. Step 2. 아래와같은식을위하여비선형회귀분석을사용하여 Kd 및 Bmax를구한다. [ Hot] is the concentration of radiol igand used in the assay (in nm) [Cold] is the concentration of competitor, which varies (in nm) GraphPad Prism에서 Y를 CPM 또는 DPM으로표시하고 X를경쟁물질의로그농도를표시한다. 위에서 curve-fit 분석을통하여 K d 및 B max 를계산한다. 카운터기기의효율및방사성리간드의 specific activity를사용하여계산된최대신호단위 (CPM/DPM) 를 pmol/ mg단위로변환시킨다. 18

23 제 1 장 자율신경계 계산된 IC 50 : M. 동종경쟁결합시험에사용된리간드농도 : M. 이를통하여계산하면다음과같다. Log K d = Antilog of = M = 10-9 pm(79 pm) B max = DPM Bmax = 12.5 pmol/ mg (5 pmol/ mg ) 3 Results Analysis 2: 다른방법으로는 specific DPM bound 를 molar units (i.e. nm) bound로변환한다. 결과분석방법은아래와같이진행한다. a) 표지된리간드의몰농도 [L] 는각 well당가한 DPM을사용하여계산된다. The specific activity and the conversion factor, 1 μci = DPM. The formula is[l] nm = (Specific counts) (1/ ) (1/specific activity) b) 이농도를최종가한리간드농도를결정하기위하여비표지된리간드의모든농도에가해준다. c) 가해준리간드의농도가증가함에따라 ( 비표지된리간드가증가함으로 ) 표지된리간드의 specific activity는감소한다. d) 각 specific DPM bound는해당조건의 specific activity를사용하여결합된것을 specific molar units으로바꾸어준다. The formula is[rl] = (Added ligand) (Specific DPM) / (DPM added per well). e) 포화결합자료와동일하게 one-site binding(hyperbola) 을이용하여 K d 및 B max 를구한다. The formula is[l] nm = (Specific counts) (1/ ) (1/specific activity) The formula is[rl] = (Added ligand) (Specific DPM) / (DPM added per well). 19

24 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 3 약리적프로파일약리적프로파일 (Pharmacological profile) 은여러비표지된화합물을동시에시험하는이종경쟁결합시험 (Heterologous competition) 이다. 각각의화합물에대한 K i 는서로비교하여컴퓨터로계산된다. 또한친화력랭크도계산될수있다. 아래는전형적인약리적프로파일을나타내며 IC 50, K i 및 rank affinity 자료를나타낸다. ( 그림2-6) < 그림 2-6> 약리적프로파일 IC 50 은시험한자료로부터얻어지며 K i 는 Cheng-Prusoff 등식을사용하여계산된다. 상대적친화력은비교하고자하는특정화합물에대하여상대적으로표기할수있다. 20

25 제 1 장 자율신경계 2. In vivo/in vitro 효능약및길항약에대한기능적반응시험효능약및길항약에대한기능적반응시험에는주로적출조직및기관등을이용한다. 적출된위장관에작용하는약물시험 (Tissue-organ bath experiments) 이많이이용되고있다. 2.1 개론통상적으로 tissue-organ bath는 in vitro 용량반응실험에사용되며여러종 ( 닭, 개구리, 토끼, 쥐, 기니픽등 ) 의조직절편을생리학적약리학적연구에사용한다. 특히아래와같은조직및기관은이러한연구에많이사용된다. - 근육 ( 골격근또는평활근 ) - 동맥혈관 ( 링및스트립형태 ) - 자궁조직또는정관 - 회장, 결장 - 심방또는심실 - 횡격막 2.2 시험방법전형적으로이러한시험은온도가조절되는환경에서산소가충진된생리적용액으로관류된다. 또한적출된조직은아래와같은자극에반응이있어야한다. Pharmacological drug/agents(dose response studies) Electrical stimulation Both pharmacological and electrical stimulation 기록된반응또는생물학적활성은아래와같은반응으로조직에서근육의수축과이완으로나타난다. Force(Isometric) Displacement(Isotonic) 21

26 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 1) 조직준비 조직준비는조직의절편의형태에따라실험적위치가달라진다. 아래와같이절편에따라링형태와스트립형태가있다.( 그림2-7) < 그림 2-7> 조직절편의준비 2) 전기적자극전기자극방법은정전류자극, 정전압자극, field 자극및 point 자극이있다. Field 자극은전자기영역으로인한반응이며막전압의탈분극과칼슘유입을일으키며수축또는이완을유발한다. Point 자극은국소공격자극으로인한반응이며하나의흥분세포에서주위세포막또는근세포막을통하여다른세포로퍼진다. 3) 근운동기록독립된 tissue-organ bath 연구에는 myograph(muscle writer) 가사용된다. Myograph 란수축된근육의다른단계에서생성되는강도, 속도등을기록하고결정하는데사용되는장치이다. 이장치는힘을전기적신호로바꾸어컴퓨터모니터에서 ocilloscope 로표시되게하는변환기 (Transducer) 를가지고있다. 전형적인 myograph는 wire myograph 및 muscle strip myograph 등이있다. 4) 소프트웨어관련소프트웨어는여러가지모듈과함께제공된다. LabChart TM software는전형적인종이챠트기록지와디지털데이터저장시스템으로강력한분석시스템과같이제공되고있다.( 그림2-8) 22

27 제 1 장 자율신경계 < 그림 2-8> LabChartTM software 5) 하드웨어기본적 organ bath systems의사양은아래와같다. Modular or compact organ baths Hardware and software for both real-time and offline data extraction and analysis Accurately record and display temperature and force Designed with features to maintain a stable set temperature Various bath sizes for different tissue types available 23

28 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 3. 자율신경계의직접자극및심혈반응측정 3.1 시험의준비손상되지않은자율신경계가포함된심장분리 1 New Zealand White 토끼 (2.0~2.8 kg ) 를 hypnorm으로 0.1 mg / kg피하주사로먼저전처치한다. 2 전신마취는 hypnoval 1 mg / kg으로정맥주사하여유도하고 pentobarbital sodium을매 5분마다 2 mg정맥주사하여마취를유지한다. 3 토끼는산소 / 공기혼합물로기도절제후소동물호흡기 (Harvard Apparatus) 로분당 60호흡으로호흡시킨다. 4 미주신경을분리하고흉곽에붙은혈관들을분리한다. 5 과량의 Sagital(60 mg i.v.) 및 500 U 헤파린을정맥주사하여사망을유도한다. 6 흉곽의앞쪽부분을제거하고하강대동맥에삽입관을연결한다. 7 심장주위를자르고심근기능을유지하기위하여뛰는심장의표면에차가운 tyrode 용액을바른다. 8 목에서흉부까지펼치고주위의조직으로부터분리해낸다. 3.2 Langendorff 관류 1 균일한속도의 langendorff 모드로대동맥삽입관을통하여관류한다. 2 Tyrode 용액 ( 조성 (mm):na 138, K 4.0, Ca 1.8, Mg 1.0, HCO , H 2 PO 4 0.4, Cl 121, glucose 11) 로관류한다. 3 온도는 37도로유지하여주며 95% O 2 / 5% CO 2 혼합물로지속적인방울로산도를 7.4 정도로유지한다. 4 좌심실끝에위치한카테터를통하여정맥삼출물을배수한다. 5 좌심실압력 (Left ventricular pressure, LVP) 은라텍스풍선에연결된압력변환기를사용하여모니터링한다. 6 풍선부피를 end-diastolic 압력의영점으로조정한다. 7 관류압력을대동맥삽입관과연결된이차압력변환기를가지고모니터링한다. 24

29 제 1 장 자율신경계 8 두개의구부러진백금전극 (Grass Instruments) 을심방의활동과박동을기록하기위하여우심방돌기에삽입한다. 9 쌍극전극을우심실정점에서심실박동을측정하기위하여우심실유출로를통하여우심실에삽입한다. 3.3 자율신경자극 1 개개의미주신경자극 (Vagus nerve stimulation, VS) 을위하여각미주신경을쌍극실버전극 (Advent Research Materials, 0.5 mm O.D.) 으로지지한다. 2 4극카테터 (Cordis, 2 mm electrode, 10 mm spacing) 를교감신경자극 ( Sympathic nerve stimulation, SS) 을위하여척추관에삽입한다. 3 카테터의끝은심장교감유출의양면을자극하기위하여첫번째흉골에넣는다. 4 전극끝은음극으로작용하고나머지세전극은양극으로작동한다. 5 두개의일채널정전압평방펄스자극기가사용된다. 하나는 VS용이며다른하나는 SS용이다. 6 5 Hz, 2 ms 자극을이용한최대반응을일으키는자극전압은시험기간내내사용된다. 7 자극전압은 5.4T 1.0 V(SS) 및 8.8T 0.8 V(Left and right VS) 이다. 8 자극주파수는좌우 VS시 2 Hz(Low), 5 Hz(Medium) and 7 Hz(High) 를사용하며 SS 시에는 2 Hz(Low), 5 Hz(Medium) and 10 Hz(High) 를사용한다. 9 SS 직접작용연구를위하여 240 bpm의맥박아래에서심장박동수가이루고 VS는방실결절을일으키지않는동성심박수가완만히감소하기위하여최대주파수를정한다. 25

30 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 3.4 신호측정및분석 1 시험에서얻어진모든압력과전기적신호는적절한시스템으로기록하고적절한프로그램으로 1 khz 에서디지털화한다. 모든데이터는컴퓨터에서표시되고저장한다. 2 자극신호들도자극의정확한시각과시간을기록하기위하여동일한시스템으로등록되어야한다. 3 자율신경자극의전후에즉각적내인성공동심박수 (Instantaneous intrinsic sinus HR) 는심방심전도의맥박간격을분석함으로써측정할수있다. 4 심방및심실의박동자료는일정한속도로심실과심방이뛰고있을때모아진다. 5 30초의평형기간동안얻어진자료는컴퓨터프로그램 (Whole Cell Program) 으로분석한다. 6 HR과 LVP은평형상태에서 10회심장순환의평균으로부터자료가얻어진다. 26

31 제 1 장 자율신경계 4. Baroreflex 테스트 4.1 토끼의경우무게가 2.6~2.9 kg의토끼를사용하여비마취상태에서시험을진행한다. 수술한신장신경전극과유치 4뇌실에도관을심기위하여개개의분리된수술을진행한다. 최소한시험전까지 4~5일의휴식기를유지한다. 1) 심혈관계측정 1 실험당일토끼를토끼박스에놓는다. 2 전극연결은국소마취제 1% prilocaine을사용하여마취후옆구리피하로부터꺼낸다. 3 중심귀동맥은국소마취하에서테플론카테터 (22 gauge, 25 mm ) 를가지고경피로관을연결한다. 4 카테터는심방압력과심박동수를연속측정하기위하여 Statham P23Dc 압력변환기에연결하고동물은심혈파라미터의안정화가이루어지도록시험전 1 시간의회복기간을준다. 5 심혈관계파라미터는 Grass polygraph 또는이에상응하는장비로모니터링한다. 6 평균심방압력 (MAP:Mean atrial pressure), 심박동수 (HR) 및신장교감신경활성 (RSNA:Renal sympathetic nerve activity) 을 Metrabyte DAS8 analog-to-digital card를사용하여 300 Hz에서디지털화한다. 7 모든파리미터들은나중에오프라인분석을위하여컴퓨터에저장한다. 2) 평균심방압력-신장교감신경활성 baroreflex 관계 (Ramp technique) 1 신장교감성 baroreflex는 phenylephrine hydrochloride(0.5 mg / ml ) 및 sodium nitroprusside(1.0 mg / ml ) 를정맥으로투여했을때 MAP의 slow ramp 상승과하강정도로측정한다. 2 주입은 1~2분정도유지하고 MAP의변화비율은 1~2 mmhg/s로조절한다. 3 MAP, RSNA 및 HR은 2초간격으로평균화하고 MAP-RSNA 및 MAP-HR 곡선을생성하기위하여 sigmoid logistic function에 fitting시킨다. 27

32 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 4.2 개의경우 Baroreflex 자료는비마취상태에서실험하여얻어지며수술방법은아래와같다. Halothane 및 NO로개를마취시킨후옆구리절개를통하여대동맥카테터 (Aortic catheter), 온도반도체소자 (Thermistor) 및대정맥카테터 (Vena cava catheter) 를심는다. 우심방카테터를삽입하고 doppler flow probes를장간및신장동맥주위에심는다. 이시험은단지동맥정맥카테터가필요하다. 1) 심혈관계측정 1 실험당일개가익숙한조용한실험실에서안락한탁자에개를억압하지않고의식있는상태로조용히누인다. 2 Phasic 대동맥혈압을 Statham P23Dc 변환기로측정하고 phasic 및평균압력을 neomedix systems physiological recorder에기록한다. 3 심박동수는태코그래프을사용하여대동맥압신호로부터얻을수있으며 neomedix systems recorder로기록한다. 2) 평균심방압력-심박동수 baroreflex 관계 (Steady-state technique) 1 개의경우 MAP 변화를유도하기위하여 phenylephrine hydrochloride (20~400 μg) or sodium nitroprusside(0.25~5 mg ) 번갈아정맥주사하여 12개의평형 baroreflex 곡선을만든다. 2 압력의증가는 20~30 mmhg 범위에있으며압력의감소는 50~60 mmhg 범위에있다. 3 각각의압력변화는약물의초기 bolus 주입후완만한 infusion 주입으로 30~60초가량유지하며마지막 10~15초의평균값은평형상태의 MAP 및 HR 값으로잡는다. 4 자료는원모델 BARO4(With resting constraint) 및 BARO5(Without resting point constraint) 로 fitting 한다. 28

33 제 1 장 자율신경계 5. 심박동수변이 5.1 개론심박동수변이는측정하기쉽기때문에심장자율활성의가장많이사용되는지표중의하나이다. 이것은심전도의 R-R 간격 (R-R intervals) 또는심방압력추적으로부터맥박과맥박간격의시계열을분석함으로써측정할수있다. European Society of Cardiology 및 North American Society of Pacing and Electrophysiology Task Force는심박동수변이 (Heart rate variability, HRV) 를순간심박동수및 R-R 간격 ( 연속된맥박의진동 ) 의변이로정의하고있다. 감소된 HRV는미주신경활성의감소지표로사용된다. HRV는 ECG로부터얻는것이기때문에뇌의미주신경중추에서감소된활성인지말초활성이감소된것인지는판단이불가능하다. 그러나 HRV는여전히동적하중 (Dynamic load) 및누적하중 (Cumulative load) 양쪽의좋은지표로사용된다. HRV는하중에대한동적지표로서급성스트레스에대하여민감하고반응성이좋아보인다. 예를들어, 실험조건에서복잡한결정을내리는것과대중앞에발표하는것과같은스트레스상황은 HRV를낮추어준다. 누적착용및눈물의지표로서 HRV는노화가됨에따라감소하는것을보인다. 그러므로 HRV는주파수활성 ( 급성스트레스에반응하는 HRV의단기하락 ) 및부적절한반응 ( 반작용의과발현결과를낳는장기미주금단 ) 프로세스의지표인것으로생각된다. 5.2 방법 HRV 측정방법은 time domain 및 frequency domain 측정으로다시나눌수있다. 5.3 Time domain 계산할수있는변수들은평균 NN 간격, 평균심박동수및최장및최단 NN 간격차이를포함한다. Time domain에서 HRV를결정하는방법에는아래와같이여러방법이있다. 29

34 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 1) Statistical methods 이들측정은연속의즉석심장박동수또는순환간격으로부터 complex statistical time domain을측정하는것이며통상 24시간보다길게기록한다. 통상사용되는추천방법은아래와같다. 1 SDNN(ms) a) 모든 NN 간격또는변수근호의표준편차 b) 기록기간의변동성을초래하는모든순환요소반영 c) 저주파및고주파 HRV 요소포함 d) HRV의총변이가분석기록길이에따라증가하므로부작위적으로선택된 ECG에대하여통계적양이잘정의되지못함 2 SDANN(ms) a) 전체기록의 5분간격구획에서계산된 NN 간격의평균에대한표준편차 b) 5분보다긴순환에서의변화평가 3 RMSSD(ms) a) 근접 NN 간격사이의차이의제곱의합평균의평방근 b) 초단기순환에서의변화측정 c) SDNN index(ms) d) 전체기록의모둔 5분구획에대한모든 NN 간격의표준편차평균 e) 5분미만순환에기인한변이측정 2) Geometric methods 연속된 NN intervals은 NN interval durations의샘플밀도분포및근접 NN intervals의차이의샘플밀도분포등을기하학적패턴으로변환할수있다 (Lorenz plot of NN or RR intervals). 그러므로이방법은결과패턴의기하학및그래프성질을근거로변이를분석할수있다. 1 HRV triangular index - 모든 NN 간격을개별기수법 (With bins of ms(1/128 seconds)) 으로계산된모든 NN 간격의히스토그램높이로나눈총수 30

35 제 1 장 자율신경계 2 TINN(ms) - 최소평방차이를이용하여계산된 NN 간격히스토그램의삼각망내삽법 - 삼각을근거로계산된측정분포의기준선폭 5.4 Frequency domain HRV는 frequency domain에서분석될수있다. HRV는다른주파수의변화량을제공하며비트-비트간격시간시리즈로부터항상계산된다. 계산방법은 nonparametric 및 parametric으로나눌수있으며거의모든경우에비슷한결과를낳는다. 1) Nonparametric 1 알고리즘사용이간단, 고속푸리에변환 (FFT) 2 높은프로세스속도 2) Parametric 1 미리선택된주파수대역의분리된독립적인부드러운스펙트럼구성요소 2 스펙트럼의후처리편리및각컴포넌트의중앙주파수의쉬운판별 3 적은샘플수라할지라도 PSD의정확한측정 4 사용성과적합성의검증이필요및더복잡한주파수대역 5 Short-term recordings(2 to 5 minutes): 고주파 (HF), 저주파 (LF), 초저주파 (VLF) 6 Long-term recordings(>24 hour): 고주파 (HF), 저주파 (LF), 초저주파 (VLF), 극초저주파 (ULF) 31

36 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 3) 소프트웨어 LabChart TM software는전형적인종이챠트기록지와디지털데이터저장시스템으로강력한분석시스템과같이제공되고있다.( 그림2-9) < 그림 2-9> LabChartTM software 의예 1 Heart rate variability module HRV 모듈은사람과동물의심전도기록에서맥박사이의간격의변동성을표시해주고분석하는이해도구이다. 아래와같은기능을제공한다. ECG 실시간또는오프라인기록에서 R파및 RR 간격변이를탐지하고분석 분석으로부터이소성박동 (Ectopic beats) 을포함또는제외 R파첨가또는분석에서간단한인위적조작을제거 데이터분석출력 (NN intervals, RR intervals, spectrum NN intervals 및리포트 ) 자동 HRV 분석창제공 32

37 제 1 장 자율신경계 4) 하드웨어데이터저장시스템은 ECG/EKG를기록하기위하여 amplifier와함께사용되며적합한아날로그출력 ( 최대 ± 10 V) 도제공될수있다. 1 Telemetry ECG/biopotential foundation system 이시스템은비마취동물로부터의체온뿐만아니라 ECG, EMG, EOG 및 EEG와같은 biopotential 신호를기록하고분석하기위한하드웨어및소프트웨어로구성되어있다. 구성및기능은다음과같다. - TR scheduler pod and lab chart scheduler extension(12개까지각각의동물에송신기를연결하여기록하는것이가능 ) - 비삽입무선송신기사용 - 독립주파수송신으로인하여특별케이지가불필요 - 소동물또는대동물에적합 - 장기 stress-free 기록가능그외에부속품으로 biopotential/temp transmitter, bio amplifiers, 16 channel bio amp, disposable ECG electrodes 및 ECG switch boxes 등이있으며각각의부속품은시험의용도에알맞게선택되고적절하게사용해야한다. 33

38 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 제 3 절 자율신경계에영향을주는약물및사례 1. 자율신경계에영향을주는약물 1.1 MAO 억제제 MAO 억제제 (Monoamine oxidase inhibitor) 의경우그화학적구조로부터 iproniazid, nialamide, heniprazine 및 isocarboxazid 등과같은 hydrazine 유도체와 tranylcypromine, pargyline 및 clorgyline 등과같은 non-hyrazine 유도체로나눌수있으며또한작용하는효소의종류에따라아래와같이나눌수있다. ( 표3-1) < 표 3-1> 작용하는효소에따른 MAO 억제제의분류 Non-sel ective MAO inhibitor s - Iproniazid - Isocarboxazid - Nial amide - Phenelzine - Tranylcypromine MAO type A inhibitor s - Clorgyline - Moclobemide - Toloxatone MAO type B inhibitor s - Selegiline - L-Deprenil MAO 억제제는다양한효과로뇌및다른조직에서노르에피네프린, 도파민및세로토닌의농도를증가시킨다. 이러한 MAO 억제제를과량투여하거나 tyramine이함유된음식을섭취하거나아민류를증가시키는의약품을사용할때생명을위협하는세로토닌증후군을발생시킬수있으며또한심각한심혈관및뇌에손상을입힐수있다. 이러한반응은늦게나타나므로주의를요한다. 심각한경우에는혼수 34

39 제 1 장 자율신경계 상태, 강직및후궁반장 (Opisthotonus) 이올수있으며이는신진대사산증및초고열을일으킬수있다. 추가합병증의경우저혈압, 심혈관붕괴및심장마비가올수있으며고열로인한사망이 24시간내에올수도있다. 이러한사망은 tyramine 함유음식, 삼환계항우울제또는교감신경계아민류및선택적인세로토닌재흡수억제제동시사용시약물상호작용으로인하여 MAO 억제제치료시더빈번하게일어날수있다. MAO 억제제의남용이환자들사이에서만연하게이루어지고있는데그금단현상으로는불안, 혼란, 우울증, 환각, 메스꺼움, 구토및경직으로다양하게나타난다. 짧고선택적이며가역적으로작용하는 MAO type A 억제제의경우단독으로복용시과용량에서도비교적심각한부작용이나타나지않는것으로보고되었다. 단독으로과량복용시에는임상증상이 6~24시간지연될수있으며초기구토, 두통, 눈동자확장, 졸음, 혼돈, 동요, 안구진탕증, 식은땀및근육경련이일어날수있으며이후환각, 과호흡, 고혈압및심실항진이일어난다. 심각할경우실신, 근육뒤틀림, 강직및후궁반장이일어나며신진대사산증및초고열을유발할수있다. 합병증으로는횡문근융해증, 급성신부전, 저혈압, 심혈관붕괴및심장마비가올수있다. MAO type A 억제제는우울증에주로사용되며 MAO type B 억제제의경우에는파킨슨병에임상적으로쓰일가능성이있다. 두개의다른형태의효소는해부학적으로도분포가서로다르며선호하는기질도서로다르다. MAO type A 억제제는주로세로토닌및노르아드레날린을대사시키며태반, 내장기관및간에주로분포되어있다. MAO type B 억제제는뇌, 간및혈소판에많이분포되어있으며 phenylethylamine, methylhistamine 및 tyramine을일차적으로대사시킨다. 35

40 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 1.2 삼환계항우울증약물삼환계항우울증치료제 (Tricyclic antidepressant) 의주된작용은세로토닌수송체및노르에피네프린수송체를차단함으로써세로토닌이나노르에피네프린의재흡수를일차적으로차단하여시냅스말단에신경전달물질의농도를증가시켜신경의활성을증강시키는것이다. 이러한삼환계항우울제는도파민수송체에는친화력이없어도파민재흡수억제제로서효과는나타나지않는다. 그외에경한진정작용, 항히스타민작용및아드레날린성항진작용등이있고또한심장에경한퀴니딘유사작용을나타낸다. 삼환계항우울증치료제는다음과같다.( 표3-2) 삼환계항우울제의부작용은항무스카린성성질과관련이있는것이많다. 이러한부작용으로는입과코가마르거나눈이희미해지며위장관운동저하, 변비, 뇨저류, 인식과기억손상및체온항진등이있다. 그밖에다른부작용으로는졸음, 불안, 감정둔감, 혼돈, 초조, 어지러움, 정좌불능증, 과민증, 식욕및체중변화, 식은땀, 성기능저하, 근육의뒤틀림이나저하, 메스꺼움, 구토, 저혈압, 빈맥등이있으며드물게불규칙적으로심장박동이빨라지는현상도있다. 횡문근변성 (Rhabdomyolysis) 또는근육파손이드물게이계열의약물들에서보고되고있다. 삼환계항우울제는 class 1A 항부정맥제처럼작용하며이론적으로심실세동차단, 심수축감소, 허혈성심근육에대한혈액순환증가등에작용할수있다. 삼환계항우울제의과량복용시에는치명적중독현상이나타날수있다. 심혈관계및신경독성을야기하여심각한병적상태및사망에이를수있다. 과량복용시에나타날수있는현상은위에서언급한바와같이건조한입, 희미한시력, 뇨저류, 변비, 어지러움, 메스꺼움과같은항콜린성효과가나타나며노르에피네프린수용체에기인한다양한신체적증후가나타난다. 36

41 제 1 장 자율신경계 < 표 3-2> 삼환계항우울증약물 세르토닌 and/ or 노르에피네프린재흡수억제제 Amitriptyline(Elavil, Tryptizol, Laroxyl) Amitriptylinoxide(Amioxid, Ambivalon, Equilibrin) Butriptyline(Evadyne) Cl omipramine(anaf ranil ) Demexiptil ine(depar on, Tinor an) Desipramine(Norpramin, Pertofrane) Dibenzepin(Noveril, Victoril) Dimetacrine(Istonil, Istonyl, Miroistonil) Dosulepin/Dothiepin(Prothiaden) Doxepin(Adapin, Sinequan) Imipramine(Tofranil, Janimine, Praminil) Imipraminoxide(Imiprex, Elepsin) Lofepramine(Lomont, Gamanil) Melitracen(Deanxit, Dixeran, Melixeran, Trausabun) Metapramine(Timaxel) Nitroxazepine(Sintamil) Nortriptyline(Pamelor, Aventyl) Noxiptiline(Agedal, Elronon, Nogedal) Pipof ezine(azaf en/ Azaphen) Propizepine(Depressin, Vagran) Protriptyline(Vivactil) Quinupramine(Kevopril, Kinupril, Adeprim, Quinuprine) 그외, 비정형화합물 Amineptine(Survector, Maneon, Directim) - norepinephrine-dopamine reuptake inhibitor Iprindol e(prondol, Gal atur, Tetran) - 5-HT2 receptor antagonist Opipramol (I nsidon, Pramol an, Ensidon, Oprimol ) - σ receptor agonist Tianeptine(Stablon, Coaxil, Tatinol) - Selective serotonin reuptake enhancer Trimipramine(Surmontil ) - 5-HT2 receptor antagonist 37

42 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 1.3 Hydralazine류 Hydralazine은동맥및소동맥에일차적으로작용하여혈관확장을일으켜고혈압치료에사용되며평활근이완에직접적으로작용한다. 혈관평활근을이완함으로써혈관을확장시켜말초저항을줄이고혈압을감소시킨다. 기전을잠시살펴보면, hydralazine은 cgmp 수준을증가시키고이차전달자인 IP3 를기능을감소시킴으로써평활근의근소포로부터칼슘의유리를제한시켜혈관이완작용이나타난다. 이완작용은정맥보다는세동맥에서주로나타난다. Hydralazine은주로심장의교감자극 (Baroreceptor reflex) 을잘반영하기때문에고혈압치료의 1차치료제로는쓰이지않는다. 교감신경자극은심박동수와심박출량을증가시키며관상동맥질환을가진환자에서협심증또는심근경색을일으킬수있다. 또한 hydralazine은혈장 renin의농도를증가시켜뇨저류를일으킨다. 이러한부작용을방지하기위하여주로 propranolol과같은베타차단약및이뇨제와같이종종처방된다. 따라서 hydralazine은중증저혈압에주로사용되며저혈압에대한 1차치료제로는사용되지않는다. 그러나임신저혈압의 1차치료제로는사용되며이때 methyldapa와함께사용된다. 일반적인부작용으로는설사, 압수용체반사로인한보상빈맥, 협심증, 두통, 식욕감퇴, 메스꺼움, 구토, 우울증, 심박동울렁임및 drug-induced Lupus Erythematosus 가있다. Hydralazine류는 hydralazine, cadralazine, dihydralazine, endralazine 등이있다. 1.4 Amphetamine류 Amphetamine은주로카테콜아민인노르에피네프린과도파민의유리를증가시킨다. 말초신경에서는주로자율신경계에작용하여노르에피네프린을증가시켜아드레날린성수용체자극을통해심계항진, 혈압상승, 동공산대, 식은땀및체온상승등을유도한다. Amphetamine의급성독성은주로중추및말초아드레날린성수용체에작용하여일어나며중추신경계의경우정신이상, 환상, 불안등이야기된다. 심혈관계에서는빈맥및혈압상승이유도되며심각할경우이상고열, 심장부정맥및뇌졸증으로인하여사망할수도있다. 다른약들과달리 amphetamine과 methamphetamine은신경독성이있으며비가역적으로도파민성신경계및세로토닌성신경계에손상을미칠수 38

43 제 1 장 자율신경계 있다. Amphetamine의도파민성신경계독성효과는주로 free radicals 및강력한산화제인 peroxynitrite가형성되어나타나며게다가 MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine) 는뇌에서항산화제인 glutathion 및비타민 E의농도를감소시켜고용량에서신경독성을나타낼수있다. Amphetamine류는 phenethylamine류의치환체이며다음과같은약물이있다. ( 표3-3) < 표 3-3> Amphetamine 류약물의종류 Amphetamine 류 약물 Amphetamine(α-methylphenylethylamine) Methamphetamine(N-methylamphetamine) Ephedrine pseudoephedrine Cathinone Methcathinone(ephedrine) MDA(3,4-methylenedioxyamphetamine) MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine) MDEA(3,4-methylenedioxy-N-ethylamphetamine) EDMA(3,4-ethylenedioxy-N-methylamphetamine) MBDB(N-methyl -1-(3, 4-methyl enedioxyphenyl )-2-aminobutane) PMA(para-metoxyamphetamine) PMMA(para-metoxymetamphetamine) 4-MTA(4-methylthioamphetamine) 3,4-DMA(3,4-dimetoxyamphetamine) 3,4,5-TMA(3,4,5-trimetoxyamphetamine, α-methylmescaline) DOM(2,5-dimethoxy-4-methylamphetamine) DOB(2,5-dimethoxy-4-bromoamphetamine) 39

44 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2. 약물사례조사 2.1 Aminepine Aminepine은 atypical 삼환계항우울제로도파민재흡수를선택적으로억제하여노르에피네프린유리를감소시켜강력하고빠른항우울효과를나타낸다. 1978년 servier사에서처음으로 survector 란상품명으로출시되었다. 반감기가짧고복용 7일정도에항우울효과가나타나는등각광을받았으나유럽시장에서간독성이슈등이제기되어 1999년퇴출되었다. FDA에서는허가된적이없다. 부작용으로는간독성뿐만아니라중추신경계작용으로는불면증, 자살충동등이나타나며, 심혈관계작용으로는동맥저혈압및심계항진현상도드물게일어난다고보고되었다. 2.2 Ephedra Ephedra는 Ephedra sinica라는식물에서추출된추출물로주성분은알칼로이드 ephedrine 및 psudoephedrine이다. 교감신경흥분제 진해제 ( 鎭咳劑 ) 진정제 발한제이며, 기관지천식때의기관지확장, 척수마취또는침윤마취때혈압이떨어지는것을막을목적으로도사용하며, 폐기종 백일해 알레르기증에내복, 또는점비제 ( 點鼻劑 ) 흡입제 스프레이제로서외용하기도한다. 현재에도 metabolife라는상품명으로사용하고있으나심장마비, 뇌졸증등다양한부작용이보고되고있다. 이후미국 FDA는많은안전성연구를통해 ephedra가위장관계및자율신경계부작용과관계가있음을밝혔다. 미국 FDA은 2003년에 ephedra 함유건강기능식품의사용을금했으며결과적으로 2004년이물질함유건강기능식품의판매를금지하였다. 40

45 제 1 장 자율신경계 2.3 MAO 억제제 Nialamide( 상품명 :Niamid), safrazine( 상품명 :Safra) 및 phenelzine( 상품명 :Nardil) 의경우 MAO억제제이므로두통, 불면증, 기립성저혈압, 동공산태, 뇨저류, 발한등자율신경계관련여러부작용이나타나나현재까지제한적으로사용되고있다. 2.4 Nefazodone Nefazodone( 상품명 :Serzone, Nefadar) 은 BMS에서개발한 5-HT 2 수용체강력한길항약으로 α1, 5-HT 1A 수용체에도작용하며또한 α2 및 D2 수용체에도다소의친화력을갖고있다. 그밖에도세로토닌, 노르에피네프린및도파민수용체에도약한친화력을나타내며세로토닌-노르에피네프린재흡수억제효과도함유하고있다. 항우울제로출시되었으며 2003년간독성이발생하여미국및캐나다시장에서철수되었으나현재에도여러제네릭품목이사용되고있다. 주된부작용으로는자율성신경계와관련된구갈, 졸음, 구역질, 어지러움, 흐릿함, 약함, 혼돈및기립성저혈압등이있다. 2.5 Nomifensine Nomifensine( 상품명 :Merital, Alival) 은노르에피네프린-도파민재흡수차단제로 1970년대에주로항우울제로사용하였으며주된부작용은구갈, 두통, 메스꺼움등이있다. 알콜과상호작용이없으며항콜린성효과는없는것으로나타났다. 그러나 1980년대 nomifensine의의존성및약물남용의잠재성이있을것으로조사되었고특히흥분탐닉의이력이있는환자에게나고용량을사용할경우에는이러한의존성및탐닉성이심하게나타났다. Nomifensine은현재용혈성빈혈에대한주의및과용량복용으로인한초고열및과도한흥분의이슈로인하여항우울제로드물게사용되고있다. Nomifensine은약물남용및신장및간독성그리고용혈성빈혈이야기될뿐만아니라기전은모르지만이약물로인한사망이다소보고되어서현재의료용으로는철회되었다. 주로과학적연구로사용되고있으며특히탐닉성에대한도파민연구로많이사용되고있다. 41

46 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2.6 Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine(PPA) 은또한 norephedrine 및 oxyamphetamine으로알려져있으며 phenethylamine 및 amphetamine 계열로흥분제, 충혈완화제및식용감퇴제로사용된다. 주로기침및감기약처방에많이사용되고있다. 노르에피네프린및에피네프린유리를선택적으로활성화시킴으로써강력한교감신경흥분효과를나타낸다. 또한도파민유리물질로도어느정도효과가있는것으로알려져있다. PPA가 18~49세사이의복용자중에 200~500명정도의뇌졸중을유발한것으로평가됨에따라 FDA는모든제약회사는 PPA 함유약을더이상제조하지말것을권고하였으며, 2005년 PPA를시장에서철회하였다. 또한 amphetamine 제조에잠재적으로사용될우려가있기때문에 Combat Methamphetamine Epidemic Act of 2005 로법령을발효하여관리하였다. 그러나유럽에서는처방및 OTC로아직도사용되며캐나다에서는 2001년시장에서철수시켰다. 2.7 Sibutramine Sibutramine은식욕억제제로유명한약이다. 이는중추신경계의세로토닌및노르에피네프린재흡수를억제하여식욕을감퇴시키며구조적으로 amphetamine과관련이있다. 초기새로운비만치료제로각광을받았으나심혈관계부작용으로인하여 2010년 FDA에서는 sibutramine이심혈관질환환자에서의심장마비및뇌졸중에대한위험을증가시킨다고보고하였다. 종종확인되는부작용으로는구갈, 식용증가, 메스꺼움, 소화불량, 변비, 수면장애, 어지러움, 졸음, 생리통, 두통, 홍조, 무릎및근육통등이보고되고있다. 갑작스런죽음, 심부전, 신부전및위장관문제에대하여지속적으로보고되고있다. 2010년 8월미국FDA는 sibutramine의임상스터디가충분치않다고하여 65세이상의환자에게금기하라고시정명령을내렸고이에제약사는 2010년 10월심혈관계리스크에대한최소효능에대해염려를인식하여미국시장에서이약물을철수시켰다. 42

47 제 1 장 자율신경계 2.8 Zimelidine Zimelidine( 상품명 :Zimeldine, Normud, Zelmid) 는시장에출시된최초의선택적인세로토닌재흡수억제제 (SSRI) 이다. 이것은 pyridylallylamine이며구조적으로다른항우울제와다르다. 이약은 1980년대에개발되었으며 bropheniramine의유도체로 1982년에처음발매되었다. 그러나치명적인중추및말초신경장애인 Guillain-Barré syndrome 및피부발진, 독감유사증상, 관절통및호산구증가증을포함한많은기관의특이과민성반응으로인하여전세계적으로판매가금지되었다. 43

48 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 제 4 절 참고문헌 1. Amersham Biosciences, LEA Dseeker Multimodality Immaging System, Application note A. 2. Arslan U et al. (2008) Heart rate variability and heart rate turbulence in mild-to moderate aortic stenosis. Europace 10(12): Brack KE et al. (2006) The effect of direct autonomic nerve stimulation on left ventricular force in the isolated innervated Langendorff perfused rabbit heart. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 124: Chatman LA et al. (2009) A Strategy for Risk Management of Drug-Induced Phospholipidosis. Toxicol. Pathol. 37: Deley G et al. (2009) Arterial baroreflex control of cardiac vagal outflow in older individual can be enhanced by aerobic exercise training. Hypertension 52: Eli Lilly and Company and the National Institutes of Health Chemical Genomics Center, Receptor Binding Assays (refer to the following assay guidance NCGC website 7. EPA (U.S. Environmental Protection Agency) (1998) Guidelines for neurotoxicity risk assessment. Risk Assessment Forum Fedreal Register 63(93): Grubb BP and Karas B (1999) Clinical disorders of the autonomic nervous system associated with orthostatic intolerance. Pacing and Clinical Electrophysiology, 22: Hasford J and Victor N, (1987) Risk-benefit analyses of drugs: Fundamental considerations and requirements from the point of view of the biometrician. Problems in the assessment of the combination of trimethoprim with sulfamethoxazole. Infection 15(5): S236-S

49 제 1 장 자율신경계 10. Hui X et al. (2005) A robust homogeneous binding assay for α4β2 nicotinic acetylcholine receptor. Acta Pharmacologica Sinica 26(10): Huikuri et al. (1993) Measurement of heart rate variability: a clinical tool or research toy? J. Am. Coll. Cardiol. 34: Meyrelles, SS et al. (1996) Cardiac baroreflex properties in myocardial infarcted rats. J. Autonomic Nervous System 60: Mustafa S et al. (2004) Hyperthermia-induced vasoconstriction of the carotid artery, a possible causative factor of heatstroke. J. Appl. Physiol 96: O'Donaughy TL et al. (2002) Laboratory demonstration of baroreflex control of heart rate in conscious rats. Adv. Physiol. Educ. 26: Petrova et al. (2006) Prolonged (48-Hour) Modest hyperinsulinemia decreases nocturnal heart rate variability and attenuates the nocturnal decrease in blood pressure in lean, normotensive humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(3): Reichgott MJ, Chapter 76 Clinical Evidence of Dysautonomia, In Clinical Methods 3rd edition, The History, Physical, and Laboratory Examinations, Edited by H Kenneth Walker, MD, W Dallas Hall, MD, and J Willis Hurst, MD, Emory University School of Medicine, Atlanta, Georgia, Boston: Butterworths; Ricketts JM and Head GA (1999) A five-parameter logistic equation for investigating asymmetry of curvature in baroreflex studies. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 46: R441-R Riley DE and Chelimsky TC, (2003) Autonomic nervous system testing may not distinguish multiple system atrophy from Parkinson's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 74: Suzuki M et al. (2007) Muscarinic and alpha 1- adrenergic receptor inding characteristics of Saw Palmetto Extract in rat lower urinary tract. Urology 69(9):

50 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 20. Task Force of the European Society of Cardiology the North American Society of Pacing Electrophysiology, Heart Rate Variability : Standards of Measurement, Physiological Interpretation, and Clinical Use. Circulation. 1996; 93: Vanhoutte PM, (1974) Inhibition by acethylcholine of adrenergic neurotransmission in vascular smooth muscle. Circ. Res. 34: Satochi Ikeda, Hiroyuki Oka, Kazuo Matunaga, Susumu Kubo, Sadahiro Asai, Yoshiyuki Miyahara, Atsumi Osaka, Shigeru Kohno (1998) Astemizole-Induced Torsades de Pointes in a Patient With Vasospastic Angina 62: Lawrence M. DuBuske (1999) Second-Generation Antihistamine: The Risk of Ventircular Arrythmia 21: Health Canada (2004) Status of Astemizole(HismanalTM) in Canada. 25. Safety Pharmacology Studies for Assessing the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals, Draft Consensus Guideline, 2002, ICH Steering Committee

51 제 2 장 내분비계 제1절내분비계안전성약리시험 49 제2절내분비계안전성약리추가시험 78 제3절내분비계에영향을주는약물및사례조사 84 제4절참고문헌 89

52

53 제 2 장 내분비계 Chapter 02 내분비계 제 1 절 내분비계안전성약리시험 1. 내분비계개괄 < 그림 1-1> 사람의내분비계 49

54 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 내분비계는호르몬과같은화학적인물질을생산하고분비하는작은분비선으로구성되어있으며, 인체내여러곳에분포되어각기다른기능을하고있다.( 그림 1-1) 외분비선과달리내분비선에서합성되고분비된호르몬은표적기관까지도달할수있는해부학적인특정분비관을가지고있지않아세포사이로분비되어혈관이나림프관을통해이동해표적기관에작용하게되므로신경계및순환계와긴밀한상관관계를맺고있다. 표적기관에도달한호르몬은하나이상의기관에작용하여그기능을조절하는역할을한다. 대표적인기능으로는 1항상성조절 (Homeostasis):pH, 삼투압, 이온등 2성장과발육 (Growth and development) 3생식 (Reproduction) 4대사 (Metabolism) 5행동 (Behavior) 이조절되어진다. 주요내분비선에는뇌하수체 (Pituitary gland), 갑상선 (Thyroid gland), 부갑상선 (Parathyroid gland), 부신 (Adrenal gland), 췌장 (Pancreas), 송과선 (Pineal gland), 가슴선 (Thymus) 및생식선 (Reproductive gland) 등이있으며, 다양한호르몬을생산한다.( 표1-1) 한편, 내분비계에이상이생겼을경우, 그증상이두드러지게나타나지않아조기발견이어렵다. 대표적인예로환경호르몬과같은내분비계장애물질에장기간노출되어내분비계의기능에이상에생기는데, 남성의경우에는정자수의감소로, 여성의경우생리통의증가등의문제가발생한다고알려져있다. 50

55 제 2 장 내분비계 < 표 1-1> 내분비계주요호르몬 ( 독성학, 이영순, 2003, pp ). 호르몬명 시상하부 corticotropin releasing hormone(crh) ACTH 분비호르몬 growth hormone releasing hormone(grh) 성장호르몬분비호르몬 growth hormone inhibiting hormone(gih) 성장호르몬분비억제호르몬 thyrotropin releasing hormone(trh) 갑상선자극호르몬분비호르몬 luteinizing hormone releasing hormone(lh-rh) 황체형성호르몬및난포자극호르몬분비호르몬 prol actin releasing hormone(prh) prolactin 분비호르몬 prolactin inhibiting hormone(pif) prolactin 분비억제호르몬하수체전엽 adrenocorticotropic hormone(acth) 부신피질자극호르몬 growth hormone(gh) 성장호르몬 thyroid stimulating hormone(tsh) 갑상선자극호르몬 luteinizing hormone(lh) 황체형성호르몬 follicle stimulating hormone(fsh) 난포자극호르몬 prolactin prolactin 하수체중간엽 melanocyte stimulating hormone(msh) 멜라닌세포자극호르몬 ( 주로어류, 양서류 ) 하수체후엽 oxytocin vasopressin(adh) 갑상선 thyroid hormone(th) calcitonin parathyroid hormone(pth) 부신 glucocorticoid mineralcorticoid adrenaline 생식선 androgen estrogen 췌장 insul in glucagon somatostatin 기타 renin gastrin secretin 옥시토신바소프레신 비고 thyroxine(t4), triiodothyronine(t3) 소포곁상피호르몬부갑상선호르몬 부신피질호르몬부신피질호르몬부신수질호르몬 남성호르몬여성호르몬 췌도 β 세포췌도 α 세포시상하부제3뇌실주위핵, 궁상핵, 정중융기, 췌도 D 세포 신장사구체곁세포위 ( 유문및유문전정부 ) 십이지장 51

56 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 1.1 내분비계의호르몬전달형식 1) 혈액분비또는내분비내분비기관은해부학적으로도관이없고분비물이세포표면이아니라, 주로세포기저측에서결합조직을경유하여혈중에분비되는것을특징으로하는선조직으로정의된다. 많은호르몬은이형식으로표적세포에도달하여호르몬작용을나타낸다. 2) 곁분비어느종류의호르몬은호르몬생성세포의인근에표적세포가있어호르몬이혈중에들어가지않고조직을통해직접표적세포에전달되어호르몬작용을나타낸다. 3) 자가분비호르몬생성세포자신이표적세포로서호르몬작용을나타낸다. 1.2 내분비계의분류호르몬생성세포및화학구조의특징을기준으로내분비계는이하의 3형태로분류할수있다. 1) 펩타이드, 아민분비계뇌하수체, 갑상선 C세포, 부갑상선, 부신수질, 위장췌장내분비계 2) 스테로이드분비계 부신, 생식선 3) 티페닐, ether계갑상선 : 갑상선호르몬은 2개의페닐기가 ether 결합한특이한화학구조를갖고있어독립된내분비계로여겨진다. 펩타이드아민계호르몬의대부분이신경세포에서도생성되어, 신경펩타이드로알려져있다. 또한위장관이나췌장에있는펩타이드호르몬도뇌내에있는것이증명되어뇌장관호르몬으로총칭되고있다. 52

57 제 2 장 내분비계 1.3 호르몬의작용기전호르몬이표적세포로작용하기위해서는먼저호르몬이표적세포의특이한수용체와결합한다. 이러한수용체는많은경우, 세포막표면에존재하지만 ( 펩타이드, 아민계호르몬 ) 어떤호르몬에서는세포내 ( 핵내 ) 수용체와결합한다 ( 스테로이드, 갑상선호르몬 ). 1) 펩타이드호르몬 호르몬 세포막수용체 작용시간은짧다. 2) 스테로이드호르몬 호르몬 핵내수용체 유전정보번역 단백질합성 작용시간은길다. 1.4 피드백시스템생체는여러가지의조절기구에의해일정한기능을유지하고있는데이것을일반적으로항상성이라고한다. 내분비계에서도항상성이유지되며그방법이피드백시스템이다. 내분비계의피드백시스템으로는음성피드백시스템, 단거리피드백및양성피드백시스템이존재한다. 53

58 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2. 시상하부-뇌하수체시상하부는자율신경계와내분비계의조절중추로섭식, 수면, 생식, 신진대사 ( 포도당, 유리지방산 ), 호르몬분비등을조절한다. 시상하부를포함하는중추에는많은신경펩타이드가존재하며, 뉴런에는각종펩타이드호르몬이분포하고있다. 시상하부-뇌하수체전엽계에는 TRH, LH-RH, TSH, LH, FSH 등이, 시상하부뇌하수체후엽계에는 oxytocin이나 vasopressin이존재하며시상하부-뇌하수체-표적내분비기축을구성하고있다. 또한시상하부는상위의중추지배하에있어연합영역이나편도체로부터입력된정신적이나운동성정보를받아, 외계에대응하는생체기능을조정한다.( 그림1-2) < 그림 1-2> 시상하부 - 뇌하수체 54

59 제 2 장 내분비계 2.1 시상하부호르몬 뇌하수체전엽호르몬의분비와관련되는시상하부조절인자는 hypothalamic releasing hormone(rh), 또는 hypothalamic inhibiting hormone(ih) 등이있다. 1) 황체호르몬분비호르몬 (LH-RH) 1 LH-RH의작용과분비조절 LH-RH는 10개의아미노산으로이루어져, 뇌하수체문맥에의해서시상하부에서뇌하수체로운반되어, 뇌하수체전엽호엽기성세포 (Gonadotrope) 에서 LH 및 FSH 를분비시킨다. LH-RH의분비는율동적이고일정간격과전폭을갖는다 ( 파상분비 ). 그러나 LH-RH의파상분비가외인적 (LH-RH 투여등 ) 으로변하면뇌하수체에있는 LH-RH 수용체의하향조절이일어난다. 이 LH-RH 수용체의하향조절이 LH-RH 유사물질치료의기초가된다. 또한 LH-RH의파상분비에제일많이관여하는중추인궁상핵은파상분비에, 시상전영역은급격한분비에관여하고있다. 2 LH-RH 및 analogue의의약품응용과안전성합성 LH-RH를이용하여간뇌-시상하부-뇌하수체계질환에대한감별진단이수행되고있다 (LH-RH test). 대표약물은초산 gonadorelin이다. 합성 LH-RH를투여하여시상하부성성선기능저하증을치료하기도한다. LH-RH 유사물질은강력한수용체결합능에의해하향조절을강화하여길항적으로작용하는데대표적인 LH-RH analogue는초산류프로레린과초산부세레린이다. 적용질환은자궁내막증, 자궁근종전립선암, 유방암, 사춘기조기발현등이다. 비임상및임상과관계없이생식기에대한영향이있어동물에서는분만지연이일어나고사람에서는여성의위폐경증이나질의위축등의갱년기증상과유사한증상을보인다. 55

60 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2) Thyrotropin releasing hormone 1 TRH의작용과분비조절 TRH는 3개의아미노산으로이루어지며뇌하수체전엽의 thyrotrope에작용하여, TSH의합성과분비를조절한다. TRH는동시에 prolactin도분비시킨다. 그러나갑상선호르몬은음성피드백을통해 TRH에의한 TSH 분비를억제하지만 prolatin 분비는억제하지않는다. 2 TRH의의약품응용과안전성 TRH에는뇌하수체호르몬을분비시키는작용외에중추부활작용이있어, 간뇌- 뇌하수체성질환의감별진단약, 또는의식장애나척수소뇌변성증등의중추질환치료약으로쓰이고있다. 3) Cotricotropin releasing hormone 1 CRH의작용과분비조절 CRH는 41개의아미노산으로이루어져있으며, 시상하부 ( 숭상핵으로추정 ) 에서생성되어, 뇌하수체로운반되어 ACTH를분비시킨다. 이 CRH는각종의중추자극 ( 스트레스, 히스타민, 에피네프린, ether 등 ) 과관계가있으며특히스트레스에민감히반응하고급속히분비된다. 스트레스시중추 CRH 활성은상승하지만, 이것은 glucocorticoid에의해서저해된다 ( 음성피드백 ). 이조절기구외에, ACTH에의한 CRH 생성 ( 활성 ) 억제도존재한다 ( 단거리피드백 ). 2 CRH의의약품응용과안전성 CRH는부신기능부전또는 cushing syndrome의감별진단 (ACTH 분비예비능검사 ) 에쓰인다. 56

61 제 2 장 내분비계 4) 성장호르몬억제호르몬 (GIH, somatostatin) 1 GIH의작용과분비조절 Somatostatin은 GH 조절인자로, 14개의아미노산으로이루어진다. 사람에서는수용체가 5종류이상있어, 아형에따라분포가다르며정상조작이나종양조직에분포하고있다. 즉, 뇌하수체 TSH 생성종양이나 GH 생성종양, 유암종, 갈색세포종등에서특이한아형의 somatostatin수용체가발현하고있다. 또한 in vitro에서종양증식억제작용이확인되고있다. Somatostatin은뇌하수체로부터의 GH 분비를억제하는것뿐만아니라 TSH, glucagon, insulin, gastrin의분비도억제한다. 2 GIH의의약품응용과안전성 Somatostatin 유도체는 GH 분비억제작용외에항종양작용이기대되고있다. 진단분야에서는 indium 표식 somatostatin 유도체를이용한수용체섬광조영술 (Scintigraphy) 을종양의전이진단이나치료에사용하고있다. 치료분야에서는선단비대증 (GH 생성뇌하수체종양 ), THS 생성종양, 호르몬과잉분비를동반하는췌내분비종영 (Insulinoma, gastronoma 등 ), 유암종등에대한 somatostatin 치료가있다. Somatostatin analogue의대표물질은초산 octotreotide이다. 이물질은지속적인 GH 분비억제작용을가지며 somatostatin 수용체 subtype 2에대하여강한결합성을보인다. 또한 BIM-23268은수용체 subtype5에선택성이높다. 향후, 아형에대한선택성이높은유도체가만들어져보다유용해질것이다. Somatostatin analogue의부작용은소화관증상 ( 구도, 위통설사 ) 또는담석형성이다. 또한유사물질중에는 glucagon 분비억제작용이강한것이있어, 저혈당을유발한다. 57

62 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2.2 뇌하수체전엽호르몬 1) 부신피질자극호르몬 (ACTH) 1 ACTH의작용과분비조절 ACTH는 39개의아미노산으로이루어지며뇌하수체전엽의호흡기성세포 (Corticotrope) 에서분비된다. ACTH는부신에서피질의스테로이드호르몬의생성촉진, 피질 ascorbic acid 감소, 부신중량증가 ( 세포증식촉진 ) 등의작용을하며부신이외에의작용은멜라닌세포자극, 지방분해촉진, 혈당강하등이있다. 2 ACTH의의약품응용과안전성부신피질기능부전, ACTH 불응증등의진단목적또는 ACTH 단독결손증, Guillain-Barre 증후군의치료에쓰이며부작용으로는쇼크가있다. 2) 갑상선자극호르몬 (TSH) 1 TSH의작용과분비조절 TSH와뇌하수체전엽의호염기세포 (Thyrotrope) 에서분비되는당단백질호르몬으로 α와 β의아형이있다. TSH의분비는시상하부 TRH와혈중의갑상선호르몬농도에의해조절된다. TSH의작용은다양하며 TSH 과잉상태에서는갑상선여포상피세포의증가 ( 요오드결핍, goitrogen 투여등 ), 갑상선의요오드흡수촉진, 갑상선호르몬합성과갑상선내대사촉진 ( 포도당산화촉진, 인지질합성촉진등 ) 등이있다. 2 TSH의의약품응용과안전성 TSH 제제는뇌하수체-갑상선계질환의 in vitro 진단에이용되었지만호르몬검사가충실한현재는거의쓰이고있지않다. 58

63 제 2 장 내분비계 3) Prolactin 1 Prolactin의작용과분비조절 Prolactin의호르몬작용은유즙분비, 유선조직발육, 성선기능억제이며, 고 prolactin 혈증에서는무월경, 생리불순, 발기부전이문제가된다. 약제성고 prolactin 혈증도중요한데, 많은향신경약이 prolactin 분비를항진한다. 약제성고 prolactin 혈증의기전에서는, phenothiazine계와 butylphenone계에의한 DA 수용체차단작용, 3환계항우울약에의한칼슘재흡수저해작용, 마약, 진통약에의한 opiate 수용체자극작용또는 DA 신경차단작용, lithium에의한 DOPA-DA 전환저해, sulfiride에의한 DA 수용체차단작용, cimetidine에의한 DA 수용체차단작용을들수있다. 2 Prolactin의의약품응용과안전성의약품응용은일반적이지않다. 유의점은고 prolactin 혈증원인약제이다. 4) LH 및 FSH 1 LH 및 FSH의작용과분비조절 LH 및 FSH는시상하부에서분비되는분비호르몬 (GnRH) 의자극을받아뇌하수체전엽에서분비된다. FSH를예로들면, 혈중에분비된 FSH는난소의과립막세포, 정소의 sertoli 세포의세포막에있는수용체에결합한다. 수컷에서는 FSH는 LH는공동으로난포를성숙시켜, 에스트로겐분비를자극하여배란을유발한다. 2 LH 및 FSH의의약품응용과안전성불임증의치료에는 hmg(human menopausal gonadotropin) 제제를이용한배란유발법과인공수정등이있다. 그러나 hmg 제제에의한다태임신이나난소과잉자극증후군등의부작용이문제가되어, 최근에는정체뇌하수체성선자극호르몬 (FSH) 제제, 유전자재조합 FSH 제제가쓰이고있다. 이러한 FSH 제제는 LH의함량을억제하거나, LH를완전히포함하지않음으로써난소에의지나친자극을주지않는다는장점이있다. 59

64 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 5) 성장호르몬 (Growth hormaone, GH) 1 GH의작용과분비조절 GH에의한직접작용과 somatomedin( 간에서생성 ) 을통한간접작용이있다. GH 분비를항진시키는약물로는 bromocryptin, 1-dopa 와같은도파민작용약이있다. GH 분비를억제하는약물로는 growth hormone inhibitiong hormone, 포도당이나 cortisol이있다. 교감신경작용약중 α-차단약 ( 펜트라민등 ) 이나 β-자극약 (Isoproterenol 등 ) 도 GH 분비를억제한다. 즉 α-수용체는 GH 분비를촉진하고 β -수용체는 GH 분비를억제한다. 스트레스, 운동, 절식은 GH 분비를항진하나포도당, 유리지방산, REM 수면은 GH 분비를억제한다.( 그림1-3) < 그림 1-3> 성장호르몬과수면 2 GH의의약품응용과안전성사람성장호르몬을쓴뇌하수체성소인증의치료역사는길다. 일찍이뇌하수체추출 GH 제제가사용되었으나, 항 hgh 항체가치료효과를저감시키는것, 이종단백질의혼입감염 ( 크로이츠펠트-야콥병 ) 의우려, 백혈병의유인등이논란이되고있다. 이후, 정제제제, 유전자재조합제제가등장, 뇌하수체성소인증뿐만아니라 60

65 제 2 장 내분비계 Turner 증후군, 소아만성신부전에응용되고있다. 부작용으로서는신질환에서신장혈류증가, GFR증가, 전해질균형의변동내당능의저하등이있다. 2.3 뇌하수체후엽호르몬 Vasopressin(8개의아미노산으로이루어지며, 8번째아미노산은 arginin vasopressin 이라고도불린다.) 과 oxytocin(vasopressin과구조적으로유사 ) 이있다. 61

66 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 3. 갑상선-부갑상선갑상선은후두바로아래, 기관의앞쪽좌우에위치하며, 협부에의해연결되어있다. 부갑상선은갑상샘의뒷면에위치하며두엽의위와아래에각각존재한다. ( 그림1-4) < 그림 1-4> 갑상선과갑상선 follicle 의구조 3.1 갑상선호르몬 신체의기초대사율을결정짓는탄수화물, 지질및단백질의대사를조절한다. 1) 갑상선호르몬의작용과분비조절갑상선내의요오드화아미노산중, 호르몬작용을갖는것은 thyroxine(t4) 와 triiodothyronine(t3) 으로 ( 참고로, T3와 T4는요오드원자의수를의미한다 ), 그밖에호르몬작용이없지만기아또는특수한질환에서의의가있는 reverse T3(rT3) 가있다.( 그림1-5) 그러나갑상선호르몬활성을비교하면, T4를 100으로한경우, T3 는 500, rt3는 5로생물활성에큰차이가있다. 62

67 제 2 장 내분비계 < 그림 1-5> 갑상선호르몬 1 소포상피세포의무기요오드흡수에대한영향혈중요오드를능동수송하여흡수농축한다. 이과정에영향을주는인자는 TSH 분비자극 (Stress, ether 마취, 한냉노출 ), 도파민, perchlorate, thioxynate 등이있다. 2 호르몬합성과정에서의작용요오드의유기화, 단백질과의결합또는축합에의한 T4나 T3의생성을저해한다. 약제는 thiourea, propylthiouracil(ptu), 메치마졸, sulfonamide, aminotriazole, paraaminosalicylic acid 등이있다. 3 호르몬분비저해호르몬분비장애를일으켜갑상선상피세포를비후시킨다. 약제는과잉요오드, lithium 등이있다. 63

68 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 4 약물대사효소유도 (UDP-glucurosyltransferase 유도 ) T4의 glucuron 산포합이나 T3의환산포합을촉진하여, 갑상선기능을저하시켜 2차적으로뇌하수체로부터의 TSH 분비를항진, 갑상선을비대시킨다. phenobarbital, 3MC, PCB, DDT, TCDD 등이있다 deiodenase 저해 T4의외측고리 5 위치의요오드의탈요오드화에의하여 T3가, 내측고리 5 지위의옥소의탈요오드화에의하여 rt3가생성되지만 5 -deiodenase 저해약물의연속투여에의해서 T3이저하하여, rt3와 TSH가증가한다. 약물은에리슬로신, PYU, 이과파노산, β-차단약, 병태로는절식, 기아, 신부전등이있다. 2) 갑상선호르몬제제및갑상선제의의약품응용과안전성 1 갑상선호르몬제제갑상선건조분말제 (Thyrazine) 과합성감상선호르몬이있다. 갑상선기능저하증의보충요법에쓰인다. 심박항진, 현기증, 두통, 발한, 협심증을조심해야한다. 드물게과민증이출현하기도한다. 2 항갑상선제갑상선기능항진증의치료에쓰인다. 기전은말초에서의 T4에서 T3으로전환하는것을억제하여정상의갑상선기능을회복시키는것으로생각된다. MMI와 PTU 가일반적으로쓰이고있다. 부작용으로는과립구감소증, 특히무과립구증 ( 발열, 치육출혈 ) 으로, 이밖에간손상, SLE성증상, 탈모, 소양증도출현한다. 3) 갑상선기능검사 (Thyroid function test) 갑상선기능검사란갑상선기능을평가하기위해필요한호르몬들의수치를측정하는검사들의조합을말한다. 갑상선호르몬에는티록신 (Thyroxine, T4) 과트리요오드티로닌 (Triiodothyronine, T3) 두종류가있다. 뇌하수체에서분비된갑상선자극호르몬 (Thyroid stimulating hormone, TSH) 이갑상선을자극하면갑상선소포세포 (Thyroid follicular cell) 에서갑상선호르몬 (T3, T4) 을생성한다. 혈중 T4는모두갑상선에서분비된것이지만, 혈중 T3의 80% 는 T4가갑상선이외의조직에서변환 64

69 제 2 장 내분비계 된것이다. 혈중 T3와 T4의대부분은단백질에결합된상태로존재하지만, T4의 0.03% 와 T3의 0.3% 는단백질과결합되지않은유리된형태로존재한다. 실제로호르몬작용을일으키는것은이유리된형태의호르몬이다. 갑상선기능에이상이오는질환의종류는크게갑상선기능항진증과갑상선기능저하증으로분류할수있다. 각각의원인질환에따라갑상선호르몬과수치가변화한다. 따라서갑상선과관련된여러호르몬및검사항목들을측정하여그변화양상에따라적절한진단과치료가필요하다. 갑상선기능검사는혈액을이용한면역검사가이용되는데, 면역검사의방법에는응집법, 효소면역측정법, 방사면역측정법, 형광면역측정법, 화학발광면역측정법등이있다. 표1-2는주요질환별갑상선호르몬의수치변화를나타낸것으로, 각항목별참고치는기관별, 측정방법에따라차이가있을수있다. < 표 1-2> 주요질환별갑상선호르몬수치변화 질환 TSH T4 T3 Fr ee T4 일차성갑상선기능저하증증가감소정상또는감소감소 일과성신생아갑상선기능저하증 증가감소감소감소 하시모토병 증가 정상또는 감소정상또는 감소정상또는 감소 그레이브스병 감소 증가 증가 증가 갑상선 자극 호르몬결핍증 정상또는 감소 감소 감소 감소 전신성질환, 초기 정상 정상 감소 정상 전신성질환, 후기 감소 감소 감소 정상또는 감소 * 참고치 TSH:0.35~4.49 μlu/ ml, T4:4.5~11.0 μg / dl, T3:0.58~1.59 ng/ ml, Free T4:0.70~1.48 ng/ dl 65

70 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 3.2 Calcitonin 성장 발생및신경계의성숙과정에필수적인칼시토닌은갑상선에서분비되는또다른호르몬으로혈중칼슘이온과인산염이온의농도를조절하고이들호르몬의분비는혈중칼슘이온의농도에의해조절되어진다. 1) Calcitonin의작용과분비조절 Calcitonin은 32개의아미노산으로이루어지며갑상선소포간결합조직에있는소포곁세포 (C세포) 에서분비된다. Calcitonin은신장과뼈에작용하여혈중칼슘농도를낮춘다. 칼슘분비촉진에는제 1인자로서혈중및세포외액의칼륨이온농도상승에의한고칼슘혈증, 제 2인자로는혈중마그네슘이온의상승, 제 3인자로는고칼슘식섭취가있다. 기타, gastrine, glucagon, CCK 등의소화관호르몬의분비시에도 calcitonin 분비는촉진된다. 1 신장에대한작용신장에서의칼슘과인의배설을촉진하며칼륨, 나트륨및물의재흡수를억제한다. 2 뼈에대한작용파골세포의활성저하에의해서골흡수를억제하여결과적으로혈중에유출하는칼슘과인이온을저하시킨다. 2) Calcitonin의의약품응용과안전성돼지 calcitonin, 장어 calcitonin, 연어 calcitonin이폐경후골다공증등에쓰이고있다. 또한고칼슘혈증 ( 신장에대한작용 ), 골통증개선 ( 중추성의진통작용 ), 그외에위궤양 ( 위산분비억제 ) 에의치료효과도기대되고있다. 부작용은구토, 식욕부진, 안면홍조등이있다. 66

71 제 2 장 내분비계 3.3 부갑상선호르몬 (parathyroid hormone, PTH) 분비된 PTH는혈중칼슘농도를증가시키고인산염의농도를낮추며, 갑상선에서분비된칼시토닌과함께혈중칼슘농도를안정화시키는역할을한다. 1) PTH의작용과분비조절 PTH는 84개의아미노산으로이루어지며, 부갑상선에서분비되어, 칼슘과인의대사를조절한다. 부갑상선의상피세포에는칼슘에대한수용체가있어, 이것이세포외칼슘의감지기로서작용하여, 혈중의칼슘의변동에민감하게반응하여 PTH 분비를조정한다. PTH의호르몬작용에는신장에대한작용과골에대한작용이있는데혈중칼슘농도를높여인을저하시키는방향으로작용한다. 또한 PTH의작용이발현하기위해서는활성형비타민 D가필수적이다. 1 신장에대한작용 칼슘재흡수촉진 : 원위세뇨관의재흡수촉진 칼슘뇨배설저하 인재흡수억제 : 근위세뇨관인, 나트륨의세포내동시수송 인의공수저해 비타민D 활성화반응 (1α 수산화 ) 의촉진 : 근위세뇨관에있어서의 25-수산화- 비타민D-1α 수산화반응촉진 장관칼슘과인흡수촉진 2 뼈에대한작용 뼈흡수촉진 : 골모세포의 PTH 수용체에결합하여골모세포활성화 파골세포활성화인자분비 골흡수촉진 2) PTH의의약품응용과안전성 PTH의골에대한작용에착안하여골다공증치료에이용하고있다. 그중에서도골신생을목적으로한유전자재조합사람 PTH의 pulse적투여가주목되고있다. 그러나 PTH 치료에관계되는안전성에관해서는알려진바없다. 67

72 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 4. 부신 4.1 부신피질호르몬 1) 부신피질호르몬의작용부신피질은조직학적으로구상대 (Zona glomerulosa; 얇은바깥층 ), 속상대 (Zona fusciculata; 두꺼운중간층 ), 망상대 (Zona reticularis; 내층 ) 로구성된다.( 그림1-6) 1 호르몬의종류와작용 Aldosterone( 미네랄 corticoid): 구상대에서분비되고혈중전해질조절에관계한다. Cortisol, corticosterone(glucocorticoid): 속상대에서분비되고, 혈당상승, 단백질이화, 지방분해작용이있다. Glucocorticoid의분비는종차가있어사람이나원숭이에서는 cortisol이랫드에서는 corticosterone이주로분비되며생물학적인작용을한다. Dehydroepiandrosterone(DHA), DHA sulfate( 성스테로이드 ): 망상대에서분비되며남성호르몬작용을갖는다. 2 Glucocorticoid의작용 당대사에대한작용 : 당신생증대, 간장에서 glycogen 축적촉진, 항인슐린작용 ( 말초에서의당이용율저하 ) 단백질대사에관한작용 : 단백질이화작용의촉진 지방대사에관한작용 : 지방분해작용 ( 당이용저하때에만해당되며 glucocorticoid 증가시에는당이증가하며지방의분해는진행되지않는다.) 전해질에관한작용 : 나트륨저류칼륨배설촉진 체내수분에관한작용 :GFR 상승이나 ADH 길항등의작용을통하여체내수분배출 골조직에대한작용 : 비타민 D 길항 ( 장관에있어서의칼슘흡수억제, 골에의칼슘침착억제 ) 단백질이화작용항진에의한골 matrix 형성장애 신경계에관한작용 : 신경세포의흥분역치의저하 혈액에관한작용 : 적혈구증가, 호중구증가, 호산구저하, 림프구저하 면역계에관한작용 : 면역기능저하 ( 항감염성 ), 항염증작용 68

73 제 2 장 내분비계 < 그림 1-6> 부신의조직학적구조 2) 스테로이드호르몬의의약품응용과안전성스테로이드는임상적으로광범위한질환에쓰인다. 1 부신피질호르몬의외용적용외용제는피부염, 건선, 습진, 홍피증, 약진, 홍반증, keloid, 악성림프종등에적용된다. 2 스테로이드의부작용중증인부작용으로는감염증유발, 부신부전, 소화성궤양, 골다공증, 당뇨병유발, 동맥경화가있다. 중증이라고는할수없지만유의해야할대상으로이상지방축적 ( 결과적으로비만이나둥근얼굴 ), 다모, 눈이상 ( 녹내장, 백내장등 ), 피부손상 ( 피부위축, 피하출혈, 발한이상등 ) 및월경이상등이있다. 69

74 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 또다른면으로는스테로이드와각종약제와의상호작용도문제가된다. 그중하나는스테로이드대사저해에의한약효의증폭으로에스트로겐류가있다. 또다른하나는스테로이드대사항진 ( 예를들면 CYP3A4 유도 ) 으로 phenobarbital, phenytoin 이나 rifampicin 등을들수있다. 4.2 부신에영향을주는화합물의독성 부신의손상으로는스테로이드호르몬의과잉분비, 또는분비저하등부신내의내분비환경의변화에의한것외에여러가지의화학물질작용에의해손상이일어난다. 70

75 제 2 장 내분비계 5. 췌장 5.1 인슐린 1) 인슐린의작용과분비조절 1 인슐린의작용혈당유지에관계하는호르몬에는 glucagon, 부신피질호르몬, catecholamine, ACTH, 성장호르몬등이있다. 그러나이들은전부혈당을증가시키는작용을갖고있다. 이것에대하여인슐린은과혈당을막는중요한호르몬으로인슐린의부족은고혈당을초래한다. 기본적으로인슐린의분비는포도당이나아미노산등의기질에의해조정되고있다. 이인슐린은많은조직에작용하며, 특히간, 근육, 지방조직에많이분포한다. 간 :glycogen 합성촉진및분해억제, 해당계효소의유도와당신생계효소의유도억제 근육 : 당의소비촉진, 아미노산흡수촉진, 단백질합성촉진, 칼륨섭취촉진 지방조직 :glycogen 합성촉진, 지방합성촉진및분해억제, 단백질합성촉진 2 인슐린분비조절인슐린은췌장베타세포로부터분비되어혈당을저하시키는유일한호르몬으로인슐린분비조절인자는아래와같이여러가지이다.( 그림1-7) 촉진인자 : 당 (Glucose, mannose), 아미노산 (Arginine, lysine), 호르몬 (Glucagon, 소화관호르몬등 ), 미주신경자극, 교감신경 α-수용체차단, β-수용체자극, 지방산, 케톤, 양이온 ( 칼슘및칼륨이온 ), 약제 (Suphonyl urea, theophylline, monoamine oxidase 억제약 ) 억제인자 : 당대사길항물질 (2-deoxyglucose, serotonin, glucosamine), 호르몬 (Catecholamine, somatostatin 등 ) 71

76 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) < 그림 1-7> 인슐린의작용 2) 인슐린의의약품응용과안전성당뇨병에는인슐린의존성 (IDDM) 과비의존성 (NIDDM) 의두가지형태가있다. 인슐린은 IDDM의치료에필수적이며 NIDDM의경우는운동식사요법이중요하다. 인슐린제제에는속효형 ( 사람형제제 : 휴마린R, 펜프일R), 중간형 ( 사람형제제 : 휴마린 N, 노보린 N), 지효형 (Ultra dirt), 그외에 2상형 ( 펜프일 30R) 이있다. 주목되는것은주사에서비주사 ( 흡입 ) 제로변하고있는것이다. 인슐린제제의일반적인부작용은저혈당, 알레르기로특히저혈당에의한의식장애이다. 드물게쇼크와위장장애가있다. 약물상호작용도임상적으로중요하고알코올살리실산계의약품, 베타차단제, monoamine oxidase 억제약등은작용을증강시키며 thiazide계이뇨제, phenothazine계약이나스테로이드호르몬은작용을약화시킨다. 72

77 제 2 장 내분비계 5.2 화학물질에의한독성췌장도종종독성의표적이되어, 중증도의독성이발현한다. 췌장은내분비와외분비의기능을가지며, 특히내분비기능을갖는 Langerhans섬구상세포의손상은중요하다. 베타세포는췌도의약 70% 를차지하며인슐린을분비한다. 이베타세포가손상되면인슐린분비가억제되어당뇨병으로발전한다. 또한 alloxan이나 streptozotocin을장기투여하면췌도파괴에그치지않고신장손상 ( 사구체경화증 ), 망막증또는신경증이발현한다. 베타세포를손상하는대표적인화학물질은 alloxan, streprozotocin, chlorozotocin, cyproheptazin, furocemide, cyclosporine 등이있고 alloxan, streprozotocin 등은랫드에서췌도종양을발생시킬수있다. 73

78 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 6. 내분비독성 6.1 뇌하수체호르몬독성실험동물모델에서 estrogen 투여는뇌하수체의종양유도, prolactin의분비유도, prolactin 분비로인한종양의생성을유도한다 (Hart, et al., 1990). 감수성이있는동물종에서 estrogen을투여하면 serum prolactin level이올라가며뇌하수체안의 prolactin 세포수를증가시키고, tritiated thymidine의 gland 내로의 incorporation의증가, 세포분열활성의증가를일으킨다. 6.2 부신피질독성 1) 스테로이드합성저해독성물질에의한 cytochrome P450 효소의콜레스테롤합성및대사가저해되면세포질내지질의증가로인해산발적인지질방울들이생성되며피질세포층내의많은종류의 cytochrome P450이활성화된다. 이로인해내부 toxin들이활성화되고 reactive oxygen species(ros) 를생성한다. 2) 외부스테로이드유사체독성물질중외인성스테로이드유사체는뇌하수체에의한 ACTH 분비에있어서 negative feedback 저해를유도하고이는부신피질층중속상대에형태학적이상을가져온다. 몇몇의성호르몬들은부신피질의병변의증식을유발한다. 3~4개의탄소고리로이루어져있는지방족화합물들은부신피질에독성을가지고있다 (Yarrington et al., 1981, 1983, 1985). 양쪽에음전하를띄는그룹을갖고있는 3 탄소화합물들은특히부신피질층의속상대와망상대에서 necrosis를유발한다. 외인성스테로이드저해물질은정상기능의스테로이드의기능을막아 ACTH의분비를유도하고부신피질의증식을유발한다. 74

79 제 2 장 내분비계 3) 지질축적증유발물질들 Aminoglutethimide, amphenone, anilines 같은독성물질들은지질축적증을유발한다. tricresyl phosphate(tcp) 와다른 triaryl phosphate들은혈청으로부터의콜레스테롤이유입되고저장되는과정을저해함으로써콜레스테롤대사에결함을유발한다. Triaryl phosphate에의한 cytosolic neutral cholesteryl ester hydroxylate(nceh) 의억제는 cholesteryl ester 들의축적을일으켜부신피질과난소의간세포에서지질방울을생성한다. 이는 cholesterol을 cholesteryl ester로에스테르화하는효소 ACAT(Cholesterol acyltransferase) 가 27% 수준으로억제되고 cholesterol의세포내저장량을높여서지질방울을형성하게한다. 4) 인지질화유발 생물학적활성이있는양이온을띄는양친매성화합물들은속상체와망상체에서인지질화를유발시킨다. 5) 미토콘드리아와 smooth endoplasmic reticulum 의선택적파괴 여러물질들이부신피질 (Adrenal cortex) 에있는 mitochondria와 microsomal fraction의 hydroxylation 및다른기능에영향을미친다. 6) Angiotensin converting enzyme(ace) 의선택적저해 ACE가감소되면 angiotensin 1에서 2로의합성이감소되기때문이다. Aldosterone 의감소는 sodium chloride 의신장세뇨관재흡수를돕고재분비를감소시키며 serum potassium을증가시키고수분의재흡수가줄어들게되어혈액량과혈압을낮춘다. 7) Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase의선택적저해독성물질은 ACAT inhibition에의한직접적인세포독성또는선택적 ACAT 저해를통해독성을유발한다 (Dominick et al., 1993). 부신의형태학적변화를일으키는많은화학물질들은부신피질의기능에도영향을미치는데말초부위에서부신피질호르몬의활동을억제하거나, 호르몬합성또는분비를억제함으로써부신의기능에영향을미친다. 75

80 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 8) 병리학적변화와병변의증대 일부항생제투여한랫드에서세포내공포로가득차있는피질세포들에의해초기퇴화병변들이피질의비대를일으키기도한다. 9) 부신피질의기능측정법 Glucocorticoid 호르몬농도측정은혈액및뇨에서각각 creatinine 에대한비율로나타낸다. 성자극시험법은외부 ACTH에대응하는 glucocorticoid 분비증가정도를측정함으로써속상대와망상대의기능을테스트하기위한유용한방법이다. 현미경으로피질 / 수질의비율과기타부위의폭을측정하는방법도있다. 6.3 부신수질독성랫드의부신수질크롬친화성세포들은 salinonycin 처리 10시간내에 necrosis와세포용해작용이나타난다 (Chen Pan et al., 1999). 그러나부신수질은최고 24시간내크롬친화성세포들을다시채울수있으므로화학물질에의한독성은 24시간이내에쉽게회복된다. 6.4 갑상선 ( 난포세포 ) 독성 1) 갑상선난포세포독성설치류에서갑상선샘종양유발물질을급성으로투여하면난포세포의선종의진행을유발한다 (Capen et al., 1996b, 1998, 1999, 2006a; Hard 1988). 설치류에서갑상선의수용체매개성 TSH 자극은난포세포의증식에이상을가져오며세포수증가, 비대및신생물을생성한다 (Hill et al., 1998, 1999, Hurley et al., 1998). 설치류에서는 TSH의분비증가만으로도갑상선종 (thyroid tumor) 의발생률을높일수있다 (Ohshima and Ward, 1984, 1986). 76

81 제 2 장 내분비계 2) 기타갑상선독성 1 요오드흡수저해에의한갑상선호르몬합성을직접적으로억제하는화학물질의독성 2 갑상선호르몬분비저해물질 3 갑상선색소화또는콜로이드변화유발물질 : 일부물질들은설치류의 thyroid colloid에선택적으로위치하여비정상적인 clumping과콜로이드로호염기구증가증을일으킨다. 4 간 microsomal 효소유도 : 화학물질은간의 microsomal 효소들을유도하고랫드에서갑상선기능을방해한다. 6.5 정소독성 1) Leydig 세포의진행성병변의진행을유도하는물질 2) Testosterone 합성저해몇몇의 imidazole compound들은랫드정소에서 testosterone의합성저해에의해 leydig cell tumor의발병률을증가시킨다. 그외몇몇물질들은 leydig cell들의진행성병변의발병률을증가시키기도한다. 6.6 난소독성 1) 선택적에스트로겐수용체조절인자선택적에스트로겐수용체조절인자 (SERMs) 는몇몇의조직에서 estrogen agonist 으로작용하는물질들이며다른조직에서는 estrogen의길항제역할을한다 (Cohen et al., 2000). 77

82 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 제 2 절 내분비계안전성약리추가시험 1. 시험방법내분비계영향시험은각각의 endocrine controller의특이성때문에아직신약에있어규정된표준시험법이나기타관련연구자료가거의없으며, 일부화학물질과내분비교란물질에관한 OECD 등에서지정한국제가이드라인만이존재한다. 1.1 OECD 시험법 < 표 2-1> OECD 시험법의분류 포유류관련 In vivo 포유류관련 In vitro 1 비특이적 시험 - 설치류 최기형성 시험 - 설치류 임신지속 시험 - 토끼 착상시험 - 설치류 질 시험 - 설치류 행동변화 시험 2 에스트로겐관련시험 - 난할영장류시험 - 설치류자궁시험 - 설치류자궁내막증식시험 - 설치류질시험 - 설치류유선시험 - NeoDES 마우스모델 - 설치류행동변화시험 3 안드로겐관련시험 - 설치류악하감수성시험 - 랫드전립선모델 - 마우스저정낭 - 개전립선초음파그래프모델 1 비특이적 시험계 - 사람세포계의검색 T-47D 세포계 ZR-75-1 사람유선암 세포계 - 동물조직 초대세포 검색 소 자궁세포 원숭이난소모델 설치류 정소모델 2 에스트로겐 관련시험 - 사람초대세포 검색 - 사람세포계 검색 MCF-7 세포계 시스템 Shigawa 세포계 시스템 MDA-MB-231 CL10A 암세포계 T-47D 세포계 HeLa 세포계 - 동물조직 초대세포 검색 랫드 자궁세포 배양 랫드 뇌하수체 세포 배양 - 동물세포계 검색 형질도입 조류 배섬유아세포 형질전환 마우스 세포 - 효모 검색 78

83 제 2 장 내분비계 포유류관련 In vivo 포유류관련 In vitro 야생생물관련 3 안드로겐관련시험 - 동물의발생, 생식시험 - 성전환시험 - In vivo vitel l ogenin 유도시험 - 추가호르몬독성지표 - 무척추동물시험 - 패류의임포섹스 - 사람세포계 Sao-2, U2-OS 사람골아세포계 - 동물조직초대세포검색 마우스배자시상하부세포배양 - 동물세포계검색 형질도입 PC-12 신경세포 곤충세포계 - 효모검색 4 Cell free 시험계 ( 에스트로겐, 안드로겐 활성 ) - 수용체 결합시험 - 미소관 중합 - 에스트로겐-2- 수산화 효소 활성 - EIA 및 에스트로겐 측정 - 폭로된 사람의지표의개발 1.2 내분비계장애물질검색및시험자문위원회가제안한시험법 1) 1단계검색법 (Tier 1S, T1S) 1단계검색법은잠재적인호르몬기능을가지고있는혼합물이나화학물질등과호르몬기능이없는물질을구별함으로써, 더효과적으로물질을평가하는데그목적이있다. 제안된 1단계검색법배터리는에스트로겐, 안드로겐또는갑상선모두에작용하는것으로알려진내분비계장애물질을검색하는시험법이다. 1단계검색법은 in vivo와 in vitro 및비포유동물시험법을포함하며다음과같다. 1 In vitro 시험 에스트로겐수용체결합시험및리포터유전자시험 안드로겐수용체결합시험및리포터유전자시험 잘게썰은정소에서의스테로이드호르몬생성시험 장점 : 저농도에서민감성, 반응의특이성, 저비용으로단기간에다량분석가능, 자동화가능, 구조반응관계규명용이, 동물사용감소 79

84 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 수용체결합시험 : 에스트로겐, 안드로겐, 갑상선호르몬수용체결합평가, 대사효소계영향평가, agonist 또는 antagonist 구별, 용량반응관계규명 기능분석 : 전사활성 (Transcriptional activation) 2 In vivo 시험 설치류 3일자궁증식시험 ( 피하투여 ) 암컷설치류 20일성성숙및갑상선시험 설치류 5일에서 7일 Hershberger 시험 개구리변태시험 물고기정소 recrudescence 시험 장점 : 일반적인독성시험, ADME( 흡수, 분포, 대사, 배설 ) 설명가능, 전반적인내분비계평가가능 / 폭넓은기전연구, 위해도평가시사용되는 endpoint 평가 : 생식기관무게, 호르몬농도, 발생, 행동발달, 성장, 해부 / 외형관찰, 유전자활성, 비용, 기간, 단순성, 특이성, 민감성등이고려되어야함 3 대체시험 In vitro: 자궁아로마타아제 (Aromatase) 시험 In vivo: 변형된설치류 3일자궁증식시험 ( 복강내투여 ), 설치류 14일갑상선을포함한완전히성숙한수컷시험, 설치류 20일갑상선 / 성성숙수컷시험 장점 :1단계시험법의 3가지 ( 암컷설치류 20일성숙및갑상선시험, 설치류 5일에서 7일 Hershberger 시험, 호르몬합성능시험 ) 와대체할수있어시간과비용을줄일수있다. 선택적시험을혼합하는경우, 1단계검색법의 3가지 ( 암컷설치류 20일성성숙및갑상선시험, 설치류 5일에서 7일 Hershberger 시험, 호르몬합성능시험 ) 과대체할수있으므로시간과비용을줄일수있다. 목적 : 에스트로겐, 안드로겐, 갑상선호르몬의작용을확인, 특이성보다민감성이중요함 80

85 제 2 장 내분비계 2) 2단계시험법 1 2단계시험법 (Tier 2 Test, T2T) 이시험법의목적은사람이나야생생물에서의에스트로겐, 안드로겐, 갑상선호르몬에대한장애와용량의존성등을특징짓기위함이다. 2단계시험법은 1단계검색법의한구성요소이다. In vitro 검색시험법은호르몬체계를무너뜨리는물질을검색하는데매우높은감도를가지고있으며특별한형태의호르몬작용에대해높은선택성을가지고있다. 그러나실제동물체내에서의생물학적복잡성이결여되어있고이때문에위음성또는위양성을나타내는경우가있을수있다. 예를들면, 실제생체내에서호르몬수용체와결합하는모든물질이항상생체에나쁜영향을주는것은아니며, 또한모든내분비장애물질이반드시그수용체를경유하는것은아니다. 따라서본시험과정은중요한시기의삶의과정 ( 성성숙, 임신, 출산등 ) 보다폭넓은범위의용량의사용, 적절한물질의투여경로등을포괄하도록하는장기간의시험연구이다. 내분비장애작용에대한시험은수태능, 교미, 자궁내태자성장, 민감한신생자의성장과발달및성적미성숙시기에서성적성숙기로의전환에서의효과를알아볼수있도록적어도 1세대시험 ( 최기형성시험 ) 을포함시킨다. 원칙적으로 2단계시험법은어떤물질의내분비장애작용을유도하는농도와위해도평가를위해내분비장애결과를평가해야만한다. 2 포유동물을이용한시험법 2세대생식독성시험 ( 다세대독성시험 ) 대체생식독성시험 81

86 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2. 최신논문자료에서의시험법 Methyltestosterone 의랫드 28일경구독성시험 (Enhanced OECD test guideline 407) 1 사용동물 :Male/female 5 주령 SPF Wistar 랫드 2 관찰및측정항목 : 일반행동관찰, 체중및사료섭취량, 신경독성측정 (FOB), 암컷성주기확인, 혈액학측정 (Red cell count, hemoglobin, hematocrit, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular, hemoglobin concentration, white cell count and differential count and platelet count), 혈액생화학 (Total bilirubin, glucose, urea, creatinine, total protein, albumin, total cholesterol, triglycerides, chloride, sodium, potassium, calcium, inorganic phosphorus concentrations, aspartate aminotransferase and alkaline phosphatase) 3 호르몬 assay(specific radio-immunoassay kits 이용 ):TSH, T3, T4, luteinizing hormone(lh) level 측정 ( 암, 수모두 ), testosterone 함량 ( 수컷 ), oestradiol level( 암컷 ) 4 부검및장기중량측정 : 모든장기와기관의절대, 상대장기중량 5 조직병리 : 정자형태, 수, 활동성관찰 6 TUNEL assay:tunel 염색후 100 sertoli cell당 apoptotic germ cell의수계수 7 결과 : 수컷에서혈중 T4 함량증가, 암컷에서 TSH 함량증가및 T3 함량약간감소, 수컷에서 LH 함량감소, oestradiol level 증가, 비정상형태의정자수증가, apoptotic germ cell 수증가 2.2 붕소화물질에서의생식, 발생및내분비독성 1 관찰및측정항목 :peripheral 호르몬분석 ( 혈중 FSH 함량분석 ) 2 실험결과 :SD rat에서투여 30~60일투여 with 500 to 2000 ppm boron 투여시 FSH 수치상승, 투여중지후에도 FSH level은 8개월간지속, swiss 마우스와 F344 랫드에서혈중 testosterone 함량저하 82

87 제 2 장 내분비계 2.3 Pentabromodiphenyl ether 혼합물의 Wistar rat에서 28일경구투여후내분비계영향시험 1 관찰및측정항목 : 장기중량, 혈중 thyroid hormones thyroxin(t4), triidothyronin (T3) 함량측정 (radioimmunoassay), 랫드부신에서의 17-hydroxylase/17,20-desmolase (CYP17) 활성과난소에서의 aromatase(cyp19) 효소활성측정 2 결과 : 수컷에서 epididymis, seminal vesicle, prostate, thymus 장기중량의감소, 암수모두에서신장중량증가, 정자두부의기형율증가, T4 혈중농도감소, 암컷에서 CYP17활성의증가등 2.4 Tetrabromobisphenol-A(TBBPA) 의 wistar rat에서의단일세대생식독성시험과아급성독성시험 1 관찰및측정항목 : 혈중 thyroid hormones thyroxin(t4), triidothy ronin(t3) 함량측정 (Radioimmunoassay), estradiol, testosterone level 측정 (Radioimmunoassay), 난소에서의 aromatase(cyp19) 효소활성측정, 정자검사, 성주기검사등 2 결과 : 혈중 T4 농도가감소하고 T3 증가 83

88 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 제 3 절 내분비계에영향을주는약물및사례 1. 내분비계에영향을주는약물임상시험시 propranolol, ipodate, iopanaic acid, amiodarone은 T4에서 T3로의전환을감소시켜 T4 증가, T3의감소를일으킬수있으며 TSH level은정상이거나높다. 이는 hypothyroidism( 갑상선기능저하증 ) 의원인이되며, hypothyroidism이없는 thyrotoxicosis( 갑상선중독증 ), thyroiditis( 갑상선염 ) 를유발할수도있다. 2. 약물사례 2.1 호르몬및호르몬유사체에의한영향 물질또는유발인자영향 initial estrogen calcitonine chloroquine troparanol chl orphentermine F344 holzman 랫드에투여후 2~4 일내에뇌하수체내 DNA 합성률증가 뇌하수체호르몬의농도를측정한결과 SD rat 에서 TSH level 2.1 배상승, fisher rat 에서는무영향수컷 SD 랫드에서 thyroid 무게가 43% 가량감소, 혈청내 α -subunit 이 20 배이상증가, fisher rat 에서는 4 배증가 부신피질속상체와망상체에서인지질화유발 84

89 제 2 장 내분비계 2.2 부신피질독성유발물질 물질또는유발인자영향 acrylonitrile 3-aminopropionitrile 3-bromopropionitril e 1-butanethiol 1,4-butanedithiol o, p-ddd 와 α-(1,4-dioxido-3-methylquinoxal in-2-yl)-n-methylnitrone (DMNM) 부신피질층의 속상대와 망상대에서 necrosis 유발 (Szabo et al., 1980) 미토콘드리아와 smooth endoplasmic reticulum 의 선택적 파괴 CYP450 대사와 독성 대사체 생성에 영향 o, p-ddd 는 부신피질 속상대와 망상대 (cor tisol 과 성호르몬 생성 구역 ) 에서 공포변성을 유발함과 함께 aldosterone 생성 구상대에 서 미토콘드리아 퇴화 유발 개에서는 o, p-ddd 에 대해 사람에서보다 더 민감 (Har t et al., 1971) carbon tetrachloride 지질과산화, 부신피질세포내거대분자들과공유결합 captopril 고혈압치료제의경우 ACE 를억제하여부신피질에서외부구상대의형태학적이상을유발 ACAT 저해제 부신피질의 속상대와 망상대의 퇴화 유발 ( 종별 sensitivity 는 개 > 기니픽 > 토끼 > 원숭이 > 랫드 순 ) 18-α-hydroxylation 의 저해를 통해 직접적으로 aldosterone 합성 저해 spironol actone 과 captopril renin angiotensin system II 를억제함으로서간접적으로구상대의형태학적이상에영향 corticosteroid 자체가기형유발물질 ( 예 : 구순구개열 ) 항생제 α- (1,4-dioxido-3-methylquinoxalin -2-yl)-N-methylnitrone(DMNM) 랫드에서세포내공포로가득차있는피질세포들에의해초기퇴화병변들이부신피질의비대유발 85

90 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2.3 갑상선난포독성유발물질 물질또는유발인자영향 thiouracil 과그유도체, braccica seed 및 erythrosine perchlorate sodium chl orate (NaCl O3) thiourea, propylthiourea(ptu), sulfonaminde(sulfamethazine, methimazol e, carbimazol e, aminotriazole, acetoacetamide) 마우스와랫드에서직접적으로갑상선호르몬의합성및분비방해갑상선호르몬이화작용증가, 담즙내로분비증가, 말초에서 T4 에서 T3 로변환을방해, 순환하는 thyroid hormone 의감소는보상기전으로서뇌하수체 TSH 의분비를증가시킴 (Hotz et. al., 1997) 요오드흡수저해, sodium-iodide symporter 의작용을억제하여갑상선난포세포로요오드가이동하는것을경쟁적으로방해 (Soldin et al., 2001) sodium-iodide symporter 를억제, 랫드음수투여시갑상선난포세포종양의발병률을높임 (Hooth et al., 2001) thyroid peroxidase 의저해에의한유기화의결함 (thyroid hormone 합성감소 ) Lithium 갑상선호르몬의분비저해 항생제 minocycline 갑상선색소화또는콜로이드에서의변화유발, 동물과사람의갑상선조직에서흑색의탈색화, follicular cell 안에갈색색소 granule 생성 CNS- 작용 약물 (penobarbital, benzodiazepine 류 ), 칼슘채널 저해제 (nicardipine, bepridil) steroid(spironol actone), retinoid 들, chl orinated hydrocarbon(chl orl ane, DDT, TCDD), pol yhal ogenated biphenyls(pcb, PBB) 등 간 microsomal 효소유도 (Waritz et al., 1996) pyrethrin 살충제 성분 수컷랫드에서 thyroid gland 무게증가 ( 난포세포비대 ) 및세포 DNA 합성증가 86

91 제 2 장 내분비계 2.4 부갑상선독성유발물질 물질또는유발인자영향 오존 al uminum L-asparaginase 0.75 ppm 오존의 4 8 시간단회투여에의해부갑상선의형태학적변화 (Atwal and wilson et al., 1974) 48 시간노출후 1 5 일이후에많은주세포들의비대와세포증식, 미세혈관내피세포증식, interstitial edema, 혈관내피세포의퇴화, 혈소판혈전생성, 분비선에서큰혈관으로의백혈구침투, 기저막의손상등을유발 주세포의 diglyceride 농도감소, PTH 분비저해 phosphatidil choline 의합성감소 토끼에서부갑상선주세포들은 L-asparaginase 에의해선택적으로파괴 2.5 정소독성유발물질 물질또는유발인자영향 cadmium 2-acetoaminofluorene 등 leydig 세포의진행성병변의진행을유도하는물질 androgen receptor antagonist 5 α-reductase 저해제 testosterone biosynthesis inhibitor aromatase inhibitor DOPAmine agonists GnRH agonist estrogen agonists/antaginosts l ansopazol e flutamide( 비스테로이드성항안드로젠물질 ) leydig cell hyperplasia 유발 testosterone 농도저하, LH 농도증가, leydig cell 의증식율증가, 랫드급성시험에서양성종양의발병률증가 target cell 에서 testosterone 을떼어내고뇌하수체 - 시상하부에서 negative feedback 을감소, LH 와 FSH 의농도상승 87

92 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2.6 난소독성유발물질 물질또는유발인자영향 nitrofurantoin tamoxifen, toremifene ( 선택적에스트로겐수용체조절인자 (SERMs)-triphenylethylene SERM) 마우스에 2 년간고농도투여시난소종양의발병률증가및난소피질의형태학적이상을유발 estrogen antagonist 효과, 유방암치료에이용, 뼈와 serum lipid 에서 estrogen agonist 효과, 자궁과유방에서는 antagonist 작용 ral oxif ene-benzothiophene raloxifene SERM tamoxifen 과는상반되는작용, 자궁내벽자극, 마우스에급성으로투여하였을때난소종양의발병률증가 (Delmas et al., 1997) estrogen receptor 에붙어서시상하부에서 estrogen 의 negative feedback 을저해, 순환하고있는 LH 의농도를증가시킴 (Yang et al., 1996) 88

93 제 2 장 내분비계 제 4 절 참고문헌 1. Hart JE (1990) Endocrine pathology of estrogens: Species differences. Pharmac Ther 47: Yarrington JT, Huffman KW, Gibson JP (1981) Adrenocortical degeneration in dogs, monkeys, and rats treated with I-(1,4-dioxido-3-methylquinoxalin-2-yl) -N-methylnitrone. Toxicol Lett 8: Yarrington JT, Huffman KW, Lesson GA. et al. (1983) Comparative toxicity of the hematinic MDL 80, 478-effects on the liver and adrenal cortex of the dog, rat and monkey. Fundam Appl Toxicol 3: Yarrington JT, Loudy DE, Sprinkle DJ, et al. (1985) Degeneration of the rat and canine adrenal cortex caused by i-(1,4-dioxido-3-methylquinoxalin-2-yl)- N-methylnitrone (DMNM). Fundam Appl Toxicol 5: Szabo S, Huttner I, Kovacs K, et al, (1980) Pathogenesis of experimental adrenal hemorrhagic necrosis("apoplexy"). Ultrastructural, biochemical, neuropharmacologic, and blood coagulation studies with acrylonitrate in the rat. Lab Invest 42: Hart MM Swackhamer ES, Straw JA (1971) Studies on the site of action of o,p'-ddd in the dog adrenal cortex. II. TPNH-and corticosteroid precursor-stimulation of o,p'-ddd inhibited steroidogenesis. Steroids 17: Dominick MA, Bobrowski WA, MacDonald JR, et al. (1993) Morphogenesis of a zone-specific adrenocortical cytotoxicity in guinea pigs administered PD , an inhibitor of acyl-coa; cholesterol acyltransferase. Toxicol Pathol 21: Dominick MA, McGuire EJ, Reindel JF, et al. (1993) Subacute toxicity of a novel inhibitor of acyl-coa: Cholesterol acyltransferase in beagle dogs. Fundam Appl Toxicol 20:

94 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 9. Chen-Pan C, Pan IJ, Yamamoto, Y, et al. (1999) Prompt recovery of damaged adrenal medullae induced by salinomycin. Toxicol 27: Capen CC: George Scott memorial lecture on mechanistic toxicology, in The Toxicology Forum. Proceedings of the 1996 Annual summer Meeting, Aspen, CO, 7-12 Kuly 1996b, pp Capen CC (1998) Correlation of mechanistic data and histopathology in the evaluation of selected toxic endpoints of the endocrine system. Toxicol Lett : Capen CC (1999) Thyroid and parathyroid toxicology, in Harvey PW, Rush K, Cockburn A (eds.): Endocrine and Hormonal Toxicology. Sessex, England: John Wiley & Sons, Ltd., pp Capen CC: Comparative toxicology of the thyroid gland. Proceedings of the Midwest Regional Chapter of the Society of Toxicology. Lincolnshire IL, 12 May 2006a 14. Hard GC (1998) Recent debelopments in the investigation of thyroid regulaton and thyroid carcinogenesis. Environ Health Perspect 106: Hotz KJ, Wilson AGE, Thake DC, et al. (1997) Mechanism of thiazopyr-induced effects on thyroid hormone homeostasis in male Sprague-Dawley rats. Toxicol Appl Pharmacol 142: Hill RN, Crisp TM, Hurley PM, et al. (1998) Risk assessment of thyroid follicular cell tumors Environ Health Perspect 106: Hill RN, Erdreich LS, Paynter O, et al. (1999) Assessment of thyroid Follicular cell tumors. Risk Assessment Forum, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC, pp Hurley PM, Hill RN, Whiting RJ (1998) Mode of carcinogenic action of pesricides inducing thyroid follicular cell tumors in rodents. Environ Health Perspect 106: Ohshima M, Ward JM (1986) Dietary iodine deficiency as a tumor promoter and carcinogen in male F344/NCr rats. Cancer Res 46:

95 제 2 장 내분비계 20. Ohshima M, Ward JM (1984) Promotion of N-methyl-N-nitrosourea-induced thyroid tumors by iodine deficiency in F344/NCr rats. JNCI 73: Soldin OP, Braverman LE, Lamm (2001) Perchlorate clinical pharmacology and human health: A review. Therap Drug Monit 23: Hooth MJ, DeAngelo AV, Gerge MH, et al. (2001) Subchronic sodium chlorate expodure in dringing water results in a concentration-dependent increase in rat thyroid follicular cell hyperplasia. Toxicol Pathol 29: Waritz RS, Steinberg M, Kinichita FK, et al. (1996) Thyroid function and thyroid tumors in toxaphene-treated rats. Regul Toxicol Pharmacol 24: Atwal OS, Wilson T (1974) Parathyroid gland changes following oxone inhalation. A morphlogic study. Arch Environ Health 28: Cohen IR, Sims ML, Robbins MR, et al. (2000) The reversible effects of raloxifene on luteinizing hormone levels and ovarian morphology in mice. Reprod Toxicol 14: Delmas PD, Bjarnason NH, Mitlak BH, et al. (1997) Effects of raloxifene on bone mineral density, serum cholesterol concentrations, and uterine endometrium in postmenopausal women. N Engl J Med 337(23): Yang NN, Venugopalan M, Hardikar S, et al. (1996) Identification of an estrogen response element activated by metabolites of 17β-estradiol and raloxifene, Science 273: Mary-Line Jugan et al. (2010)Endocrine disruptors and thyroid hormone physiology, Biochemical Pharmacology 79: Sheila Wason et al., (2003) 17-Methyltestosterone: 28-day oral toxicity study in the rat based on the "Enhanced OECD Test Guideline 407" to detect endocrine effects, Toxicology 192: Patricia A. Fail et al. (1998) General, reproductive, developmental, and endocrine toxicity of boronated compounds,, Reproductive Toxicology. 12(1): l

96 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 31. Leo T.M. van der Ven et al. (2008) A 28-day oral dose toxicity study enhanced to detect endocrine effects of a purified technical pentabromodiphenyl ether (pentabde) mixture in Wistar rats, Toxicology Leo T.M. Van der Ven. (2008) Endocrine effects of tetrabromobisphenol-a (TBBPA) in Wistar rats as tested in a one-generation reproduction study and a subacute toxicity study, Toxicology OECD Test Guideline 407, OECD. 34. U.S. EPA, Endocrine Disruptor Screening Program-Report to Congress, USA, 독성학이영순, 청구문화사

97 제 3 장 근골격계 제 3 장 근골격계 제1절근골격계안전성약리시험 95 제2절근골격계안전성약리추가시험 98 제3절근골격계에영향을주는약물및사례조사 108 제4절참고문헌

98

99 제 3 장 근골격계 Chapter 03 근골격계 제 1 절 근골격계안전성약리시험 1. 근골격계안전성약리시험근골격계란인체를구성하는결체조직, 골, 근육, 연골, 인대와관절을총칭하는것으로신체다른조직의지지역할, 기관과연조직의보호역할, 근육의지렛대역할등을수행한다. 특히네가지의주요조직유형중하나인근조직은주로근세포 ( 또는근섬유라한다 ) 로구성되어있으며, 이세포들은수축을위해고도로분화되어있다. 근조직에는골격근 (Skeletal muscle), 심근 (Cardiac muscle), 평활근 (Smooth muscle) 의세가지유형이있다. 골격근조직으로는결합조직, 신경및혈관도함께포함되어있다. 1.1 골격근의체계 1) 결합조직체계 (Connective tissue organization) 결합조직은세가지의결합조직층인바깥의근외막 (Epimysium), 가운데의근다발막 (Perimysium), 안쪽의근내막 (Endomysium) 으로구성된다. 근육전체는치밀교원섬유층인근외막로둘러싸여있다. 근외막은근육을주위의조직들및기관들과격리시킨다. 근다발막의결합조직섬유들은골격근을일련의구획들 (Compartments) 로나누며, 각각의구획들은근다발 (Fascicle) 이라하는근섬유다발을수용하고있다. 근다발막은교원섬유와탄성섬유와함께근다발에혈류를유지시키고신경지배하는혈관과신경들을수용하고있다.( 그림1-1) 95

100 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) < 그림 1-1> 골격근의체제 골격근은근외막으로에워싸여져있는근다발들로구성된다. 근다발들은결합조직섬유로된근다발막에의해격리되며, 각각의근다발내에는근섬유들이근내막에의해둘러싸여있다. 각각의근섬유는많은천층핵들뿐만아니라미토콘드리아및기타세포소기관들도갖고있다. 근다발내에서는, 섬세한결합조직인근내막이골격근섬유를둘러싸며인접근섬유들과묶어놓는다. 흩어져있는성상세포 (Satellite cells) 는근내막과근섬유사이에위치한다. 이세포들은손상된근조직을복구하는기능을한다. 근내막과근다발막의교원섬유들은서로얽혀있으며, 근다발막의교원섬유들은근외막의근외막의섬유들과서로얽혀있다. 근육의양끝에서, 근외막의교원섬유들은서로합쳐져건 (Tendon) 이라하는다발이나건막 (Aponeurosis) 이라하는넓은시트 (Sheet) 를형성한다. 치밀정형결합조직의예인건과건막은골격근을뼈에부착시킨다. 건의섬유들은근외막과서로얽혀있으며골간질내로뻗어나가단단한부착을제공한다. 그결과, 근육의모든수축은건과건이부착되어있는뼈를당기는힘을발휘한다. 96

101 제 3 장 근골격계 2) 혈관과신경 (Blood vessels and nerves) 근외막과근다발막의결합조직은근섬유들에공급되는혈관과신경을수용하고있다. 근수축은막대한양의에너지를필요로한다. 대규모의혈관망이산소와양분을공급하고활동하는골격근에의해산출된대사폐기물들을실어나간다. 대부분의경우혈관들은신경과함께근육으로들어가고, 혈관과신경은근다발막까지동일한패턴으로가지를친다. 일단근내막안에들어가면, 소동맥은개개의근섬유들을둘러싸고있는모세혈관망에혈액을공급한다. 골격근은오직중추신경계 (CNS) 에서오는자극에의해서만수축한다. 근외막을관통하는축색 (Axon), 즉신경섬유 (Nerve fibers) 는근다발막을통해가지를치고근내막으로들어가개개의근섬유들을지배한다. 골격근은종종수의근 (Voluntary muscles) 이라불리는데, 이들의수축을수의적으로조절할수있기때문이다. 아울러이골격근중많은수가불수의적으로조절되기도한다. 예를들면, 횡격막과같이호흡에관여하는골격근들은보통불수의적인조절하에움직인다. 1.2 근골격계시험의목적 ICH 지침에따르면근골격계기능에대한평가에대한자세한내용은기술되어있지않지만약물에의해골조직및근육조직에대한잠재적인영향에대한평가가이루어져야하기때문에기존에알려진근골격계기능을판단하는 in vitro 및 in vivo 시험을응용하여약물의근골격계기능에대한안전성약리학적인측면에서추가시험이필요할것이다. 97

102 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 제 2 절 근골격계안전성약리추가시험 1. Alkaline phosphatase(alp) assay 1.1 목적및의의 Alkaline phosphatase는간담계질환, 골질환등에서증가하며근골격계질환의지표가되는효소로써골기질에활발하게조골세포가축적될때많은양의효소가분비된다. Phosphatase는 aliphatic과 aromatic phosphate ester에작용해가수분해를통해 phosphate로 release시키는효소이다. 조직비특이적 ALP중 bone-specific isozyme 은 bone type alkaline phosphatase라고한다. ALP는석회화작용 (Calcification site crystallization) 을저해시키는 pyrophosphate를기능저하시켜골형성 (Osteogenesis) 을유도하며, organic phosphate ester을억제 (Degradation) 하여뼈를구성하는 inorganic phosphate 농도또한증가시키면서골형성을유도하는작용을한다. 그러나 ALP는다른장기에서도발견되므로, 정확한뼈활성도측정을위해서는검사전 ALP의증가요인을배제시켜야한다. 일반적으로이효소는혈액 1 l당 30~130 IU 정도존재하는것으로알려져있다. 1.2 원리및방법 Diethyltetraamine 완충액 (ph 9.8) 중에서 p-nitrophenyl phosphate는시료중의 ALP의작용에의해서 p-nitrophenol로유리된다. P-nitrophenol의생성속도를측정하여시료중의 ALP의활성치를구한다. p-nitrophenyl phosphate + H 2 O phosphate + p-nitrophenol 1.3 결과해석 Alkaline phosphatase는체내여러기관에넓게분포되어있는데, 그기원은조골조직에서유래한것이많은것으로알려져있다. 따라서구루병, 섬유성골염, 상피소체기능항진병, Paget 병, 전이성골염, 골연화증등의조골조직의질환에서볼수있고, 질병의상태에병행하여혈청중의 alkaline phosphatase 활성도의상승이보인다. 또폐쇄성황달, 급성간염, 간경변, 전이성간암등에서상승한다. 98

103 제 3 장 근골격계 2. C-reactive protein(crp) 2.1 목적및의의 C-reactive protein은 Streptococcus pneumoniae의표면항원인 C-polysaccharide와반응하는단백질로서급성기반응물질의하나이다. 급성기반응물질이란염증 ( 감염, 자가면역질환등 ) 이나조직손상 ( 외상, 수술, 심근경색, 종양 ) 에비특이적으로반응하여농도가변하는물질들을가리키는용어로그중가장대표적인물질이 C-reactive protein이다. 이런질환이있는환자들에서 cytokine, 주로 interleukin-6가간세포를자극하여 C-reactive protein의생산을촉진한다. C-reactive protein은감염성질환이나자가면역질환의진단, 경과관찰에이용할수있고, 최근에는 C-reactive protein 의농도가높을때뇌졸중과심근경색증의위험도가높다는사실이알려져이러한질환의위험인자로서의기능도활발히연구되고있다. 이런용도로 C-reactive protein 을이용할때는일반염증성질환에서보다더낮은농도를정확히측정할필요가있어민감도를높인고민감도 C-reactive protein시험이개발되었다. 2.2 원리및방법혈액샘플을면역검사 (Immunoassay) 를이용하여 C-reactive protein을측정한다. 면역검사는항원항체반응을이용한검사로, 측정하고자하는물질에선택적으로결합하는항체를이용해서원하는물질을측정할수있다. 대표적인면역검사의종류와원리는다음과같다. 실험실별로사용하는방법과구체적인반응조건은약간차이가있을수도있으나기본원리는거의동일하다. 1) 응집법 (Particle immunoassay) 항원과항체의결합에의해응집반응이나타나는것을이용한다. 대개적혈구나라텍스, 젤라틴등에항원이나항체를부착시켜이입자가반응하면응집을나타내는것을측정한다. 응집측정은빛의흡수정도를혼탁측정법 (Turidimetry) 으로측정하거나빛의산란정도를비탁법 (Nephelometry) 로측정할수있다. 99

104 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 2) 효소면역측정법 (Enzyme immunoassay, EIA) 항원과항체의결합을효소반응 (Enzyme reaction) 을이용하여측정한다. 대개측정하고자하는물질에결합하는항체에효소를미리부착시켜놓고항원항체반응을일으킨다. 그후결합한효소에반응하는기질을넣어주면효소반응이일어나게된다. 흔히이용하는효소는알카리성인산분해효소 (Alkaline phosphatase), 고추냉이과산화효소 (Horseradish peroxidase), 베타갈라토시다제 (β-galactosidase) 등이있다. 효소반응의산물은대개색깔을띠는물질로이를분광광도계 (Spectrophotometer) 로측정한다. 3) 방사면역측정법 (Radioimmunoassay, RIA) 항원과항체의결합을방사성동위원소 (Radioisotope) 를이용하여측정한다. 방사성동위원소란물리적으로불안정하여자연적으로붕괴 (Radioactive decay) 를일으키면서안정한물질로바뀌고, 이과정에서방사선을방출하는물질이다. 측정하고자하는물질과같은물질에방사성동위원소를부착하거나, 또는측정하고자하는물질에반응하는항체에방사성동위원소를부착하여항원항체반응을일으킨다. 반응이끝난후반응물에서나오는방사선의양을측정하여원하는물질의농도를계산해낼수있다. 4) 형광면역측정법 (Fluoroimmunoassay, FIA) 항원과항체의결합을형광반응 (Fluorescence) 을이용하여측정한다. 형광반응이란형광물질이특정파장의빛을흡수하여형광물질의분자가여기 (Excitation) 되었다가다시원래의상태로돌아오면서흡수한빛과는다른파장의빛을내는반응을말한다. 면역측정에이용할때에는측정하고자하는물질과같은물질에형광물질을부착하거나, 또는측정하고자하는물질에반응하는항체에형광물질을부착하여항원항체반응을일으킨다. 반응이일어난후형광반응을일으킬수있는파장의빛을투사하면형광물질의양에비례하여형광을내고, 이형광의양으로부터측정물질의농도를계산한다. 100

105 제 3 장 근골격계 5) 화학발광면역측정법 (Chemiluninescence immunoassay, CLIA) 항원과항체의결합을화학발광반응 (Chemiluminescence) 을이용하여측정한다. 화학발광반응이란화학발광물질이여기 (Excitation) 되었다가기저상태 (Ground state) 로돌아오면서빛을발하는현상으로, 분자를여기시키는에너지가빛이아닌화학반응이라는점에서형광과다르다. 면역측정에이용할때에는다른방법들과마찬가지로측정하고자하는물질과같은물질에화학발광물질을부착하거나, 또는측정하고자하는물질에반응하는항체에화학발광물질을부착하여항원항체반응을일으킨다. 반응이일어난후필요한화학반응을일으킨후, 발산되는발광의정도를측정하여이로부터측정물질의농도를계산한다. 대표적인발광물질로는루미놀 (Luminol), 이소루미놀 (Isoluminol), 아크리디늄에스터 (Acridinium ester) 등이있다. 2.3 결과해석정상적인 C-reactive protein의중앙값 (Median) 은 1 mg /l이며 99 백분위수값은 10 mg /l이다. 세균성감염같은급성질환환자에서 300 mg /l까지도증가할수있다. 관상동맥질환위험도의계산에있어서는 1 mg /l 이하를저위험도, 1~3 mg /l 를중간위험도, 3 mg /l 이상을고위험도로분류할수있다. 뇌졸중에대해서는연구자별로여러결과를내놓고있어아직정확한위험수치는정해지지않았다. 감염성질환, 자가면역질환에서는진단적도구로서의기능보다는치료후변화양상을보면서치료효과판정을보는데에더유용하다. 101

106 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 3. Alizarin red S 염색법 3.1 목적및의의 Alizarin red S는금속이온과결합하는성질이있기때문에체내의칼슘침착부를염색한다. 이런이유로생화학분야에서사용되고있다. 예를들면, 골조직의석회화를비색정량할때사용된다. 정상인골에서는세포외기질이형성된다. 이세포외기질에서석회화가진행된다. 이때문에초기단계의기질석회화를식별하기위해사용된다. 3.2 원리및방법 Alizarin red S를증류수에용해시킨후, 0.5% ammonium hydroxide를이용하여 ph를 4.1~4.3에맞춘다. 1) 슬라이드제작필요한조직을희생시킨동물로부터회수하여 10% formalin으로고정시킨후알코올로탈수하고 xylene으로치환한다. 파라핀침투과정을거친후포매하여블록을제작한다. 이렇게준비된파라핀블록을회전형박절기 (Microtome) 를사용하여 10 μm로절단하여조직슬라이드를제작한다. 2) 염색방법염색을위하여조직을다시 deparraffinization과 hydration 시킨후최종적으로증류수에수세한다. 염색의정도에따라 30초에서 5분간제조한 alizarin red S solution로염색시킨다. 이때주기적으로세포의염색정도를광학현미경으로관찰한다. 염색이끝난후에는 acetone과 acetone-xylene(1:1) 에 20번씩세척한후 xylene으로 clear 단계를완료하고 permount로봉입 (Mount) 하여슬라이드제작을완료한다. 102

107 제 3 장 근골격계 4. Creatine phosphokinase assay 4.1 목적및의의근육과심근에서나오는효소로서근육조직이파괴되거나손상되었을경우혈중수치가증가하며주로심근, 골격근, 뇌에서발견된다. 크레아틴포스포키나제는 CK-BB, CK-MB, CK-MM 3가지동종효소로분류되며 CK-MB는손상된심근세포에대한특이한지표가된다. CK-MB 수준은경색시작후 3~6시간내에오르기시작하여 12~24시간후최고에달하고 12~48시간후정상으로되돌아온다. 따라서심근경색진단을위해흉통이있은후 24시간이내에환자의 CPK-MB 수준을측정한다 ( 정상 :CK-MB 0~5 ng/ ml ). 파골세포를배양하면서골흡수활성을측정하고자할때 plate 바닥면에 calcium-phosphate nano crystal을초박막코딩한 osteoclast activity assay substrate(oaas) plate를사용한다. Osteoclas는 bone marrow의 stem cell에서나온 macrophage forming units(cfu-m) 인 hematopoietic progenitors에서유래한거대한다핵세포로골의석화화바탕질의파괴와흡수에큰역할을하는세포이다. 그크기는지름이 20~100 μm에이르며핵의수는 6~50개로다양하다. Osteoclasts의생성과활성화는 osteoblast에서분비되는 macrophage colony stimulating factor(m-csf), osteoblast differentiation factors(odfs), transforming growth factor-β(tgf-β) 등에의해서조절된다. 103

108 >>> 안전성약리시험해설서 (Ⅵ) 5. 콜라겐유도관절염모델 5.1 목적및의의류마티스관절염은관절의만성염증과더불어서서히진행되는관절의파괴가특징인질병이다. 특히활막에서발생하는염증, 그로인한관절의연골과뼈의파괴및변형이주증상이다. 실험모델로서 2형콜라겐유도관절염모델 (Collagen induced arthritis, CIA) 이대표적으로사용되고있다. 2형콜라겐을접종함으로써관절염을유도하며, Th1 반응이우세하여임상학적, 조직학적으로인간의류마티스관절염과매우유사한장점을가지고있다. 따라서만성관절염의병인과분자수준의기전을연구하고새로운약물을개발하는데다양하게이용되고있다. 5.2 원리및방법 1) 제 2 형콜라겐 (Native bovine type II collagen, BnCII) 준비 10 mm acetic acid를이용하여 4 mg / ml로녹인후 4 mg / ml의 complete freund adjuvant(cfa) 와균질기를이용하여 1:1 비율로혼합한다. 2) 실험동물 6~8 주령 DBA/1J male mice 를사용한다. 3) 주입 CIA 유발을위하여 BnCII과 CFA 혼합액 50 μg을주사기를이용하여꼬리에피하주사한다. 3주후동일한혼합액을추가접종하여 CIA를유발시킨다. 4) 관찰및평가 1 임상학적관찰및평가관절염의유도여부및발생정도는쥐의사지에서나타나는부종의유무에따라평가한다. 1차주사후주 1회관찰하며, 3주이후에는 2~3회관찰하여시기별관절염중증정도를평가하여기록한다. 점수는각마리당 16점을최대값으로산정한다. 104

109 제 3 장 근골격계 중증도 0 중증도 2 중증도 3 중증도 4 부종이나종창이없음발목관절과발관절에약한부종과발적발목관절과발목뼈에중증의부종과발적발목에서발가락에걸친부종과발적 2 조직학적검사관절의조직학적변화를관찰하기위하여발목관절을 formalin으로고정한후 calci-clear rapid를이용하여탈회시킨다. 흐르는물로조직내에남아있는포르말린과탈회액을제거한다. 50% 알코올부터무수알코올까지농도를올리면서탈수하고 xylene 으로치환한다. 파라핀침투과정을거친후포매하여블록을제작하고, 준비된파라핀블록을회전형박절기를사용하여 7 8 μm두께로자른뒤슬라이드위에놓고 xylene, 무수알코올부터 50 % 알코올순으로탈파라핀과정을거쳐수돗물에세척한다. Hematoxylin과 eosin으로염색을실시한다. 3 조직면역염색방법 (Immunohistochemistry) 조직학검사를위해서만들어진파라핀조직슬라이드에서 xylene을이용하여파라핀을제거한후 PBS로함수시킨다. Digest-All3(Zymed lab, USA) 을처리하여외부물질의투과를용이하게한후, hydrogen peroxide block(labvision corporation, USA) 을이용하여내인성 peroxsidase를제거한다. 10% BSA/PBS 용액으로조직의 non specific binding을제거한다음일차항체를알맞은비율로희석시켜 4 에서 overnight 시킨다. 이후 HRF-conjugated secondary antiobdy와 1시간동안실온에서반응시킨후 avidin-biotin complex kit(zymed lab, USA) 으로발색시켜 Gill's hematoxylin으로교차염색한다.( 그림2-1) < 그림 2-1> 조직학적검사 105