공개특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 1/12 ( ) C12N 13/00 ( ) C12P 7/64 ( ) (21) 출원번호 1

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선자 야
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 1/12 ( ) C12N 13/00 ( ) C12P 7/64 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2011 년 09 월 15 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2013 년 04 월 12 일 (86) 국제출원번호 PCT/FR2011/ (87) 국제공개번호 WO 2012/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2012 년 03 월 22 일 년 09 월 15 일프랑스 (FR) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2014년02월14일 (71) 출원인 페르망탈그 프랑스에프 리부른 4 뤼리비에르 (72) 발명자 카레자, 피에르 프랑스에프 보르도 4 뤼메종드라도라드 (74) 대리인 양영준, 양영환 전체청구항수 : 총 15 항 (54) 발명의명칭섬광형태로빛의불연속적인공급하의혼합영양단세포조류의배양방법 (57) 요약 본발명은조류의지질함량의강화를가능하게하는혼합영양단세포조류의새로운배양방법에관한것으로, 상기강화는특히섬광형태의빛의가변적이거나불연속적인제공에의해유발된다

2 특허청구의범위청구항 1 조류를암흑에서배양하되, 시간에따라가변적이거나불연속적으로빛을공급하고, 빛의세기가광자의마이크로몰단위로시간당여러번의비율로 10 μ몰. m -2. s -1 이상의진폭으로변화하는것을특징으로하는, 혼합영양방식에서배양된단세포조류의배양방법. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기빛의세기가시간당여러번의비율로 2 μ 몰. m -2. s -1 적으로도달하는것을특징으로하는, 단세포조류의배양방법. 및 10 μ 몰. m -2. s -1 의값에연속 청구항 3 제 1 항또는제 2 항에있어서, 빛의세기가주기적으로변하는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 4 제1항내지제3항중어느한항에있어서, 빛의세기가 0 내지 20 μ몰. m -2. s -1 사이, 바람직하게는 0 내지 50 μ몰. m -2. s -1 사이의값으로변하는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 5 제1항내지제4항중어느한항에있어서, 빛의공급이불연속적인것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 6 제5항에있어서, 빛을섬광으로공급하는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 7 제6항에있어서, 상기섬광은 5초내지 10분사이, 바람직하게는 10초내지 2분사이, 더바람직하게는 20초내지 1분에포함되는지속기간을갖는연속적인조명상태로이루어진것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 8 제7항에있어서, 상기섬광은시간당 20 내지 30번사이의섬광을포함하는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 9 제6항내지제8항중어느한항에있어서, 섬광의세기가 5 내지 15 μ몰. m -2. s -1 사이에포함되는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 10 제1항내지제4항중어느한항에있어서, 빛의세기가시간에따라계속적으로변하는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 11 제1항내지제9항중어느한항에있어서, 배양배지는아세테이트, 글루코스, 셀룰로오스, 녹말, 락토스, 사카로스또는글리세롤을포함하는탄소-함유기질이보충된최소배지인것을특징으로하는단세포조류의배양방법

3 청구항 12 제11항에있어서, 탄소-함유기질이아세트산나트륨을주로포함하는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 13 제1항내지제12항중어느한항에있어서, 단세포조류가다음의강 (class): 유글레나조강 (Euglenophyceae), 담녹조강 (Prasinophyceae), 진암점조강 (Eustigmatophyceae), 규조강 (Bacillariophyceae), 후각편모조강 (Prymnesiophyceae), 핀귀오조강 (Pinguiophyceae), 와편모조강 (Dinophyceae), 트레복시조강 (Trebouxiophyceae), 비코소엑조강 (Bicosoecophyceae), 카타블레파리조강 (Katablephariophyceae), 녹조식물강 (Chlorophyceae), 착편모조강 (Haptophyceae), 침편모조강 (Raphidophyceae), 키소조강 (Chysophyceae), 체돌말강 (Coscinodiscophyceae), 알베올라타상문 (Alveolata), 원시홍조강 (Bangiophyceae), 홍조강 (Rhodophyceae) 중에서선택된것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 14 제1항내지제13항중어느한항에있어서, 단세포조류가담녹조강에, 바람직하게는테트라셀미스 (Tetraselmis) 속 (genus) 에속하는것을특징으로하는단세포조류의배양방법. 청구항 15 ⅰ) 제1항내지제14항중어느한항의배양방법에따라단세포조류를배양하는단계, ⅱ) 단계 ⅰ) 에서배양된단세포조류를회수하는단계, 및 ⅲ) 단계 ⅱ) 에서회수된조류의세포내함유물로부터지질을추출하는단계를포함하는것을특징으로하는, 지질의생산방법. 명세서 [0001] [0002] 기술분야본발명은혼합영양조건하에서단세포조류 ( 미세조류 ) 를배양하기위한새로운방법, 특히이러한조류의지질함량의강화를가능하게하는것에관한것이다. 이러한방법은배양배지에시간에따라가변적이거나불연속적인빛의공급에기초하며, 상기공급은조류의지질함량및배양물의수득률증가를유발한다. [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 배경기술단세포조류는현재그들의보조식품으로서의직접적인용도또는녹색화학의원료로서의간접적인용도를목적으로하는수많은산업적프로젝트의대상이다. 이러한미세조류에서얻은지질은그것이우수한영양특성이있기때문에특히수요가있다. 구체적으로, 그것은특히모유를대신하는제제에사용되는 EPA 및 DHA와같은필수장쇄다가불포화지방산 (PUFA) 을함유한다. 수경재배에서, 미세조류는어유및어분을대신하는역할을한다. 유리한조건하에서미세조류는지방산에서그것의건조중량의최대 80 % 까지축적할수있음에기초하여, 후자는바이오연료의생산을위한기름함유육생식물재배의믿을만한대안을제공한다 ( 문헌 [Li, Y. et al., 2008 Biotechnol. Prog., 24: ]). 단세포조류는독립영양특징의광합성미생물이다, 즉그것은광합성에의해독자적으로자라는역량이있다. 민물에서또는바다에서접하게되는단세포조류의대부분의종은엄격하게는독립영양체이다, 즉광합성에의하지않고서는자랄수없다. 후자에의할때, 그것의환경에서탄소-함유기질또는유기물질의존재는그것에게유리하지않고, 심지어그것의성장을저해하는경향도있다. 그러나매우다양한족및기원의단세포조류의특정수의종은엄격하게는독립영양체는아니라는것을발견했다. 종속영양생물이라불리는, 이들중일부는발효에의해, 즉유기물질을이용하여빛의완전한부재에서 - 3 -

4 자랄수있다. [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 성장을위해필수적으로광합성을해야하는조류의다른종은그들의환경속에있는유기물질및광합성둘다사용할수있다. 혼합영양체라불리는이러한중간종을빛이있을때와유기물질이있을때모두배양할수있다. 소위 " 혼합영양 " 조류의이러한특별한특징은그들이광합성및발효를동시에진행할수있게하는그의대사와관계가있는것으로보인다. 대사의이두유형은조류의성장에전체적으로긍정적인영향과공존한다 ( 문헌 [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6: ]). 현재, 조류의분류는대체로형태학적기준및그것이함유한광합성색소의본질에여전히기초한다. 조류가매우많은다양성의종및형태를포괄하는반면에, 이러한분류는독립영양, 종속영양또는혼합영양특성에관해거의정보를주지못한다 ( 문헌 [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639: ]). 그러므로글루코스, 아세테이트또는글리세롤과같은탄소-함유기질을첨가한무기질배지에서광합성으로성장하는능력을갖추고있음이실험적으로증명된다면, 그균주는혼합영양체인것으로생각된다. 탄소-함유기질의이러한보충물이빛을비추는시기동안에성장저해를일으키지않는다면, 그균주는혼합영양체인것으로생각된다. 특정종의조류의경우에, 혼합영양조건하에서자랄수있는것은이론상배양시에세포의생물량및지질의생산에대해더높은수득률을달성할수있게함에도불구하고 ( 문헌 [Ceron Garcia M.C. et al. 2000, Journal of Applied Phycology, 13: ]), 이러한수준의수득률은매우드물게얻어진다. 사실, 최적의수득률을얻기위해배양배지에첨가되는빛의양대탄소-함유기질의양비율의관리는, 특히상업적으로유용한지질량의생산에관해서여전히결정하기어렵다 ( 문헌 [Lee Y.K. et al. 2001, Journal of Applied Phycology, 13: ]). 그러므로생물량의높은수준및지질의높은농도를제공하는생산조건을얻기위해혼합영양미세조류를위한기존의배양기술을여전히향상시킬필요가있다. 미세조류의각각다른종에서수행된연구는빛의세기가혼합영양방식에서수행된배양의정량적및정성적수득률에직접영향을준다는것을밝혀냈다. 따라서독립영양방식에서사용된것과같은빛의세기는일반적으로혼합영양방식에서조류가성장하기에는너무세다. 이러한광-저해현상때문에, 더높은수득률을얻기위해빛의세기를감소하는것이보통바람직하다 ( 문헌 [Liang Y. et al., 2009, Biotechnol. Lett., 31: ; Chojnacka, K. et al., 2004, Enzyme and Microbial Technology, 34: ; Bouarab L. et al., 2004, Water Research, 38: ; Jeon Y.C. et al. 2006, Enzyme and Microbial Technology, 39: ]). 산업적규모의조류는보통야외에서, 즉자연조명으로배양하기때문에, 혼합영양방식으로의배양을위한최적의조건을결정하기위해수행된실험을일반적으로연속적인조명상태로수행한다. 특정경우에, 매일조명상태가암흑상태와번갈아가며나타나게하여 ( 광주기 ), 이리하여낮과밤을재생산한다. 그러나선행기술에서는배양에공급되는빛의세기의반복되는교대또는시간에따른상당한변화에관해언급하고있지않다. 각각몇시간의독립영양방식 ( 조명 ) 및종속영양방식 ( 암흑속 ) 에서, 배양상태를교대시켜배양한이전실험은배양의최적화에관해실망스러움을입증하였는데, 왜냐하면조류가배양조건의변화에대한적응을필요로하기때문이다. 배양의수득률하락에기여하는, 소위광-활성화현상과관계가있는지체시간은각사이클의시작에서관찰된다 ( 문헌 [Ogbonna J.C. et al., 1997, Journal of Applied Phycology 9: ]). 이것은의심할여지없이혼합영양방식에서조류배양의최적화를위한다양한연구의저자가조명및암흑상태의교대가배양물의수득률에유리한영향을줄수있다는것을고려하지않은이유이다. [0021] 발명의내용놀랍게도, 이와는반대로본발명자는불연속적인빛의공급이혼합영양방식에서수행된배양물의수득률에유해하지않음을발견했다. 구체적으로, 암흑상태및조명상태의빠른교대 ( 섬광 ) 에의하거나시간에따라빛의세기의변동을일으키면서, 빛의세기를변화시킴으로써, 생물량에관한배양물의수득률에및더구체적으로는세포의지질함량에긍정적으로작용할수있음을관찰했다

5 [0022] [0023] [0024] 이러한관찰에기초하여, 본발명자는한편으로는생물량증가의달성을, 다른한편으로는조류의지질함량의강화를가능하게하는혼합영양조류의배양방법을발견했다. 이방법은시간에따라가변적이거나불연속적인빛공급에기초한다. 본출원의대상인, 이방법은혼합영양단세포조류의수많은종에대해일반화될수있는것으로보인다. 본발명의다양한측면및장점은아래에기술되어있다. [0025] 도면의간단한설명 도 1 : 본발명 (Δ) 에따라섬광형태로공급된빛이있는혼합영양방식으로및독립영양방식 ( ) 으로, 즉연 속적인빛에서각각수행된테트라셀미스 (Tetraselmis) 배양물의생물량비교그래프. 도 2 : 본발명 (X) 에따라섬광형태로공급된빛이있는혼합영양방식으로및독립영양방식 ( ) 으로각각배 양된테트라셀미스세포의지질함량비교그래프. [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] 발명을실시하기위한구체적인내용따라서본발명은단세포조류의생물량증가및그것의지질함량강화를가능하게하는그의배양방법에관한것이다. 이방법은또한혼합영양방식에서지질의생산에특히적합한미세조류의균주선택을가능하게한다. 이방법은배양에서조류에공급된광속이시간에따라가변적이거나불연속적인것을특징으로한다. 사회통념과대조적으로, 특히혼합영양방식에서, 배양의가변적이거나불연속적인조명은조류의성장에유리한효과가있고후자에의해지질의생산의증가를가능하게한다는것을발견하였다. 이론에의해구속받지않고, 본발명자는빛의불연속적이거나가변적인공급은조류에서지질의합성에유리한스트레스유발효과가있는것으로생각한다. 사실, 조류가환경스트레스를견딜수있으려고지질비축물을축적하는것이종종자연에서일어난다. " 불연속적인조명 " 은암흑주기에의해간간이중단된조명을의미한다. 암흑주기는조류가배양되는동안, 그시간의 4분의 1보다더많은, 바람직하게는그시간의절반이상을차지할수있다. 본발명의바람직한측면에따르면, 섬광형태로, 즉짧은지속주기로불연속적인조명을공급한다. 따라서연속적인조명상태는일반적으로는 5초내지 10분사이, 바람직하게는 10초내지 2분사이, 더바람직하게는 20초내지 1분사이이다. " 가변적인조명 " 은주기적으로또는비-주기적으로, 시간에따라빛의세기를의도적으로변화시킨빛의공급을의미한다. 본발명에따르면, 조명은연속적으로변화할수있다, 즉빛의세기가일정하지않고시간에따라계속변한다 (dμ몰( 광자 )/dt 0). 본발명에따르면, 연속적이고불연속적인조명상태를조합한빛의공급을사용하는것도가능하다. 특히, 본발명은상기조류를, 시간에따라가변적이거나불연속적인빛공급과함께암흑에서배양하며, 그세 기가광자의마이크로몰단위에서, 시간당여러번의속도로 10 μ 몰. m -2. s -1 이상의진폭으로변하는것을특 징으로하는단세포조류의배양방법에관한것이다. [0037] 이러한조명의불연속적인또는가변적인다양한방식이공통으로가지는것은, 본발명에따르면, 배양에서조 류에공급된제곱미터당초당광자의마이크로몰 (μ몰. m -2. s -1 ) 로표현되는빛의세기가일반적으로는 8 μ몰. m -2. s -1 초과, 바람직하게는 10 μ몰. m -2. s -1 이상, 더바람직하게는 15 μ몰. m -2. s -1 이상의진폭으로단지한시간내에여러번변한다는것이다. 다시말해서, 빛의세기는매시간, 바람직하게는한시간에여러번최고값과최저값에도달하며, 그차이는앞서언급한것이상이다. 바람직하게는, 상기빛의세기는매시간잇따라서다음값에도달한다 ( 즉, 이값를거친다 ): 2 μ몰. m -2. s -1 및 10 μ몰. m -2. s -1, 더바람직하게는 0 μ몰. m -2. s -1 및 50 μ몰. m -2. s -1 인값, 더욱더바람직하게는 0 및 20 μ몰. m -2. s -1 인값

6 [0038] [0039] 1 μ 몰. m -2. s -1 은본출원의실시예에서사용된단위인 1 μe m -2. s -1 ( 아인슈타인 ) 과일치함을주의해야한다. 본발명의바람직한측면에따르면, 빛의세기는 0 내지 20 μ 몰. m -2. s -1 사이, 바람직하게는 0 내지 50 μ 몰. m -2. s -1 사이에서변한다. [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] 배양에빛의공급은발효조의외벽둘레에분포된램프로제공될수있다. 클록 (clock) 이정해진조명시간동안에이들램프를켠다. 발효조를챔버의실온을제어할수있는, 햇빛으로부터차단된챔버에위치시키는것이바람직하다. 본발명에따른방법은더구체적으로는혼합영양조건하에서성장가능한단세포조류에적용한다. 본출원의서두에서지적한바와같이, 혼합영양방식에서조류의배양을탄소-함유기질이강화된배양배지에서독립영양방식으로수행된배양으로정한다. 바람직하게는, 상기탄소-함유기질은아세테이트, 글루코스, 셀룰로오스, 녹말, 락토스, 사카로스또는글리세롤을포함하거나, 또는이들로이루어진다. 본발명의취지에서, 조류의종은, 예를들어 5 mm 이상의글리세롤또는아세테이트인탄소의농도비율로탄소-함유기질이첨가된최소배지 ( 예를들면 MM 또는 f/2) 에서, 성장저해가관찰되지않으면서, 즉, 탄소-함유기질이결핍된동일한최소배지에서 ( 즉, 독립영양방식으로 ) 수행된배양에비해건조물에서의생물량손실발견이없으면서, 빛에서배양될수있는한, 혼합영양체로여겨진다. 본발명의목적을위해, 생산한에너지의적어도 25 %, 바람직하게는적어도 50 % 를상기탄소-함유기질의사용으로얻는혼합영양미세조류가사용하기에바람직하다. 배양배지는조류의성장저해를피하기위해, 발효하기에충분하지만너무높지는않은탄소-함유기질의양을함유해야한다. 바람직하게는, 본발명에따른배양배지는 10 g/l 미만, 바람직하게는 4 내지 6 g/l 사이의이용가능한글루코스농도를포함한다. 본발명의바람직한측면에따르면, 탄소-함유기질은아세테이트, 바람직하게는아세트산나트륨을포함하고, 배양배지에서그것의농도는일반적으로 5 mm 내지 50 mm 사이, 바람직하게는 15 내지 25 mm 사이에포함된다. 유리하게는, 혼합영양조류의종은다음의강 (class) 중에서선택된다 : 유글레나조강 (Euglenophyceae), 담녹조강 (Prasinophyceae), 진암점조강 (Eustigmatophyceae), 규조강 (Bacillariophyceae), 후각편모조강 (Prymnesiophyceae), 핀귀오조강 (Pinguiophyceae), 와편모조강 (Dinophyceae), 트레복시조강 (Trebouxiophyceae), 비코소엑조강 (Bicosoecophyceae), 카타블레파리조강 (Katablephariophyceae), 녹조식물강 (Chlorophyceae), 착편모조강 (Haptophyceae), 침편모조강 (Raphidophyceae), 키소조강 (Chysophyceae), 체돌말강 (Coscinodiscophyceae), 알베올라타상문 (Alveolata), 원시홍조강 (Bangiophyceae), 홍조강 (Rhodophyceae), 특히지질-생산균주및바람직하게는독립영양방식에서적어도 5 % 의지질을생산하는균주. 담녹조강에속하는미세조류는바람직하게는테트라셀미스속 (genus) 의것이다. 예를들면섬광형태로공급된빛이있는혼합영양조건하에서본발명에따른배양방법을수행하며, 바람직하 게는시간당 20 내지 30 번사이의섬광이고, 그것의세기는일반적으로 5 내지 50 μ 몰. m -2. s -1 사이, 바람직하 게는 5 내지 15 μ 몰. m -2. s -1 사이에포함된다. [0051] 본발명의바람직한실시예에따르면, 글루코스또는아세트산나트륨및칼슘을포함하는배양배지에약 10 μ 몰. m -2. s -1 의세기로시간당 30 초의섬광을 30 번적용한다. [0052] [0053] [0054] 배양배지는칼륨, 마그네슘, 미량원소및비타민과같은다른원소를함유할수있다. 바람직한실시태양은공급형-배치배양 (fed-batch culture) 기술사용으로이루어지며, 이것은생물량의증가를촉진하면서, 비-억제농도로탄소-함유기질유지를가능하게한다. 바람직하게는, 배양배지에사용된글루코스는 D-글루코스또는덱스트로스, 특히녹말, 예를들면옥수수, 밀또는감자의생변환으로얻은덱스트로스이다. 녹말가수분해물은생물량의더좋은성장을제공하는, 조류에의해쉽게동화될수있는작은크기의분자로이루어진다

7 [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] 본발명의다른측면에따르면, 균주의성장은배양배지안의높은농도의칼슘, 즉, 80 mg/l 초과, 바람직하게는 120 내지 190 mg/l 사이의칼슘존재에의존한다. 구체적으로적합한실시태양에따르면, 배양배지는 3 내지 10 g/l 사이의글루코스및 100 내지 200 g/l 사이의칼슘을포함한다. 유리하게는, 이러한배지는약 18시간의지체시간및 3 내지 4시간사이의세대기간을얻는것을가능하게한다. 본발명에따른배양방법은조류의좋은성장을하게하는평균온도, 바람직하게는 4 내지 32 에서수행되어야한다. 이러한조건하에서는, 40시간미만으로배양시간단축이관찰되고, 지체시간및세대기간이매우짧다. 본발명의방법에따라얻어진조류는, 단백질및다가불포화지방산 ( 예를들면 EPA 및 DHA) 이잠재적으로풍부하기때문에, 음식재료와같은것, 특히동물사료로사용될수있다. 본발명의바람직한측면에따르면, 앞서정해진배양방법은또한지질의생산도가능하게한다. 지질생산을위한이러한방법은하나이상의다음단계를포함하는것을특징으로한다 : ⅰ) 상기기술된방법에따라단세포조류를배양하는단계, ⅱ) 단계 ⅰ) 에서배양된단세포조류를회수하는단계, 및 ⅲ) 단계 ⅱ) 에서회수된조류의세포내함유물로부터지질을추출하는단계. 지질은세포용해에의해추출되고, 당업자에게알려진기술에따라분별될수있다. 따라서얻어진지질은다가불포화지방산의형태로, 특히어유의대체와같은보조식품으로또는트리글리세리드의형태로, 예를들어바이오연료생산을위해, 다양한응용에사용될수있다. 아래주어진실시예는본발명의예증목적일뿐이것에제한되지않는다. 실시예 Ⅰ-테트라셀미스속의혼합영양균주의스크리닝 1 - 균주 : 국제배양기탁기구인 CCAP( 스코틀랜드 ), SAG( 독일 ), CCMP( 미국 ) 및 CSIRO( 호주 ) 에서테트라셀미스속 (n=78) 의균주를주문했다. 2 - 배양액 : 민물조류를, 액체최소배지 MM[ 베이저링크 (Beijerink) 용액 50 ml/l(nh 4 Cl 8 g/l, CaCl 2 1 g/l, MgSO 4 2 g/l), 포스페이트완충액 1 ml/l(k 2 HPO g/l, KH 2 PO 4 53 g/l), 미량원소용액 1 ml/l(bo 3 H g/l, ZnSO 4 7H 2 O 22 g/l, MnCl 2 4H 2 O 5.06 g/l, FeSO 4 7H 2 O 4.99 g/l, CoCl 2 6H 2 O 1.61 g/l, CuSO 4 5H 2 O 1.57 g/l, Mo 7 O 24 (NH 4 ) 6 4H 2 O 1.1 g/l, EDTA 50 g/l), 트리즈마 (Trizma) 염기 2.42 g/l, HCl로조정된 ph 7.2 내지 7.4, 비타민 B mg/l 및비타민 B mg/l( 즉석으로첨가됨 )] 및고체배지 MM(+1.5 % 아가 ) 에서독립영양조건하배양한다. [0075] 먼저, 해양미세조류를재구성된해수또는액체배지 f/2[nano g/l, KCl 0.74 g/l, NaCl 또는트로픽 (Tropic) 해수염 26 g/l, CaCl 2 1 g/l, MgSO 4 7H 2 O 1.92 g/l, NaH 2 PO 4 2H 2 O 50 mg/l, 미량원소용액 1 ml/l(na 2 EDTA 2H 2 O 4.36 g/l, FeCl 3 6H 2 O 5.82 g/l, MnCl 2 4H 2 O 2.46 g/l, ZnSO 4 7H 2 O 34.5 mg/l, CoCl 2 6H 2 O 12 mg/l, CuSO 4 5H 2 O 9.8 mg/l, Na 2 MoO 4 2H 2 O 2.2 mg/l), HCl로조정된 ph 7.2 내지 7.4, 비타민 B mg/l, 비타민 B mg/l 및비타민 B mg/l( 즉석으로첨가됨 )] 및고체배지 f/2(+1.2 % 아가 ) 에서독립영양조건하배양한다. [0076] 혼합영양조건및종속영양조건하에서미세조류의배양을다음탄소 - 함유기질 : 아세테이트 5 mm, 글루코스 5-7 -

8 g/l, 락토스 10 g/l, 사카로스 10 g/l 및글리세롤 5 g/l 각각의첨가가있는배지 MM 또는 f/2 에서수행 했다. [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] 및 96-웰마이크로플레이트에서액체배지내의균주성장의고-처리량스크리닝 : 테트라셀미스균주의종속영양및혼합영양특징을기체-투과성필름으로밀봉한, 24-웰 (V=2 ml) 또는 96-웰 (V=1 ml) 마이크로플레이트내의탄소-함유기질이존재하는배지 MM( 민물균주 ) 또는 f/2( 해수균주 ) 에서미세조류균주를수용하는즉시배양하여평가했다. 독립영양조건 (MM 또는 f/2) 에서의성장을체계적으로모니터링하여혼합영양및종속영양조건하의배양물에대한참고로사용하였다. 마이크로플레이트를독립영양및혼합영양조건하의배양을위해 22, 60 % 습도및 10 μe 빛의세기인인큐베이션챔버 (incubation chamber)( 산요 (SANYO) MLR-351H) 안쪽에배치하고, 종속영양조건하의배양을위해 22, 60 % 습도및암흑 (0 μe) 인인큐베이션챔버 ( 바인더 (BINDER) KB53) 안쪽에배치하였다. 인큐베이션챔버를 10 μe의섬광형태로시간당 30초의섬광을 30번의비율로제어된조명을공급하기위해변경했다. 4 - 혼합영양및종속영양조건하에서각각배양된미세조류균주의세포내지질함량의스펙트럼형광분석에의한고-처리량스크리닝 : 3 내지 4주동안 24- 또는 96-웰마이크로플레이트내의성장을모니터링한후, 혼합영양및종속영양미세조류의세포내지질함량을스펙트럼형광분석으로평가했다. 세포내지질을형광색소, 나일레드 (Nile Red) 로특이적으로표지했다. 488 nm의형광여기에대응하여, 나일레드로염색된중성지질은 570 nm에서형광을발광하고극성지질은 nm에서방출한다. 이러한목적을위해, 혼합영양및종속영양하에서수행된미세조류균주의액체배양물을 96-웰 PCR 마이크로플레이트 (V= 배양의 100 내지 200 μl) 로이전하고나일레드 (0.1 mg/ml) 1-2 μl로염색한다. 인큐베이션또는암흑에서 20분후에, PCR 마이크로플레이트를스펙트럼형광분석기 ( 바리안 (Varian)) 에배치하고 500 내지 700 nm의형광발광스캔을수행한다. 테트라셀미스속의 78개균주의성장에미치는, 섬광의 ( 독립영양및혼합영양컬럼 ) 및글루코스 (Glc 5 g/l), 아세테이트 (Ac 1 g/l), 사카로스 (Sac 10 g/l), 락토스 (Lac 10 g/l) 및글리세롤 (Gly 5 g/l) 과같은탄소-함유기질의 ( 혼합영양및종속영양컬럼 ) 효과를액체배지 MM 또는 f/2의 96-웰마이크로플레이트에서스크리닝으로평가했다. 배양의육안관찰및쌍안현미경 (10X 및 32X 대물렌즈 ) 을통한현미경관찰로 3 내지 4주동안주 2회성장을모니터링한다. 5- 결과 : 테트라셀미스속의시험된 78개균주중에서, 22개가종속영양특징을보였고단지 7개의균주가엄격히독립영양체인것으로입증되었다. 사실, 시험된기질중하나에서 22개의종속영양균주가 0 μe에서, 독립영양조건과유사하거나그보다더큰상당한성장을보여준것이관찰되었다. 테트라셀미스속균주의바람직한탄소- 함유기질은 21개중에서혼합영양균주 17개의경우글루코스인것으로나타난다. 빛의유무에서탄소-함유기질의첨가가독립영양조건하에서배양하는것에비해세포성장향상이없을때의균주를엄격히독립영양체라고부른다. 본경우에서, 빛 (10 μe) 의공급및탄소-함유기질이테트라셀미스속의 71개균주를독립영양조건하에서의대조물의것과유사하거나그보다더큰세포농도에도달하게했다. 그러므로혼합영양조건하의배양이테트라셀미스속의가장많은수의균주배양을위한최상의조건을구성한다. 정지-기배양조건하에서, 96-웰마이크로플레이트내의, 연속적이고불연속적인조명의혼합영양조건하에서성장할수있는테트라셀미스속의혼합영양균주 21개에서세포내지질의축적에미치는빛의효과를평가했다. 실제로, 테트라셀미스의종속영양균주 21개각각의배양분취액 (200 μl) 을 96-웰마이크로플레이트에이전하고, 이어서나일레드 (1 μg/ml) 로염색했다. 세포내지질의축적이나타낸형광발광신호 (570 nm에서중성지질및 620 nm에서극성지질 ) 를스펙트럼형광분석기에의해수집한다. 시험된 21개의균주에서, 섬광이있을때배양된균주가연속적인조명으로배양된것에비해나일레드로더진하게염색되었다. Ⅱ - 섬광방식에서테트라셀미스속혼합영양균주의성장 - 8 -

9 [0091] [0092] [0093] 1 - 생물반응기에서테트라셀미스속균주의배양 : 앞선파트Ⅰ에기술된스크리닝동안선택된 21개의혼합영양균주에서임의로뽑은, 테트라셀미스의두균주를발효조 ( 공급형-배치 ) 에서본발명에따른섬광방식으로배양했다. 동시에, 동일한균주를연속적인조명으로독립영양조건하에서배양했다. 배양을전용자동장비및전산화된통제와함께사용하는 2-리터발효조 ( 바이오컨트롤러 (BioController) ADI 1030) 에서수행했다. 시스템의 ph를염기 (1 N 수산화나트륨용액 ) 및 / 또는산 (1 N 황산용액 ) 첨가로조정했다. 배양온도를 23 로고정한다. 교반은루쉬톤 (Rushton) 배열 ( 다운펌핑하는 3-블레이드교반날개 ) 에따라샤프트에장착된 3개의교반로터에의해제공되었다. 교반속도및통기흐름속도를각각 Q 최소. = 0.5 vvm / Q 최대. = 2 vvm과함께최소 100 rpm 및최대 250 rpm으로조절했다. 생물반응기는투명탱크를둘러싼외부조명시스템을장착했다. 조명주기뿐아니라방출된빛의세기도컴퓨터스테이션으로프로그래밍했다. 반응기를연속적인 100 μe 조명, 자동온도조절챔버 (22 ) 안의교반테이블 (140 rpm) 에서수행된예비배양물로접종했다. 생물반응기안의예비배양및배양은 10 mm NaHCO 3 가보충된배지 f/2에서수행되었다. 생물반응기내의혼합영양조건하의배양에사용된탄소-함유기질은 20 mm 농도의아세트산나트륨이다. 배양 92시간부터시작해서, 매 24시간마다농축된배지 f/2를첨가하여 0.5X 최종농도에도달하게하였다. 혼합영양조건하의 " 섬광 " 배양의경우, 농축된배지 f/2뿐아니라 5 mm의아세트산나트륨도첨가했다. [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] 2 - 섬광형태의빛공급 : 상기발효조의외부벽둘레에분포된 LED 램프를사용하여생물반응기에섬광형태로빛을공급했다. 클록이조명시간동안에또는 8 내지 50 μe 사이의펄스로이 LED 램프를켰다. 섬광시스템의빛의세기는독립영양조건하의대조용배양에서연속적인방식으로사용된것과같다. 3 - 생물량모니터링 : 생물량의총농도를건조중량 ( 와트만 (Whatman) 지로, GFC 필터로여과, 이어서 65 및 -0.8 바의진공스토브에서적어도 24시간동안건조후무게측정 ) 을측정하며모니터링했다. 4 - 세포내지질의정량화 : 10 7 세포 /ml의샘플을뽑아총지질의정량화를수행했다. 지질추출방법은 Bligh, E.G. 및 Dyer, W.J. 에의해기술되어있다 ( 문헌 [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37: ]). 5 - 결과 : 다양한배양에서얻은결과가도 1 및 2의그래프에표현되어있다. 첫번째그래프는독립영양방식에서수행된동일한균주의배양에비해섬광방식 ( 선택된각각다른혼합영양균주의평균값 ) 에서수행된배양일때의생물량의큰증가를보여준다. 두번째그래프는섬광방식에서배양된세포내지질축적이독립영양방식에서배양된세포내의것보다최대 30 % 더큰것을보여준다. 6 - 결론 : 앞선연구는테트라셀미스속의다양한미세조류의배양에탄소-함유기질뿐아니라섬광 ( 시간당 30초의 30번의약 10 μe 섬광 ) 형태의빛공급이, 혼합영양특징을가진모든것에서, 세포내지질의상당히더큰축적을유발함을보여준다. 생물량에관해서, 수득률은독립영양조건하에서보다섬광형태로공급된빛이있는혼합영양방식에서훨씬더높았다. 얻어진미세조류의농도는 100 내지 150 g/l( 도 1) 사이이며, 이것은연속적인빛에서의배양으로얻은농도보다훨씬더높다. 게다가, 본발명에따른단세포조류의배양방법은매우짧은지체시간및세대기간과함께, 40시간미만으로상기조류의배양시간을감소시키는것이가능하다

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특허청구의 범위 청구항 1 구제역이나 에이아이(AI) 감염에 의해 살 처분된 가축 매몰지의 붕괴나 침출수 유출에 의한 제2차 오염을 방 지하기 위한 방제방법에 있어서, 매몰지 내부에 고화제(Firming agent) 및 첨가물질이 주입되도록 통로를 형성하기 위한 천공단

특허청구의 범위 청구항 1 구제역이나 에이아이(AI) 감염에 의해 살 처분된 가축 매몰지의 붕괴나 침출수 유출에 의한 제2차 오염을 방 지하기 위한 방제방법에 있어서, 매몰지 내부에 고화제(Firming agent) 및 첨가물질이 주입되도록 통로를 형성하기 위한 천공단 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (51) 국제특허분류(Int. Cl.) B09B 1/00 (2006.01) C09K 17/00 (2006.01) E02D 31/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0016170 (22) 출원일자 2011년02월23일 심사청구일자 전체 청구항 수 : 총 9 항 2011년02월23일 (11)