특허청구의범위청구항 1 수소를생산하는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주.. 청구항 2 제 1 항에있어서, 혐기성조건하에서수소를생산하는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL

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희원 평
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2013년12월04일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 1/12 ( ) C12P 3/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2012 년 05 월 25 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 14 항 2012 년 05 월 25 일 (71) 출원인 연세대학교원주산학협력단 강원도원주시흥업면연세대길 1 (72) 발명자 전병훈 강원도원주시명륜동청구아파트 202 동 1201 호 황재훈 강원도원주시흥업면매지리연세대학교환경공학부 (74) 대리인 특허법인다나 (54) 발명의명칭호기 / 혐기조건에서수소생산이가능한신균주클로렐라불가리스 YSL001 (57) 요약 본발명은신균주클로렐라불가리스 YSL001 KCTC 12144BP 균주에관한것으로서, 더욱상세하게는수소생산사례가극히드물며대부분의연구도혐기수소발생및유기물이풍부한조건에서진행되어자연상태에서의수소생산한계를갖는기존의녹조류에반해, 혐기상태, 유기물조건과동시에호기상태, 또는대기중의이산화탄소를가지고있는독립영양조건에서도수소생성효소가활성화하여수소를생산할수있는신규한클로렐라불가리스 YSL001 KCTC 12144BP 균주에관한것이다. 대표도 - 도 5-1 -

2 특허청구의범위청구항 1 수소를생산하는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주.. 청구항 2 제 1 항에있어서, 혐기성조건하에서수소를생산하는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주. 청구항 3 제 1 항에있어서, 호기성조건하에서수소를생산하는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주. 청구항 4 제 1 항에있어서, 독립영양조건하에서수소를생산하는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주. 청구항 5 제 1 항에있어서, 서열번호 1로표시되는 28s r DNA 서열을갖는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주. 청구항 6 제 1 항에따른클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주또는이의배양액을 포함하는수소생산용미생물제제. 청구항 7 제 1 항에따른클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주를배양하는단계를 포함하는수소의생산방법. 청구항 8 제 7 항에있어서, - 2 -

3 혐기성조건하에서상기균주를배양하는단계를포함하는수소의생산방법. 청구항 9 제 7 항에있어서, 호기성조건하에서상기균주를배양하는단계를포함하는수소의생산방법. 청구항 10 제 7 항에있어서, 독립영양조건하에서상기균주를배양하는단계를포함하는수소의생산방법. 청구항 11 제 7 항에있어서, 상기균주를 KH 2 PO 4, CaCl 2 ㆍ2H 2 O, MgSO 4 ㆍ7H 2 O, NaNO 3, K 2 HPO 4, NaCl, H 3 BO 3 및미량원소로이루어진배지에서배양하는단계를포함하는수소의생산방법. 청구항 12 제 7 항에있어서, 상기균주를 20 내지 30 에서 ph 7.0 내지 9.0 에서배양하는단계를포함하는수소의생산방법. 청구항 13 제 7 항에있어서, 상기균주를이산화탄소를탄소원으로하여배양하는단계를포함하는수소의생산방법. 청구항 14 클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주로부터분리된산소내성을갖는수소 화효소. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은호기 / 혐기조건에서수소생산이가능한신균주클로렐라불가리스 YSL001 에관한것이다. [0002] 배경기술지구상의에너지사용증가는지속적으로증가하여많은환경오염을초래하며, 결과적으로지구온난화의문제를가져왔다 [ 비특허문헌 1]. 바이오매스는온실효과에작용을하지않는신재생에너지원으로 [ 비특허문헌 2] 대량생산시에너지로활용 ( 수소, 메탄, 에탄올 ) 이되어지속적으로개발되고있다. 또다른관점으로바이오매스에속하는광합성균주는대사활동시수소를방출하며수소는청정에너지로서미래의궁극적인대체에너지원 - 3 -

4 으로꼽히고있다. 광합성세균은홍색비유황세균 (purple non-sulfur bacteria), 홍색유황세균 (purple sulfur bacteria), 녹색비유황세균 (green non-sulfur bacteria) 및녹색유황세균 (green sulfur bacteria) 으로구분되고, 호기적조건, 혐기어둠조건, 혐기광조건모두에서성장할수있다. 홍색비유황세균인로도박터속미생물은대사과정에서태양에너지를청정화학에너지인수소로전환시키는높은능력으로인해미생물을이용한대체에너지기술개발의주된대상으로사용되어왔다 [ 비특허문헌 3]. 이들은조류 (algae) 나식물의광합성과는달리그과정중에산소를발생시키지않는것을특징으로한다. 반면클로렐라속조류는수소생성질소고정효소 (nitrogenase) 및수소생성효소 (hydrogenase) 의구성요소들의유전자들도비교적알려져있지않다. 클로렐라는조류중가장널리알려져있으며, 분포또한다양한지역에서쉽게발견된다. 현재조류의연구방향은박테리아의유전자변이연구와다르게주로배양을통한수소생성능증진에주안점을두고있다. 이와같은접근으로수소생성능의상당한증진이있었으나, 이와같은접근은그한계가있었다. 로도박터스페로이데스 KCTC 12085는자연계에서분리된광합성균주로서높은수소생성능과염에대한높은저항성을가지고있으며, 다른수소생성광합성균주들에비해유사하거나보다높은수소생산능력을가지고있어수소생성효율이증가하는것을관찰하여보고한바있다 [ 비특허문헌 3]. 상기와같은광합성균주의수소생성은주로질소고정효소에의한양자 (proton, H + ) 고정의결과이며, 이때소모되는에너지는전적으로명반응에의존한다. 한편, 대부분의광합성박테리아및조류는자연계에서높은산소 (O 2 = 0.21atm) 에노출되어있다. 그러나수소를발생시키는수소화효소는니켈-철함유수소화효소 [NiFe-Hydrogenase, 비특허문헌 4] 와철함유수소화효소 [Fe-only Hydrogenase, 비특허문헌 5] 는주로혐기조건에서활동을한다고보고된다. 최근홍색비유황세균중에산소내성을갖는수소화효소가발견되면서자연환경 ( 호기조건 ) 에서의수소생산가능성이보여진다 [ 비특허문헌 6]. [0003] 따라서, 보다많은호기조건에서수소생성과관련된수소화효소들의활성화및안정화등을유도할수있는 배양조건등을규명하는연구는이러한한계를뛰어넘기위해반드시이루어져야할과제이다. 선행기술문헌 [0004] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) Chisti, Y Biotechnology Advances, 25: ( 비특허문헌 0002) Widjaja, A., Chao-Chang Chien, Yi-Hsu Ju Study of increasing lipid production from fresh water microalgae Chlorella vulgaris. J. Taiwan Inst. Chem. Eng.40, ( 비특허문헌 0003) Lee et al Improvement of Photoheterotrophic Hydrogen Production of Rhodobacter sphaeroides by Removal of B Light-Harvesting Complex. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: ( 비특허문헌 0004) Appel et al The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis.arch Microbiol. 173: ( 비특허문헌 0005) Pan et al Characterization of a basic [2Fe-2S]-cluster-containing protein from the Fe-only hydrogenase operon of Thermotoga maritime. J. Biol. Inorg. Chem. 8: ( 비특허문헌 0006) Liebgott et al Original Design of an Oxygen-Tolerant [NiFe] Hydrogenase: Major Effect of a Valine-to-Cysteine Mutation near the Active Site. J. Am. Chem. Soc. 133, 발명의내용 [0005] [0006] 해결하려는과제이에, 본발명자들은수소생산을하는미세조류균주를확보하기위해연구한결과, 기존수소발생조건인혐기상태와더불어자연대기상태인호기상태에서수소가발생되는독립영양미세조류종을자연환경으로부터분리하여호소수환경에서수소생산에유용함을확인함으로써본발명을완성하게되었다. 따라서, 본발명은신규한클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주를제공하 - 4 -

5 는데그목적이있다. [0007] 또한, 본발명은상기신균주를호기 / 독립영양상태에서성장시켜에너지생산을하며, 그과정에서고농도의 이산화탄소를탄소원으로활용하여온실효과의환경문제뿐만아니라대체에너지를해결하는방법을제공하는데 그목적이있다. [0008] 과제의해결수단 상기과제를해결하기위한수단으로서, 본발명은수소를생산하는클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주를제공한다. [0009] 상기과제를해결하기위한다른수단으로서, 본발명은클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주또는이의배양액을포함하는수소생산용미생물제제를제공한다. [0010] 상기과제를해결하기위한또다른수단으로서, 본발명은클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주를배양하는단계를포함하는수소의생산방법을제공한다. [0011] 상기과제를해결하기위한또다른수단으로서, 본발명은클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주로부터분리된수소화효소를제공한다. [0012] [0013] [0014] 발명의효과본발명은클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주를이용하여호기 / 혐기조건및대기중과량의이산화탄소주입에따른에너지생산과산소내성수소화효소를검토하여호기조건수소생산용신균주로서의가능성을확보하였다. 본발명의신균주가가지는수소화효소는산소내성이강하며, 신균주의이산화탄소적용이가능하여배양의경제성을크게향상시키는효과를가진다. 또한, 성장된클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주는호기뿐만아니라혐기상태에서도수소생산을보여주고있어호소수환경에서미세조류의수소생산에기여토록하는효과를가진다. [0015] 도면의간단한설명 도 1 은클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주의사진이다. 도 2는클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주의 23s r DNA의염기서열을나타낸것이다. 도 3은클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주의계통수를나타낸것이다. 도 4는클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주의혐기, 호기, 독립영양 ( 이산화탄소 15%(v/v)/ 산소 15%(v/v)) 상태에서수소생성나타낸것이다. 도 5는클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주의수소화효소활성을나타낸것이다. [0016] [0017] 발명을실시하기위한구체적인내용이와같은본발명을더욱상세히설명하면다음과같다. 본발명의신균주인클로렐라불가리스 YSL01(Chlorella vulgaris YSL01) 는본발명자들에의해최초로분리동정된것으로서, 호수에서 BBM 배지를이용하여균주를분리하였으며, 분리한균주를 28s rdna 시퀀싱서열검색에의해분자유전학적인방볍으로분석한결과, 표준균주인클로렐라불가리스 AB 과 98% 유사한신균 - 5 -

6 주임을확인하였다. [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] 본발명자들은상기분리동정된클로렐라불가리스 YSL001라명명하였으며, 2012년 2월 23일자로한국생명공학연구원생물자원센터에기탁하여수탁번호 KTCT12144BP를부여받았다. 특히, 본발명의클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) 는서열번호 1로표시되는 28s r DNA 서열을가지며, 혐기, 호기, 독립영양조건하에서모두수소생산이가능함을확인할수있었다. 상기혐기조건은산소가없는상태를말하며, 상기호기조건은산소가있는대기상태, 구체적으로산소농도가 5%(v/v) 이상 ( 바람직하게는 5 내지 35%(v/v)) 를의미하며, 상기독립영양조건은이산화탄소가고농도로포함되어있는대기상태, 구체적으로이산화탄소의농도가 5 내지 20%(v/v) 포함된대기상태를의미한다. 이산화탄소는전세계적온실효과문제와밀접한관계가있어환경적이슈로해결책을강구하고있다. 본발명에따른클로렐라불가리스 YSL001의호기및혐기고농도이산화탄소대기상태등의조건에서모두수소생산이가능하므로호소수의모든자연환경에서수소가생산됨이가능하다. 본발명은또한, 클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주또는이의배양액을포함하는수소생산용미생물제제를제공할수있다. 본발명은또한, 클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주를배양하는단계를포함하는수소의생산방법을제공할수있다. 상기클로렐라불가리스 YSL001은 KH 2 PO 4, CaCl 2 ㆍ2H 2 O, MgSO 4 ㆍ7H 2 O, NaNO 3, K 2 HPO 4, NaCl, H 3 BO 3 및미량원소로 이루어진 BBM 배지에서 20 내지 30 ( 바람직하게는 25 내지 27 ) 에서 ph 7.0 내지 9.0( 바람직하게는 ph 7.5 내지 8.5) 에서배양한다. 상기미량원소는 ZnSO 4 ㆍ7H 2 O, MnCl 2 ㆍ4H 2 O, MoO 3, CuSO 4 ㆍ5H 2 O, Co(NO 3 ) 2 ㆍ6H 2 O, Na 2 EDTA, KOH, FeSO 4 및 H 2 SO 4 로이루어진군에서선택된 1종이상인것이바람직하다. 특히, 상기배지는 KH 2 PO 내지 17.7 g/l, CaCl 2 ㆍ2H 2 O 2.3 내지 2.7 g/l, MgSO 4 ㆍ7H 2 O 7.3 내지 7.7 g/l, NaNO 내지 25.2 g/l, K 2 HPO 내지 7.7 g/l, NaCl 2.3 내지 2.7 g/l 및미량원소 3 내지 5 ml를포함하는것이더욱바람직하다. [0024] [0025] [0026] 본발명은또한, 클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) KTCT12144BP 균주로부터분리된산소내성을갖는수소화효소를제공할수있다. 조류가지닌수소화효소활성은메틸바이오로겐 (methyl viologen] 을이용하여분석해낼수있으며, 본발명의신균주역시상기와같은통상의분석법으로수소화효소활성을분석하였다. 또한, 이렇게분석된수소화효소활성은혐기뿐만아니라호기상태에서활동이관찰되었고, 수소화효소활성으로수소생산할수있는바, 본발명은상기호기상태에서수소화효소발현도포함할수있다. [0027] 이하, 본발명을실시예에의해더욱상세히설명한다. 단, 하기의실시예는발명을예시하는것일뿐, 본 발명의내용이하기실시예에의해제한되는것은아니다. [0028] [0029] 실시예 1: 신균주의분리강원도원주연세대학교매지호수주변에서시료를채취하였다. 채취시료는 200 ml 시험관에다음표 1에나타낸바와같은 BBM 액체배지를넣고약 2주간정치배양하였다. 예비배양한시료 1 ml를 10 ml의멸균증류수가포함된 30 ml시험관에넣고잘혼합하여미세조류세포를분산시켰다. 이로부터마이크로피펫을사용하여 0.1 ml의시료를취한후멸균증류수가포함된시험관에넣고혼합하였다. 이러한조작을 5회반복한후각각의시험관에서약 0.1 ml의시료를취하고, 이를다음표 2에나타낸바와같은조성의 BBM 배지가놓인페트리디쉬 (Petri dish) 에접종한다음, 온도 25 ~ 27 및조도 50 μmol/ m2-sec의배양기에서 2~3주간정치배양하였다. 미세조류의콜로니 (Colony) 가나타나면현미경으로확인하면서백금이를사용하여각각의군락을웰세포배양플레이트 (well cell culture plate) 에옮겨분리를시작하였다. 각각의홀에는조류군락과 BBM 배지를 1:1로하여투여후 10-14일간배양하였다 ( 표 1). 일부미생물의성장을억제하게위해본실시예에서는항생제스트렙도마이신 (Streptomycin) 을사용하여조류만을성장하도록하였다. 이때, 사용된항생제의양은배지 1L 당 0.15 μm/ml를사용하였다. 일정기간후각각의홀에배양된콜로니를현미경관찰하였다. 이때, 대부분의홀에서는특성미세조류만성장하며, 같은모양을지닌종을 BBM 배지로준비된페트리디쉬에서배양을하 - 6 -

7 였다 ( 표 2). 일정기간후배양된조류콜로니는한종류의콜로니로우세하게배양되며, 이콜로니를채취하여 100 m 의 BBM 배지가들어있는 250 ml 삼각플라스크에이식하여본배양을시작하였다 ( 표 1). [0030] 표 1 미세조류배양용액체배지 (BBM) 의조성 KH 2 PO 4 CaCl 2 ㆍ2H 2 O MgSO 4 ㆍ7H 2 O NaNO 3 K 2 HPO 4 ZnSO 4 ㆍ7H 2 O H 3 BO 3 MnCl 2 ㆍ4H 2 O MoO 3 CuSO 4 ㆍ5H 2 O Co(NO 3 ) 2 ㆍ6H 2 O Na 2 EDTA FeSO 4 H 2 SO 4 성분 NaCl KOH 함량 (per liter) 17.5 g 2.5 g 7.5 g 25 g 7.5 g 2.5 g Microelement Stock Solution 8.82 g g 1.44 g 0.71 g 1.57 g 0.49 g Solution (1) 50 g 3.1 g Solution (2) 4.98 g 1 ml [0031] 표 2 미세조류배양용배지 (BBM) 아가의조성 KH 2 PO 4 CaCl 2 ㆍ2H 2 O MgSO 4 ㆍ7H 2 O NaNO 3 K 2 HPO 4 ZnSO 4 ㆍ7H 2 O H 3 BO 3 MnCl 2 ㆍ4H 2 O MoO 3 CuSO 4 ㆍ5H 2 O Co(NO 3 ) 2 ㆍ6H 2 O Na 2 EDTA 성분 NaCl KOH 함량 (per liter) 17.5 g 2.5 g 7.5 g 25 g 7.5 g 2.5 g Microelement Stock Solution 8.82 g g 1.44 g 0.71 g 1.57 g 0.49 g Solution (1) 50 g 3.1 g - 7 -

8 FeSO 4 H 2 SO 4 Agar powder Solution (2) Agar 4.98 g 1 ml 15 g [0032] [0033] 실시예 2: 신균주배양 상기표 1 에나타난 BBM 배양액 [KH 2 PO 4, CaCl 2 ㆍ 2H 2 O, MgSO 4 ㆍ 7H 2 O, NaNO 3, K 2 HPO 4, NaCl, 및미량원소 (H 3 BO 3, ZnSO 4 ㆍ7H 2 O, MnCl 2 ㆍ4H 2 O, MoO 3, CuSO 4 ㆍ5H 2 O, Co(NO 3 ) 2 ㆍ6H 2 O, Na 2 EDTA, KOH, FeSO 4, H 2 SO 4 )] 를이용하여상기실시예 1에서분리한균주를 25 내지 27, ph 7.5 내지 8.5 하에서 250 ml 삼각플라스크에 10 ml의상기균주를넣고형광교반배양기에서약 14일간배양을하였다. 교반은 150 rpm으로유지하였으며, 조도 50 μmol/ m2- sec를유지하였다. [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 실시예 3: 신균주동정상기실시예 1에서분리한균주의염기서열분석은 28s rdna 염기서열시퀀스분석법으로분석하였다. 샘플의상태는상기실시예 1의콜로니가있는평판배지상태로의뢰하였으며, 의뢰내역으로는 ExtractiongDNA, PCR 증폭에의한 PCR 산물을시퀀싱 (sequencing) 반응을통해분석하였다. 분석에사용된프라이머로구분되는시퀀스는다음과같다. 5'-AGCGGAGGAAAAGAAACTA-3' 정방향프라이머 ( 서열번호 2) 5'-TACTAGA-AGGTTCGATTAGTC-3' 역방향프라이머 ( 서열번호 3) 분리균주의 28s rdna 염기서열분석결과를첨부된서열목록의서열번호 1에기재하였으며 [ 도 2], 계통학적결과는쥬크-캔터 (Jukes-Cantor) 모델을적용한네이버-조이닝 (Neighbour-joining) 방법에따라계통수 (phylogenetic tree) 결과를도 3에나타내었다. 분리균주의염기서열 [ 서열번호 1] 은 NCBI에서상동성을조사한결과, 다음표 3에나타낸바와같이클로렐라불가리스로분류되었다. [0041] 분리균주서열길이 표 3 근연종 % (nt a ) 상동성 Chlorella vulgaris YSL Chlorella vulgaris AB [0042] a nucleotide [0043] [0044] 이상에서와살펴본바와같이, 본발명에서분리한미세조류균은호기성조건에서도수소를생산하는점을제외하고는형태및최적온도, ph 등의특성을종합고려할때클로렐라불가리스에속하는것으로밝혀졌다. 이에, 본발명에따른분리균주를클로렐라불가리스 YSL001(Chlorella vulgaris YSL001) 으로명명하였고, 2012년 2월 23일자로한국생명공학연구원생물자원센터에기탁하여수탁번호 KTCT12144BP를부여받았다. [0045] [0046] [0047] 실시예 4: 수소생산확인수소생산을위해클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주를대상균주로사용하였으며, 이균주의성장을위해서상기표 1의최소 BBM 배지를사용하여, ph , 교반속도 150 rpm, 배양온도 27 를유지시키는동시에조도 50 μmol/ m2-sec를유지하여 5주간배양하였다. 여기에서수소화효소의활성을독립영양에대해최적화하기위해상기표 1의 BBM 배지에함유된 Na 2 EDTA를첨 - 8 -

9 가하지않아배지안에탄소 (carbon) 성분이없는상태에서실험을진행하였다. [0048] 상기균의수소화효소활성능과수소생성을보기위해공기가새어나가지않도록고안된병에담아배양기에서 성장시켰다. 또한, 자연상태의가스층을그대로병에담아생장시킨조건, 이산화탄소를대기중의약 150 배 증가시킨 15%(v/v) CO 2, 15%(v/v) O 2 를병에담은조건및혐기성상태의 3 가지조건에서시간에따라공기층 (gas phase) 의일부를역시공기가새어나가지않도록고안된주사기를통해빼내어기체크로마토그래피 (Gas Chromatography; GC, Shimadzu) 를통해분석하였다. [0049] 도 4 및도 5 는혐기 (0%(v/v) O 2 ), 호기 (21%(v/v) O 2 ), 독립영양 (15%(v/v) CO 2 /15%(v/v) O 2 ) 조건에서클로렐라 불가리스수소생산및수소화효소의활성을나타내었다. [0050] [0051] [0052] 현재까지는수소화효소는일반적으로광학미생물또는발효미생물등에서많이발견되며, 혐기조건에서이들의활동이알려져왔다 [Kessler E., Hydrogenase, photoreduction, and anaerobic growth. In Stewart WDP (ed.), Algal Physiology and Biochemistry. Blackwell, Oxford, pp ]. 수소화효소는수소생산에주요반응기작으로상기신균주가혐기조건이아닌자연환경에서서식하면서수소생산관찰하고자혐기및호기조건에서수소생산및수소화효소활성을관찰하였다. 또한, 클로렐라불가리스 YSL001 KTCT12144BP 균주는 ph 7.5 내지 8.5 조건에서서식하며, 이때대기중의이산 - 화탄소는물속에 HCO 3 형태로용존되어미생물등이이를탄소원으로섭취한다. 따라서, 균주들의활동이증가하면균주들에의해발생되는부산물의증가를보기위해이산화탄소의농도를증가시켜수소생산및수소화효소의활성을관찰하였다. 조류가지닌수소화효소활성은메틸바이오로겐 (methyl viologen] 을이용하여하였다. [0053] [0054] 정리하면, 본발명에서는신균주클로렐라불가리스가서식하는환경인호기조건에서수소생산이가능성여부와이때의수소화효소활성을검토하여수소생성능을시도하였다. 현재까지는광합성균주중에혐기조건에서만수소생산이검토되었을뿐 [Rao, K.K. and Hall, D.O Hydrogen production by cyanobacteria: potential, problems and prospects. J Mar Biotechnol. 4, 10-15] 호기조건에서조류에대한수소생산신균주에대한보고가없다. 따라서, 본발명에서는신균주클로렐라불가리스를이용하여호기조건뿐만아니라혐기및다량의이산화탄소가함유된독립영양조건상태에서도수소가생성되는신균주를확보하여수소생산능력이향상되는결과를보였다. [0055] 수탁번호 기탁기관명 : 한국생명공학연구원 수탁번호 : KCTC12144BP 수탁일자 :

10 도면 도면 1 도면

11 도면 3 도면

12 도면 5 서열목록 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Novel strain Chlorella vulgaris YSL001 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 883 <212> DNA <213> Chlorella vulgaris YSL001 <400> 1 agcggaggaa aagaaactaa ccgagatgcc acttakctat acggygagcg aaccgggcaa 60 agccccaact tgaaaatctc cagcctatgg ctggcgaatt gtagtctaga gaagcgctct 120 ctgccccacc ccggccccaa gtcccctgga aaggggcgtc aaagagggtg agaaccccgt 180 tgggaccgga ttttggggct ccacgagacg ctttcgtaga gtcgggttgc ttgggaatgc 240 agcccaaaga aggtggtaaa tcccatctaa ggctaaatac agacgggaga ccgatagcga 300 acaagtaccg tgagggaaag atgaaaagaa ctttgaaaag agagttaaaa agtacttgaa 360 attgttgaga gggaagcgat tggatcctac gggtgcaccc aggcacacgc ctgcctaacg 420 gttggctgaa tgcgctgggt gctggtcagc atgggttgtc cgggcgggat aaaaccgggg

13 gttgttaccc cggctatgtc gcctggccga ccgaggaacg aagggcgctc tttgagtcct 540 ccgggaactg cgccctcaag atgctggcgg aaaggttcta atcggcccgt cttgaaacac 600 ggaccaagga gtctaacatg catgcgagct ggtgggtggc aaacccatga agcgcaagta 660 acctgactgg tgggacggcc tgtgcctgca ccatcgaccc cgcttgatgt tttcagaagg 720 ctgggagtac gagcatgcac gttgggaccc gaaagatggt gaactatgcc tgagcagggc 780 gaagccagag gaaactctgg tggaggctcg tagatgtgct gacgtgcaaa tcgcwtttcg 840 gactgtgggt ataggggcga aagactaatc gaaccttcta gta 883 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> forward primer <400> 2 agcggaggaa aagaaacta 19 < 210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> reverse primer <400> 3 tactagaagg ttcgattagt c

특허청구의 범위 청구항 1 구제역이나 에이아이(AI) 감염에 의해 살 처분된 가축 매몰지의 붕괴나 침출수 유출에 의한 제2차 오염을 방 지하기 위한 방제방법에 있어서, 매몰지 내부에 고화제(Firming agent) 및 첨가물질이 주입되도록 통로를 형성하기 위한 천공단

특허청구의 범위 청구항 1 구제역이나 에이아이(AI) 감염에 의해 살 처분된 가축 매몰지의 붕괴나 침출수 유출에 의한 제2차 오염을 방 지하기 위한 방제방법에 있어서, 매몰지 내부에 고화제(Firming agent) 및 첨가물질이 주입되도록 통로를 형성하기 위한 천공단 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (51) 국제특허분류(Int. Cl.) B09B 1/00 (2006.01) C09K 17/00 (2006.01) E02D 31/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0016170 (22) 출원일자 2011년02월23일 심사청구일자 전체 청구항 수 : 총 9 항 2011년02월23일 (11)