비스포스포네이트관련 악골괴사증동물모델확립 연세대학교대학원 치의학과 장효원

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1 비스포스포네이트관련 악골괴사증동물모델확립 연세대학교대학원 치의학과 장효원

2 비스포스포네이트관련 악골괴사증동물모델확립 지도차인호교수 이논문을석사학위논문으로제출함 2014 년 12 월 10 일 연세대학교대학원 치의학과 장효원

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4 감사의글 무엇보다지금의저를있게해주신사랑하는부모님과제쌍둥이동생에게깊은 감사를드립니다. 이논문이나오기까지많은지도편달해주시고, 구강악안면외과 수련기간동안많은가르침을주신차인호교수님께도깊은감사를드립니다. 또한구강악안면외과의사로서의열정과학문에대한흥미를주신박형식교수님, 이상휘교수님, 김형준교수님, 정영수교수님, 강정완교수님, 남웅교수님, 정휘동교수님께도깊은감사를드립니다. 또한이논문이있기까지함께의논해주고같이실험에동참해주신김진우선생님께도깊은감사를드립니다. 3 년의수련기간동안함께고생한동기들, 박혜정, 박정현, 박진후, 백지웅을 비롯한의국선후배들에게도감사의마음을전합니다. 항상정진하는자세로공부하고환자를먼저생각하는구강악안면외과의사가 되겠습니다. 감사합니다 년 12 월 장효원

5 차례 차례 i 그림차례 iii 표차례 iv 국문요약 v Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 연구대상및방법 3 1. 연구대상 3 2. 연구방법 3 3. 육안적평가 6 4. 방사선학적평가 6 5. 조직학적평가 6 6. 이학적평가 6 7. 통계분석 7 Ⅲ. 결과 8 1. 육안적소견 8 2. 방사선학적소견 조직학적소견 이학적소견 통계분석결과 18 i

6 Ⅳ. 고찰 20 Ⅴ. 결론 27 참고문헌 28 영문요약 32 ii

7 그림차례 Figure 1. Time table of study 4 Figure 2. Clinical appearance of extraction sites on maxillary & mandibular ridge in rats 10 Figure 3. Radiographic examination of extraction sites on maxillary & mandibular ridge in rats 13 Figure 4. Incidence of ONJ lesion(%), experimental group 14 Figure 5. Histologic examination of extraction sites on maxillary & mandibular ridge in rats 16 Figure 6. CTX & TRACP 5b level between normal & BRONJ group 17 Figure 7. CTX & TRACP 5b level between normal & BRONJ group 18 Figure 8. Linear mixed test equation and Effect factor 19 iii

8 표차례 Table 1. Group information of BRONJ 4 Table 2. Clinical examination of extraction sites 2,4,8 weeks after extraction 8 Table 3. Radiographic examination of extraction sites 2,4,8 weeks after extraction 11 Table 4. Histologic examination of extraction sites 2,4,8 weeks after extraction 14 iv

9 국문요약 비스포스포네이트관련악골괴사증동물모델확립 골다공증등에서치료목적으로비스포스포네이트를투여하며, 매우드물지만그합병증으로악골괴사증이유발되기도한다. 본연구의목적은 Bisphosphonatesrelated osteonecrosis of the jaw( 이하 BRONJ) 의발병기전, 치료및예방에관한연구의기초를마련하고자, BRONJ 동물모델을확립하고이를임상적, 방사선학적, 조직학적으로검증하였다. 본실험에총 27마리의쥐를사용하였으며 3 그룹으로나누었다. 4주동안매주복막내약물 (saline, zoledronate, dexamethasone) 을투여하였다. 4번째주사후 3 일뒤상하악좌측제1,2 대구치를발거하였다. 발치 2, 4, 8 주후대조군은 3마리씩, 실험군은 2, 2, 5 마리씩희생하였다. 모든실험동물은희생시키기전에육안적관찰을하였으며, 희생시킨후에는표본을방사선학적, 조직학적으로 BRONJ 진단에합당한지검증하였다. 그리고희생전채취한쥐의혈액으로 C-terminal crosslinked telopeptide of Type I collagen( 이하 CTX) 와 Serum tartrateresistant acid phosphate( 이하 TRACP 5b) 를분석하여 BRONJ 와의관계를검증하였다. 본실험을통해비스포스포네이트와스테로이드제재를병용투여한쥐모델은 BRONJ 를발생시킬수있는믿을수있고재현가능한모델이며, BRONJ 의병태생리를이해하고진단과치료에도움이될수있는생체표지자를발굴하는데유용한동물모델로이용이가능할것으로사료된다. 핵심되는말 : 비스포스포네이트, 악골괴사증, BRONJ, 동물모델 v

10 비스포스포네이트관련악골괴사증동물모델확립 < 지도교수 : 차인호 > 연세대학교대학원치의학과 장효원 Ⅰ. 서론 비스포스포네이트 (Bisphosphonates, 이하 BPs) 는골다공증 (Osteoporosis), 악성종양의골전이 (Bone metastasis), 대사성골질환 (e.g Paget s disease, Osteogenesis imperfecta, Primary hyperparathyroidism) 등에의한 2차적인고칼슘혈증 (Hypercalcemia), 병적골절 (Pathologic fracture) 을예방및치료하는약제로쓰인다. BPs는두개의포스폰산 (Phosphonate) 을포함한다는점에서피로인산 (Pyrophosphate) 과구조적으로유사하며파골세포 (Osteoclast) 의활성을억제하여골양의손실 (Loss of bone volume) 을감소시킨다. 이들 BPs는질소포함여부에따라질소포함 BPs(Nitrogen containing BPs : pamidronate, alendronate, risedronate, zoledronate, etc.) 와질소불포함 BPs(Non-nitrogen containing BPs : clodronate, etidronate, etc.) 로나뉘는데질소포함 BPs는체내에서잘대사되지않으며, 파골세포억제효과가더강하다. 반면질소불포함 BPs는체내에서빠르게대사된다. Marx는 2003년질소포함 BPs(pamidronate(Aredia ), zoledronate(zometa )) 사용환자에서악골괴사증 (Osteonecrosis of the jaw) 이발생함을처음보고하였으며,(Marx, 2003) 이후이질환의발생기전, 이환율, 치료방법에대한많은논의가있었다. American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons(AAOMS) 에서 2014년발표한성명서 (position paper) 에따르면현재, 혹은이전에골흡수억제제나 1

11 혈관신생억제제를복용한병력이있거나, 골노출혹은노출되지않더라도구강내외로탐침이가능한구강악안면부위병변이 8주이상지속되거나, 이전에구강악안면부위방사선치료를받은적이없으며, 구강악안면부위로확실한병소의전이가없는경우 BRONJ 로정의하고있다. (Ruggiero et al., 2014) 아직까지 BRONJ 유병률은명확히알려지지않았으나 The American Society for Bone and Mineral Research(ASBMR) Task Force의조사에따르면, 골다공증 (Osteoporosis) 치료를위해 BPs 제재를경구복용하는경우 1:100,000 에서 1:10,000 사이의유병률을보이지만, 치료기간에따라그유병률은더높을것으로예상되며, 항암치료를받는환자군에서고용량으로 BPs 제재를정맥주사할경우유병률은 1% ~ 10% 정도까지보고된다.(Khosla et al., 2007; Marx et al., 2005) BRONJ 를유발하는위험인자들 BPs 종류, 투여방법, 환자의나이, 해부학적위치, 기존치주질환의유무, 침습적치과치료, 기타약제병용여부 - 은매우다양하며 (Kyrgidis et al., 2008; Marx et al., 2005) Kyrgidis A 등에의하면그중 BPs 제재복용중발치등외과적치료는 BRONJ 발생가능성을높이는인자로보고되었다.(Kyrgidis et al., 2008) 최근 ASBMR Task Force 에의하면종양의치료와관련된전신적인위험요소가 BRONJ 의발생및악화에관여하며, BPs 제재와동시투여하는항암제재, 스테로이드제재가상승작용을하는것으로보고되고있다.(Chiu et al., 2010; Marx et al., 2005; Sonis et al., 2009) 대다수의 BRONJ 환자는다발성골수종, 유방암, 전립선암으로진단된환자에서많이발생하였으며, 이들환자는모두질소포함 BPs 및 dexamethasone 과같은스테로이드제재를정맥투여하였다.(Kyrgidis et al., 2008) 그러나이들전신적요인, 약물병용과 BRONJ 악화와의상호작용기전은아직확립되지않았다. 이연구의목적은비스포스포네이트관련악골괴사증동물모델을확립하고이를임상적, 방사선학적, 조직학적으로검증하며, 특히 BPs 와스테로이드제재병용투여시 BRONJ 발생및악화에영향을미치는지여부를확인하는것이다. 또한악골괴사증동물모델을기반으로 BRONJ 의발병기전, 치료및예방에관한연구의기초를마련하고자한다. 2

12 Ⅱ. 연구대상및방법 1. 연구대상 본실험은 8주령의암컷백서 (Female Spraque-Dawley rat) ( g) 27마리의좌측상, 하악제 1,2대구치총 54 부위를이용하였다. 본실험은 Institutional Animal Care and Use Committee( 이하 IACUC) 규정을준수하였으며실험동물은연세대학교의료원임상의학연구센터의동물실험지침에따랐다. 2. 연구방법 가. 실험설계 실험동물은 3 그룹으로나누었다. 그룹 1( 대조군 ) 은 Normal saline 만복강내 (Intra-peritoneal) 주사하였고, 그룹 2( 실험군 ) 는 Zoledronic acid(zometa, Sigma Aldrich, Republic of Korea) 0.2mg/kg 을복강내주사하였다. 그룹 3( 실험군 ) 는 Zoledronic acid 0.2mg/kg 에추가적으로 Dexamethasone (Dexamethasone, Sigma Aldrich, Republic of Korea) 5mg/kg 을복강내주사하였다. (Table. 1) 실험기간은총 12주이며, 실험진행표는다음과같다. (Fig. 1) 3

13 Group number Group information Medication 1 (n=9) Control Normal saline 2 (n=9) Zoledronic acid injection Zoledronic acid 0.2mg/kg 3 (n=9) Zoledronic acid + Dexamethasone injection Zoledronic acid 0.2mg/kg + Dexamethasone 5mg/kg Table. 1 We used 27 rats, divided into 3 groups. Figure. 1 Time table of study is shown above. It takes 12 weeks, and 2,4,8 weeks after extraction, we sacrifice 2,2,5 rats of experimental group, taking blood samples at the same time. 4

14 나. 실험방법 실험동물은연세대학교의료원실험동물부지침에따라 1주일의순화기관을거쳐실험시작일부터 4주동안 1주일간격으로 1회씩, 동일실험자가복강내로약물을주입하였다. 4주주입후 3일뒤, 모든쥐의좌측상하악제 1,2 대구치를발치하면서혈액샘플을채취하였다. 발치 2주, 4주및 8주에대조군은 3마리씩, 실험군은각각 2마리, 2마리, 5마리희생하면서 (CO 2 asphyxiation chamber) 동시에혈액샘플을채취하였으며, 모든표본에대한육안적, 방사선학적, 조직학적검사를시행하였다. 혈액샘플은 ELISA kit를사용하여각각 CTX, TRACP 5b 농도를측정하였다. 발치 (Tooth extraction) 모든실험대상쥐의좌측상하악제 1,2 대구치를발치하였다. 모든발치는 무균적으로이루어졌으며전신마취하에이루어졌다.(Tiletamine/zolazepam -milan, Italy; xylazine-rompun Bayer AG, Leverkusen, Germany) 모든발치는치과용 탐침 (dental explorer) 을사용하여치주인대절제술및아탈구, 탈구, 발치, 소파술을 순차적으로시행하였다. 발치시행직후연세대학교의료원임상의학연구센터의동물실험지침에따라 meloxicam(metacam, Boehringer-Ingelheim, Germany) 을 10mg/kg 으로 복강내주사하여수술후통증을관리하였다. 5

15 3. 육안적평가 발치후 2 주, 4 주, 8 주에희생된백서의상, 하악골을연조직과함께절단하여 구강점막의치조골피개여부및부골형성여부를육안적으로확인하고사진촬영 후, 10% buffered-formalin 에즉시보관하였다. 4. 방사선학적평가 절제한조직은표준치과방사선필름을이용한 Plain X-ray 촬영을실시하여 영상을비교하였다. (Voltage(kV)=60, Current(mA)=70, Exposure(s)=0.08) 5. 조직학적평가 (H-E staining) 절제한조직은 10% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 에 1주일간탈회시킨후, 파라핀에포매하였다. 파라핀포매후, 하악골의전, 후방향으로 4μm 두께로절단하였다. 병리조직학적인소견을관찰하고 Empty osteocytic lacunae / Total osteocytic lacunae 비율을계산하고자하였다. 6. 이학적평가 (Serum chemistry) 발치직전, 발치 2 주, 4 주, 8 주후희생직전에각각안와하 (Infraorbital) 채혈을 시행하여 1 ~ 1.5cc 의전혈 (whole blood) 을얻었다. 이혈액샘플은원심분리후, ELISA Kit 에적용하여각각 CTX, TRACP 5b 농도를측정하였다. 6

16 가. CTX (C-terminal crosslinked telopeptide of type I collagen) Type I bone tropocollagen 의 Non-helical C-terminal 로서 type I collagen 의 흡수정도및파골세포의활성정도를평가하는지표이다. 본연구에서는동물 모델에서악골괴사증과이학적소견과의관계를평가하기위해사용되었다. 나. TRACP 5b (Serum tartrate-resistant acid phosphate) TRACP 5b 란생체표지자를사용하여비스포스포네이트가골흡수를억제하는데효과적이라는연구가진행되고있으며 (Kuroshima et al., 2012), 본연구에서는대조군과실험군사이에 TRACP 5b 농도가유의한차이를보이는지, BRONJ 진단에 TRACP 5b 가유용한생체표지자로사용될수있는지여부를확인하였다. 7. 통계분석 실험군내 BRONJ가발생하지않은그룹 (n=6) 과발생한그룹 (n=12) 의 CTX, TRACP 5b를비교하였다. 모집단개수가충분하지않아 (n=18) t-검정통계분석을시행하였다. 또한실험군내 BRONJ가발생한그룹에서시간에따른 TRACP 5b 변화량을조사하여 (Linear mixed test) TRACP 5b가 BRONJ 의발생여무를예측할수있는생체표지자인지여부를평가하였다. 7

17 Ⅲ. 결과 1. 육안적소견 최종적인소견은아래 Table. 2에정리되어있다. 육안적으로구강점막의열개없이회복된경우정상회복으로정의하였으며, 구강점막의열개및하방골조직의노출, 혹은하방골조직이노출되지않더라도구강점막의변연이완전히융합되지않고점막의충혈이관찰될경우불완전회복으로서 BRONJ 로진단하였다. 2 weeks 4 weeks 8 weeks Control group *0/3 0/3 0/3 Z group 2/2 2/2 5/5 Z+D group 0/2 2/2 5/5 Table. 2 Clinical appearance of extraction sites on maxillary & mandibular ridge in rats * BRONJ 의심개체수 / 전체개체수 Z group : Zoledronate만복막투여한 group Z+D group : Zoledronate + dexamethasone 병용복막투여한 group 8

18 가. 2 주희생군 (1) 대조군 모든대조군에서발치와부위의완전한회복이관찰되었다. 골결손이보이지 않았고, 발치와상방은구강점막으로완전히피개되어있었다. 또한연조직의감염, 염증소견은보이지않았다. 4 주, 8 주희생군에서도완전한회복이관찰되었다. (2) 실험군 Zoledronate 만복막투여한그룹 ( 이하 Z 그룹 ) 에서 2개체의불완전한회복이관찰되었다. 발치와상방점막의열개관찰되었으며, 하방으로골조직이노출되었다. 반면 Zoledronate 와 Dexamethasone 병용복막투여한그룹 ( 이하 Z+D 그룹 ) 에서는발치와상방점막열개없이완전한회복이관찰되었다. 나. 4 주희생군 ( 실험군 ) Z 그룹과 Z+D 그룹에서모두불완전한회복이관찰되었다. 다. 8 주희생군 ( 실험군 ) Z 그룹과 Z+D 그룹에서모두불완전한회복이관찰되었다. 4주희생군에비해하방의괴사된골조직명확하게관찰되었으며, 특히 Z+D 그룹에서점막의열개가더명확하고크기가컸다. 일부표본에서는점막열개변연부에서명확한충혈이관찰되었다. (Fig. 2) 9

19 Figure. 2 Representative photographs of gross clinical appearance of maxillary & mandibular ridge in rats. (All sacrificed 8weeks after extraction) 1. Control group shows complete healing of oral mucosa covering extraction site. 2. Z group shows incomplete healing of oral mucosa, showing exposed, necrotic alveolar bone. 3. Z + D group shows incomplete healing of oral mucosa, showing definitely wide, exposed necrotic alveolar bone. 10

20 2. 방사선학적소견 최종적인소견은아래 Table. 3에정리되어있다. 방사선학적으로발치와부위에서가골, 혹은성숙골이채워져있지않으며, 주변으로부분적인골파괴가보이는경우 BRONJ 로진단하였다. 단순골결손만보이고주변으로골파괴가없을경우, 발치와에연조직내성장에의한회복가능성이있으므로정상회복으로진단하였다. 2 weeks 4 weeks 8 weeks Control group *0/3 0/3 0/3 Z group 2/2 2/2 2/5 Z+D group 0/2 2/2 2/5 Table. 3 Radiographic examination of extraction sites on maxillary & mandibular ridge in rats * BRONJ 의심개체수 / 전체개체수 Z group : Zoledronate만복막투여한 group Z+D group : Zoledronate + dexamethasone 병용복막투여한 group 가. 2 주희생군 (1) 대조군 모든대조군에서발치와부위의회복이관찰되었다. 아직발치와에골결손이 관찰되나, 주변으로골파괴가없는표본의경우정상회복으로진단하였다. 4 주, 8 주 희생군에서도완전한회복이관찰되었다. 11

21 (2) 실험군 Z 그룹에서 2 개체의불완전한회복이관찰되었다. 발치와내에빈공간이그대로 남아있었으며, 발치와주위로부분적인골파괴가관찰되었다. 반면 Z+D 그룹에서는모두완전한회복이관찰되었다. 나. 4 주희생군 ( 실험군 ) Z 그룹과 Z+D 그룹에서모두불완전한회복이관찰되었다. 다. 8 주희생군 ( 실험군 ) Z 그룹과 Z+D 그룹모두 2 / 5 (40%) 에서 BRONJ 가관찰되었다. 나머지 3 / 5 에서는발치와공간이신생골로채워져있지않거나잔존치근이남아있는경우가있었으나주변으로골파괴가보이지않아정상회복으로진단하였다. Z 그룹에비해 Z+D 그룹에서발치와주위로더넓은골파괴가관찰되었다. (Fig. 3) 12

22 A B C Mx A B C Mn Figure. 3 Representative radiograph of extraction sites on maxillary & mandibular ridge in rats. (All sacrificed 8 weeks after extraction) A. Linear opaque radio-density around extraction socket (Control group) B. Mottled trabecular pattern around extraction socket (Z group) C. More definite, wider mottled trabecular pattern around extraction socket (Z + D group) 13

23 3. 조직학적소견 최종적인소견은아래 Figure. 4, Table. 4에정리되어있다. 조직학적으로괴사된골조직주변으로염증세포가침윤되어있으며, 상방점막의열개가관찰되고발치와주변에 empty lacunae가관찰될경우 BRONJ 로진단하였다. 이는 BRONJ 를최종확진하기위한소견이며, 조직학적으로 BRONJ 진단된경우에만 BRONJ 발생모델로선정하였다. Figure. 4 Incidence of ONJ lesion(%),experimental group 2 weeks 4 weeks 8 weeks Control group *0/3 0/3 0/3 Z group 1/2 2/2 3/5 Z+D group 0/2 2/2 4/5 Table. 4 Histologic examination of extraction sites on maxillary & mandibular ridge in rats * BRONJ 의심개체수 / 전체개체수 Z group : Zoledronate만복막투여한 group Z+D group : Zoledronate + dexamethasone 병용복막투여한 group 14

24 가. 2 주희생군 (1) 대조군 모든대조군에서발치와부위의정상적인회복이관찰되었다. 4 주, 8 주 대조군에서도동일한소견관찰되었다. (2) 실험군 Z 그룹에서 1 /2 (50%) 의불완전한회복이관찰되었다. 반면 Z+D 그룹에서는 모두정상적인회복이관찰되었다. 나. 4 주희생군 ( 실험군 ) Z 그룹과 Z+D 그룹에서모두불완전한회복이관찰되었다. 발치와주변으로 empty lacunae 가관찰되어괴사된골조직이관찰되었으며, 일부표본에서는주변으로부골 (sequestra) 이관찰되었다. 발치와상방으로구강점막의열개가관찰되었으며, 괴사된골조직주변으로다수의백혈구세포침윤이관찰되었다. 다. 8 주희생군 ( 실험군 ) Z 그룹과 Z+D 그룹에서모두불완전한회복이관찰되었다. (Fig. 5) Z 그룹에 3 개체 (3/5, 60%) 에서 BRONJ 진단되었고, Z+D group 에서 4 개체 (4/5, 80%) 에서 BRONJ 진단되었다. (Table. 4) 15

25 A B C Figure. 5 Representative histologic features of extraction sites. (All sacrificed 8 weeks after extraction) A. Inflammatory cells (neutrophils) surround necrotic alveolar bone with empty lacunae (Z group, Mn, x50, sacrificed 8wks after ext.) B. Sequestra formation apart from alveolar bone with empty lacunae (Z group, Mn, x100, sacrificed 8wks after ext.) C. Ulcerative overlying mucosa invaginates into extraction socket, and necrotic bone with empty lacunae on the surface of exposed alveolar bone (Z + D group, Mx, x200, sacrificed 8wks after ext.) 16

26 4. 이학적소견 아래도표는실험군에서정상회복그룹과 BRONJ 그룹간의 CTX, TRACP 5b 를비교한것이다. (Fig. 6) Figure. 6 CTX shows no tendancy neither between normal and BRONJ group, nor within each group. TRACP 5b consistently shows lower value of BRONJ group than normal healing group, although time and TRACP 5b level are not inversely proportional. 17

27 5. 통계분석결과 A. Bivariate analysis (Independant t-test) 모집단의개수가적어서 (n=18) 독립 t-test 를시행하였다. 결과는아래도표로 표기하였다. (Fig. 7) Figure. 7 TRACP 5b can distinguish between normal and BRONJ group with statistical significance. (P value< 0.05) 18

28 B. Linear mixed test Linear mixed test 를사용하여 BRONJ 발생그룹내에서 TRACP 5b 농도에 대한 time effect 를측정하였다. 이는 Effect factor (e SE ) 로표현된다. (Fig. 8) Effect factor = e SE y = Xβ +Zu +ε y: TRACP 5b measures β: Fixed effects u: Random effects ε: Random error Figure. 8 Linear mixed test equation and Effect factor 위방정식을해석하면 1. TRACP 5b 는정상회복그룹과 BRONJ 그룹을구분하는데 e 0.18 만큼 effect 가 있으며이는통계적유의성이있다. (P value = 0.001) 2. TRACP 5b 는시간변화에따라 BRONJ 의발병률을예측하는데 e 0.02 만큼 effect 가있으며이는통계적유의성이없다. (P value = 0.023) 3. TRACP 5b 는 BRONJ 를진단하는생체표지자로사용될수있는가능성이있다. 19

29 Ⅳ. 고찰 비스포스포네이트제재는현재가장효과적인골흡수억제재로 Paget s disease 치료를위해임상에처음도입되었다. (Rodan and Martin, 2000) Food and Drug Administration( 이하 FDA) 에서는다발성골수종및유방암과같은고형종양의골전이를억제하기위해 pamidronate 와 zoledronic acid 의정맥비스포스포네이트제재의사용을승인하였으며, 이외에도비스포스포네이트는골다공증 (Osteoporosis), Paget s disease 를포함한골형성부전증 (Osteogenesis imperfect), 원발성부갑상선항진증 (Primary hyperparathyroidism) 과같은골대사성질환에광범위하게사용되고있다. (Kremer et al., 2014; Nussbaum et al., 1993; Rosen et al., 2004) 비스포스포네이트는피로인산 (pyrophosphate) 계열의합성물질이며칼슘포스페이트결정 (calcium phosphate crystal) 의응집을억제하고이러한무정형칼슘포스페이트결정 (amorphous calcium phosphate crystal) 이수산화인회석 (hydroxyapatite) 으로변환되는것을억제한다.(Fleisch, 1998) 비스포스포네이트제재의가장중요한작용은파골세포 (osteoclast) 의활성을억제하는것이다.(Van Beek et al., 2002) 비스포스포네이트제재는파골세포-골아세포 (osteoclast osteoblast) 의상호작용을억제함으로써궁극적으로골재형성을억제하게된다. 비스포스포네이트제재의전신투여시나타날수있는소화기계의부작용과 (Yoshioka et al., 2013) 최근관심을모으고있는 Bisphosphonate-related osteonecrosis of jaw (BRONJ) 의합병증은비스포스포네이트제재의선별적인투여, 20

30 적용대상의선정및용량선택에대한논란을불러일으켰다.(Aguirre et al., 2010; Allen et al., 2010) BRONJ 환자발생에대한기존의후향적연구에서비스포스포네이트제재를정맥투여한환자군에서 BRONJ 발생률은 0.8 ~ 12% 로조사되었으며투여후 6개월이후에 BRONJ 발생률이급격히증가하는것으로나타났다. (Bamias et al., 2005; Pozzi et al., 2007; Thumbigere Math et al., 2012; Wang et al., 2007) 특히 BRONJ 환자가고령환자에주로분포되어있고, 암환자와같이다수의면역억제제 (multiple-immunosuppression drug) 를사용하는환자에게발병률이높다는사실은주목할필요가있다. (Sonis et al., 2009; Then et al., 2012) 특히다발성골수종환자나골다공증환자는생존율이높아비스포스포네이트제재의적용기간이길고결과적으로비스포스포네이트의누적용량 (cumulative dose) 이증가하여 BRONJ 가더쉽게발생한다. 크론병 ( 만성장염 ) 환자에대한장기간스테로이드사용이고관절의무혈관성괴사 (avascular necrosis) 를유발하여골괴사를초래한다는보고도있어서 (Klingenstein et al., 2005) Zoledronate 와 Dexamethasone 의병용투여는 BRONJ 의발병률을증가시키는데임상적상관성이있다. 본연구는비스포스포네이트제재와스테로이드제재를병용투여하여 BRONJ 환자의임상적, 병리학적인양상을재현하는동물모델을제시하는것이며, 기존실험에서는안정적인 BRONJ 재현성과약물투여의용의성을고려하여 8주령의 Spraque-Dawley 쥐를사용하였다. 실험군을 Zoledronate 만투여한그룹과 Zoledronate 와 Dexamethasone 을병용투여한그룹으로구분하였으며, 암환자에게투여하는양과동일한수준으로 21

31 등가용량 (equivalent dose) 을투여하였다. 다만다발성골수종환자의경우 zoledronic acid 4mg / 60kg / 4 weeks (1.6 x 10-4 g/kg/week) 를정맥내투여하는데본실험의경우복막내투여를하게되어유효약물농도가감소할것을우려하여 2.0 x 10-4 g/kg/week 의 zoledronic acid 를복막내투여하였다. 따라서투여약물의누적용량이암환자에비해증가하였다. Dexamethasone 같은면역억제제는일반적으로임상에서암환자에게투여하는양과동일한수준으로 (5mg/kg/week) 적용하였다. 결과적으로실험군의 66.6% 에서 BRONJ 가발생하였으며, 이는암환자의임상적발병률 (0.8 ~ 12%) 보다훨씬높았다. 이전실험에서보고한바로는 Spraque-Dawley 쥐의상하악제1,2대구치발치 2일후발치와에골형성이시작되며, 14일후발치와가신생골로완전히채워짐이관찰되었다.(Iizuka et al., 1992; Johansen, 1970) 본실험에서도발치후 2,4,8주희생결과대조군의 spraque-dawley 쥐는특기할합병증없이발치와가신생골로치유되었다. 다만, 발치시치과용탐침기를사용하여치주인대절제술및아탈구, 탈구, 발치, 소파술을순차적으로시행하였으나쥐의상하악제1,2 대구치의치근이다근치이며사람보다치근이개도가커서발치후 x-ray 촬영상에잔존치근이남아있는경우가있었다. 2주뒤 Zoledronate 만투여한그룹에서는 BRONJ 가발생하였으나 (1/2, 50%) Zoledronate 와 Dexamethasone 을병용투여한그룹에서는오히려 BRONJ 가발생하지않았는데 (0/2, 0%), 이는잔존치근의존재여부가원인이될수있다. 잔존치근이남을경우골결손 (bone defect) 양이 22

32 완전히발거된발치와에비해작고, 골손상량도상대적으로작아서 BRONJ 발생률이감소할수도있다. 치아치조골수술 (dentoalveolar surgery) 을시행한환자군은단순히 pamidronate 제재만투여한환자군보다 7배정도 BRONJ 발생률이높다고보고하였으며 (Badros et al., 2006), 본실험에서잔존치근이남은경우보다완전발치 (complete extraction) 후발치와를소파하는것이골결손을더크게남겨 BRONJ 발생률을증가시킬가능성이높다고생각된다. 실제로 Z+D 그룹 2주희생군중한표본에서잔존치근이발견되었으며, 나머지한표본에서는잔존치근이발견되지않았다. Zoledronate 와 Dexamethasone 의병용투여는 BRONJ의발병률을증가시킨다. 다만 Spraque-Dawley 쥐의경우사람과회복기전이다르며, dexamethasone 이단기간사용되었을경우오히려술후염증을감소시켜 BRONJ 발생을억제했을가능성도있다. 실제다발성골수종이나골다공증으로비스포스포네이트제재와스테로이드제재를병용투여하는환자는 50 ~60대이상의고령군이며, 장기간약물을투여받고, 추가적으로면역억제제, 항암제 (e.g Docetaxel etc) 등으로정맥투여받는다. Spraque-Dawley 쥐의평균수명을 24개월, 96주로추정하였을때, 본실험에사용된쥐는 8주령이며, 실험에총 12주가소요되었음을고려할때실험종료시에도쥐는 20주령의정상적인면역력을가진상태이다. 발치 4주후희생한실험군에서 Z 그룹과 Z+D 그룹모두에서 BRONJ 가발생하였으며, 발치 8주후희생한실험군에서는 Z 그룹의 3/5 (60%), Z+D 그룹의 4/5 (80%) 가 BRONJ 에이환된것으로확인되어 zoledronate 와 dexamethasone 의병용투여시누적용량증가및소요된시간 (Time factor) 이 23

33 BRONJ 발생의위험인자 (Risk factor) 임을확인할수있다.(Hikita et al., 2009; Sonis et al., 2009; Tabuchi et al., 2005; Yamamoto et al., 2006) 다만 BRONJ 의발생률을유의하게증가시키는스테로이드농도및적용기간에대해서는더많은실험이필요하다. Ruggiero 등은비스포스포네이트가신생혈관의생성을방해하여골내혈관분포 (Bone vascularity) 의감소가파골세포의활성감소, 괴사및결과적으로골의무혈관성괴사 (Avascular necrosis) 가유발된다고하였다. (Ruggiero, 2008) 괴사골주변의혈액공급감소는비스포스포네이트의항혈관형성 (Antiangiogenetic) 특성으로잘설명될수있으며, 기존의실험논문에서비스포스포네이트를투여한실험군의표본을병리학적으로분석하였을때, 괴사골주변에혈관분포가감소하였다고하였다. 본실험에서는혈관불포를정량적으로계산하지는못하였으나, 괴사골주변으로괴사된골세포및 empty lacunae 가발견되었고그공간으로미세혈관충전 (Capillary refill) 이관찰되지않아혈행의감소가뚜렷하게확인되었다. 괴사골상방으로심한염증반응을보이는점막조직에는많은백혈구와신생혈관이관찰되었으나, 괴사골의범위가더넓어서결과적으로전체적인혈관분포는감소된양상이었다. 최근 in vivo, in vitro 실험에서이러한혈관분포의감소양상이신생혈관의내피세포 (Endothelial cell) 의기능을감소시킨다는보고가있으며혈관내피세포성장인자 (VEGF : Vascular endothelial growth factor) 와같은생체표지자를통해 BRONJ 의발병률및진행상태를분류하는방법도논의되고있다. (Fournier et al., 2002) (Stresing et al., 2011) 24

34 CTX 는골아세포 (Osteoblast) 에의해형성된콜라겐전구물질 (Procollagen) 이세포외공정 (Extracellular process) 에의해 N, C-extension 이분해되어 100kDa 분자량의 propeptide 가생성되는데이중에 C-terminal telopeptide 가 CTX 농도이며 N-terminal crosslinked telopeptide of Type I collagen( 이하 NTX) 보다혈액내변화량이작다. Marx 등은 CTX 농도가 150pg/ml 이상일경우 BRONJ 의발생률이유의하게증가한다고주장하였다. (Marx, 2003; Marx et al., 2005) 또한 CTX 는혈액내에서빠르게대사되나 (Short serum half-life) 90% 가골의 type I 콜라겐에서합성되어새롭게형성된콜라겐분자와 1:1 비율로형성되므로콜라겐합성, 골형성을확인할수있는생체표지자로서의의를지닌다고하였다. (Marx et al., 2005) CTX 를이용하여 BRONJ 의발생률및진행정도를예측하는논문은이전에많이있었으며, 최근에는 CTX 뿐만아니라 osteocalcin, RANKL/OPG ratio, Cathepsin K 등의생체표지자에대한실험이진행중이다.(Chao et al., 2010; Khosla et al., 2008) 본논문에서는 TRACP 5b 를 BRONJ 를진단하는생체표지자로서유의성이있는지검증해보았다. TRACP 5b는 2가지의동형 (Isoform) 이있다. Type 5a는소수로혈소판, 적혈구등에존재하며 Type 5b는대다수로서파골세포에존재한다. 따라서 TRACP 5b 를정량적으로분석하면파골세포의수와활성도 - 부착 (Adhesion), 콜라겐단백질의분해정도 를직접적으로확인할수있다. 또한기존의혈청표지자들이간과신장의기능에영향을많이받지만 (False positive), TRACP 5b 는이들장기에영향을받지않는독특한생체표지자이다. 25

35 또한 CTX 값이주간변동성 (Diurnal variability) 가심한반면 TRACP 5b 는그러한변동성이크지않아그의미가더크다. 이러한 TRACP 5b 는골다공증치료를평가하기위한골교체율표지자 (Bone turn-over marker) 로서주로채택되어왔으나, BRONJ 영역에서는시도되지않았다는점에서본논문의의의가있다. (Chao et al., 2010; Civitelli et al., 2009; Martini et al., 2007) 본실험에서 TRACP 5b ELISA 분석결과정상회복그룹은평균 1.5U/L, BRONJ 그룹은 1~1.25U/L 의값을보였으며, Linear mixed test 결과정상회복그룹과 BRONJ 그룹을구분할수있는가능성이있는생체표지자임을확인하였다. 반면누적용량이증가할수록시간에따라 TRACP 5b 값이반비례하여감소할것으로예상하였으나큰변화량은없었다. (Fig. 6) CTX, TRACP 5b를포함한골교체율표지자의농도는성인남성, 폐경기전후의여성등에따라다르지만, 아직 BRONJ 환자에서는확립되지못했다. 이에대해서는후향적연구가더필요하며 BRONJ 를진단할수있는추가적인표지자발견도가능할것으로생각된다. 26

36 Ⅴ. 결론 본연구에서성공적인비스포스포네이트관련악골괴사증 (BRONJ) 동물모델을 확립하였으며다음과같은결론을도출하였다. 1. 비스포스포네이트제재와스테로이드제재의병용투여로누적용량이증가하게 되면 BRONJ 가발생하는동물모델을구현할수있다. 2. 비스포스포네이트제재와스테로이드제재의병용투여만으로자발적으로 BRONJ 가능성이높아지는것은아니며, 치아발거와같은외과적국소요인이 BRONJ 발생가능성을높게한다. 3. TRACP 5b 는 BRONJ 진단에유용하게이용할가능성이있는생체표지자가될 수있다. 본실험을통해비스포스포네이트와스테로이드제재를병용투여한쥐모델은 BRONJ 를발생시킬수있는믿을수있고재현가능한모델로서향후 BRONJ 의병태생리를이해하고진단과치료에도움이될수있는생체표지자를발굴하는데유용한동물모델로이용이가능할것으로사료된다. 27

37 참고문헌 Aguirre JI, Altman MK, Vanegas SM, Franz SE, Bassit AC, Wronski TJ: Effects of alendronate on bone healing after tooth extraction in rats. Oral diseases 16(7): , Allen MR, Kubek DJ, Burr DB: Cancer treatment dosing regimens of zoledronic acid result in near-complete suppression of mandible intracortical bone remodeling in beagle dogs. Journal of bone and mineral research 25(1): , Badros A, Weikel D, Salama A, Goloubeva O, Schneider A, Rapoport A, et al.: Osteonecrosis of the jaw in multiple myeloma patients: clinical features and risk factors. Journal of clinical oncology 24(6): , Bamias A, Kastritis E, Bamia C, Moulopoulos LA, Melakopoulos I, Bozas G, et al.: Osteonecrosis of the jaw in cancer after treatment with bisphosphonates: incidence and risk factors. Journal of clinical oncology 23(34): , Chao T, Wu Y, Janckila AJ: Tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b (TRACP 5b) as a serum maker for cancer with bone metastasis. Clinica chimica acta 411(21-22): , Chiu C, Chiang W, Chuang C, Chang S: Resolution of oral bisphosphonate and steroid-related osteonecrosis of the jaw--a serial case analysis. Journal of oral and maxillofacial surgery 68(5): , Civitelli R, Armamento Villareal R, Napoli N: Bone turnover markers: understanding their value in clinical trials and clinical practice. Osteoporosis international 20(6): , Fleisch H: Bisphosphonates: mechanisms of action. Endocrine reviews 19(1): , Fournier P, Boissier S, Filleur S, Guglielmi J, Cabon F, Colombel M, et al.: Bisphosphonates inhibit angiogenesis in vitro and testosterone-stimulated vascular regrowth in the ventral prostate in castrated rats. Cancer research 62(22): ,

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40 Stresing V, Fournier PG, Bellahcène A, Benzaïd I, Mönkkönen H, Colombel M, et al.: Nitrogen-containing bisphosphonates can inhibit angiogenesis in vivo without the involvement of farnesyl pyrophosphate synthase. Bone 48(2): , Tabuchi M, Miyazawa K, Kimura M, Maeda H, Kawai T, Kameyama Y, et al.: Enhancement of crude bone morphogenetic protein-induced new bone formation and normalization of endochondral ossification by bisphosphonate treatment in osteoprotegerin-deficient mice. Calcified tissue international 77(4): , Then C, Hörauf N, Otto S, Pautke C, von Tresckow E, Röhnisch T, et al.: Incidence and risk factors of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw in multiple myeloma patients having undergone autologous stem cell transplantation. Onkologie 35(11): , Thumbigere Math V, Tu L, Huckabay S, Dudek AZ, Lunos S, Basi DL, et al.: A retrospective study evaluating frequency and risk factors of osteonecrosis of the jaw in 576 cancer patients receiving intravenous bisphosphonates. American journal of clinical oncology 35(4): , Van Beek ER, Löwik CW, Papapoulos SE: Bisphosphonates suppress bone resorption by a direct effect on early osteoclast precursors without affecting the osteoclastogenic capacity of osteogenic cells: the role of protein geranylgeranylation in the action of nitrogen-containing bisphosphonates on osteoclast precursors. Bone 30(1): 64-70, Wang EP, Kaban LB, Strewler GJ, Raje N, Troulis MJ: Incidence of osteonecrosis of the jaw in patients with multiple myeloma and breast or prostate cancer on intravenous bisphosphonate therapy. Journal of oral and maxillofacial surgery 65(7): , Yamamoto Y, Udagawa N, Matsuura S, Nakamichi Y, Horiuchi H, Hosoya A, et al.: Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappab ligand. Endocrinology 147(7): , Yoshioka T, Okimoto N, Okamoto K, Sakai A: A comparative study of the effects of daily minodronate and weekly alendronate on upper gastrointestinal symptoms, bone resorption, and back pain in postmenopausal osteoporosis patients. Journal of bone and mineral metabolism 31(2): ,

41 Abstract Development of animal model for Bisphosphonates-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ) Hyo Won Jang Department of Dental science The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor In Ho Cha, D.D.S., M.S.D., Ph.D.) Bisphosphonates, which is used to treat various bone diseases including osteoporosis, can induce osteonecrosis of the jaw. However, pathophysiology, treatment and prevention of Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ) are still unclear. The objective of this study was to develop a rat model of BRONJ with clinical, radiological and histological demonstration. Twenty seven rats were divided into 3 groups; control group (I), zoledronate group (II), zoledronate and dexamethasone group (III). Rats received weekly intraperitoneal injection of the drugs for 4 weeks and extraction of left maxillary and mandibular 1st, 2nd molars were followed. Consecutive injections were performed, and 3 rats were sacrificed at 2, 4, and 8 weeks each in the control group, and 2, 2, and 5 rats were sacrificed at 2, 4, and 8 weeks, respectively, in groups II and III. After clinical determination of the extraction wound, all specimens were further evaluated by radiological and histological 32

42 measures. Blood sampling for measurement of C-terminal crosslinked telopeptide of type I collagen and tartrate-resistant acid phosphate 5b rats were performed at the time of 2, 4 and 8 weeks. Based on this study, the rat model with bisphosphonates and steroid administration was found to be a reliable and reproducible model for BRONJ. This rat model can be used as a valuable model for the detection of biomarkers of BRONJ, which could help further understanding of the pathophysiology of BRONJ. Key words : Bisphosphonate, jaw necrosis, BRONJ, animal model 33