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재연 노
5 years ago
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1 자궁경부세포검사에서 Makorin Ring Finger Protein1 (MKRN1) 면역세포화학의유용성 연세대학교대학원 의학과 장민영

2 자궁경부세포검사에서 Makorin Ring Finger Protein1 (MKRN1) 면역세포화학의유용성 지도교수김재훈 이논문을석사학위논문으로제출함 2014 년 6 월 연세대학교대학원 의학과 장민영

4 감사의글 먼저이렇게논문을마무리할수있도록지도해주신김재훈교수님께진심으로감사드립니다. 늘어린아이와같이투정을부리는저로하여금제능력이상의것을할수있도록이끌어주시고정신적인버팀목이되어주신점에대해서어떤방법으로도제마음을다표현할길이없습니다. 늘부모님과같이생각해왔고앞으로도그럴것이며부끄럽지않은제자가되도록노력하며살겠습니다. 교수님의제자가된것에대해늘자랑스럽게느끼고있으며저에게는가장큰행운이었다고생각합니다. 이부족한논문을심사하시고귀중한조언을아끼지않으신김성훈, 전경희교수님께도감사드리며늘곁에서작은부분까지도챙겨주신채두병, 조한별교수님께도이기회를빌어서감사한마음전합니다. 세계에서 2 번째로큰나라인캐나다에서우연히두분을마주치게된것은제인생의중요한기회였다고생각하고저를알아봐주신두교수님께진심으로감사드립니다. 제가하는일에대해서는 100% 의신뢰와적극적인지원을아끼지않은저를제외한나머지 19 명의우리가족들너무고맙고가족과다름없는내과분국식구들영미언니, 지수, 지현이모두제가무사히산부인과전문의가될수있도록큰도움을주어서진심으로고맙습니다. 다시한번감사의마음을전하며위의모든분들께이논문을바칩니다 년 6 월장민영

5 < 차례 > 국문요약 1 Ⅰ. 서론 4 II. 재료및방법 7 1. Study population 7 2. Liquid-based cervical cytology 8 3. Human papillomavirus testing 8 4. Histology 9 5. Cell block preparation 9 6. MKRN1 immunocytochemistry p16 INK4a immunocytochemistry Statistical analysis 11 III. 결과 Cytology and histologic results Cytology, HPV, MKRN1 and p16 INK4a positivity in histologic categories Clinical performance of cytology, HPV testing, MKRN1, and p16 INK4a immunostaining to detect CIN2+ 15 IV. 고찰 19 V. 결론 23 참고문헌 24 ABSTRACT 27

6 그림차례 그림 1. HSIL 환자에서관찰된 MKRN1 면역염색양성소견과 c y t o l o g y 음성환자에서의 MKRN1 면역염색음성소견 10 표차례 표 1. Liquid-based cervical cytology 와 histologic result 의비교 13 표 2. Histologic category 에따른 cytology, HPV test, MKRN1, p16 INK4a 의양성률비교 14 표 3. 전체환자군에서 CIN2+ 에대한 cytology, HPV test, MKRN1 과 p16 INK4a 면역염색법의진단정확도비교 17 표 4. ASCUS/LSIL 군에서 CIN2+ 에대한 cytology, HPV test, MKRN1 과 p16 INK4a 면역염색법의진단정확도비교 18

7 국문요약 자궁경부세포검사에서 Makorin Ring Finger Protein1 (MKRN1) 면역세포화학의유용성 목적 MKRN1 이자궁경부병변에서면역반응성이증가하는지확인하고 MKRN1 면역염색이자궁경부암진단의정확도를높이는데유용한검 사법인지확인하기위하여본연구를시행하였다. 방법 2013년 6월강남세브란스병원임상시험심사위원회의승인을받은이후 2013년 7월부터전향적으로검체수집을하였다. 자궁경부액상세포검사 (cytology) 와인유두종바이러스검사 (HPV test) 를시행하고남은 cytology 검체를이용하여세포블록을제작한뒤 MKRN1과 p16 INK4a 면역염색을시행하였다. 4 가지검사결과는최종조직검사 결과와비교하였다. 각검사법의 CIN2 이상 (CIN2+) 의병변을진단하는데있어진단정확도를비교하기위해민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도, 정확도를계산하였고 ASCUS/LSIL군만따로케이스선택하여같은분석을반복시행하였다. 1

8 결과 연구에등록된환자는 189명이었으나 2개의검체에서자궁경부세포가관찰되지않아최종분석에서제외하였다. 전체환자 187명중비정상 cytology를보인환자는 140명 (74.9%), 정상 cytology를보인여성은 47명 (25.1%) 이었다. Cytology와 HPV test는각각 CIN1에서 78.9%, 86.8%, CIN2에서 90.6%, CIN3/CIS에서 93.6%, 97.9%, cancer에서 92.9% 의양성률을보였고 MKRN1과 p16 INK4a 는각각 CIN1에서 31.6%, 60.5%, CIN2에서 62.5%, 65.6%, CIN3/CIS에서 74.5%, 76.6%, invasive cancer에서 92.9%, 85.7% 로중증도에비례해서증가하는양상을보였다. MKRN1 의 CIN2+ 를진단하는데있어민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도, 정확도는각각 73.1%, 74.5%, 73.9%, 73.7%, 73.8% 였다. 그러나 cytology와 HPV test는민감도면에서는각각 92.5%, 94.6% 로 MKRN1보다높았으나특이도가 42.6%, 54.3% 로낮았다. p16 INK4a 의민감도, 특이도, 정확도는 74.2%, 53.2%, 63.6% 로 4가지검사방법중정확도가가장낮았다. 두가지검사를조합하여보았을때, cytology+hpv는 90.3% 의민감도를보였으나특이도가 66% 로가장낮았던반면 MKRN1+HPV 는민감도는 68.8% 였으나특이도가 87.2% 로가장높았고두조합의진단의정확도는같았다 (78.1%). ASCUS/LSIL의경우에는 HPV+MKRN1가민감도 60.0%, 특이도 81.3% 로가장정확도가높았다 (73.1%). 2

9 결론 MKRN1은 cytology, HPV test보다민감도는낮았으나특이도가높았다. 그리고두가지검사를조합하였을경우 HPV+MKRN1은 ASCUS/LSIL군에서 cytology+hpv보다진단의정확도가더높았고전체환자군에서는정확도가같았다. 따라서 MKRN1 면역염색은특이도가낮은 cytology 또는 HPV 검사의단점을보완하여자궁경부암진단의정확도를높이는데보조적인검사로유용하게이용될수있을것으로생각된다 핵심되는말 : MKRN1, 자궁경부액상세포검사, 인유두종바이 러스검사, 면역세포화학 3

10 자궁경부세포검사에서 Makorin Ring Finger Protein1 (MKRN1) 면역세포화학의유용성 < 지도교수김재훈 > 연세대학교대학원의학과 장민영 Ⅰ. 서론 자궁경부세포검사는자궁경부암의발병률을감소시키는데상당히기여하였지만재현성에대한제한때문에세포검사단독으로는자궁경부상피내암 (cervical intraepithelial neoplasia, CIN) 을진단하는데있어서정확도가감소하는단점이있다. 따라서자궁경부암은사실상인유두종바이러스 (Human papilloma virus, HPV) 감염에의해발생한다는점에근거하여자궁경부암선별검사의정확도를향상시키기위해새로운 molecular assay를발전시키기시작하였다. 1 특히최근의연구에서고등급의 CIN을발견하는데자궁경부세포검사보다 HPV DNA를검사하는것이민감도가더높았음을보여주었을뿐만아니라인유두종바이러스검사 (HPV test) 를기본으로한자궁경부암선별검사를시행하였을경우사라지지않는고등급의 CIN을 4

11 더조기에발견하여침윤성자궁경부암을예방하는데더효과적이었음을알아내었다. 2,3 그러나 HPV 감염은매우흔하고대부분이 1~2 년후에자연적으로소실되며 HPV DNA 검사는저절로소멸될일시적인감염을함께발견하기때문에고등급 CIN에대한특이도가낮다는단점이있다. 3 따라서많은연구자들은세포검사와 HPV 검사의높은민감도는유지하면서낮은특이도를보완함으로써 CIN을발견하는데더욱더효과적인검사방법을개발하기위해노력하고있다. 특히대부분은암화과정에서강하게표현되는 HPV와관련된유전자들에초점을맞추어표지자를개발하고있고이는세포증식과관련된 Ki-67이나세포주기를조절하는 p16 INK4a 이대표적이다. 이미여러연구들에서 p16 INK4a 과 Ki-67은 CIN을발견하는데유용한표지자임을발표하였으나 1,3-7 p16 INK4a 면역염색은내자궁경부세포, 화생세포, 위축된정상세포에서도면역반응성이발현될수있어판독을할때추가적으로세포형태학적인평가가요구되는제한점이있다. 8 Makorin Ring Finger Protein1 (MKRN1) 은 transcriptional co-regulator이자 E3 ligase로서종양억제유전자인 p53과 p21의 negative regulator로 MKRN1이감소되면 p53과 p21이활성화되어성장정지가유도된다는연구결과가있었다 년 nature communication에실린 Lee등의연구에따르면 MKRN1은세포사멸수용체에의해활성화되는외인성세포사멸에중추적역할을하는 fas-associated protein with death domain (FADD) 의유비퀴틴화를유도함으로써 FADD 단백질분해를촉진하여암세포사멸을방해한다고알려졌다. 또한 MKRN1과 FADD는 necrosome 형성과 necroptosis를조절하는데관여하고있어 MKRN1을 down 5

12 regulation 시켰을경우유방암의종양크기성장이심각하게방해되었음을확인하였고이연구과정에서자궁경부암조직에서역시 MKRN1의 mrna level이정상조직에비해의미있게증가되어있음을발견하였다. 10 따라서본연구는자궁경부액상세포검사 (cytology) 후남은검체를이용하여 MKRN1과 p16 INK4a 에대한면역염색을시행, cytology, HPV test, MKRN1 그리고 p16 INK4a 4가지검사방법의 CIN2 이상의 (CIN2+) 진단에대한민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도, 정확도를비교하여 MKRN1 면역염색이자궁경부암및전암병변진단을진단하는데보조적인검사방법으로유용하게이용될수있는지확인하기위하여시행하였다. 6

13 Ⅱ. 재료및방법 Study population 2013년 6월강남세브란스병원임상시험심사위원회의승인을받은후 2013년 7월부터 2014년 2월까지전향적으로검체수집을하였다. 연구대상은비정상 cervical cytology 소견을보여의뢰된환자또는자궁근종이나선근증과같이자궁경부이외의양성질환으로인해전자궁절제술을받기위해내원한환자, 그리고정기검진을위해강남세브란스병원에내원하여자궁경부세포검사를시행한 18세이상의여성을대상으로하였다. 모든여성을대상으로자궁경부액상세포검사및인유두종바이러스검사 (HPV test) 를시행하였고 cytology를시행하고남은검체를이용하여세포블록을제작한뒤 MKRN1과 p16 INK4a 에대한면역염색을시행하였다. 18세미만이거나전자궁절제술을시행한여성, 임신한여성, 다른암으로진단받은적이있는여성, 최근 5년간 CIN 또는침윤성자궁경부암 (invasive cancer) 에대한치료를받은기왕력이있는여성, 기타면역력이저하된만성질환여성, 연구에대한동의를하지않은여성은본연구대상에서제외하였다. 총 189명의환자가본연구에참여하였으며펀치생검이나전자궁절제술을통해얻은조직검사결과를바탕으로후향적으로각검사방법에대한 clinical performance를분석하였다. 7

14 Liquid-based cervical cytology 본연구에포함된모든여성을대상으로 cytobrush를이용하여자궁경부액상세포검사 (Thin prep 2000 system; Cytic Corporation, Boxborough, MA, USA) 를시행하였으며동일한기관에소속된두명의병리학전문의가 2001 Bethesda System에기초하여진단하였다. 1차의료기관에서시행한 cytology 결과와본기관에서시행한검사결과가다른경우더고등급의결과를분석에이용하였다. HPV testing 13가지종류의고위험군 HPV를검출하도록디자인되어있는 Hybrid Capture 2 assay (HC2) (Digene Corporation, Gaithersburg, MD, USA) 를시행하였으며결과는실험검체의 light emission과세개의 control 검체평균값인 1pg/mL HPV DNA 비로나타내었다 ( 예, 1 relative light unit [RLU] 은검체의 HPV DNA가 1 pg/ml임을의미함 ). HC2 방법은단독감염과다중감염을구분하지못하며 HPV type 16, 18만을분류해내지못하므로추가적으로 Cobas 4800 HPV test (Roche, Pleasanton, CA, USA) 를시행하였다. HPV type에대한결과는 negative, type 16 또는 18, 그리고 other type으로구분하였으며 HPV 양성여부는 HC2 결과양성이거나 16, 18 또는 other type의 HPV가 detection 되었을경우양성으로판단하였다. 8

15 Histology Cytology상이상소견을보였거나정상 cytology 결과를보이나 HPV 고위험군감염결과를보였을경우 colposcopy 전문가에의해펀치생검을시행하였다. CIN1 이하일경우는더이상의치료없이추적관찰을하였고모든 CIN 3 이상 (CIN3+) 의환자와대부분의 CIN2 환자의경우는환상투열요법 (loop electrosurgical excision procedure, LEEP) 또는전자궁절제술의치료를, 침윤성자궁경부암이진단된경우는근치적자궁절제술을시행하였다. 만약펀치생검과 LEEP 또는자궁절제술의진단결과가다른경우가장고등급의결과를분석에이용하였다. Cell block preparation MKRN1과 p16 INK4a 의면역염색을위하여 cytology를시행하고남은 Thin-prep sample을이용하여이전의여러논문에서소개된방법에따라세포블록을제작하였다. 11,12 간단히소개하면, 남은 PreservCyt solution을 1500 revolutions per minute (rpm) 으로 5분간원심분리한뒤상층액은버리고 pellet은 5-8방울의혈장과함께재부유시켰다. 그리고 2% 염화칼슘 (CaCl 2 ) 을첨가해잘혼합하여응고가될때까지약 20분간둔후 Clot은렌즈티슈로감싼뒤조직카세트에넣고 10% 중성완충포르말린 (neutral buffered formalin) 에서 10분간고정시켰다. 만들어진 Cell block은우선 400μm로 section한뒤 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을하여세포의형태와충실도를확인하였다. 9

MKRN1 immunocytochemistry 준비된세포블록을다시 400μm로 section하여 MKRN1 발현을확인하기위해 Rabit anti-mkrn1 antibody, affinity purified makorin-1 antibody (Bethyl Laboratories, Inc.

Fremont, CA, USA) kit를사용하여 biotin이부착된 2차항체를반응시킨다음 streptavidin biotin-horseradish peroxidase와반응시켰다. 부착된 horseradish peroxidase는 DAB (3.

16 MKRN1 immunocytochemistry 준비된세포블록을다시 400μm로 section하여 MKRN1 발현을확인하기위해 Rabit anti-mkrn1 antibody, affinity purified makorin-1 antibody (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA) 를이용하여 immunocytochemistry를시행하였으며발색은 streptavidin biotin-horseradish peroxidase법을이용한 UltraVision LP Detection System (Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA) kit를사용하여 biotin이부착된 2차항체를반응시킨다음 streptavidin biotin-horseradish peroxidase와반응시켰다. 부착된 horseradish peroxidase는 DAB (3.3-Diaminobenzidine) tetrahydrochloride를이용하여발색시키며 hematoxylin으로대조염색하였다. MKRN1 발현여부에대한평가는병리학전문의가시행하였으며핵이염색되었을경우양성으로판독하였다 (Fig. 1). (A) (B) Fig 1. (A) HSIL 환자에서의 MKRN1 면역염색양성소견과, (B) 자궁 경부액상세포검사음성환자에서의 MKRN1 음성소견. 10

17 p16 INK4a immunocytochemistry Section된 cell block에서 p16 INK4a 발현을확인하기위하여 p16-ink4a-specific monoclonal antibody (clone E6H4) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) 와 CINtec p16-ink4a Cytology kit (Dako Cytomation, now Dako A S, Glostrup, Denmark) 를이용하였다. 이어 secondary goat-anti-mouse antibody (Dako) 로 30분간 incubation 한뒤다시 10분간 DAB (3,3 -diaminobenzidine) tetrahydrochloride (Dako) 로 incubation 하고최종적으로 Mayer s hematoxylin으로대조염색을하였다. Statistical analysis SAS software package (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) version 9.2를이용하여 cytology, HPV test, MKRN1과 p16 INK4a 면역염색법각각의 CIN2+ 진단에대한민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도를계산하였고민감도와특이도를이용하여 Receiver Operating Characteristic (ROC) curve를통해각검사법의정확도를알아보았다. 그리고 4가지검사방법중두가지를조합하여역시같은분석을시행하였으며 cytology 결과상 ASCUS 또는 LSIL 결과를보인환자들을따로추출하여같은분석을반복하였다. 각결과는 95% 신뢰구간과함께나타내었다. 11

18 Ⅲ. 결과 Cytology and histologic results Table 1은 cytology 결과와 histology 결과를비교한것이다. 총 189명의환자가등록되었으나 2개의검체에서자궁경부세포가관찰되지않아분석에서제외되어최종적으로 187명의결과를분석에이용하였다. 정상 cytology를보인여성은 47명 (25.1%), 비정상 cytology 환자는 140명 (74.9%) 이었다. Cytology상음성이었던 47명의환자중조직검사상 8명 (17%) 은 CIN1, 3명 (6.4%) 은 CIN2, 3명 (6.4%) 은 CIN3/Cervical carcinoma in situ (CIS), 1명 (2.1%) 은 cancer였다. 비정상 cytology군 140명중에서 atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS) 또는 atypical glandular cells of undetermined significance (AGUS) 를보인환자는 22명으로그중 5명 (22.7%) 은조직검사상 negative 소견을보였고 5명 (22.7%) 은 CIN1, 4명 (18.2%) 은 CIN2, 6명 (27.3%) 은 CIN3/CIS, 2 명 (9.1%) 은 cancer로나타났다. Low-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL) 55명의환자는 17명 (30.9%) 이조직검사상정상소견을보였고 20명 (36.4%) 이 CIN1, 12명 (21.8%) 이 CIN2, 6명 (10.9%) 이 CIN3/CIS 진단을받았다. Atypical squamous cells, cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion (ASC-H)/High-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) 환자는 57명으로 5명 (8.8%) 이 CIN1, 13명 (22.8%) 이 CIN2, 31명 (54.4%) 이 CIN3/CIS, 6명 (10.5%) 이 invasive cancer의결과를보였다. Cytology상 6명은 cancer로보고되었고조직검사상에서는 1명 (16.7%) 은 CIN3/CIS로, 5명 (83.3%) 은모두 cancer로나왔다. 12

19 Table 1. Liquid-based cervical cytology 와 histologic result 비교 Cytology, HPV, MKRN1 and P16 INK4a in histologic categories 본연구에서자궁경부암선별검사로서의역할을알아보고자한 4가지의검사방법이조직검사결과범주로구분하여보았을때각각어떤결과를보였는지알아보았으며 Table 2에나타내었다. Cytology상 reactive cellular change 또는 chronic non-specific inflammation 소견을보인경우는음성으로간주하였고 ASCUS이상의소견을보인경우만양성결과로생각하였다. 조직검사상에서는병변이관찰되지않은환자는 56명 (29.9%) 이었고이중 24명 (42.9%) 의환자에서 cytology 양성을보였으며 21명 (37.5%) 의환자에서는 p16 INK4a 면역염색결과양성이었다. HPV test와 MKRN1 면역염색양성을보인여성은각각 10명 (17.9%), 12명 (21.4%) 이었다. CIN1 환자는 38명 (20.3%) 으로 cytology, HPV test, p16 INK4a 각각 30명 (78.9%), 33명 (86.8%), 23명 (60.5%) 의양성률을보였고 MKRN1은 12명 (31.6%) 에서양성소견을보였다. 13

20 32명 (17.1%) 은 CIN2 진단을받았는데 cytology와 HPV test의양성률은 29명 (90.6%) 으로같았고 MKRN1과 p16 INK4a 은 20명 (62.5%), 21명 (65.6%) 으로비슷한결과를보였다. CIN3/CIS 환자군 47명 (25.1%) 에서는 cytology와 HPV test는각각 44명 (93.6%), 46 명 (97.9%), MKRN1과 p16 INK4a 은각각 35명 (74.5%), 36명 (76.6%) 의양성소견을보였다. Invasive cancer 환자 14명 (7.5%) 에서는 cytology, HPV test, MKRN1이 13명 (92.9%) 으로같은결과를보였고 p16 INK4a 은 12명 (85.7%) 의양성률을보였다. Table 2. Histologic category 에따른 cytology, HPV test, MKRN1, p16 INK4a 의양성률비교. 14

21 Clinical performance of cytology, HPV testing, MKRN1 and p16 INK4a immunostaining to detect CIN2+ 본연구의궁극적인목적인자궁경부전암병변을진단하는데있어앞서소개한선별검사 4가지방법에대한임상적인진단의정확성을알아보기위해민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도및정확도를계산하였으며검사방법을두가지씩조합해서도알아보았다 (Table 3). 조직검사결과 CIN2를기준으로질병양성으로간주하였고 cytology 결과가 ASCUS 또는 LSIL이었던환자만을따로추출하여같은분석을반복시행하였다 (Table 4). 먼저단독검사의경우 HPV test가 94.6% 로가장민감도가높았으나 54.3% 의낮은특이도를보였다. 현재 primary screening 방법으로이용되고있는 liquid-based cytology의경우민감도는 92.5% 로 HPV test와비슷하였으나특이도가 42.6% 로 4가지검사법중가장낮았다. MKRN1 면역염색은 73.1% 의민감도와 74.5% 의특이도를보여민감도는 cytology와 HPV test에비해낮았으나가장높은특이도를보이는검사법으로나타났다. p16 INK4a 은 MKRN1과비슷한 74.2% 의민감도를보였으나특이도가 53.2% 로낮았다. 두가지검사법을조합하였을경우 cytology와 HPV test의조합 (cytology+hpv) 의경우 90.3% 의가장높은민감도를보였으나특이도는 66.0% 로모든조합의경우중가장낮은결과를보였다. Cytology+HPV를제외한나머지검사방법에서는 HPV와 MKRN1을시행하였을경우 (HPV+MKRN1) 특이도가 87.2% 로가장높았다. Cytology와 MKRN1 (cytology+mkrn1), HPV와 p16 INK4a 조합의경우 (HPV+p16 INK4a ) 민감도, 특이도가각각 71.0%, 77.7% 로같은결과 15

22 를보였다. Cytology와 p16 INK4a (cytology+p16 INK4a) 의경우는특이도가 69.1% 로 cytology+hpv 다음으로가장낮았고 MKRN1과 p16 INK4a 을시행하였을경우 (MKRN1+p16 INK4a ) 는특이도가 80.9% 로 HPV+MKRN1 다음으로높았으나민감도가 62.4% 로모든검사방법중가장낮았다. 정확도는단독검사로서는 74.3% 의 HPV test와 73.8% 의 MKRN1이가장높게나왔고두가지검사를시행하였을경우는 cytology+hpv와 HPV+MKRN1이 78.1% 로같은결과를보였다. ASCUS 또는 LSIL 환자군에서도역시단독검사법으로는 cytology와 HPV test가 100% 로높은민감도를보여주었으나특이도가낮았고 MKRN1과 p16 INK4a 은각각 60.0%, 63.3% 의비슷한민감도를보였으나 MKRN1의경우특이도가 62.5% 로가장높았다. 검사를조합하였을경우에는 cytology+hpv의경우 100% 민감도인반면특이도가 41.7% 로가장낮은결과를보였고이에반하여 HPV+MKRN1의경우는 81.3% 로특이도가높았다. 단독검사법의정확도는 HPV test가 64.1%, MKRN1이 61.5% 로전체환자군과같이가장높게나왔고 cytology는 39.7% 로가장정확도가낮았다. 두가지검사를시행하였을경우는 HPV+MKRN1이 73.1% 로가장높은정확도를보였고 cytology+hpv의정확도는 64.1% 였다. 16

23 Table 3. 전체환자군에서 CIN2+ 에대한 cytology, HPV test, MKRN1 과 p16 INK4a 면역염색법의진단정확도비교. 17

24 Table 4. ASCUS/LSIL 군에서 CIN2+ 에대한 cytology, HPV test, MKRN1 과 p16 INK4a 면역염색법의진단정확도비교. 18

25 고찰 Cytology 와 HPV 검사의낮은특이도를보완하기위해새로운표 지자로써그동안 p16 INK4a 에대한연구가활발히진행되었다. p16 INK4a 은진단의특이도를높이는데유용하며 6,15,16 조직검사결과와 correlation 이잘되고 17 기존에시행되던 cervical cytology 와 HPV test 를조합하였을때보다 HPV test 에대한보조검사로 p16 INK4a 면 역염색을시행하여과다발현여부를보는것이더진단의정확도가 높았음을대규모무작위연구에서발표하였다. 3,8 이와같이 cytology 나 HPV test 에대한보조검사로서유용한표지자를찾는연구가진 행되던중 Lee 등의연구에서 MKRN1 의과발현과자궁경부암의상관 관계가 in vivo 에서확인되어 10 본기관에서선행연구를시행한결과 자궁경부조직에서의 MKRN1 발현정도와종양의 stage나 grade가비례한다는것을알수있었고또한 MKRN1의발현은 pakt 발현과는양의상관관계를, PTEN의발현과는음의상관관계를보인다는것을확인하였다 (data not shown). 따라서본연구를시행한결과민감도와특이도를모두고려하였을때 HPV와 MKRN1은약 74% 의비슷한정확도를보여주었으나 cytology는 67.4% 로두검사법보다정확도가낮았다. 두가지검사를하였을경우 cytology+hpv, HPV+MKRN1이 78.1% 로같은정확도를보였으나차이점은 cytology+hpv의경우는두검사방법모두특이도가낮은공통적인단점을가진검사법으로써오히려 cytology 또는 HPV 단독으로시행하였을경우 92.5%, 94.6% 의더높은민감도를얻을수있었고 HPV+MKRN1의경우는 HPV test의높은민감도에낮은특이도를 MKRN1이보완하여 54.3% 에서 87.2% 19

26 로특이도를높여주어정확도가가장높았다는점은두가지검사를시행하는데충분한이득이있으며추가검사를시행하는데대한합리적인근거를제시하여주었다. Cervical cancer screening을시행하였을때가장치료에어려움을겪는경우가 ASCUS와 LSIL group이다. 이전연구에서이와같은범 주에드는환자들은병변이소실될가능성이높은집단이므로 17 경과 관찰만을할경우불필요한 procedure를피할수있다고발표하였다. 본연구결과에서도볼수있듯이 cytology상 ASCUS 또는 LSIL 였던환자 77명이실제조직검사상 CIN1+ 는 55명 (71.4%), CIN2+ 는 30명 (39.0%) 를진단받았다는점은간과할수없는부분이다. 따라서자궁경부병변을가지고있을가능성이높으며향후 invasive cancer로진행할확률이높아적극적인 procedure를시행할군과경과관찰을할군을구별해내는것이중요한과제이며 cytology상 ASCUS 또는 LSIL을보인환자만을선택하여선별검사들의 clinical performance를다시알아보았다. 결과는전체환자를대상으로하였을때와같은경향을보였고특히 cytology+hpv와비교하여 HPV+MKRN1의특이도는약 2배높았으며 (41.7% Vs. 81.3%) 정확도는 HPV+MKRN1이 76.5% 로가장높았다. HPV 감염에대한역학조사를보면성생활이활발한 35세미만에서감염률이더높게나타나지만이들대부분은자연소실되는경과 를보인다는것을알수있다. 18,19 이들젊은연령군에서는향후출산 을계획하는여성이많으므로자궁경부시술로인한조산이나자궁경부근무력증과 (IIOC) 같은산과적 morbidity 증가의가능성이그들에게는매우중요한문제가될수있고 cytology상 ASCUS나 LSIL 또는 HPV에감염이되었다는검사결과가미혼의여성에게 psychological stress 요인이될수있어 reassurance 후경과관찰을 20

27 할지적극적인검사와치료를통해 invasive cancer로의진행을막아야할지주치의의결정이중요하다. 이와같은이유로본연구결과에서보인 ASCUS/LSIL군에서의 HPV+MKRN1의탁월한특이도는굉장히의미있으며주목할만하다. 또한 2006년에는 Gardasil (Sanofi Pasteur MSD) 이, 2009년에는 Cervarix (GlaxoSmithKline) 가 FDA 승인된이후미국에서자궁경부암예방을위한접종을시작한이후약 8년이지난지금백신접종률이높아져 HPV type 16, 18 감염에대한예방효과의결과로 invasive cancer 또는머지않아 invasive cancer로이행될고등급의 CIN 환자들의비율이줄어들것으로예상되어 cytology의경우더더욱양성예측도가떨어질것으로생각된다. 따라서 primary cervical cancer screening의 policy가점차 cytology에서 HPV DNA test로 shift 되고있으나이는앞에서기술한바와같이낮은특이도로인한제한점이있어본연구결과에서밝힌보조적인검사로서 MKRN1의역할이필요할것으로생각된다. Cytology는주관적인검사방법이므로시술자의기술이나경력에따라 unsatisfactory의결과를얻는비율이높아지기도하고병리과의사가판독할시많은정상세포들사이에존재하는비정형세포를유심히찾아보아야진단을할수있으므로주의를기울이지않는다면관찰한슬라이드의위치에서비정상세포를놓칠가능성이있다. 또한 ASCUS부터 HSIL까지의 cytologic category의진단에대한 intra-observer 또는 inter-observer간의 discrepancy가있을수있어 Fahey등이 pap test의 accuracy를알아보기위해 62개논문에대한 systemic review를시행해본결과민감도가 11-99%, 특이도가 14-97% 로확인되어 variation이큼을알수있었다. 20 이에비해 HPV test는자동화된방법으로시행하는객관적인검사방법이므로 21

28 높은민감도이외에도결과에대한논쟁의여지가적기때문에 medico-legal claim을줄일수있다는장점도있다. 본연구는 invasive cervical cancer/cin 진단의표지자로서 MKRN1의기능과이점에대해서처음으로발표한연구이다. 또한연구가계획된이후전향적으로검체수집을하여치료 guideline에따라 management를한뒤조직검사결과를바탕으로후향적으로데이터를분석하였으므로 selection bias에대해자유로울수있었다. 본연구에서 cytology와 HPV의낮은특이도를보완해줄수있는효율적인검사방법으로선택된 MKRN1 면역염색법은 liquid-based cytology 또는 cobas HPV test 후남은검체를이용하여시행하는것이므로환자에게부인과검사에대한추가적인번거로움과불편감, 두려움을주지않는다는장점이있으며특히불필요한 colposcopically directed biopsy 및 refer rate를줄일수있어의료비용의절감을기대할수있고 screening interval을안전하게연장시켜줄수있을것으로생각된다. 향후연구에서는 age category에따른 study population의세분화를통해각검사별 clinical performance를분석하여 HPV+MKRN1 이특히어느연령대의여성에게더유익한지알아보고선별검사시 MKRN1 양성이었던군과음성이었던군을구분하여추적검사를실시하였을경우고등급 CIN으로의이행률에대한차이를보이는지추가분석이이루어져야할것으로생각된다. 22

29 Ⅴ. 결론 결론적으로현재까지알려진자궁경부암선별검사들과 MKRN1 면역염색의진단정확도를비교해본결과 cytology+hpv와 HPV+MKRN1의정확도는같았으나 HPV+MKRN1의경우 HPV 검사의높은민감도와 MKRN1의높은특이도를이용하여서로의단점을보완할수있는이상적인조합임을알수있었고 ASCUS/LSIL군에서도 HPV+MKRN1이 CIN2+ 진단에대한정확도가가장높았다. 따라서 cytology 또는 HPV test 시행후남은검체를이용하여시행하는 MKRN1 면역염색은 cervical cancer screening에서유용한보조적인검사법으로이용될수있을것으로기대된다. 23

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32 19. Ronco G, Segnan N, Giorgi-Rossi P, Zappa M, Casadei GP, Carozzi F, et al. Human papillomavirus testing and liquid-based cytology: results at recruitment from the new technologies for cervical cancer randomized controlled trial. J Natl Cancer Inst 2006;98: Fahey MT, Irwig L, Macaskill P. Meta-analysis of Pap test accuracy. Am J Epidemiol 1995;141:

33 ABSTRACT Usefulness of Makorin Ring Finger Protein1 (MKRN1) immunocytochemistry in liquid-based cervical cytology Min Young Chang Department of Medicine The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Jae-hoon Kim) Objectives The aim of the study was to investigate the clinical performance of detecting high grade cervical lesions (CIN2+) with MKRN1 immunostaining and its use as an adjunctive test to liquid based cervical cytology. Materials and methods This study was approved by the institutional review board of Gangnam Severance Hospital in June We conducted 27

34 PROspective specimen collection and retrospective Blinded Evaluation (PROBE) study. Liquid-based cervical cytology, HPV hybrid capture and real time Polymerase chain reaction (PCR) were performed and cell block was prepared from residual cervical cytology specimen for immunocytochemistry of MKRN1 and P16 INK4a. Clinical performances [sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), accuracy] of detecting CIN2+ were calculated for all women and subgroup analysis was performed for patients with ASCUS or LSIL. Results Specimens were collected from 189 women, however, 2 cases were not available due to scant cellularity. Women who showed abnormal cytology were 140 and normal cytology were 47 out of 187 patients. Cytology and HPV showed a positive rate of 78.9%, 86.8% in CIN1, 90.6% in CIN2, 93.6%, 97.9% in CIN3/CIS, 92.9% in cancer respectively. MKRN1 and p16 INK4a positivity also increased with histologic severity, from 31.6%, 60.5% in CIN1, 62.5%, 65.6% in CIN2, 74.5%, 76.6% in CIN3/CSI to 92.9%, 85.7% in invasive cancer. The sensitivity, specificity, PPV, NPV and accuracy of MKRN1 to detect CIN2+ was 73.1%, 74.5%, 73.9%, 73.7% and 73.8%, respectively. Liquid-based cytology and HPV test showed higher sensitivity (92.5%, 94.6%, respectively) than MKRN1, however, the specificity was low by 42.6% and 54.3%, respectively. p16 INK4a 28

35 showed the lowest accuracy by 63.6%. (sensitivity: 74.2%, specificity: 53.2%, respectively) Combining two screening tests, cytology+hpv showed sensitivity of 90.3% but the lowest specificity by 66%, meanwhile the sensitivity of MKRN1+HPV was 68.8% but it showed the highest specificity by 87.2% and the accuracy of these two combinations was the same (78.1%). For ASCUS/LSIL, HPV+MKRN1 showed the highest accuracy (73.1%) by showing 60.0% of sensitivity and 81.3% of specificity. Conclusion MKRN1 immunostaining showed lower sensitivity but higher specificity than cytology and HPV test. In addition, combining two screening tests, HPV+MKRN1 showed the highest accuracy in ASCUS/LSIL group. Therefore it is considered that MKRN1 can be useful in increasing the accuracy of diagnosis of cervical cancer Key Words : MKRN1, liquid-based cervical cytology, human papillomavirus test, immunocytochemistry 29

김범수

김범수 Analysis of Outcomes after Resection of Sarcomatous Hepatocellular Carcinoma Purpose: Sarcomatous hepatocellular carcinoma (HCC) is rare. Therefore, the clinicopathologic characteristics and prognosis