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기복 만
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1 대한임상검사학회지 : 36 권제 2 호, , 2004 인유두종바이러스의감염또는감염되지않은자궁경부이형성증에서 p53 및 Ki-67의발현 건국대학교농축대학원생물공학과 1, 서울보건대학임상병리과 2, 분당제생병원진단검사의학과 3 최숙경 1 김태전 2 홍승복 3 이훈택 1 Expression of p53 and Ki-67 in Cervical Dysplasia with Human Papilloma Virus Infection or Non-infection Choi, Sook-Kyung 1., Kim, Tai Jeon 2., Hong, Seung Bok 3., Lee, Hun Taeck 1 Department of Biotechnology, Graduate School of Agriculture and Animal Science, Konkuk University, Seoul, Korea 1 Department of Clinical Laboratory Science, Seoul Health College, Sungnam, Korea 2, Department of Laboratory Medicine, Bundang Jesang General Hospital, Sungnam, Korea 3 This research focuses on the overall evaluation of tumor protein (p53) and cell growth marker (Ki-67) in their functions as carcinogenic factors in both a HPV-infected group and in a HPV-noninfected group with the precancerous dysplasia of uterine cervix. Histological grades were determined by the H&E staining and the expression level of p53 and Ki-67 were tested by the immunohistochemistry method. The results were as follows. Among the total of 66 cases, p53 (+) was observed in 19 cases (29.0%) from the mild grade group, 22 cases (33.0%) from the moderate grade group, and 19 cases (29.0%) from the severe grade group. The values correlate with the increase of dysplasia intensity in HPV-noninfected group and showed significant correlation (p<0.05), but there were no significant difference from the HPV-infected group. Among a total of 66 cases, the mitotic index of Ki-67 (+) were observed in 19 cases (29.0%) from the mild grade group, 22 cases (33.0%) from the moderate grade group, and 19 cases (29.0%) from the severe grade group. The values were significantly different against dysplasia intensity (p<0.05), but showed no significant difference from HPV infection. After cross comparing the statistical parameters of p53 and ki-67 in their significance, p53 was shown to be statistically significant with Ki-67 while there was no statistically significant difference with Ki-67 (p<0.05). Taken together, tumor protein (p53) and an index of Ki-67 observed in cervical dysplasia and in HPV related dysplasia of cervix uterine did not have any notable significance with HPV infection. The incidence rate of p53, however, had some significant correlation with dysplasia while Ki-67 had no particular statistical significance. As a result, p53 and Ki-67 can be considered as effective diagnostic markers in predicting the disease progression of dysplasia to cervical cancer. 1) Key Words : Cervical dysplasia, HPV, p53, Ki-67 교신저자 : 김태전, ( 우 ) , 경기도성남시수정구양지동 212 서울보건대학임상병리과 Tel : taijeon@shjc.ac.kr 178

2 I. 서론 자궁경부암은세계적으로유방암, 난소암다음으로빈번한여성의악성종양이며, 한국의경우에도자궁경부암은한국여성암중유방, 위, 대장, 갑상선암다음으로발생빈도가높아국민보건상중대한문제가되고있다 ( 보건복지부, 2002). 자궁경부암의진행과정을보면악성변화의첫단계로이형성증 (dysplasia) 이발생하는데, 이과정이지속되면상피내암 (carcinoma in situ, CIS) 이되고이상피내암이다시침윤암 (invasive carcinoma) 으로발전하게된다. 그과정은매우완만하여침윤암으로발전하기까지약 10년이상이걸린다. 이형성증으로진단된후치료를받지않을경우일부는침윤암으로진행하여사망에까지이를수있는데, 어떤인자가상피내병변을침윤암으로진행시키는지에대해서는정확히알려진바가없는실정이다 (Jonathan 등, 1996). 지금까지자궁경부암의발생원인에대한역학적연구에의하면조기성경험, 성생활배우자의수, 흡연, 호르몬제의복용및바이러스감염등여러복합적인환경요인에의하여발생하는것으로알려져있다 (Brinton 등, 1987). 그리고면역기능의저하나암유전자와종양억제유전자등이암의발생에관련이있을것으로추정하고있다. 이중에서도인유두종바이러스 (human papilloma virus, HPV) 의감염이중심적인역할을하는것으로알려져있고, 아울러암유전자의활성화및종양억제유전자의불활성화가암발생에미치는영향에대해서도 HPV와함께지속적으로연구되었다 (Drust 등, 1987). p53 유전자는인간의제 17번염색체의단완 (17q13) 에위치하며 53 kd의분자량으로서핵소체단백질을암호화하여세포주기중 G0기에서 G1기로의이행에관여하며 (Benchimol 등, 1985), DNA 수선, 세포자연사 (apopotosis) 에관여하여세포의증식과변형을억제하는것으로알려져있다 (Finlay 등, 1988). p53 종양억제유전자의돌연변이는점돌연변이에의해일어나며, 변이형 p53단백질은정상단백질의기능을상실하고세포의형질전환및증식을유도하는암유전자로작용하여 (Hinds 등, 1989) 악성종양을일으키고, 그생성물은구조적으로안정되어있으며세포에축적되어 p53 항체를이용한면역조직화학적검사로검출할수있다 (Banks 등, 1986). Ki-67은 G0기를제외한모든세포주기를거치는모든세포의핵에서발현되는단백질로, 이단백질이발현되는세포분획은세포의증식상태를직접적으로나타내기때 문에면역조직화학염색으로관찰한 Ki-67의표지지수는자궁경부암의예후와관련된인자로알려졌다 (Beronese 등, 1991). 따라서본연구는자궁경부생검을통하여이형성증으로진단받은조직을 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을실시하여이형성증의조직학적등급을평가한후, HPV 감염이이형성증의각등급에미치는영향을규명하기위하여종양단백질인 p53과세포증식표지자인 Ki-67을면역조직화학염색을실시하여발현양상을조사하였다. II. 재료및방법 1. 재료본실험은 2002년 1월부터 2004년 1월까지분당제생병원병리과에서자궁경부생검을통하여이형성증으로진단받은조직을사용하였다. 특히환자의병력기록지와슬라이드표본을검사하여생검전약물요법등의보조적치료를받지않은환자의생검조직중비교적고정이잘된파라핀블록을선택하여 HPV 감염군 33예와 HPV 비감염군 33예를대상으로실험하였다. 2. 방법 1) 병리학적검사일반적인조직표본제작방법을통해만들어진파라핀블록을박절기를이용하여 4μm 두께로박절하였다. 그리고 xylene에서탈파라핀과 alcohol에서함수과정을거친후 H&E 염색을실시하였다. Hematoxylin으로핵을염색하였고 eosin으로세포질을염색한후 alcohol에서탈수과정과 xylene에서투명과정을거친후 canada balsam으로봉입하였다. 2) 면역조직화학염색일반적인조직표본제작방법을통해만들어진파라핀블록을박절기를이용하여 4μm 두께로박절한후항원복구를위한과정에서조직표본의탈락을방지하기위해 3-aminopropyl triethoxysilane으로처리된코팅슬라이드에절편을부착시켰다. 표본슬라이드를탈파라핀과함수과정을거친후 p53, Ki-67은항원복구를위해 ph mM 구연산완충액에담가고압증기멸균기에서

10분간처리하였고, HPV는 ph 6.0 10 mm 구연산완충액에담가 microwave oven에서 10분간처리하였다.

conjugate법으로면역조직화학염색을실시하였다. 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride를사용하여발색시킨후 Harris hematoxylin으로대조염색을실시하였고 canada balsam으로봉입하였다.

로분류하였다. 각등급의이형성증조직에서세포질의공동을확인하여 HPV 감염군과 HPV 비감염군으로구분하였고면역조직화학염색으로재확인하였다. p53과 Ki-67은광학현미경으로관찰하여핵이갈색의과립상으로염색되면양성으로판정하였다.

통계분석은 SPSS Windows version 8.0 프로그램을사용하였고, 통계적유의성은 p값이 0.05 미만인경우로하였다. III. 결과 1.

으로진행될수록핵의이형성정도와핵 / 세포질의비율은증가되었고, 염색질의상태는더욱응집되었으며, 면역조직화학염색은모두음성을나타냈다 (Fig. 1A, B).

1C, D). 2. 자궁경부이형성증 (HPV 감염군및 HPV 비감염군 ) 의면역조직화학적검사 1) p53 단백질의발현자궁경부이형성증 (HPV 감염군및 HPV 비감염군 ) 에서 p53 단백질의발현을면역조직화학염색으로검사하였다.

3 10분간처리하였고, HPV는 ph mm 구연산완충액에담가 microwave oven에서 10분간처리하였다. 10% H 2 O 2 -methanol을 10분간처리하여내인성인자의활성을억제한다음, 일차항체인 p53, Ki-67 및 HPV을사용하여 30분간실온에서반응시킨후, LSAB kit를사용하여 avidin biotin conjugate법으로면역조직화학염색을실시하였다. 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride를사용하여발색시킨후 Harris hematoxylin으로대조염색을실시하였고 canada balsam으로봉입하였다. 3) H&E 염색과면역조직화학염색의평가및통계분석 H&E염색표본은 Papanicolaou의분류법에의해핵의이형성, 핵 / 세포질의비율및염색질의상태를광학현미경으로관찰하여이형성증의등급을경도 (mild), 중등도 (moderate) 및고도 (severe) 로분류하였다. 각등급의이형성증조직에서세포질의공동을확인하여 HPV 감염군과 HPV 비감염군으로구분하였고면역조직화학염색으로재확인하였다. p53과 Ki-67은광학현미경으로관찰하여핵이갈색의과립상으로염색되면양성으로판정하였다. 평가는통계분석을위해다섯군으로분류하였다. 각군은반정량적인방법을사용하여전체암조직중양성으로염색된암조직을백분율로나누어 0~5% 인경우 0, 6~30% 인경우 1, 31~50% 인경우 2, 51~75% 인경우 3 그리고 76% 이상인경우는 4로구분하였다. 통계분석은 SPSS Windows version 8.0 프로그램을사용하였고, 통계적유의성은 p값이 0.05 미만인경우로하였다. III. 결과 1. 자궁경부이형성증 (HPV 감염군및 HPV 비감염군 ) 의조직학적검사 H&E 염색표본슬라이드를현미경으로관찰한결과 HPV 비감염군은경도이형성증 (mild dysplasia) 에서고도이형성증 (severe dysplasia) 으로진행될수록핵의이형성정도와핵 / 세포질의비율은증가되었고, 염색질의상태는더욱응집되었으며, 면역조직화학염색은모두음성을나타냈다 (Fig. 1A, B). HPV 감염군은비감염군보다핵의얼룩짐 (smudge) 과다핵형성 (multinucleation) 이증가되었고, 세포질에공동세포 (koilocyte) 와착각화증 (parakeratosis) 이증가되었으며, 면역조직화학염색에서모두양성을나타냈다 (Fig. 1C, D). 2. 자궁경부이형성증 (HPV 감염군및 HPV 비감염군 ) 의면역조직화학적검사 1) p53 단백질의발현자궁경부이형성증 (HPV 감염군및 HPV 비감염군 ) 에서 p53 단백질의발현을면역조직화학염색으로검사하였다. 염색된표본슬라이드를광학현미경으로관찰한결과, p53은정상및간질조직에는염색되지않았으나, 이형성증조직에서는세포의핵에염색되었으며이형성증의정도가진행될수록염색된핵의수가증가되었다 A B C D E F Fig. 1. Hematoxylin & Eosin stainings for grading cervical dysplasia(a, B, C) and HPV-infected dysplasia(d, E, F) (x 100). A; mild dysplasia B; moderate dysplasia C; severe dysplasia, D; mild dysplasia with HPV, E; Moderate dysplasia with HPV and F; severe dysplasia with HPV. 180

A; mild dysplasia, B; moderate dysplasia, C; severe dysplasia, D; mild dysplasia with HPV, E; moderate dysplasia with HPV and

HPV 감염군에서는 0의경우는 3예, 1의경우는 5예, 2의경우는 11예, 3의경우는 8예그리고 4의경우 5예로나타났다.

05), HPV 감염과유의성은인정되지않았다. 2) 유사분열지수인 Ki-67의발현유사분열지수인 Ki-67의발현은모든이형성증에서 Table 2.

0.219 Positive 33(100.0) 0(0.0) Negative 32( 3.0) 1(3.0) Dysplasia grade 0.001 Mild 22(33.0) 0(0.0) Moderate 21(32.0) 1(2.

Correlation between p53 expression and pathologic parameters in cervical dysplasia p53 Positive(%) Negative(%) p-value HPV 0.

4 A B C D E F Fig. 2. Immunohistochemical stainings for p53 expression in cervical dysplasia(a, B, C) and HPV-infected dysplasia (D, E, F) (x 100). A; mild dysplasia, B; moderate dysplasia, C; severe dysplasia, D; mild dysplasia with HPV, E; moderate dysplasia with HPV and F; severe dysplasia with HPV. (Figs. 2A, B, C, D, E, F). 통계적유의성을검사하기위해전체이형성증세포의핵과염색된핵의수를백분률로계산하여다음과같은결과를얻었다 (Table 1). HPV 감염군에서는 0의경우는 3예, 1의경우는 5예, 2의경우는 11예, 3의경우는 8예그리고 4의경우 5예로나타났다. HPV 비감염군에서는 0의경우는 3예, 1의경우는 2 예, 2의경우는 15예, 3의경우는 6예그리고 4의경우 7 예로나타났다. p53의발현률은이형성증의정도가증가할수록높게나타났고유의한상관관계를나타냈으나 (p <0.05), HPV 감염과유의성은인정되지않았다. 2) 유사분열지수인 Ki-67의발현유사분열지수인 Ki-67의발현은모든이형성증에서 Table 2. Correlation between Ki-67 expression and pathologic parameter in cervical dysplasia Ki-67 Positive(%) Negative(%) p-value HPV Positive 33(100.0) 0(0.0) Negative 32( 3.0) 1(3.0) Dysplasia grade Mild 22(33.0) 0(0.0) Moderate 21(32.0) 1(2.0) Severe 22(33.0) 0(0.0) Table 1. Correlation between p53 expression and pathologic parameters in cervical dysplasia p53 Positive(%) Negative(%) p-value HPV Positive 30(91.0) 3(9.0) Negative 30(91.0) 3(9.0) Dysplasia grade Mild 19(29.0) 3(4.5) Moderate 22(33.0) 0(0.0) Severe 19(29.0) 3(4.5) 분열시기에있는세포의핵에염색되었고이형성증의정도가진행될수록염색된핵의수가증가되었다 (Fig. 3A, B, C, D, E, F). Ki-67의발현율은 Table 2와같이 HPV 감염군에서 0의경우는 1예, 1의경우는 7예, 2의경우는 9예, 3의경우는 13예그리고 4의경우는 3예가나타났다. 그리고 HPV 비감염군은 0의경우 0예, 1의경우 4예, 2의경우 12예, 3의경우 10예그리고 4의경우는 7예가나타났다. 이러한결과 Ki-67의발현율은이형성증의정도와는유의한차이를보였으나 (p<0.05), HPV 감염과는유의성이없었다 (Table 2). 181

(D, E, F) (x 100), A; mild dysplasia, B; moderate dysplasia, C; severe dysplasia, D; mild dysplasia with HPV,

Correlations between expression of p53 and Ki-67 in cervical dysplasia p53 Ki-67 Positive(%) Negative(%)

001 Ki-67 Positive 63 3 51 15 Negative 0 0 0 0 p-value 0.001 0.

(p<0.05)(table 3). IV. 고 찰 자궁경부암은인유두종바이러스 (HPV) 등이그원인 으로알려져있지만아직적절한예방법에대해서는알려지지않고있다.

5 A B C D E F Fig. 3. Immunohistochemical stainings for Ki-67 expression in cervical dysplasia(a, B, C) and HPV-infected dysplasia (D, E, F) (x 100), A; mild dysplasia, B; moderate dysplasia, C; severe dysplasia, D; mild dysplasia with HPV, E; moderate dysplasia with HPV and F; severe dysplasia with HPV. Table 3. Correlations between expression of p53 and Ki-67 in cervical dysplasia p53 Ki-67 Positive(%) Negative(%) Positive(%) Negative(%) p53 Positive Negative p-value Ki-67 Positive Negative p-value ) 종양단백질 (p53) 과 Ki-67 간의상관관계 경도이형성증에서고도이형성증으로진행될수록 p53 과 Ki-67 의발현률도증가되었고, 통계적유의성은 p53 은 Ki-67 과유의성이있었다 (p<0.05)(table 3). IV. 고 찰 자궁경부암은인유두종바이러스 (HPV) 등이그원인 으로알려져있지만아직적절한예방법에대해서는알려지지않고있다. 특히, 종양의악성도는그종양의특성을결정하므로진단및치료나예후등이동일종양에서도다르게나타나므로최근에는성장인자와그수용체들이나변형된암유전자, 암유전자단백질산물, 혹은암억유전자단백질산물을밝히려는노력이진행되고있다 (Ozanne 등, 1986). 이에최근많은종류의암에서연구되어지는종양유전자에의해발현되는단백질이자궁경부암에서도발현되어지며, 특히 p53과 Ki-67 종양단백질들은세포의성장과증식에관여하므로자궁경부암에서이러한단백질의발현은종양의성장과예후에중요한역할을한다. 본연구는 HPV와관련된자궁경부의이형성증에서종양단백질인 p53과세포증식표지자인 Ki-67을면역조직화학염색을실시하여이형성증정도에따른발현률과 HPV 감염이각인자에미치는영향을연구하였다. 본연구에서 p53은이형성증의정도가증가할수록높게나타났고유의한상관성을나타냈으나, HPV 감염과는유의한차이가없었다 (Table 1). 이러한결과는 Busby-Earle 등 (1994) 이돌연변이와 HPV 감염상태가항상일치하는것은아니라는보고와는차이가없었다. 그리고 Wrede 등 (1991) 은자궁경부암세포주중 HPV 16/18형에감염이안된세포주에만 p53의과발현이있었으며, p53 유전자의점돌연변이가발견된다고하여, 고위 182

6 험 HPV 26/18형과 p53 유전자변이와의역상관관계를시사하는보고와차이가있었다. 또한 Crook 등 (1991) 은세포주를이용한실험에서와마찬가지로임상적으로도 p53과 HPV 사이에역상관관계가있음을보고하였다. 최근자궁경부암에서 p53 단백은발생기전에중요한역할을한다고생각되지만, 이것의과발현은예후인자로서는크게관여하지않는것으로받아들여지고있다 (Hunt 등, 1996). 따라서 p53은 HPV 양성인자궁경부이형성증에서발현이증가되므로 p53 단백소실이발암과정에관여하는것으로추정되나, 임상적예후인자와의상관관계는관찰되지않아예후인자로서는의미가적으며오히려종양의크기나, 림프절침범유무등의고전적인예후인자가더욱중요하다고본다. 본연구에서유사분열지수인 Ki-67의발현은모든이형성증에서분열시기에있는세포의핵에염색되었고이형성증의정도가진행될수록염색된핵의수가증가되어, Ki-67의발현율은이형성증의정도와는유의한차이를보였으나, HPV 감염과는유의성이없었다 (Table 4). 이러한결과는이형성증의등급이높을수록분열세포가증가한다는 Konishi 등 (1991) 의결과와일치하였다. 따라서자궁경부이형성증조직에서 Ki-67 양성인분열기세포의분획을조사하는것은병의진행과정을예측하는데뿐만아니라진단에도많은도움이될것으로사료된다. 종합적으로볼때, 본연구결과에서자궁경부암의전암단계인이형성증중 HPV가감염되지않은이형성증과 HPV가감염된이형성증에서 p53과 Ki-67 종양단백질의발현률은이형성증이증가할수록유의성이인정되었다. 따라서본연구에서확인한종양단백질의발현은이형성증에서자궁경부암으로의진행과정여부를진단하고예후판정및치료에대한판단기준으로활용할수있을것으로사료된다. V. 결론 본연구는자궁경부암의전암단계인이형성증에서 HPV 감염군과 HPV 비감염군을대상으로암발생인자로추정되는종양단백질 (p53) 과세포증식표지자 (Ki-67) 를종합적으로평가하고 HPV 감염이각인자에미치는영향을연구하였다. 총이형성증으로진단받은검체중 HPV 감염군 33예와 HPV 비감염군 33예를대상으로 H&E염색으로조직학적등급을검사하였고, 면역조직화 학염색으로 p53과 Ki-67을검사하여다음과같은결과를얻었다. 1. 총 66예의이형성증중 p53의발현률은경도가 19 예 (29.0%) 였고중등도는 22예 (33.0%) 였으며고도는 19예 (29.0%) 로나타났다. 이형성증의정도가증가할수록높게나타났고유의한상관성을나타냈으나 (p<0.05), HPV 감염과유의성은인정되지않았다. 2. Ki-67 유사분열지수의발현은총 66예중경도는 22 예 (33.0%) 였고중등도는 21예 (32.0%) 였으며고도는 22예 (33.0%) 로나타났다. 이형성증의정도와는유의한차이를보였으나 (p<0.05), HPV 감염과의유의성은인정되지않았다. 3. p53과 Ki-67 간의상관관계를조사한결과유의한상관성이있는것으로조사되었다 (p<0.05). 요약하면자궁경부이형성증과 HPV와관련된이형성증에서종양단백질 (p53, Ki-67) 은 HPV 감염과는유의성이없었다. 그러나 p53의발현률은이형성증과유의한상관성을나타냈다. 이러한결과를종합하면 p53과 Ki-67은자궁경부이형성증에서자궁경부암으로의이행을예측혹은진단을하는데도움이될것으로생각된다. 참고문헌 1. Banks L, Matlashewski G, Crawford L. Isolation of human p53 specific monoclonal antibodies and their use in the study of human p53 expression. Eur J Biochem 159: , Benchimol S, Lamb P, Crawford LV, Sheer D, Shows TB, Bruns GA. Transformation associated p53 protein is encoded by a gene on human chromosome 17. Somatic Cell Mol Genet 11: , Beronese SM, Gambacorta M. Detection of Ki-67 proliferation rate in breast cancer. Correlation with clinical and pathologic features. Am J Clin Pathol 95: 30-34, Brinton LA, Hamman RF, Huggins GR. Sexual reproductive risk factors for invasive squamous cell cervical cancer. J Natl Cancer Inst 79:23-35, Busby-Earle RMC, Steel CM, Williams ARW, Cohen B, Bird CC. p53 mutations in cervical carcinogenesislov frequency and lack of correlation with human 183

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean