186 홍숙희 김대철 조세헌외 1 인 켜나쁜예후를보이는것으로알려져있다. 2,4-6 그러나 p27 발현은높지만세포증식은억제되지않는종양에서는 p27이핵이아닌세포질에잘못발현된현상이관찰된다. 이러한현상은 p27 이핵이아닌세포질에격리됨으로써, 핵안의 cyclin E/CDK2 와

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혜교 변
6 years ago
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1 The Korean Journal of Pathology 2006; 40: 유방암종에서 p27 kip1 단백의세포내발현위치와예후와의관련성 홍숙희 김대철 조세헌 1 홍영습 2 동아대학교의과대학병리학교실 1 외과학교실, 2 예방의학교실 Subcellular Localization of p27 kip1 in Breast Cancer and Its Prognostic Significance Sook Hee Hong, Dae Choel Kim, Se Heon Cho 1 and Young Seoub Hong 2 Departments of Pathology, 1 Surgery, and 2 Preventive Medicine, Dong-A University Medical School, Busan, Korea 접수 : 2006 년 2 월 6 일게재승인 : 2006 년 4 월 10 일 책임저자 : 홍숙희우 부산시서구동대신동 3가 1 동아대학교의과대학병리학교실전화 : Fax: shhong@dau.ac.kr * 본연구는 2004학년도동아대학교학술연구비 ( 공모과제 ) 지원을받아이루어졌음. Background : p27 is a member of the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors that arrest the progression of the cell cycle; thus, it acts as a tumor suppressor gene. The loss or decrease of p27 protein is frequently seen and this has an independent prognostic potential for many human cancers. p27 is functionally inactivated through accelerated proteolysis and cytoplasmic sequestration. Cytoplasmic mislocalization of p27 by abnormal phosphorylation in the tumor cells doesn t allow it to bind and inhibit nuclear cyclin/cdk targets. Methods : We examined the p27 protein expression in 86 cases of invasive ductal carcinoma of the breast via immunohistochemical staining to evaluate the subcellular localization of p27 and its relationship with the clinicopathologic features and the prognostic factors. Results : The nuclear expression of p27 was noted in 48.9% of the tumors, a combined nuclear and cytoplasmic expression was noted in 20.9%, a cytoplasmic expression was noted in 12.8%, and a negative expression was noted in 17.4%. The decreased nuclear expression and/or cytoplasmic mislocalization of p27 were statistically correlated with the nuclear grade (p=0.001), histologic grade (p=0.036), tumor size (p=0.033), lymph node metastasis (p=0.043), ER (p=0.001), and PR (p=0.001) status, while they were not correlated with patient age, stage, HER2, p53, and Ki67. Conclusions : The breast tumors showing both decreased nuclear expression and cytoplasmic mislocalization of p27 are associated with a deranged cell cycle via functional inactivation and also with poor prognostic factors. It is expected that p27 can be a promising anticancer target molecule for the treatment of breast cancer. Key Words : Breast cancer; CDK inhibitor p27; Immunohistochemistry; Prognosis 포유류세포에서세포의성장과분화는세군의세포주기조절단백, 즉 cyclin, cyclin-dependent kinase (CDK) 및 CDK inhibitor (CDKI) 의상호작용에의해조절된다. 1 CDK의기능은 cyclin과결합하면활성화되고 CDKI와결합하면억제된다. CDKI에는 cyclin/kinase inhibitor proteins (Cip/Kip) 군과 INK4 군의두군이있으며, 이들은 CDK와 cyclin 의결합을방해하여세포주기진행을억제하고무제한적인세포증식을막는다. 따라서 CDKI의기능에이상이생기면세포증식을초래할수있다. Cip/Kip에속하는 p21, p27, p57 단백은 CDK2의강력한억제인자로서 G1기를정지시켜세포성장을멈추게한다. CDKI 중 p27은핵단백으로여러종류의 cyclin/cdk 복합체와결합하여키나아제활동을억제하여세포증식을막는종양억제단백으로 알려져있다. 또이러한세포증식억제기능외에도세포분화, 노화, 세포사멸, 세포부착, 세포이동등다양한기능을하는단백으로알려져있다. 1 p27의활성도는주로세포내에서발현되는양에의해조정된다. 세포주기동안에 p27의 mrna와단백합성은일정하므로세포내 p27 양은 ubiquitin-proteasome에따른단백분해등전사후조절에의하여변한다. 1,2 p27이하는역할을다룬연구중에서 p27 결손쥐에게서장기증식증과뇌하수체종양이발생한다고보고한연구도있어, 3 p27의절대량이세포주기조절에중요함을알수있다. 또한여러가지종양에서 p27 발현정도는세포증식과반비례관계를보여, p27 발현이감소한종양은과도한세포증식을일으 185

2 186 홍숙희 김대철 조세헌외 1 인 켜나쁜예후를보이는것으로알려져있다. 2,4-6 그러나 p27 발현은높지만세포증식은억제되지않는종양에서는 p27이핵이아닌세포질에잘못발현된현상이관찰된다. 이러한현상은 p27 이핵이아닌세포질에격리됨으로써, 핵안의 cyclin E/CDK2 와결합하여키나아제를억제시켜세포주기를정지시키는 p27의고유기능이상실되어세포증식이일어나는것으로생각된다. 7-9 또한세포질에발현하는 p27은세포이동과관련이있다는연구결과가있어세포내에서 p27이발현하는위치에따라기능이달라진다는사실을알수있다. 1 종양세포에서발생하는단백분해에따른핵 p27의감소와 p27의세포질내격리는서로다른기전에의하여일어나는것으로알려져있다. 9,10 종양세포에서는 protein kinase B/Akt (Akt) 의활성화에따른비정상적인 p27 인산화와분해에의해세포질 p27이발현된다 이러한현상은종양의분화가나쁘고진행된암에서잘나타나며, 또이러한환자는생존율도낮다고한다. 7,10,13 그러므로세포증식에관여하는 p27이종양의예후인자로서가치가있는지정확하게평가하려면종양세포에서 p27 발현의감소뿐만아니라세포질 p27 발현에대한평가를병행해야할것이다. 종양에서발현하는 p27에관한연구는주로핵에서발현하는 p27을관찰한결과를토대로한것이며, 국내연구에서도세포질발현을관찰한연구는찾아보기가어렵다 유방암은서양여성에게서가장흔히발생하는악성종양이며, 우리나라에서도점차발병률이증가하여현재여성암발생률 1 위를차지하고있다. 유방암의예후는흔히조직학적분류, 조직학적등급, 종양의크기, 호르몬수용체상태, 임상병기등으로평가하여적절한치료방법을선택하고있다. 특히초기유방암환자에서는림프절전이유무와호르몬수용체발현유무에근거하여적절한보조요법을시행하고있으며, 재발을방지하고생존율을높이기위한여러가지치료방법이제시되고있다. 5,11,12,19-21 그리고이러한연구결과를기초로초기유방암환자의재발위험이나치료에대한반응을예견할수있는지표를찾고자노력하고있다. 그러나임상적으로유용한정보는소수에불과하며, 아직도많은연구가필요한실정이다. 본연구는한국여성에게서가장흔하게발생하는유방암중침윤성관상암조직에서 p27 단백에대한면역조직화학검사를시행하였다. 그리하여종양세포에서 p27 단백의발현정도와세포내에서발현하는위치의변동이유방암의예후관련인자로알려진임상병리학적인자들과어떤상관관계가있는지살펴보고, p27이유방암의예후인자로서가치가있는지알아보고자한다. 및조직학적등급, 림프절전이유무, 임상병기는병력지를검토하여조사하였다. 면역조직화학염색방법유방암조직의헤마톡실린-에오신염색표본을재검색하여종양을대변할수있는가장대표적인파라핀포매블록 1, 2개를선택하였다. 그런다음 p27, 에스트로겐수용체 (ER), 프로게스테론수용체 (PR), HER2, p53 및 Ki67 단백에대한면역조직화학염색을시행하였다. 면역조직화학염색은 EnVision TM Chem- Mate TM Detection Kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) 를사용하여표본의전처치로전자오븐에서 15분간가열한후통상적인방법으로시행하였다. 본연구에사용한일차항체는 p27 (Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA, 1:400), ER (Dako, 1:50), PR (Dako, 1:200), HER2 (NeoMarkers, Fremont, CA, USA, 1:200), p53 (Dako, 1:100), Ki67 (Dako, 1:100) 이다. 면역조직화학염색판독 p27 발현은광학현미경으로관찰하여종양세포주위의정상유방조직의근상피세포와림프구핵을양성대조세포로하여종양세포의핵이나세포질이적갈색으로염색되면양성반응으로판독하였다. 세포내에서 p27 이발현하는양상은 Baldassarre 등 7 의기준을참고로하여네가지로나누었다. 종양세포중 p27 양성세포가 15% 미만이면 p27 음성종양으로판정하였고, 종양세포의 15% 이상이염색되면 p27 염색의강도와상관없이 p27 양성종양으로판정하였다. 다시 p27 양성종양은세포내에서 p27 이발현하는위치에따라세가지형으로나누었다. p27 양성세포중 50% 이상이핵에서양성반응을보이면핵 p27 발현종양 (N p27) 으로, p27 양성세포중 15-50% 가핵과세포질에서동시에양성반응을보이면혼합 p27 발현종양 (NC p27) 으로, 그리고핵 p27 발현은 15% 미만이나 p27 양성세포중 35% 이상이세포질에양성반응을보이면세포질 p27 발현종양 (C p27) 으로판정하였다 (Fig. 1). ER, PR, p53은 5% 이상의종양세포핵이염색되면양성종양으로분류하였다. HER2는 10% 이상의종양세포에서연속적인세포막염색을보이는 2+ 이상을양성종양으로분류하였다. Ki67 염색에서는 Spataro 등 21 의연구를참고하여양성세포가 8% 이상이면높은 Ki67 발현종양으로분류하였다. 재료와방법 통계학적분석 2003년 1월부터 12월까지동아대학교병원에서변형근치유방절제술을받은환자중침윤성관상암으로진단받고종양조직이충분한 86예를선택하였다. 환자의나이, 종양의크기, 핵 p27 단백에대한면역조직화학검사에서 p27의발현양상과발현위치에따라나눈네가지분류 (N p27/nc p27/c p27/ 음성 ) 와종양의임상병리조직학적소견및다른여러단백발현

Immunohistochemical stain for p27 shows nuclear (A), mixed nuclear-cytoplamic (B), cytoplasmic (C) and negative (D) expression in breast

p27 발현양성종양을판정하는기준이연구자마다다르므로그기준에따라상관관계분석에서다소차이를보일것으로가정하여, p27 양성종양의기준을 50% 이상핵발현, 15% 이상핵발현, 15% 이상핵과세포질혼합발현의세가지로나누어각각의사례를비교분석하였다.

p27 양성종양, 15% 미만으로감소한종양을음성종양으로판정하였고 (N p27+nc p27/c p27+ 음성 ), 세번째기준은 p27 발현이핵과세포질에서 15% 이상인모든종양을양성종양, 15% 미만인종양을 p27 음성종양으로판정하였다 (N

3 유방암종에서세포내 p27 발현위치와예후 187 A B C D Fig. 1. Immunohistochemical stain for p27 shows nuclear (A), mixed nuclear-cytoplamic (B), cytoplasmic (C) and negative (D) expression in breast carcinoma. 양상의상관관계를분석하였다. p27 발현양성종양을판정하는기준이연구자마다다르므로그기준에따라상관관계분석에서다소차이를보일것으로가정하여, p27 양성종양의기준을 50% 이상핵발현, 15% 이상핵발현, 15% 이상핵과세포질혼합발현의세가지로나누어각각의사례를비교분석하였다. 양성기준을자세히설명하면, 첫번째기준은핵발현이 50% 이상인종양을 p27 양성종양, 핵발현이 50% 미만으로감소하거나세포질발현을보이는종양을음성종양으로판정하였고 (N p27/ NC p27+c p27+ 음성 ), 두번째기준은핵발현이 15% 이상인종양을 p27 양성종양, 15% 미만으로감소한종양을음성종양으로판정하였고 (N p27+nc p27/c p27+ 음성 ), 세번째기준은 p27 발현이핵과세포질에서 15% 이상인모든종양을양성종양, 15% 미만인종양을 p27 음성종양으로판정하였다 (N p27+nc p27+c p27/ 음성 ). 통계분석은개인용컴퓨터통계프로그램인 SPSS (version 12.0) 를이용하여 2 test로검정하였다. 유의수준은 p값이 0.05 이하일때로하였으며수치로표시하였다. 결과임상병리학적소견대상환자의나이는 25세부터 76세까지로평균 50세이었다. 종양의크기는 0.5 cm부터 8 cm까지로평균 2.7 cm이었다. 감시림프절과액와림프절을포함하여림프절전이는 43예 (50%) 에서일어났다. 면역조직화학검사결과대상환자중 ER 양성은 50예 (58.1 %), PR 양성은 46예 (53.5%) 였으며, HER2 양성은 32예 (37.2 %), p53 양성은 47예 (54.7%) 였다. Ki67에대한면역조직화학염색결과양성세포수는 0-90% 까지다양하였으며 8% 이상높은지수를보인예는 78예 (90.7%) 였다. p27 발현양상과임상병리학적인자들의상관성유방암세포에서 p27은핵과세포질에서다양한비율로발현되었다. 15% 이상의종양세포에서 p27이양성인종양은 71예

4 188 홍숙희 김대철 조세헌외 1 인 Table 1. Relationship between subcellular localization of p27 and clinicopathologic parameters in breast cancer Parameters No. of cases (%) Subcellular localization of p27 (%) N p27* NC p27 C p27 Negative p value No. of cases (%) 86 (100) 42 (48.9) 18 (20.9) 11 (12.8) 15 (17.4) Age (yr) (53.5) 21 (24.4) 11 (12.8) 7 (8.1) 7 (8.1) >50 40 (46.5) 21 (24.4) 7 (8.1) 4 (4.7) 8 (9.3) Nuclear grade I 11 (12.8) 7 (8.1) 0 (0) 4 (4.7) 0 (0) II 42 (48.8) 29 (33.7) 6 (7.0) 4 (4.7) 3 (3.5) III 33 (38.4) 6 (7.0) 12 (14.0) 3 (3.5) 12 (14.0) Histologic grade I 20 (23.3) 12 (14.0) 1 (1.2) 6 (7.0) 1 (1.2) II 23 (26.7) 17 (19.7) 2 (2.3) 2 (2.3) 2 (2.3) III 43 (50) 13 (15.1) 15 (17.4) 3 (3.5) 12 (14.0) Stage I 19 (22.1) 11 (12.8) 3 (3.5) 1 (1.2) 4 (4.7) II 49 (57.0) 22 (25.6) 9 (10.5) 8 (9.3) 10 (11.6) III 17 (19.8) 8 (9.3) 6 (7.0) 2 (2.3) 1 (1.2) Tumor size (cm) (45.3) 27 (31.4) 4 (4.7) 4 (4.7) 4 (4.7) >2 47 (54.7) 15 (17.4) 14(16.3) 7 (8.1) 11 (12.8) Lymph node metastasis Negative 43 (50) 21 (24.4) 5 (5.8) 6 (7.0) 11 (12.8) Positive 43 (50) 21 (24.4) 13 (15.1) 5 (5.8) 4 (4.7) Estrogen receptor Negative 36 (34.9) 9 (10.5) 12 (14.0) 3 (3.5) 12 (14.0) Positive 50 (58.1) 33 (38.4) 6 (7.0) 8 (9.3) 3 (3.5) Progesterone receptor Negative 40 (46.5) 11 (12.8) 12 (14.0) 4 (4.7) 13 (15.1) Positive 46 (53.5) 31 (36.0) 6 (7.0) 7 (8.1) 2 (2.3) HER Negative 54 (62.8) 29 (33.7) 10 (11.6) 7 (8.1) 8 (9.3) Positive 32 (37.2) 13 (15.1) 8 (9.3) 4 (4.7) 7 (8.1) p Negative 39 (45.3) 18 (20.9) 9 (10.5) 8 (9.3) 4 (4.7) Positive 47 (54.7) 24 (27.9) 9 (10.5) 3 (3.5) 11 (12.8) Ki <8% 8 (9.3) 4 (4.7) 0 (0) 2 (2.3) 2 (2.3) >8% 78 (90.7) 38 (44.2) 18 (20.9) 9 (10.5) 13 (15.1) *N p27 (nuclear localization) was assigned when more than 50% of cells staining positive for p27 had nuclear p27 staining; NC p27 (mixed nuclear and cytoplasmic localization) was assigned when 15-50% of cells that stained for p27 had simultaneous cytoplasmic and nuclear staining; C p27 (cytoplasmic localization) was assigned when less than 15% of cells were positive for nuclear p27 and more than 35% of p27-positive cells had clear cytoplasmic staining; negative was assigned when less than 15% of cells were positive for p27 staining. (82.6%) 였다. 이들을세포내에서발현한위치에따라나누어보면, 50% 이상의핵에서발현된핵발현종양은 42예 (48.9%), 핵과세포질에서발현된혼합발현종양은 18예 (20.9%), 세포질발현종양은 11예 (12.8%) 였다. 15% 미만으로발현된 p27 음성종양은 15예 (17.4%) 였다 (Table 1). p27 발현양상과종양의핵등급의상관관계를분석해본결과, 핵 p27 발현이 50% 미만으로감소하거나세포질 p27 발현을보이는종양은핵등급이비교적낮은 I과 II등급의 53예중 17예 (32.1%) 에서, 핵등급이높은 III등급의 33예중 27예 (81.8 %) 에서나타나핵등급이높을수록핵 p27 발현이감소하는 빈도가높아핵등급과 p27 발현은통계학적으로유의한상관관계를보였다 (p=0.001). p27 발현양상과조직학적등급의상관관계를분석해보면, 핵 p27 발현이 50% 미만으로감소하거나세포질 p27 발현을보이는종양은 I과 II등급 43예중 14예 (32.6%) 에서, III등급 43예중 30예 (67.8%) 에서나타나조직학적분화가나쁠수록핵 p27 발현이감소하는빈도가높아조직학적등급과 p27 발현은통계학적으로유의한상관관계를보였다 (p=0.036). p27 발현양상과종양의크기의상관관계를살펴보면, 핵 p27 발현이 50% 미만으로감소하거나세포질 p27 발현을보이는

5 유방암종에서세포내 p27 발현위치와예후 189 종양은크기가 2 cm 이하인 39예중 12예 (30.8%) 에서, 2 cm 이상인 47예중 32예 (68.1%) 에서나타나종양의크기가클수록핵 p27 발현이감소하는빈도가증가하여종양의크기와 p27 발현은통계학적으로유의한상관관계를보였다 (p=0.033). 림프절전이와 p27 발현의상관관계를분석해보면, 50% 이상핵 p27 발현은림프절전이가없는 43예중 21예 (48.8%) 에서, 림프절전이가있는 43예중 21예 (48.8%) 에서나타나림프절전이와 p27 발현은유의한상관관계를보이지않았다 (p>0.05). 그러나 p27 양성종양의판정기준을 15% 로달리하여분석하였을때 p27 발현이 15% 이하인 p27 음성종양은림프절전이음성인 43예중 11예 (25.6%) 에서, 림프절전이양성인 43예중 4예 (9.3%) 에서나타나 p27 음성종양에서림프절전이음성빈도가높았는데, 이차이는통계학적으로유의하였다 (p=0.043). 또 p27이핵에서 50% 이상발현된종양은 ER 양성종양 50예중 33예 (66%) 에서, PR 양성종양 46명중 31예 (67.4%) 에서나타나 ER 및 PR 발현과 p27 발현은통계학적으로유의한상관관계를보였다 (p=0.001). 이상의결과를종합하면 p27 발현양상은종양세포의핵등급, 조직학적등급, 종양의크기, 림프절전이, ER, PR과통계학적으로유의한상관관계를보인반면, 환자나이, 임상병기, HER2, p53, Ki67 발현과는상관관계를보이지않았다 (p>0.05). 본연구에서는 p27 양성유방암의판정기준을세가지로달리하여각각의경우에서임상병리학적소견및다른단백발현과의상관관계를다시분석하였다. p27 양성유방암의판정기준을 50% 이상핵발현군으로정했을때는핵등급, 조직학적등급, 종양크기, ER, PR의다섯가지인자와유의한상관관계를보였다. 그렇지만 15% 이상핵발현군만으로정했을때는핵등급과 PR의두가지인자만유의한상관관계를보였고, 15% 이상핵과세포질발현군으로정하였을때는핵등급, 조직학적등급, 림프절전이, ER, PR의다섯가지인자와유의한상관관계를보여약간의차이를보였다. 그러나 p27 양성종양의판정기준을세가지로나누어분석하였음에도핵등급과 PR은세가지경우모두에서 p27 발현과통계학적으로유의한상관관계를보여주고있어, p27 발현감소는유방암의예후인자로서의미가있는소견으로생각된다. 고찰여러종류의인체종양에서세포주기를조절하는 cyclin, CDK, CDKI의변화가자주관찰된다. 그리고 p27 발현감소는위암, 18 결직장암, 2,16,22 갑상선암, 7 난소암, 13 신장암 6 등여러인체암에서다양한빈도로나타나며, 이러한종양에서는 p27의기능이비활성화되는것으로보고되어있다. 따라서발현감소로인한 p27의기능이상은종양의진행과예후와관련성을보이므로 p27은암의악성도를평가할수있는인자가운데하나라고할 수있다. 유방암에서핵 p27 발현은 41-69% 정도감소하는것으로보고되어있으며, 21 p27 발현이감소한종양은높은조직학적등급, ER 음성, PR 음성, cyclin D1 감소, HER2 과발현, Ki-67 증가, S기분획의증가, 재발위험률증가, 항에스트로겐에대한저항, 생존율감소등나쁜예후를보이는인자와관련이있어예후인자로서 p27의가치를긍정적으로평가하고있다. 4,5,14,15,19-22 국내유방암환자를대상으로 p27 발현에대해연구한결과를보면, 45명의유방암조직을대상으로조사한강등 14 은핵 p27 발현이 25% 이하로감소한유방암은 69% 였고, 이들에서는림프절전이가높고생존율도낮아예후인자로가치가있다고하였다. 183예의유방암을대상으로한김등 15 의연구에서는핵 p27 발현이 50% 이하로감소한빈도가 59% 였으며, 이들도나쁜예후인자들과상관관계를보이고또생존율과도연관이있다고하였다. 본연구에서는면역조직화학검사를시행하여 p27 발현을핵뿐만아니라세포질에서동시에관찰하였는데, 핵 p27 발현이 50% 미만으로감소한종양은 51.1% 였으며, 15% 미만으로감소한종양은 30.2% 였다. 또한유방암관련임상병리학적인자와상관관계를분석한결과, 핵 p27 발현감소는종양세포의핵등급, 조직학적등급, 종양크기, 림프절전이, ER, PR와통계학적으로유의한상관관계를보인반면, 환자나이, 임상병기, HER2, p53, Ki67과는관련이없었다. 본연구대상환자의추적기간이짧아비록생존율조사는하지않았지만, 핵 p27 감소는나쁜예후인자와관련이있음을나타내어다른연구들과비슷한소견을보였다. 그러나 Barnes 등 23 은 830명의유방암환자를장기간추적조사한결과를다변량분석하여, p27은독립적인예후인자로서가치가없어 p27은유방암세포의증식과분화에관여하나임상적으로유용한표지자는아니라고하였다. 유럽유방암환자 512 명을장기간 ( 평균 9년간 ) 추적조사한 Barbareschi 등 24 은 p27 감소군은나쁜예후인자와연관이있으나, 림프절전이음성군중에서생존율은 p27 증가군보다 p27 감소군에서오히려높아 p27 은예후인자로서가치가없다고하였다. 국내에서 102명의유방암환자를대상으로연구한김등 17 의결과에서도 p27 발현과예후인자및생존율과는상관관계가없다고하였다. 이와같이 p27이종양의예후관련인자로서가치에대해저마다다른평가를내리는이유는 p27 양성종양과음성종양의판정기준이되는핵 p27 발현정도의기준이연구자마다다르기때문이기도하지만, 세포주기를조절하는 p27의기능이세포내에서발현하는위치와깊은연관이있고, 또정상세포와종양세포에존재하는 p27의기능에차이가있기때문이다. 대장암에서 p27의발현을 Western blot 방법으로조사한 Ciaparrone 등 2 은핵 p27 양이정상조직과종양조직에서는의미있는차이를보이지않았으나, 총 p27 양은조직학적등급과병기가높은진행암에서감소하였고, 세포질 p27 양은정상조직보다종양조직에서더높다는사실을관찰하였다. 공격적인진행을보이는다른

6 190 홍숙희 김대철 조세헌외 1 인 종양에서도세포내에서 p27 발현위치를자세히관찰해보면세포질에서높게발현되는것을확인할수있다. 이러한소견은 p27 의발현감소와세포내에서발현하는위치의변동으로인하여 p27의불활성화를야기해 p27의세포주기억제기능이상실되어종양이발생한다는것을암시한다. 세포질 p27은대장암의 35%, 경계영역종양을포함한난소암종의 55%, 갑상선암의 80% 에서발현되어다소높은빈도로나타나며, 분화가나쁘고진행된암에서잘나타나며이들의생존율은낮은것으로보고되어있다. 2,7,10,13 유방암의경우세포질 p27 이약 40% 정도에서발현되는것으로보고되어있는데, 8,10 본연구에서세포질 p27 발현종양의빈도는 18예의혼합 p27 발현종양과 11예의세포질 p27 발현종양을합하여 33.7% 를차지하였다. 유방암조직에서 Western blot 방법으로 p27 총단백양과세포질발현양을측정한 Liang 등 10 은이들사이에는상관관계가없으며, 높은핵 p27 발현군에서생존율이가장높았으나 p27 감소와더불어세포질 p27 발현군에서생존율이가장낮아, p27 감소뿐만아니라세포질 p27 존재유무가유방암예후평가에중요하다고주장하였다. 종양세포에서 p27 발현의핵과세포질사이의이동과정경로와세포질내축적기전은확실히밝혀져있지않다. p27은핵단백으로세포주기에서 G1기에서 S기로진행을억제하는주조절인자다. 세포주기동안에 p27 의 mrna와단백합성은비교적일정하므로 p27 양은전사보다는주로유전암호해독 (translation), cyclin D/CDK 복합체와의결합, ubiquitin-proteasome 단백분해등전사후변화에의해조절되는데, 1 휴지기세포에서는 p27 의단백분해가감소하기때문에핵에많이존재한다. 세포주기동안에 p27 단백분해에의한 p27 양의조절과핵과세포질사이의이동에의한 p27 의세포내발현위치변동은서로다른기전에의하여매우복잡하게일어난다. 9,10 p27 단백을구성하는아미노산분자중 serine (S10) 과 threonine (T187) 의인산화가 p27이핵과세포질사이의이동에매우중요한역할을하는것으로알려져있다 G0와초기 G1기에서핵에존재하던 p27은후기 G1기에서는핵단백 hkis (human kinase interacting stathmin) 와결합하여, S10이인산화되면 exportin의매개로핵밖으로유출되어 G1/S 이행기에는세포질에존재한다. 9 이곳에서 phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) 와 Akt 경로에따라 T187 분자가인산화되면 SCF- Skp2/Cks1의매개로 ubiquitination되고 proteasome에의해분해가촉진되어 p27 양은급속히감소한다. 1 이로서 cdk2 억제인자로서 p27의기능은상실되고, cyclin E/cdk2 복합체에의해세포는 S기로진입한다. 세포의성장과생존에매우중요한신호전달경로인 Akt 는발암과정에서는암유전자에의해활성화된다. 유방암에서도 HER2 과발현등암유전자의활성으로인한 PI3K-Akt 경로의활성화로 p27을비롯한주요조절인자들의인산화가일어난다. p27이비정상적으로인산화되면핵안으로들어가지못하고세포질에 격리되는데, 이때문에 cyclin E/cdk2 억제에필요한핵 p27 양이부족하므로 G1기에서 p27의세포증식억제기능이소실되어종양세포는증식하게된다. 9,10 이로써세포증식을억제하는데유용한 p27은절대량보다는세포내발현위치가중요함을알수있고, 유방암에서세포질 p27의존재는 Akt 활성화에의한비정상적인 p27 인산화와분해를의미한다. 유방암세포에서 p27 분자의인산화가비정상적으로일어난다는사실이최근알려졌다 Viglietto 등 8 은 p27이세포내에서발현하는위치는 p27의 T157 인산화와밀접한연관이있음을밝혔냈다. 이들은사람유방암조직에서단백을분획하여 Western blot 결과와면역조직염색결과를비교한결과, p27 T157 인산화를보이는종양에서는 Akt 활성이증가하고, p27 T157 인산화가없는종양에서는 p27이핵에서발현하고 Akt 활성도감소하였음을관찰하였다. Shin 등 9 은세포질로나온 p27이 Akt 활성화로인하여 T157이인산화되면 p27은핵내로유입을담당하는수송단백인 importin 와의결합이억제되어세포질에남게되어세포질 p27이발현되는것을증명하였다. 그리고이러한결과를토대로유방암발생에는 Akt 에의한 p27의이동조정이중요하다고하였다. 또 Motti 등 26 도정상세포보다유방암세포주에서 p27 T198의인산화가증가한다고보고하였는데, 이때도 p27 T198의인산화는 PI3K-Akt의활성과비례하였다고하였다. 인체종양에서 p27 발현의 downregulation은흔하지않으며, 10 종양세포에서 p27 발현의감소혹은기능의이상으로 p27 의세포증식억제능력이감소하는이유는대부분 p27 단백분해가촉진되기때문인것으로알려져있다. 1 그러나많은종양에서는 p27이핵밖으로유출되어세포질내에축적될때도 p27의세포증식억제능력이감소할수있다 그러므로각종종양에서 PI3K-Akt 경로와이에의한 p27의인산화와 importin/exportin의결합에의한핵으로의이동과분해경로를좀더자세히연구하면 p27의종양성활성화와세포주기조절이상사이의연관성을밝힐수있을것으로생각된다. 유방암에서림프절전이는가장의미있는예후인자다. 그러나림프절전이가없는경우라도약 30% 에서재발과사망을일으킬수있으므로, 기존의예후인자중어떤것을근거로치료를해야하는지결정하기어렵다. 세포주기를억제하는기능외에도 p27은 F-actin과결합하여 actin 세포골격을재배열하여세포이동을유도하는기능을한다. 1,27 유방암에서세포이동기능을하는 p27과림프절전이의관련성에대해서는의견이다양하다. p27 감소가림프절전이양성과관련이있다는보고가있는반면, 14 p27 감소는림프절전이양성군보다전이음성군에서더흔하게일어난다는상반된보고도있으며, 24,25 p27 발현감소는림프절전이와상관관계가없다는보고도있다. 23 Kouvaraki 등 25 은진행된유방암환자에게서핵 p27이 50% 이상발현된사례는액와림프절전이양성예의 42% 에서보였으나림프절전이음성예에서는없어, 종양의전이는비활성화된안정상태의 p27이축적되거나 p27의 CDK 억

7 유방암종에서세포내 p27 발현위치와예후 191 제기능보다우월한다른기전이관여하여발생하는것이라고하였다. 본연구결과에서는 15% 이상의종양세포핵과세포질에서 p27이발현된종양은림프절전이양성 43예중 39예 (90.7%) 에서나타나종양세포의분화와전이에는다른기전이관여하고있음을시사하였다. 핵 p27은종양의성장을억제하는기능을하는반면, 세포질 p27은세포이동을촉진해전이유전자의역할을하는이중기능을하므로, p27이전이와관련있는인자라는것을확증하기위해서는이두기능을연결짓는깊이있는연구가필요할것으로생각된다. 면역조직화학검사를통해 p27 발현양성종양을판정하는기준은연구자마다달라, 유방암에서는종양세포핵의 5% 부터 13,16,18 50% 까지 15,21,24,25 다양한범위를채택하고있다. 또한 p27의면역조직화학염색에서핵발현만을관찰하였는지, 핵뿐아니라세포질발현을함께관찰하였는지에따라예후인자로서유용한지에대한평가도상당히다르게나타난다. 따라서유방암을포함한여러종양에서 p27 발현정도를예후인자로삼기위해서는 p27 양성종양의기준을표준화하여엄격하게적용해야연구결과에따른해석의차이를줄일수있을것이다. 종양에서 p27 발현에관한연구를살펴보면, 예후인자들과관련이있다는보고와함께치료에대한반응도 p27 발현정도에따라차이가있다는연구도있다. 유방암에서 MEK 경로의활성화, p27 인산화변화, HER2 과발현이동반되면 p27 발현이감소하거나세포질발현이나타날수있는데, 이러한유방암은항에스트로겐, Herceptin 및화학요법치료에저항을보일것으로예견되므로다른치료방법을강구하여야한다는견해도있다 유방암세포중 Herceptin 내성세포에서는 p27이감소되었지만, p27을주입하면 Herceptin 에대한감수성이증가하므로 p27 발현정도는 Herceptin 에대한반응과도관련이있음을알수있다. 11,20,28 Herceptin 이종양성장을억제하는기전은아직자세히밝혀지지않았지만, p27의인산화를조절하여반감기를증가시켜세포내에축적되어 G1기를정지시키는것으로알려져있다. 11 이러한소견은 p27 발현을유도할수있는다양한경로와방법을알게되면유방암환자의생존율을높일수있음을시사하기도한다. 1,11,20,28 이러한점에착안하여 Zhang 등 12 은 T187의인산화에의해 p27의단백분해가시작되는데, p27 T187 위치에 threonine 대신 alanine으로대치한돌연변이 p27 (T187A) 은단백분해에영향을받지않아세포내에서 p27이증가하고세포증식억제효과가유도되는것을관찰하였다. 그리고이러한결과를토대로단백분해에저항성을보이는 p27을제작하면유전자치료로유방암을치료할수있다는가능성을제시하였다. 그러나본연구에서는 HER2 발현과 p27 발현은상관관계를보이지않았으며, p27 발현정도에따른 Herceptin 에대한반응은아직임상예가충분하지않아추가연구를진행해야알수있을것같다. 본연구결과에서도핵 p27 발현의감소혹은세포질 p27 발현종양은나쁜예후와관련이있었다. 그러나 p27 발현을유방 암예후관련인자로이용하기위해서는 p27 발현양성종양을판정하는기준에대한연구자들의의견일치가필요하다. 또한 p27의핵발현은세포주기를억제하는종양억제인자로역할을하는반면, 세포질 p27은세포증식억제기능을상실하므로세포내에서 p27의발현위치의변동에대한자세한관찰이필요하다. 앞으로 p27의분자생물학적성상, 암유전자와의상호연관성을조절하는경로, 그리고 p27의단백분해과정과세포내발현위치의변동과관련된요인이밝혀지면핵 p27 발현을안정시키거나증강시킬수있는다양한 p27 증강법을유방암의보조치료방법으로이용할수있을것으로기대한다. 참고문헌 1. Sgambato A, Cittadini A, Faraglia B, Weinstein IB. Multiple functions of p27 Kip1 and its alterations in tumor cells: a review. J Cell Physiol 2000; 183: Ciaparrone M, Yamamoto H, Yao Y, et al. Localization and expression of p27 Kip1 in multistage colorectal carcinogenesis. Cancer Res 1998; 58: Nakayama K, Ishida N, Shirane M, et al. Mice lacking p27 (Kip1) display increased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia, and pituitary tumors. Cell 1996; 85: Tan P, Cady B, Wanner M, et al. The cell cycle inhibitor p27 is an independent prognostic marker in small (T1a,b) invasive breast carcinomas. Cancer Res 1997; 57: Wu J, Shen ZZ, Lu JS, et al. Prognostic role of p27 Kip1 and apoptosis in human breast cancer. Br J Cancer 1999; 79: Migita T, Oda Y, Naito S, Tsuneyoshi M. Low expression of p27 Kip1 is associated with tumor size and poor prognosis in patients with renal cell carcinoma. Cancer 2002; 94: Baldassarre G, Belletti B, Bruni P, et al. Overexpressed cyclin D3 contributes to retaining the growth inhibitor p27 in the cytoplasm of thyroid tumor cells. J Clin Invest 1999; 104: Viglietto G, Motti ML, Bruni P, et al. Cytoplasmic relocalization and inhibition of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 Kip1 by PKB/ Akt-mediated phosphorylation in breast cancer. Nat Med 2002; 8: Shin I, Rotty J, Wu FY, Arteaga CL. Phosphorylation of p27 Kip1 at Thr- 157 interferes with its association with importin during G1 and prevents nuclear re-entry. J Biol Chem 2005; 280: Liang J, Zubovitz J, Petrocelli T, et al. PKB/Akt phosphorylates p27, impairs nuclear import of p27 and apposes p27-mediated G1 arrest. Nat Med 2002; 8: Le XF, Claret FX, Lammayot A, et al. The role of cyclin-dependent kinase inhibitor p27 Kip1 in anti-her2 antibody-induced G1 cell cycle

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean