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담 석
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2 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 식중독예방및치료를위한 Listeria 균의 phage 저항체계연구 과제의 보고서로제출합니다 년 2 월 21 일 주관연구기관명 : 서울대학교 주관연구책임자 : 배의영 연 구 원 : 연 구 원 : 연 구 원 : 연 구 원 : - 1 -

3 요약문 Ⅰ. 제목 식중독예방및치료를위한 Listeria 균의 phage 저항체계연구 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성식중독원인균인 Listeria monocytogenes와같은병원균감염에대한예방및치료를위해기존의항생제를이용한치료법의대안이될수있는 phage 치료법 (phage therapy) 관련원천기술개발을연구의목적으로하였다. 병원균의 phage 저항체계인 CRISPR-Cas system의작용기작규명을통해병원균의 phage 저항기능약화및 phage 치료법의효능강화연구가가능하며, 이를위해 CRISPR-Cas system의핵심구성요소인 Cas 단백질의구조및기능을밝히고자하였다. Ⅲ. 연구개발내용및범위병원균 phage 저항체계의구성요소인 CRISPR 핵산과 Cas 단백질을생산하여분리및정제하고이들의생화학적특성을분석하였다. Cas 단백질의 CRISPR 핵산에대한결합여부및촉매활성등을조사하였고 X-선결정학을이용하여 Cas 단백질의삼차원적구조를규명하였다. 당초연구개발계획서의내용대로연구의성공률을높이고위험요소분산을위해 Listeria monocytogenes와유사한 CRISPR-Cas system을보유한병원균에대해서도동시에연구를진행하였다. Ⅳ. 연구개발결과 Listeria monocytogenes에존재하는 4종의 Cas 단백질의유전자를모두확보하였으나그기능및구조연구에적합할정도의단백질생산및정제가여의치않아대안으로서 Listeria monocytogenes와유사한 Cas 단백질을보유한병원균인 Streptococcus pyogenes를대상으로연구를진행하였다. Streptococcus pyogenes의 Cas 단백질중하나인 Csn2 단백질의비특이적 DNA 결합성을규명하였고삼차원적구조를결정하였으며칼슘결합단백질임을증명하였다. Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 Csn2 단백질에관한연구결과는 SCI급해외학술지에게재하였으며후속연구결과도논문게재를준비중이다. Csn2 단백질의삼차원적구조는 Protein Data Bank에 2건의생명정보로서등록하였으며연구를통해농학석사 1명을배출하였다

4 SUMMARY ( 영문요약문 ) Ⅰ. Title Study of Listeria phage defense system for prevention and treatment of food poisoning Ⅱ. Purpose To prevent and treat the infection by pathogenic bacteria such as Listeria monocytogenes, we intended to develope a new technology related to phage therapy, which can be used as an alternative to the conventional approaches using antibiotics. The elucidation of the mechanism of the CRISPR-Cas system, a bacterial phage defense system can make it possible to increase the efficacy of the phage therapy by inhibiting bacteria s phage resistance. To do this, we performed structural and functional studies for Cas proteins, core components of the CRISPR-Cas system. Ⅲ. Contents We produced and purified CRISPR nucleic acids and Cas proteins, main components of the CRISPR-Cas system, and analyzed their biochemical properties. The Cas proteins were tested for their affinities to nucleic acids, and their three dimensional structures were also determined. We also carried out the characterization of homologous Cas proteins from other bacteria to accomplish the goal of this research project more effectively. Ⅳ. Results We obtained genes for the four Listeria monocytogenes Cas proteins, but their purification were not successful. As an alternative, we decided to study Streptococcus pyogenes that contains Cas proteins similar to those from Listeria monocytogenes. Csn2, one of the Streptococcus pyogenes Cas proteins, has DNA and calcium binding affinities. We also solved its crystal structure, and showed that Csn2 can from a protein complex with Cas1, another Streptococcus pyogenes Cas protein. Ⅴ. Contribution We published the structure and function of the Csn2 protein in the international research journal and are preparing another manuscript now. We also deposited two Csn2 structures in the Protein Data Bank. One master-degree student graduated with the results about the Csn2 protein

5 CONTENTS ( 영문목차 ) Chapter 1. Abstract Chapter 2. Background Chapter 3. Results Chapter 4. Contribution Chapter 5. Accomplishment Chapter 6. Information Chapter 7. Equipment Chapter 8. References - 4 -

6 목 차 제 1 장 연구개발과제의개요 제 2 장 국내외기술개발현황 제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도 제 5 장 연구개발성과및성과활용계획 제 6 장 연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장 연구시설 장비현황 제 8 장 참고문헌 - 5 -

7 제 1 장 연구개발과제의개요 1. 연구개발의목적가. 연구개발의궁극적목표 1) 식중독원인균인 Listeria monocytogenes와같은병원균감염에대한예방및치료를위해기존의항생제를이용한치료법의대안이될수있는 phage 치료법 (phage therapy) 관련원천기술개발. 2) 병원균의 phage 저항체계인 CRISPR-Cas system의작용기작규명을통해병원균의 phage 저항기능약화및 phage 치료법의효능강화연구. 3) 병원균의 phage 저항체계인 CRISPR-Cas system의핵심구성요소인 Cas 단백질을병원균제어의표적물질로서발굴. 나. 연구개발의구체적목표 1) 식중독원인균인 Listeria monocytogenes와같은병원균에존재하는 phage 저항체계인 CRISPR-Cas system의작용기작규명. 2) CRISPR-Cas system의작용기작규명연구에필요한충분한양과높은순도의 Cas 단백질생산법확립. 3) CRISPR-Cas system의핵심구성요소인 Cas 단백질의기능및구조규명. 2. 연구개발의필요성가. 생명산업기술개발로서의필요성 1) L. monocytogenes는식품매개병원균중가장높은치사율을가진세균으로서 L. monocytogenes의감염에의해매년미국에서만 2,500 여건의발병과 500 여건의사망이보고될정도로식품안전에가장큰위협임 (J Microbiol Immunol Infect 40: 4-13 (2007)). 2) L. monocytogenes의치료를위해기존의항생제치료법의대안으로서 bacteriophage 를이용하여병원균을사멸시키는 phage 치료법이상업적으로개발되었으나 (J Food Prot 73: 32-8 (2010)), L. monocytogenes에존재하는 CRISPR (Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats) 라고이름붙여진 phage 저항체계로인해그효과가제한적이며보다큰효과를위해서이 phage 저항체계의무력화가필수적으로요구됨. 3) L. monocytogenes에존재하는 phage 저항체계의구성요소중그기능에핵심적인 - 6 -

8 역할을담당하는물질을신약표적으로서발굴하고연구하며, 이를바탕으로 phage 저항체계를약화시킴으로써 L. monocytogenes 감염에대한치료및예방법으로서 phage 치료법의효능을강화하는것이필요. 나. 높은응용가능성에따른연구개발의필요성 1) phage에대한세균의저항체계인 CRISPR-Cas system을응용하여세균자체내의유전자를외부에서침입한유전물질로인식할수있게한다면고등생물에서 RNAi와같이세균에서유전자발현을조절하는실험적기술로서이용될수있음. 2) 다양한산업현장에서세균이이용되거나최종산물로생산되고있으나, 세균의바이러스에해당하는 phage에의한오염이효율성및생산성제고에커다란장애가되고있으므로, CRISPR-Cas system을연구함으로써세균의면역체계를강화하여감염에대한저항성을높일수있다면세균이용산업에큰도움이될수있음. 3) L. monocytogenes 감염에의한식중독이외에도다양한병원성세균에존재하는 phage 저항체계의약화에이용되어해당병원성세균의억제기작으로서이용될수있음. 다. 학술적필요성 1) phage에대한세균의저항체계인 CRISPR-Cas system은그자체로서생명현상에대한중요한기초연구의대상이며기존에널리알려진세균의방어체계들과는달리한번감염된외부유전물질의일부서열을기억하였다가이를이용하여차후의감염에대응하는일종의획득면역 (acquired immunity) 체계이므로기초연구주제로서의참신성및중요성이더욱높다고할수있음. 2) CRISPR-Cas system은그작용기작에있어서의고등생물 RNAi system과의유사성으로인해더욱주목받고있는연구주제이므로학술적으로도그연구필요성이매우높음 ( 그림 1). 3. 연구개발의범위가. L. monocytogenes의 phage 저항체계연구 1) L. monocytogenes의 phage 저항체계의구성요소인 CRISPR 핵산과 Cas 단백질의생산및정제. 2) L. monocytogenes의 phage 저항체계의핵심구성요소인 Cas 단백질의촉매활성및기능규명. 3) L. monocytogenes의 phage 저항체계의핵심구성요소인 Cas 단백질의삼차원적구조규명및분석

9 나. L. monocytogenes와유사한 phage 저항체계의연구 1) 연구의성공률을높이고위험요소분산을위해 L. monocytogenes와유사한 CRISPR-Cas system을보유한병원균을연구대상으로선정. 2) L. monocytogenes와유사한 CRISPR-Cas system을보유한병원균 phage 저항체계의핵심구성요소인 Cas 단백질의생산. 3) L. monocytogenes와유사한 CRISPR-Cas system을보유한병원균 phage 저항체계의핵심구성요소인 Cas 단백질의기능및삼차원적구조규명. 그림 1. 세균의 phage 저항체계인 CRISPR-Cas system 과고등생물의 RNAi system 의유사 성 (Nature 482: (2012))

제 2 장 국내외기술개발현황 1. 국외관련분야현황가. L. monocytogenes의 phage 치료법관련현황 1) L. monocytogenes의치료를위해기존의항생제치료법의대안으로서 phage를이용하여병원균을사멸시키는 phage 치료법이상업적으로개발되었음 (J Food Prot 73: 32-8 (2010)). 2) phage 치료법을이용한 L.

10 제 2 장 국내외기술개발현황 1. 국외관련분야현황가. L. monocytogenes의 phage 치료법관련현황 1) L. monocytogenes의치료를위해기존의항생제치료법의대안으로서 phage를이용하여병원균을사멸시키는 phage 치료법이상업적으로개발되었음 (J Food Prot 73: 32-8 (2010)). 2) phage 치료법을이용한 L. monocytogenes 감염의치료를위해네델란드 EBI Food Safety 社의 LISTEXTM와미국 Intralytix 社의 ListShieldTM 등총 2종의 phage 상품이개발되어미국 FDA의승인을얻음 ( 출처 : 네델란드 EBI Food Safety 社와미국 Intralytix 社홈페이지 ). 나. 세균의 phage 저항체계로서 CRISPR-Cas system 연구관련현황 1) CRISPR는 bacteria와 archaea의 genome에존재하는특이한 DNA 서열이며, 1987년 Escherichia coli에서처음발견된이후 (J Bacteriol 169: (1987)), 지금까지 genome 서열분석이완료된세균의약 40%, 고세균의약 80% 에서발견되었음. 2) CRISPR는동일한서열의짧은 repeat들과다양한서열을가지는짧은 spacer들로이루어져있는데, repeat들사이사이에 spacer들이하나씩끼워져있는구조이며 cas (CRISPR-associated) 라고이름붙여진 CRISPR에인접한다양한유전자들도발견되었는데 (Mol Microbiol 43: (2002)), 이들은 CRISPR가존재하는미생물 genome에서만선택적으로발견 ( 그림 2). 그림 2. 세균의 phage 저항체계인 CRISPR-Cas system 의모식도 (Nat Rev Genet 11: (2010)). 3) 생물정보학적기술을이용한연구들로부터 CRISPR 의 spacer 들중일부가 phage 의유 전자와동일한염기서열을가지고있다는것이규명되었고 (Microbiology 151: (2005), J Mol Evol 60: (2005), Microbiology 151:

11 (2005)), 이로부터 CRISPR 와 cas 유전자로부터유래한 Cas 단백질들이고등생물의 RNAi 와같이세균에서 phage 에대한저항체계로서기능할것이라는가설로이어짐 ( 그 림 3). 그림 3. CRISPR-Cas system 의작용기작예상도 (Nat Rev Genet 11: (2010)). 4) 세균의 phage 저항체계로서 CRISPR 의기능은 Streptococcus thermophilus 를이용하 여처음으로실험적으로규명되었는데 (Science 315: (2007)), 이연구에서는

12 S. thermophilus 에특정한 phage 를감염시킨후, 이 phage 의유전자서열중의일부가 S. thermophilus 가가지고있는 CRISPR 에 spacer 로서삽입되었음을확인하였고, spacer 가삽입되어 면역화 된 S. thermophilus 는같은종류의 phage 에대해저항성을 가지고있음을실험적으로증명. 5) 이후로다양한세균또는고세균에존재하는 CRISPR-Cas system에관한연구결과가발표되었으며, Cas 단백질의기능및구조에대한연구결과의발표도증가되는추세임 (Nature 482: (2012)). 2. 국내관련분야현황가. L. monocytogenes의 phage 치료법관련현황 1) 다양한병원성세균에침투하여숙주의사멸을유도하는 phage에대한연구는다수의국내연구실에서수행되고있으나세균의 phage 저항체계인 CRISPR에대한연구는상대적으로찾아보기어려움. 2) L. monocytogenes에대한국내연구결과는다수보고되어있으나병원균의 phage therapy와관련된연구는찾기어려우며병원균의 phage 저항체계에대한연구도드문편임. 나. 세균의 phage 저항체계로서 CRISPR-Cas system 연구관련현황 1) 식물병원균인 Xanthomonas oryzae의 genome sequencing 연구등일부국내연구진이주도또는참여한세균의 genome sequencing 연구에서 CRISPR 서열이발견된적이있으나이에대한보다직접적연구는최근까지찾아보기힘듦 (Nucleic Acids Res. 33: (2005)). 2) 최근본연구과제책임자의연구실을비롯하여한국과학기술원오병하교수연구실및전남대학교김정선교수연구실에서 CRISPR-Cas system의핵심구성요소인 Cas 단백질에관한연구가보고되었음 (PLoS One. 7: e33401 (2012), Proteins. 80: (2012), Proteins. doi: /prot (2012), Proteins. 80: (2012))

13 제 3 장 연구개발수행내용및결과 1. L. monocytogenes의 Cas 단백질연구가. L. monocytogenes의 Cas 단백질유전자확보 1) L. monocytogenes의 phage 저항체계인 CRISPR-Cas system에는총 4종의 Cas 단백질들이발견되며그들의이름과특징은다음표1에나열하였음. 표 1. L. monocytogenes 의 Cas 단백질의종류와특징. 종류 Csn1 Csn2 Cas1 Cas2 특징 - CRISPR 핵산을처리하는효소일것으로예상됨. - 특정한종류의 CRISPR-Cas system에만특이적으로존재. - CRISPR의생성에관여할것으로예상됨. - 특정한종류의 CRISPR-Cas system에만특이적으로존재. - nuclease 또는 integrase로예상됨. - 모든 CRISPR-Cas system에존재하는일반적 Cas 단백질. - nuclease로예상됨. - 모든 CRISPR-Cas system에존재하는일반적 Cas 단백질. 2) L. monocytogenes 의 Cas 단백질유전자를확보하기위하여 3 종의 L. monocytogenes strain 들을국내연구자로부터공여받았으며이들을다음표 2 에나열하였음. 표 2. 본연구를위해확보한 L. monocytogenes strain. 확보한 L. monocytogenes strain 종류 L. monocytogenes ATCC L. monocytogenes ATCC L. monocytogenes ATCC 나. L. monocytogenes Csn1 단백질의생산 1) 확보한 3종의 L. monocytogenes strain을대상으로 PCR을수행하여 CRISPR-Cas system의존재유무를확인하는동시에 Csn1 단백질유전자 (4014 bp) 의증폭을시도하였으며아래그림 4에서확인할수있는바와같이 L. monocytogenes ATCC 15315에서만 Csn1 단백질의유전자증폭에성공하였음 (ATCC Lane 2, 3)

monocytogenes ATCC Csn2 단백질유전자가 E. coli에서 Toxic한효과를내기때문인것으로사료됨. 다. L. monocytogenes의 Csn2 단백질의생산 1) 확보한 3종의 L.

14 그림 4. PCR 을이용한 L. monocytogenes Csn1 단백질유전자의증폭. 2) 증폭된 L. monocytogenes ATCC 15315의 Csn2 단백질유전자를 E. coli에서의생산하기위해 E. coli 과다발현용 Vector에 Cloning을시도하였으나 Ligation 반응후에 Transformation된 E. coli colony를찾을수없었음 3) 반복된실험에서도성공적인결과를얻을수없었으며, 이는 L. monocytogenes ATCC Csn2 단백질유전자가 E. coli에서 Toxic한효과를내기때문인것으로사료됨. 다. L. monocytogenes의 Csn2 단백질의생산 1) 확보한 3종의 L. monocytogenes strain 중 Csn1 단백질의증폭에성공한 L. monocytogenes ATCC 15315를대상으로 PCR을수행하여 Csn2 단백질유전자 (696 bp) 의증폭을시도하였으며아래그림 5에서확인할수있는바와같이유전자증폭에성공하였음. 그림 5. PCR 을이용한 L. monocytogenes Csn2 단백질유전자의증폭

site가있는구조를가지는 Construct에 Cloning하였음. 그림 6. E. coli 에서 Csn2 단백질생산을위한 Construct. 3) Coning 후 Sequencing 을통해 Csn2 단백질유전자의서열을확인하였는데, Genome 서열이이미알려진 L.

15 2) 증폭된 Csn2 단백질의유전자를이용하여 E. coli에서 Csn2 단백질의생산을목적으로다음의그림 5와같이 N-terminal에 Hisidine (His)-Maltose binding protein (MBP) tag이있고 Tag과 Csn2 단백질사이에는 Tobacco etch virus (TEV) protease site가있는구조를가지는 Construct에 Cloning하였음. 그림 6. E. coli 에서 Csn2 단백질생산을위한 Construct. 3) Coning 후 Sequencing 을통해 Csn2 단백질유전자의서열을확인하였는데, Genome 서열이이미알려진 L. monocytogenes F6854 strain 과비교할때, 총 6 개아미노산에 차이가있음을발견하였음 ( 그림 7). 그림 7. L. monocytogenes ATCC 및 F6854 Csn2 서열비교 (A) DNA 서열 (B) 아 미노산서열 (C) 상이한아미노산잔기목록. 4) 위와같이서열을확인한 Csn2 단백질의유전자를 IPTG 를이용하여 E. coli 에서과다 발현한후, His-tag 과 Ni-column 의상호작용을이용하는 Affinity chromatography 를 수행하였음 ( 그림 8)

6) 이렇게얻은 Csn2 단백질의 N-terminal tag을제거하기위해 TEV protease를처리하고, 제거된 N-terminal tag과 Csn2 단백질부분을분리하기위해 Ni-column을이용하는 Affinity

16 그림 8. L. monocytogenes Csn2 단백질의첫번째 Affinity chromatography 와 SDS-PAGE 결과. 5) 위의결과에서볼수있는바와같이대부분의 Csn2 단백질이예상대로 Column에결합하였으며 Imidazole gradient를이용하여 Elution에성공하였음. 6) 이렇게얻은 Csn2 단백질의 N-terminal tag을제거하기위해 TEV protease를처리하고, 제거된 N-terminal tag과 Csn2 단백질부분을분리하기위해 Ni-column을이용하는 Affinity chromatography를다시한번수행하였음 ( 그림 9). 그림 9. L. monocytogenes Csn2 단백질의두번째 Affinity chromatography 와 SDS-PAGE 결과. 7) 위에서볼수있는바와같이 TEV protease에의한 N-terminal tag의제거가비교적성공적이었으나상당수의 Csn2 단백질을 N-terminal tag과함께 Elution되었으며, 앞서 Elution된 Csn2도 N-terminal tag이제거되지않은단백질과혼합되어있는상태임을확인하였음

monocytogenes Csn2 단백질이후속실험에필요한정도의충분한양과순도로정제되지않았음을발견하였고, 이는반복적인실험에서도확인됨. 라. L. monocytogenes의 Cas1 단백질의생산 1) 확보한 3종의 L.

17 8) 위에서얻은 Csn2 단백질을 Size-exclusion chromatography 를이용하여보다순수한 형태로정제를시도하였음 ( 그림 10). 그림 10. L. monocytogenes Csn2 단백질의 Size-exclusion chromatography 및 SDS-PAGE 결과. 9) Size-exclusion chromatography 결과로부터 L. monocytogenes Csn2 단백질이후속실험에필요한정도의충분한양과순도로정제되지않았음을발견하였고, 이는반복적인실험에서도확인됨. 라. L. monocytogenes의 Cas1 단백질의생산 1) 확보한 3종의 L. monocytogenes strain을대상으로 PCR을수행하여 Cas1 단백질유전자 (867 bp) 의증폭을시도하였으며아래그림 11에서확인할수있는바와같이 L. monocytogenes ATCC 15315에서만 Cas1 단백질의유전자증폭에성공하였음. 그림 11. PCR 을이용한 L. monocytogenes Cas1 단백질유전자의증폭. 2) 증폭된 Cas1 단백질의유전자를이용하여 E. coli 에서 Cas1 단백질의생산을목적으로

18 다음의그림 12 와같이 N-terminal 에 His-MBP tag 이있고 Tag 과 Csn2 단백질사이에 는 TEV protease site 가있는구조를가지는 Construct 에 Cloning 하였음. 그림 12. E. coli 에서 Cas1 단백질생산을위한 Construct. 3) 위와같이 Cloning 한 Cas1 단백질의유전자를대상으로 E. coli 에서 IPTG 를이용한과 다발현을 Small-scale 로시험하였으며그결과가성공적이었음 ( 그림 13). 그림 13. Cas1 단백질의과다발현시험. 4) 위의실험후, N-terminal tag 과함께 Cas1 단백질을 E. coli 에서과다발현한후, Ni-column 을이용하는 Affinity chromatography 를수행하였음 ( 그림 14). 그림 14. L. monocytogenes Cas1 단백질의첫번째 Affinity chromatography. 5) 위에서볼수있는바와같이대부분의 Cas1 단백질이 Column 에결합하지않고바로 Elution 되었으며, 이는 Cas1 단백질이 Soluble aggregate 로존재하기때문일수있고 이결과로부터발현된 Cas1 단백질이후속실험에적합하지않음을알수있었음

coli 에서 Cas2 단백질의생산을목적으로 다음의그림 16 와같이 His-MBP tag 이있고 Tag 과 Cas2 백질사이에는 TEV protease site 가있는구조를가지는 Construct 에 Cloning 하였음. 그림 16. E.

19 마. L. monocytogenes의 Cas2 단백질의생산 1) 확보한 3종의 L. monocytogenes strain을대상으로 PCR을수행하여 Cas2 단백질유전자 (342 bp) 의증폭을시도하였으며아래그림 15에서확인할수있는바와같이 L. monocytogenes ATCC 15315에서만 Cas2 단백질의유전자증폭에성공하였음. 그림 15. PCR 을이용한 L. monocytogenes Cas2 단백질유전자의증폭. 2) 증폭된 Cas2 단백질의유전자를이용하여 E. coli 에서 Cas2 단백질의생산을목적으로 다음의그림 16 와같이 His-MBP tag 이있고 Tag 과 Cas2 백질사이에는 TEV protease site 가있는구조를가지는 Construct 에 Cloning 하였음. 그림 16. E. coli 에서 Cas2 단백질생산을위한 Construct. 3) 위와같이 Cloning 한 Cas2 단백질의유전자를대상으로 E. coli 에서 IPTG 를이용한과 다발현을 Small-scale 로시험하였으며그결과가성공적이었음 ( 그림 17). 그림 17. Cas2 단백질의과다발현시험

20 4) 위의실험후, N-terminal tag 과함께 Cas1 단백질을 E. coli 에서과다발현한후, His-tag 과 Ni-column 의상호작용을이용하는 Affinity chromatography 를수행하였음 ( 그림 18). 그림 18. L. monocytogenes Cas1 단백질의첫번째 Affinity chromatography. 5) Cas1 단백질과마찬가지로대부분의 Cas2 단백질이 Column에결합하지않고바로 Elution되었으며, 이는 Cas2 단백질이 Soluble aggregate로존재하기때문일수있고이결과로부터발현된 Cas2 단백질이후속실험에적합하지않음을알수있었음. 바. L. monocytogenes의 Cas 단백질연구의결론 1) 총 4종의 L. monocytogenes의 Cas 단백질중 ( 표 1) Csn1 단백질의유전자는위의 E. coli 과다발현용 construct의생산에실패하였고, 나머지 3종 (Csn2, Cas1, Cas2) 의 Cas 단백질의경우 E. coli 과다발현용 construct의생산에는성공하였으나그로부터 Cas 단백질의구조및기능연구에필요한충분한양과순도의단백질을생산하는데실패하였음 3) 이와같은결과들을바탕으로당초연구계획서상대안으로서제안하였던대로 L. monocytogenes는아니지만 L. monocytogenes의 Cas 단백질들과유사한 Cas 단백질들을보유한또다른병원성세균을대상으로연구를진행하기로결정함. 2. Listeria innocua의 Cas 단백질연구가. 대안으로서의 L. innocua의 Cas 단백질연구 1) L. innocua는 L. monocytogenes와같은속 ( 屬, genus) 에속하는세균으로 L. monocytogenes와의비교유전체연구로부터유사한 CRISPR-Cas system을보유한것

이규명되었으므로대안으로서연구하기로결정함 (BMC genomics. 11: 688 (2010)). 2) L. inocua의 Cas단백질유전자를확보하기위하여 2종의 L. inocua strain들을국내연구자로부터공여받았으며이들을대상으로 PCR을수행하여L. inocua Csn1 단백질유전자 (4005 bp) 의증폭을시도하였으나실패하였음. 그림 19.

21 이규명되었으므로대안으로서연구하기로결정함 (BMC genomics. 11: 688 (2010)). 2) L. inocua의 Cas단백질유전자를확보하기위하여 2종의 L. inocua strain들을국내연구자로부터공여받았으며이들을대상으로 PCR을수행하여L. inocua Csn1 단백질유전자 (4005 bp) 의증폭을시도하였으나실패하였음. 그림 19. PCR 을이용한 L. inocua Csn1 단백질 유전자의증폭시도. 3) 이로부터공여받은 2 종의 L. inocua strain 들에는 CRISPR-Cas system 이존재하지 않음을결론내리고, 다른종류의병원성세균을대상으로연구를진행하기로결정함. 3. Streptococcus pyogenes의 Cas 단백질연구가. 대안으로서의 S. pyogenes의 Cas 단백질연구 1) S. pyogenes는우리말로화농성연쇄상구균이라고하며감염에의해다양한염증성질환을일으키는병원균임. 2) S. pyogenes는 L. monocytogenes와같은속 ( 屬, genus) 은아니지만유사한 Cas 단백질들을보유하고있으며 ( 표 3), phage 저항체계로서 CRISPR-Cas system의기능이처음연구된 Streptococcus thermophilus와같은속 ( 屬, genus) 이므로연구대상으로선정. 표 3. L. monocytogenes와 S. pyogenes Cas 단백질의비교. 종류 L. monocytogenes S. pyogenes Sequence identity Csn aa 1368 aa 44.4 % Csn2 231 aa 220 aa 58.6 % Cas1 288 aa 289 aa 68.1 % Cas2 113 aa 113 aa 74.3 %

22 3) 지금까지발견된세균및고세균의 CRISPR-Cas system은 Cas 단백질의유사성, CRISPR-Cas system의구성요소, CRISPR의 Repeat 서열등을종합적으로고려하여다양한 Type 및 Subtype으로분류할수있는데 ( 그림 20), 같은 Type 및 Subtype으로분류되는 CRISPR-Cas system은그종이나속에상관없이매우유사한것으로결론지을수있음 (Nat Rev Microbiol 9: (2011)). 그림 20. CRISPR-Cas system 의 Type 및 Subtype 들 (Nat Rev Microbiol 9: (2011)). 4) 연구대상인 L. monocytogenes와 S. pyogenes의 CRISPR-Cas system은모두 Type II의 Subtype II-A에속하며, 매우유사한특성을가지고있음을 JCVI-CMR (J. Craig Venter Institute-Comprehensive Microbial REseource) 의 Genome Properties Report에서도알수있음 ( 그림 21)

그림 21. L. monocytogenes 와 S. pyogenes CRISPR-Cas system 들의유사성 (http://cmr.jcvi.org). 5) L. monocytogenes 와 S. pyogenes 의 Cas 단백질들은각각동일한단백질 Family 또 는 Superfamily 에속함이규명되었음 ( 표 4) 표 4. L. monocytogenes와 S.

23 그림 21. L. monocytogenes 와 S. pyogenes CRISPR-Cas system 들의유사성 ( 5) L. monocytogenes 와 S. pyogenes 의 Cas 단백질들은각각동일한단백질 Family 또 는 Superfamily 에속함이규명되었음 ( 표 4) 표 4. L. monocytogenes와 S. pyogenes Cas 단백질이속하 는단백질 Family 또는 Superfamily (Nat Rev Microbiol 9: (2011)). L. monocytogenes S. pyogenes Csn1 COG3513 COG3513 Csn2 Spy1049-like Spy1049-like Cas1 COG1518 COG1518 Cas2 COG3512 COG3512 6) 또한, Bacillus halodurans Csn2 및 Streptococcus agalactiae Csn2 단백질에대한연구결과로부터이들 Cas 단백질들이다른속 ( 屬, genus) 에속하는세균들로부터유래한것임에도불구하고그기능과구조가매우유사함이증명되었고이는같은 Type 또는 Subtype의 CRISPR-Cas system에속하는 Cas 단백질들은다른속의세균으로부터유래했음에도서로매우유사할수있음을보여주는중요한예임 (J Biol Chem. 286: (2011); J Struct Biol. 178: (2012)) 7) 위의사항들을종합적으로고려할때, L. monocytogenes와 S. pyogenes는매우유사한 CRISPR-Cas system을보유하고있으며, 그들의 Cas 단백질들도또한유사할것으로결론지을수있으며, 따라서 L. monocytogenes Cas 단백질연구에대한대안으로서 S. pyogenes Cas 단백질을연구하는것이타당하다고사료됨

coli에서의과다발현에적합한 construct로제작하였고, 이중 Csn2 단백질을그구조및기능연구에필요한충분한양과순도로생산하는데성공 3) S.

24 나. S. pyogenes의 Csn2 단백질의생산 1) S. pyogenes의 Cas 단백질생산을위해 S. pyogenes M1 GAS strain의 genomic DNA로부터총 4종의 Cas 단백질에대한유전자모두를 PCR을이용한증폭을통해확보하는데성공 2) 확보한총 4종의유전자중 Csn1 유전자를제외한 3종의 Cas 단백질유전자 (Csn2, Cas1, Cas2) 를 E. coli에서의과다발현에적합한 construct로제작하였고, 이중 Csn2 단백질을그구조및기능연구에필요한충분한양과순도로생산하는데성공 3) S. pyogenes Csn2 단백질은 N-terminal의 His-MBP tag을이용한 affinity chromatography, TEV protease를이용한 His-MBP tag의분리, gel filtration chromatography의 3단계로이루어진분리및정제법을통해생산하였으며그순도와양을다음의 Size-exclusion chromatography과 SDS-PAGE 결과로판단가능하였음 ( 그림 22) 그림 22. S. pyogenes Csn2 단백질의 Size-exclusion chromatography 과 SDS-PAGE 결과. 다. S. pyogenes 의 Csn2 단백질의구조및기능규명 1) 정제한 S. pyogenes Csn2 단백질로부터 X- 선결정학을통한구조규명에필수적인 단백질결정을획득하였음 ( 그림 23). 그림 23. S. pyogenes Csn2 단백질결정들

pyogenes Csn2단백질은음전하를가진 double-stranded DNA와의결합할가능성이높다고유추가능. 6) 이로부터 Csn2 단백질이이중나선 DNA와결합할가능성이높다는것을인식하게되었으며 S.

25 4) 위에서얻어진결정으로부터 X- 선결정학을이용하여 S. pyogenes Csn2 단백질의결 정구조를규명 ( 그림 24). 그림 24. S. pyogenes Csn2 단백질의결정구조 5) S. pyogenes Csn2 단백질은 tetramer로서가운데가비어있는다이아몬드모양의 ring 구조를가지고있는데 ring의내경 (inner diameter) 이 DNA 이중나선을수용할수있을만큼의크기이고 ring의내부표면에양전하가존재함이예상되었으므로, S. pyogenes Csn2단백질은음전하를가진 double-stranded DNA와의결합할가능성이높다고유추가능. 6) 이로부터 Csn2 단백질이이중나선 DNA와결합할가능성이높다는것을인식하게되었으며 S. pyogenes Csn2 단백질과이중나선 DNA의결합을확인하기위한 electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 를수행하여 S. pyogenes Csn2 단백질이이중나선 DNA와비특이적으로결합함을실험적으로확인하였음 ( 그림 25). 그림 25. S. pyogenes Csn2 단백질 의비특이적이중나선 DNA 결합성

26 7) S. pyogenes Csn2 단백질의비특이적이중나선 DNA 결합성규명을통해이단백질이 CRISPR-Cas system의 phage 저항작용에있어서 phage DNA의 CRISPR 삽입또는재침입한 phage DNA의파괴등중요한 phage 저항단계에서작용할것임을예상할수있음

27 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도 1. 목표달성도 가. 연구개발의목표및내용 1) 당초연구계획서상의연구개발의목표및내용을다음표 5 에나열하였음. 표 5. 연구계획서상의연구개발의목표및내용. 구분연도연구개발의목표연구개발의내용 1 차년도 2011 phage 저항체계의구성요소생산 Cas 단백질의특성분석및신약표적으로서발굴 L. monocytogenes 의 Cas 단백질과유사한 단백질연구 - L. monocytogenes 또는 L. monocytogenes의 genomic DNA 확보 - L. monocytogenes 또는 L. monocytogenes의 genomic DNA로부터 CRISPR DNA 및 cas 유전자 cloning - 다양한형태 (double-stranded, single-stranded, hybrid) 의 L. monocytogenes CRISPR 핵산 (DNA 및 RNA) 생산 - L. monocytogenes의 Cas 단백질을대장균에서과다발현 - 과다발현된 L. monocytogenes의 Cas 단백질을분리및정제 - L. monocytogenes Cas 단백질과 CRISPR 핵산의결합여부규명 - L. monocytogenes Cas 단백질의 CRISPR 핵산을기질로한효소활성규명 - L. monocytogenes Cas 단백질의삼차원적구조규명및분석 - L. monocytogenes Cas 단백질의구조분석을통한기능예측 - L. monocytogenes Cas 단백질을신약표적물질로선정 - L monocytogenes 의 Cas 단백질과유사한단백질생산 - L. monocytogenes 의 Cas 단백질과유사한단백질구조규명 2) 연구의성공률을높이고위험요소분산을위해 L. monocytogenes와유사한 CRISPR-Cas system을보유한병원균에대해서도동시에연구를진행하기로당초연구계획서상에기술하였으며연구수행중의결과에따라대안으로서제안하였던대로 L. L. monocytogenes의 Cas 단백질들과유사한 Cas 단백질들을보유한또다른병원성

28 세균인 S. pyogenes 를대상으로연구를진행하여목표를달성하였음. 나. 평가의착안점및기준 1) 당초연구계획서상의평가의착안점및기준을다음표 6 에나열하였음. 표 6. 연구계획서상의평가의착안점및기준. 평가의착안점및기준 비중 CRISPR 및 cas 유전자 cloning 성공여부 10 % CRISPR 핵산의생산성공여부 15 % Cas 단백질들의발현, 분리및정제성공여부 25 % Cas 단백질의기능규명여부 20 % Cas 단백질들의분자구조규명여부 30 % 2) 앞서기술한바와같이 S. pyogenes CRISPR-Cas system을대상으로위와같은기준을적용할수있을것으로사료됨. 다. 연구목표및평가착안점에입각한연구개발목표의달성도 1) 당초연구계획서상의연구목표및평가착안점에입각하여다음과같이연구개발목표의달성도를산출함 ( 표 7). 표 7. 연구개발목표의달성도. 평가의착안점및기준 비중 달성도 내용 CRISPR 및 cas 유전자 L. monocytogenes와 S. pyogenes의 10 % 100 % cloning 성공여부 CRISPR 및 4종의 cas 유전자확보성공 CRISPR 핵산의생산 L. monocytogenes와 S. pyogenes의 15 % 100 % 성공여부 CRISPR 핵산의이중나선 DNA 생산성공 Cas 단백질들의발현, 분리및정제성공여부 25 % 90 % S. pyogenes의 Csn2 단백질의생산성공 Cas 단백질의기능 S. pyogenes의 Csn2 단백질의비특이적 20 % 100 % 규명여부이중나선 DNA 결합성및칼슘결합성규명 Cas 단백질들의분자 S. pyogenes의 Csn2 단백질의삼차원적 30 % 100 % 구조규명여부구조규명및분석성공 S. pyogenes의 Csn2 단백질의생산에 합계 100 % 97.5 % 성공하였으나 L. monocytogenes Cas 단백질의생산은성공하지못하였으므로세번째평가착안점에 10 % 달성도를감함

29 2. 관련분야기여도가. 병원균의 phage 치료법관련기여도 1) 감염에의해다양한염증성질환을일으키는병원균인 S. pyogenes의 phage 저항체계연구를통해해당병원균의방제및치료법개발에직접또는간접적으로기여할수있을것으로예상. 2) 그구조가밝혀진 S. pyogenes의 Csn2 단백질을표적으로하는저분자약물이개발된다면그기능을약화시키는것이가능하고, 결과로서 S. pyogenes의 phage 저항기능이약화되므로병원균사멸의한방법이될수있음. 나. CRISPR-Cas system의작용기작규명기여도 1) Csn2 단백질이비특이적이중나선 DNA 결합성을보유하고있음일규명함으로써이단백질이 CRISPR-Cas system의 phage 저항작용에있어서 phage DNA의 CRISPR 삽입또는재침입한 phage DNA의파괴등중요한 phage 저항단계에서작용할것임을제시하고있고이는 CRISPR-Cas system의작용기작규명에기여할수있음. 2) S. pyogenes의 Csn2 단백질이 tetramer로존재하며가운데가비어있는다이아몬드모양의 ring 구조를가지고있고 ring의내부표면에양전하가존재함을규명함으로써이러한특성들이다양한세균에존재하는 Csn2 단백질의공통된특성임을확인

30 제 5 장 연구개발성과및성과활용계획 1. 연구개발성과가. 연구성과목표대비연구개발성과 1) 당초연구계획서상의연구성과목표와이에대비하여실제연구개발성과를다음의표 8에나열하였음. 표 8. 연구성과목표와연구개발성과대비표. 구분 출원 특허 등록 신품종품종생산품종품종보호명칭등록수입판매신고출원등록 생명정보등록및기탁 목표 1 1 성과 2 1 달성도 200 % 100 % SCI 논문 비 SCI 기타 2) 위의표에나열한연구성과는아래표 9 에상술하였음. 표 9. 연구개발성과내용. 성과구분내용생명정보등록및기탁 Protein Data Bank에단백질구조정보등록 (ID: 3TOC) 생명정보등록및기탁 Protein Data Bank에단백질구조정보등록 (ID: 3V7F) Crystal structure of Streptococcus pyogenes Csn2 reveals 논문 (SCI) calcium-dependent conformational changes in its tertiary and quaternary structure, PLoS One. 2012; 7(3):e33401 나. 기타연구개발성과 1) 당초연구계획서상의연구성과목표에제시하지않았지만본연구과제와관련된성과 를아래표 10 에나열하였음. 표 10. 기타연구개발성과내용. 성과구분 국내학술대회발표 국제학술대회발표 연구인력양성 내용한국구조생물학회학술대회 / /Crystal Structure of Streptococcus pyogenes Csn2 Reveals Calcium-Dependent Conformational Changes in Its Tertiary and Quaternary Structure 미국세포생물학회학술대회 / /Crystal Structure of Streptococcus pyogenes Csn2 protein, a component of CRISPR-mediated bacterial immune system 농학석사 / / 서울대학교농생명공학부

31 2. 성과활용계획가. 추가연구및타연구에활용계획 1) S. pyogenes Csn2 단백질의생산및특성분석연구를통해얻어진노하우를활용하여 S. pyogenes의다른 Cas 단백질들에대한기능및구조연구도수행하고자계획중임. 2) S. pyogenes Cas 단백질들간의상호작용및복합체형성여부와이에따른구조및기능적특성등도분석하고자함

제 6 장 연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 1. 해외연구정보가. Csn2 단백질관련해외연구정보 1) 독일연구그룹에서 Streptococcus agalactiae Csn2 단백질에관한연구논문을발표 (J Struct Biol. 178:350-62 (2012)). 2) 이논문에서저자들은 S.

32 제 6 장 연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 1. 해외연구정보가. Csn2 단백질관련해외연구정보 1) 독일연구그룹에서 Streptococcus agalactiae Csn2 단백질에관한연구논문을발표 (J Struct Biol. 178: (2012)). 2) 이논문에서저자들은 S. agalactiae Csn2 단백질의삼차원적구조와비특이적이중나선 DNA 결합성을규명하였으며이는본연구진의연구결과와대동소이함. 3) 이논문에서한가지특이할만한사항은저자들이 molecular dynamics simulation을통해제안한 S. agalactiae Csn2 단백질의아중나선 DNA 결합방식으로기존에제시되었던 Csn2 tetramer의중앙 ring을통하여결합하는것이외의 ring 바깥쪽과결합하는방식도제안함 ( 그림 26). 그림 26. 독일연구진이제안한 Csn2 단백질의두가 지가능한이중나선 DNA 결합방식 (J Struct Biol. 178: (2012))

33 제 7 장 연구시설장비현황 본연구과제는연구시설및장비도입이불가한사업으로해당사항없음

34 제 8 장 참고문헌 1. J Microbiol Immunol Infect 40: 4-13 (2007) 2. J Food Prot 73: 32-8 (2010) 3. Nature 482: (2012) 4. J Bacteriol 169: (1987) 5. Mol Microbiol 43: (2002) 6. Nat Rev Genet 11: (2010) 7. Microbiology 151: (2005) 8. J Mol Evol 60: (2005) 9. Microbiology 151: (2005) 10. Science 315: (2007) 11. Nucleic Acids Res. 33: (2005) 12. PLoS One. 7: e33401 (2012) 13. Proteins. 80: (2012) 14. Proteins. doi: /prot (2012) 15. Proteins. 80: (2012) 16. BMC genomics. 11: 688 (2010) 17. Nat Rev Microbiol 9: (2011) 18. J Biol Chem. 286: (2011) 19. J Struct Biol. 178: (2012)

농림축산식품부장관귀하 본보고서를 미생물을활용한친환경작물보호제및비료의제형화와현장적용매뉴 얼개발 ( 개발기간 : ~ ) 과제의최종보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 고려바이오주식회사 ( 대표자 ) 김영권 (

농림축산식품부장관귀하 본보고서를 미생물을활용한친환경작물보호제및비료의제형화와현장적용매뉴 얼개발 ( 개발기간 :2014. 7. 29 ~ 2016. 7. 28.) 과제의최종보고서로제출합니다. 2016. 7. 28. 주관연구기관명 : 고려바이오주식회사 ( 대표자 ) 김영권 ( 인 ) 협동연구기관명 : 목원대학교산학협력단 ( 대표자 ) 고대식 ( 인 ) 협동연구기관명