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본승 운
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1 Appl. Chem. Eng., Vol. 24, No. 5, October 2013, Original article 이주협 마진열 * 김진철 강원대학교의생명과학대학생명공학연구소, * 한국한의학연구원신한방제제연구센터 (2012 년 10 월 23 일접수, 2012 년 12 월 7 일심사, 2013 년 7 월 8 일채택 ) The Preparation and Release Property of Alginate Microspheres Coated Gelatin-cinnamic Acid Ju Hyup Lee, Jin Yeul Ma*, and Jin-Chul Kim College of Biomedical Science and Institute of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Gangwon-do , Korea *Center for Herbal Medicine Improvement Research, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon , Korea (Received October 23, 2012; Revised December 7, 2012; Accepted July 8, 2013) 이연구는젤라틴 - 신남산접합체를알긴산나트륨마이크로스피어에코팅하여광민감성마이크로스피어를제조하여광민감성을관찰하였다. 광민감성마이크로스피어는 W/O (water-in-oil) 에멀젼법을이용하여알긴산나트륨마이크로스피어를만든후젤라틴 - 신남산접합체를알긴산나트륨마이크로스피어표면에코팅시켜제조하였다. 젤라틴 - 신남산접합체의합성은젤라틴의아미노그룹과신남산의카복실그룹사이의아미드화반응으로결합하였다. 알긴산나트륨마이크로스피어표면의젤라틴 - 신남산접합체의코팅은 SEM-EDS 의결과로확인하였다. 또한형성된접합체에결합된신남산의흡광도를측정하여알긴산나트륨 1 g 당젤라틴 - 신남산접합체가 0.13 g 이코팅된것을확인했다. 코팅된마이크로스피어를 SEM 을통해마이크로스피어의크기가 10 µm 인것을확인했다. 광민감성의관찰을위해 365 nm 와 254 nm 파장의자외선을조사하여이량화정도를측정한결과이량화정도가 49% 와 28% 였다. 마이크로스피어의방출경향을관찰하기위해모델약물로 FITC-dextran 을사용하여알긴산나트륨마이크로스피어에봉입하여방출실험을진행하였고그결과약 42% 의 FITC-dextran 이방출되었다. 결과적으로젤라틴 - 신남산접합체가코팅된마이크로스피어는광반응성을가지는약물전달체로사용될수있을것이다. This study is about photosensitive microspheres prepared by coating alginate microspheres with gelatin-cinnamic acid conjugate. Firstly, alginate microspheres was prepared in water-in-oil (W/O) emulsion and then they were coated with gelatin-cinnamic acid conjugate. Herein, gelatin-cinnamic acid conjugate is obtained by the amidation between an amine group of gelatin and a carboxy group of cinnamic acid. Cinnamic acid is widely used as a photo-responsive material easy to dimerize and dedimeriz under UV irradiation at λ = 254 nm and λ = 365 nm, respectively. As shown in SEM-EDS, alginate was successfully coated with gelatin-ciannmic acid. By determining the absorbance of coated microspheres at 270nm, the amount of cinnamic acid per microspheres was 0.13/1. The SEM photos showed the size of coated microspheres is around 10 µm. And the degrees of dimerization and dedimerization were calculated to be 49% and 23% respectively. Then the release of FITC-dextran from the coated micrspheres was studied and release the degree was 42%. As a result, the coated microspheres have potential to be used as a photo-responsive drug carrier to delivery drugs. Keywords: alginate microspheres, gelatin, Cinnamic acid, photo sensitivity 1) 1. 서론 생체적합성고분자는생체내무독성을나타내어경구투여를위한약물전달시스템에널리사용되고있으며, 그중알긴산나트륨과젤라틴은구강약물전달시스템에적합한물질로광범위하게이용된다 [1]. Corresponding Author: Kangwon National University College of Biomedical Science and Institute of Bioscience and Biotechnology 1 Kangwondaehak-gil, Chuncheon, Gangwon-do , Korea Tel: jinkim@kangwon.ac.kr pissn: 2013 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 알긴산나트륨은해조류에서추출된천연고분자로 B-D-mannuronic acid 과 a-l-glucuronic acid 등두종류의 uronic acid를포함한다 [2]. 알긴산나트륨을증류수에녹이면점성을가지는액체가되고 Ca 2+, Sr 2+ 또는 Ba 2+ 같은다가금속을첨가했을때금속이온과 guluronic acid의 sodium ion 사이의이온결합에의한겔화 (gelation) 및가교화를통해입자가형성된다 [3]. 알긴산나트륨은모체내에상대적으로소수성의물질을포접할수있고실온에서유기용매를포함하고, 다공성으로높은발산력을가진다. 알긴산나트륨의이러한특징으로인해다양한단백질이나세포등을포접하는모체로서사용될수있다 [4,5]. 다양한분야에서연구되고있는젤라틴은비교적낮은농도와낮은온도에서점성을나타내며, 젤라틴용액이냉각될때탄력성있는열 471

2 472 이주협 마진열 김진철 가역적겔을형성해미세캡슐의피복물질로도사용되고있다 [6-12]. 광민감성약물전달체의표면에리간드를수식하여표적지향적전달체로사용될수있고표적에도달하여약물을방출을조절할수있는장점을가지고있어이에관한연구가필요하다 [13]. 기존연구에서는광민감성을부여하기위해서쿠마린, 아조벤젠, 살리실산, 칼콘등여러물질들이사용되어왔으나알긴산나트륨마이크로스피어에도입하기가쉽지않다. 신남산은 cinnamate group을갖는대표적인광민감성물질중하나로, 카복실기와이중결합을포함하고있어 UV조사시, 이중결합의첨가환원에의해광반응성이관찰되고카복실기에의해 ph 반응성을나타낼수있다 [14]. 온도, ph 등의자극민감성알긴산나트륨마이크로스피어에관한연구는기존에많이이루어져있지만광민감성알긴산나트륨마이크로스피어에관한연구는거의이루어져있지않다. 따라서본연구에서는젤라틴의아미노그룹과신남산의카복실그룹의아미드화결합을통하여젤라틴- 신남산접합체를제조하고젤라틴과알긴산나트륨의정전기적상호작용을이용하여알긴산나트륨마이크로스피어에젤라틴-신남산접합체를코팅함으로써광민감성알긴산나트륨마이크로스피어를제조하였다. 기존에연구된알긴산나트륨마이크로스피어에관한연구에서는코팅을통한방출실험이충분히이루어지지않았다. 따라서 UV조사에따른젤라틴-신남산접합체의이량화를통한알긴산나트륨미립구의크기가감소하여팽윤도에영향을줄것이라추정된다. 본연구에서는알긴산나트륨마이크로스피어에젤라틴-신남산접합체의코팅을이용한광 (UV), 반응성접합체의팽윤도관찰및방출실험을진행하였다. 2. 실험 2.1. 재료및시약젤라틴 (Gelatin type B), 트랜스신남산 (Trans-cinnamic acid), 알긴산나트륨 (Sodium alginate), span80, paraffin oil, isopropanol, cyclohexane, fluorescein isothiocyante (FITC-dextran, M.W 10000), 수산화나트륨 (Sodium hydroxide) 은 Sigma (st. louis, mo, USA) 에서구입하였다. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), 염화칼슘 (Calcium chloride) 은대정 (Dae Jung chemicals & metals co. ltd, Korea) 에서구입하였고, 글라이신 (Glycine) 은 (Bio basic inc, Canada) 에서구입하였다. Phosphate Buffered Saline (PBS) 은 Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc, USA) 에서구입하였다 젤라틴 -신남산접합체의합성 1 M의수산화나트륨용액 (20 ml) 에 0.34 g의트랜스신남산을용해하고 ph를 8로조정하였다. 60 ml PBS (30 mm) 용액에 EDC (4.4 g) 를첨가한후트랜스신남산이용해되어있는용액에첨가하여 30 min간 4 에서교반하였다. 젤라틴 (5 g) 이용해되어있는 50 ml의 PBS (30 mm, ph 7.4) 에트랜스신남산과 EDC 용액에첨가한후 35 에서 24 h 동안교반하였다. Dialysis membrane (Spectra/Por Cellulose Ester Membrane, M.W.C.O 3000) 에젤라틴 -신남산접합체혼합용액을넣고 3일간증류수로투석하였다. 초저온냉동고 (-76 ) 에 24 h 보관후 3일간동결건조하였다 (FD-5508, Illshin)[15]. (Bruker Advance 400spectrometer (400 MHz), Karlsruhe, Germany, in the Central Laboratory Center of Kangwon National University) 을이용하여분석하였다 알긴산나트륨마이크로스피어제조알긴산나트륨수용액 5% (w/v) 를제조하여파라핀오일 (2% v/v 스판 80) 을알긴산나트륨과 1 : 4 비율로첨가한후, 균질기 (RPM 8000, Heidolph Elektro, DE/DIAX900) 로 2 h 교반하여 W/O (water-in-oil) 에멀젼을제조하였다. 염화칼슘을아이소프로판올에 5% (w/v) 로녹인후 2 ml/min으로에멀젼에투여하고 30 min간더교반하였다. 교반후마이크로스피어를거름종이로필터후사이클로헥센으로 3번세척하여파라핀오일을제거하고 24 h 동안동결건조하였다 [16] 알긴산나트륨마이크로스피어의젤라틴- 신남산접합체로의코팅제조된젤라틴-신남산접합체를 1% (w/v) 로증류수에용해시킨후 ph를 3.5로조정하였다. 젤라틴-신남산접합체가용해되어있는용액에알긴산나트륨마이크로스피어 1% (w/v) 를넣고 24 h 동안롤러믹서에교반하였다. 원심분리기 (NB-550, N-BIOTEK CO, LTD.) 로원심분리한후 ph 3.5 용액으로 5회세척하여동결건조하였다 젤라틴- 신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의팽윤실험젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의팽윤효율을측정하기위하여, UV를조사하지않은알긴산나트륨마이크로스피어, 254 nm UV에서 6 h 조사한알긴산나트륨마이크로스피어, UV를조사하지않은젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어, 254 nm UV에서 6 h 조사한젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어를제조하였다. 0.5 g의알긴산나트륨마이크로스피어를 10 ml ( 글라이신완충용액 30 mm, ph 3.5) 에넣고시간별로측정하였다. 팽윤효율은다음과같은식으로계산하였다 [17]. 팽윤효율 (%) = 팽윤된알긴산나트륨마이크로스피어의무게 - 알긴산나트륨아미크로스피어무게 알긴산나트륨마이크로스피어의무게 젤라틴- 신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의방출실험젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의방출정도를측정하기위하여, 254 nm UV를 6 h 조사한알긴산나트륨마이크로스피어 50 mg, 젤라틴 -신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어 50 mg, UV을조사하지않은알긴산나트륨마이크로스피어 50 mg, UV (λ = 254 nm) 를 6 h 조사한젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어 50 mg에 2 mg/ml의 FITC-dextran 용액을각각 2 ml씩넣고 24 h 동안롤러믹서에교반한후 50 ml ( 글라이신완충용액 30 mm, ph 3.5) 에방출을진행하였다. 봉입효율은다음과같은식으로계산하였다 [18] 젤라틴 -신남산접합체의합성확인건조된젤라틴- 신남산접합체는 D 2O에용해시킨후 1 H-NMR spectrum 공업화학, 제 24 권제 5 호, 2013

473 Figure 1. Microscopes pictures of gelatin-cinnamic acid conjugates coated microparticles. Figure 3.

4 ppm에서신남산의아로마틱링 (aromatic ring) 이 (b) 1.2 ppm에서라이신, 나타나는것으로젤라틴에신남산이아미드화결합으로합성된것을확인하였다. 합성된젤라틴-신남산접합체의흡광도를순수한신남산의흡광표준곡선 (Y = 0.1294-0.

신남산, 젤라틴 -신남산접합체의이량화도 (Dimerization Degree) 측정 Figure 2는 UV의조사에따른신남산과젤라틴-신남산접합체의이량화도를측정한결과이다.

이후 λ = 254 nm의 UV를 10 min 간조사했을때, 신남산과젤라틴-신남산접합체의이량화도는각각 38% 와 29% 로감소하여신남산의탈이량화 (dedimerization) 현상을확인 Figure 4.

3 473 Figure 1. Microscopes pictures of gelatin-cinnamic acid conjugates coated microparticles. Figure 3. Dimerization of cinnamic acid, cinnamic acid-gelatin conjugates. Figure 2. 1 H-NMR spectrum of gelatin-cinnamic acid conjugates. 3. 결과및고찰 3.1. 젤라틴 -신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의고분자합성및구조분석 Figure 1의 1 H-NMR에서의피크를관찰하면 (a) 7.4 ppm에서신남산의아로마틱링 (aromatic ring) 이 (b) 1.2 ppm에서라이신, 나타나는것으로젤라틴에신남산이아미드화결합으로합성된것을확인하였다. 합성된젤라틴-신남산접합체의흡광도를순수한신남산의흡광표준곡선 (Y = ) 에대입하여결합된신남산의양을계산한결과, 젤라틴한유닛당아미노그룹 36.8개중 8개의아미노그룹에신남산이결합한것을확인할수있었다 신남산, 젤라틴 -신남산접합체의이량화도 (Dimerization Degree) 측정 Figure 2는 UV의조사에따른신남산과젤라틴-신남산접합체의이량화도를측정한결과이다. λ = 365 nm의 UV를 60 min 동안조사하였을때, 신남산의초기이량화도는 59% 였으며, 젤라틴-신남산접합체의초기이량화도는 47% 였다. 이후 λ = 254 nm의 UV를 10 min 간조사했을때, 신남산과젤라틴-신남산접합체의이량화도는각각 38% 와 29% 로감소하여신남산의탈이량화 (dedimerization) 현상을확인 Figure 4. SEM-EDS analysis of alginate microspheres, SED-EDS analysis of gelatin-cinnamic acid conjugates coated alginate microspheres. 하였다. 이와같은실험을 5회반복하여, 신남산과젤라틴-신남산의접합체의이량화도와탈이량화도가일정하게유지되는것을확인하였다 젤라틴- 신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의확인 Figure 3은젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어를광학현미경 ( 400배율 ) 으로관찰한결과이다. 마이크로스피어의크기는평균 10 µm였으며, 구형태를나타내고있다. Figure 4 에서의 SEM-EDS 결과는코팅이되지않은알긴산나트륨마이크로스피어와젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의구성원소의차이를나타낸다. 알긴산나트륨은탄소 (C), 수소 (H), 산소 (O) 로구성되어있어 SEM-EDS 결과에서알긴산나트륨의 Appl. Chem. Eng., Vol. 24, No. 5, 2013

4 474 이주협 마진열 김진철 Figure 6. Release properties gelatin-cinnamic acid conjugates coated alginate microsphere, Release properties alginate microspheres. Figure 5. Swelling ratio of alginate microsphere, Swelling ratio of gelatin-cinnamic acid conjugates coated alginate microspheres. 탄소, 수소, 산소와가교제로쓰인칼슘 (Ca) 과염소 (Cl) 이나타났다. Figure 4 에서의 SEM-EDS 는젤라틴- 신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의 SEM-EDS 결과에서는탄소, 수소, 산소와가교제로쓰인칼슘과염소이외에질소 (N) 가나타났다. 이는젤라틴의아미노그룹이나타난것으로성공적으로알긴산나트륨마이크로스피어에젤라틴-신남산접합체가코팅된것을알수있다 알긴산나트륨마이크로스피어의팽윤효율 Figure 5는 UV조사에따른알긴산나트륨마이크로스피어와젤라틴- 신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의팽윤효율을측정한결과이다. Figure 5 에서 254 nm UV를 6 h 조사전알긴산나트륨마이크로스피어의팽윤효율은 40% 였고, 254 nm UV를 6 h 조사한후팽윤효율은 42% 였다. Figure 5 에서 254 nm UV를 6 h 조사전젤라틴-신남산접합체로코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의팽윤효율은 60% 였고, 254 nm UV를 6 h 조사후팽윤효율은 30% 였다. 젤라틴-신남산접합체가다공성의알긴산나트륨마이크로스피어에코팅되어알긴산나트륨마이크로스피어의공극을막아팽윤효율이더높게나타났다. 254 nm UV를 6 h 조사한후에는코팅된젤라틴- 신남산접합체가이량화되어막았던다공성의알긴산나트륨마이크로스피어의공극이열리어팽윤효율이 30% 로낮아졌다. 이는젤라틴- 신남산이이량화가되어분자사이의간격이좁아지면서알긴산나트륨마이크로스피어공극의빈공간이넓어져알긴산나트륨마이크로스피어내로유입되는수분이증가하여팽윤효율이높아지는것으로보인다 알긴산나트륨마이크로스피어로부터 FITC-dextran 의방출거동알긴산나트륨마이크로스피어의봉입된 FITC-dextran의양은 45.8 mg 이었다. 젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어에봉입된 FITC-dextran의양은 17 mg이었다. 이는젤라틴-신남산접합체가코팅됨에따라알긴산나트륨마이크로스피어의공극을막게되어 FITC-dextran이봉입된양이작아진것을나타낸다. Figure 6 는젤라틴- 신남산접합체를코팅후 254 nm UV를조사하여가교시킨알긴산나트륨마이크로스피어와 254 nm UV를조사하지않은알긴산나트륨마이크로스피어의방출거동을나타낸그래프이고, Figure 6 는젤라틴 -신남산접합체가코팅되지않은마이크로스피어의 254 nm UV을 공업화학, 제 24 권제 5 호, 2013

5 475 조사한것과 254 nm UV 를조사하지않은것을비교하여 FITC-dextran 의 방출거동을나타낸것이다. UV 를조사한알긴산나트륨마이크로 스피어와 UV 을조사하지않은알긴산나트륨마이크로스피어의방출 정도가큰차이가나타나지않았다. 이것은알긴산나트륨의분자량이 높아젤라틴 - 신남산접합체의이량화로인한 FITC-dextran 의방출 정도의차이가나지않은것으로보인다. 4. 결론 본연구는젤라틴 - 신남산접합체와알긴산나트륨의정전기적상호 작용을이용하여코팅된알긴산나트륨마이크로스피어를제조하여알긴산나트륨마이크로스피어의광민감성방출특성에관한것이다. 젤라틴-신남산접합체의합성은 1 H-NMR결과와이량화도를통해확인할수있었다. 광학현미경을통해알긴산나트륨마이크로스피어의형성여부를확인하였을때 10 µm 크기의구모양의알긴산나트륨마이크로스피어를확인할수있었다. SEM-EDS 의원소분석결과를통해알긴산나트륨마이크로스피어에젤라틴-신남산접합체가코팅이잘된것을확인할수있었다. 젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어의광민감성방출특성은 UV조사유무에따라큰차이를보이지않았지만팽윤실험과이량화도관찰한결과, 젤라틴-신남산접합체가알지네이트마이크로스피어에코팅이되어광민감성에따른차이를나타내는것을확인할수있었다. 위의결과를토대로젤라틴 - 신남산접합체가정전기적상호작용에의해알긴산나트륨마이크로스피어표면에코팅된알긴산나트륨마이크로스피어가형성되었으며, 이젤라틴-신남산접합체가코팅된알긴산나트륨마이크로스피어는광반응성을가지는약물전달체로서의잠재력을가지는것으로보인다. 감 This work was supported by a grant from Korea Institute of Oriental Medicine (K12050). 사 참고문헌 1. J. M. Russell, S. H. Allan, A. P. Pauli, S. B. Lisa, and R. G. Wayne, Calcium-alginate beads for the oral delivery of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) : stabilization of TGF-β1 by the addition of polyacrylic acid within acid-treated beads, Journal of Controlled Release, 30, 3 (1994). 2. N. M. Velings and M. M. Mestdagh, Physico-chemical properties of alginate gel beads, Polymer Gels and Networks, 3, 311 (1995). 3. S. M. Jay and W. M. Saltman, Controlled delivery of VEGF via modulation of alginate microparticle ionic crosslinking, Journal of Controlled Release, 134, 26 (2009). 4. M. G. Neumann, C. C. Schmitt, and E. T, Lamazaki, A fluorescence study of the interactions between sodium alginate and surfactants, Carbohydrate Research, 338, 1109 (2003). 5. M. George and T. E. Abraham, Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs: Alginate and chitosan - a review, Journal of Controlled Release, 114, 1 (2006). 6. M. K. Kang, J. Dai, and J.-C. Kim, Ethylcellulosemicroparticles containing chitosan and gelatin: ph-dependent release caused by complex coacervation, Journal of Industrial and Engineering Chemistary, 18, 355 (2012). 7. A. Bigia, G. Cojazzib, S. Panzavoltaa, K. Rubinia, and N. Roveria, Mechanical and thermal properties of gelatin films at different degrees of glutaraldehyde crosslinking, Biomaterials, 22, 763 (2001). 8. K. Ulubayrama, A. N. Cakarb, P. Korkuguzb, C. Ertanc, N. Hagirci, and N. Hagirci, EGF containing gelatin-based wound dressings, Biomaterials, 22, 1345 (2001). 9. U. G. Spizzirri, F. Iemma, F. Puoci, G. Cirillo, M. Curcio, O. I. Parigi, and N. Picci, Synthesis of Antioxidant Polymers by Grafting of Gallic Acid and Catechin on Gelatin, Biomacromolecules, 10, 1923 (2009). 10. H. C. Liang, W. H. Chang, K. J. Lin, and H. W. Sung, Genipincrosslinked gelatin microspheres as a drug carrier for intramuscular administration: In vitro and in vivo studies, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 65, 271 (2003). 11. M. Gudmundsson and H. Hafsteinsson, Gelatin from cod skins as affected by chemical treatments, Journal of Food Science, 62, 37 (1997). 12. H. L. Bruno, Investigation of viscosity and gelation properties of different mammalian and fish gelatins, Food Hydrocolloids, 5, 353 (1991). 13. Y. Qiu and K. Park, Environment-sensitive hydrogels for drug delivery, Advanced Drug Delivery Reviews, 64, 49 (2012). 14. E. Y. Mok, H. J. Cha, and J. C. Kim, Preparation and Characterization of Complex Composed of β-cyclodextrin Polymer/Cinnamic Acid, Appl. Chem. Eng, 23, 462 (2012). 15. J. H. Ko, H. Y. Yin, J. A, and D. J. Chung, Characterization of cross-linked gelatin nanofibers through electrospinning, Macromolecular Research, 18, 137 (2010). 16. A. J. Ribeiro, R. J. Neufeld, P. Amaud, and J. C. Chaumeil, Microencapsulation of lipophilic drugs in chitosan-coated alginate microspheres, International Journal of Pharmaceutics, 187, 115 (1999). 17. E. B. Denkbas and M. Odabasi, Chitosan microspheres and sponges: Preparation and characterization, Journal of Applied Polymer Science, 76, 1637 (2000). 18. X. Z. Shu and K. J. Zhu, A novel approach to prepare tripolyphosphate/chitosan complex beads for controlled release drug delivery, International Journal of Pharmaceutics, 201, 51 (2000). Appl. Chem. Eng., Vol. 24, No. 5, 2013

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- 1 - - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - 6 - ι κ λ β β β β β - 7 - - 8 - - 9 - - 1 - - 11 - 마. - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 - - 17 - - 18 - - 19 - - 2 - - 21 - - 22 - - 23 - - 24 - ι κ λ β β - 25 - - 26 - -