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2 이학석사학위논문 초파리의생체시계에서 CLOCK 의 PERIOD 결합도메인의역할 아주대학교대학원 의생명과학과 / 신경과학전공 강두현 i

3 초파리의생체시계에서 CLOCK 의 PERIOD 결합도메인의역할 지도교수김은영 이논문을이학석사학위논문으로제출함 년 8 월 아주대학교대학원 의생명과학과 / 신경과학전공 강두현 ii

4 강두현의이학석사학위논문을인준함. 아주대학교대학원 2012 년 06 월 22 일 iii

5 - 국문요약 - 초파리생체시계에서 CLOCK 의 PERIOD 결합도메인의역할 생체시계의작동기전은 Transcriptional/Translational Feeldback Loop (TTFL) 이다. 초파리에서는전사인자인 CLOCK (dclk) 과 CYCLE (CYC) 가결합하여 period (per) 와 timeless (tim) 의발현을촉진하고, PER 와 TIM 단백질은결합하여 CLK/CYC 의활성을억제함으로써자신의발현을저해하며 하는되먹임고리가 TTFL 의핵심고리를이룬다. PER/TIM 이합체에서 PER 가 CLK/CYC 의활성을억제하는역할을하는데어떤생화학적기전을 통하여억제하는가에대한이해가많이부족하다. 본연구에서는 CLK 의 아미노산을각각 100~200 개정도의단위로내부적으로제거하여변이체를 만들고 PER 가결합하는도메인을찾고자하였다.Schneider2 (S2) 초파리 세포라인에서각각의 CLK 변이체들과 PER 와의결합정도를 면역침강법으로 비교한결과아미노산 이제거된 dclk (dclkd 로명명 ) 이 PER 와결합정도가감소하는것을관찰하였다. 흥미롭게도 S2 세포에서 CLKD 은 E-box 의존적인전사활성을나타내지못하였다. 그러나 dclkd 이 CYC 단백질과는정상적으로결합하는것으로보아 아미노산 의제거로인한구조변화와같은비특이적결함에 의해서가아니라아미노산 부위가 dclk 단백질의전사활성및 PER 단백질과의결합에필요한도메인임을의미하는것이다. 아미노산 의 in vivo 역할을탐색하기위하여 dclk 을 발현시키는초파리를 iv

6 제작하고 dclk 을발현하지못하는 Clk OUT 유전적배경 (dclk ;Clk OUT 707;Clk OUT 으로명명 ) 에서분자적 행동학적리듬을관찰하였다.dClk 657- 초파리는생체리듬을나타내지못하여초파리세포라인에서얻은 결과와마찬가지로아미노산 부위가 CLK 이생체시계를작동시키는 데있어중요한역할을하는도메인임을입증할수있었다. 흥미롭게도 S2 에서 dclk 은전사활성을전혀나타내지못하였는데, 초파리에서는 PER 와 TIM 단백질이정상초파리에서보다는약간낮은정도로만들어지는 것으로확인되어이에대한후속연구가진행되어야할것으로보인다. 핵심어 : 초파리, 생체시계, dclock,dperiod, 전사활성, 결합도메인 v

7 차례 국문요약 iv 차례 vi 그림차례 viii 표차례 x Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 재료및방법 4 A. plasmid 4 1. S2 에서발현시키기위한 plasmid 들 4 (1) plasmid 종류 4 (2) Site-directed mutagenesis 를위한 primer 4 (3) Site-directed mutagenesis 6 2. 형질전환초파리제작을위한 plasmid 8 B. Schneider 2 (S2) 세포의배양과 transfection 9 C. 형질전환초파리 (Transgenic Drosophila melanogaster) 10 D. Locomotor activity assays 11 E. Immunoblot analysis 12 F. Immunoprecipitation(IP) 15 G. Luciferase Reporter Assay 와 β-galactosidase Enzyme Assay System 18 H. Quantitative Real-time RT-PCR 20 vi

8 Ⅲ. 결과 21 A. S2 세포에서 dclk( ) 은 dper 가결합하지못하지만 CYC 단백질의결합에는영향이없다. 21 B.S2 세포에서dCLK( ) 은dPER와의결합을하지못한다. 25 C.dCLK( ) 을발현하는형질전환초파리는정상적인생체리듬을가지지못한다. 29 Ⅳ. 고찰 38 Ⅴ. 결론 40 참고문헌 42 ABSTRACT 46 vii

9 그림차례 Fig. 1.Schematic diagram of internally deleted amino acid region on dclk protein 23 Fig. 2.Interaction between PERIOD with CLOCK internal deletion mutants 24 Fig. 3.Interaction between CYCLE with CLOCK internal deletion mutants 25 Fig. 4.Amino acid is necessary for PERIOD binding to CLOCK 27 Fig. 5.CLOCK does not have transcriptional activity 28 Fig. 6.Amino acid is not necessary for CYCLE binding to CLOCK 29 Fig. 7.Daily activity patterns of Clk-WT; Clk OUT and Clk ; Clk OUT 33 viii

10 Fig. 8.Amino acid is necessary for PERIOD binding to CLOCK at in vivo 34 Fig. 9.Molecular rhythms of Clk-WT; Clk OUT andclk ;Clk OUT during Light/Dark Cycle 35 Fig. 10.Molecular rhythmsofclk-wt; Clk OUT andclk ;Clk OUT during Light/Dark Cycle 36 Fig. 11.Daily levels of tim and clk mrnasclk-wt; Clk OUT andclk ;Clk OUT flies 37 ix

11 표차례 Table 1. Circadian behavior of Clk-WT; Clk OUT andclk ;Clk OUT flies 32 x

12 I. 서론 지구상에존재하는모든생명체는지구의자전으로변화하는환경을미리예측할수있다. 예를들면포유류의경우뇌의시상하부에위치한 SCN(Suprachiasmatic Nuclei) 이낮과밤을예측하고각장기의다양한세포로필요한정보를보내어하루중대사작용, 체온, 호르몬분비, 수면등을조절한다. 이로인해하루를주기로생명체의여러생리작용과행동및대사패턴을변화시키는생체리듬이나타나게된다. 생체시계와질병과의상관관계는암, 수면장애, 여러가지형태의우울증, 신경퇴행성질환, 대사증후군, 약물중독등무수히많은예로부터중요성이입증되고있다 (Bunney 와 Bunney,2000; Cardinali, 2000; Fu 와 Lee, 2003; McClung, 2007; Rudic 등, 2004). 따라서생체시계의작용기전을밝혀생체리듬을일으키는원인과비정상적생체리듬이발생함으로인해어떠한질병이나타나며, 예방과치료를위한수단과방법을탐색하는데중요한단서가될것이다. 생체시계는미생물에서부터포유류까지지구상의모든생물이가지고있는데기원전부터과학자들은생물내부에자체적인시계를가지고있을것이라고생각하고있었으며, 이에관한연구는초파리를동물모델로이용하면서 활발히진행되었다. 생체시계의핵심기전은 interlocked transcriptionaltranslational feedback loop 으로써두개의 loop 이맞물려생체시계의핵심 유전자들의발현이하루를주기로진동할수있도록한다. 초파리에서는 dperiod(dper) / timeless (tim) loop 이두개의 feedback loops 을이루고 있다. 이때 dclk/cyc 단백질은이형이합체를이루어 dper/tim 유전자의 - 1 -

13 promotor 부분의 E-box 에붙어전사를촉진하고 dper/tim 단백질은이형이합체를이루어서자신의유전자를만들게하는 dclk/cyc 단백질의전사활성을저해하는되먹임고리를만들게된다. 또한 dclk/cyc 단백질의이형이합체는 vrille (vri ) 과 PAR domain protein 1ε (PDP1 ε) 유전자의 E- box 에결합하여이들의발현을촉진하는데, 이때 VRILLE (VRI) 은 dclk 의 발현을억제하고반면 PDP1 ε 은 dclk 의발현을촉진하는또다른 feedback loop 를이루게된다 (Cyran 등, 2003). 생체시계의 interlocked transcriptional-translational feedback loop 에서 dper 와 TIM 의이형이합체가 dclk 과 CYC 이형이합체의활성을억제한다는것은잘알려져있다. 이때 dper-tim 이형이합체단백질이전사인자인 dclk-cyc 이형이합체단백질을억제하기위해직접적인결합이필요할것이며 (Lee 등, 1998; Lee 등, 1999; Sato 등, 2006), Chang 등은 dper 가단독으로도 dclk-cyc 의활성을저해할수있음을보고하여 dclk-cyc 이합체의활성을저해하는주요단백질은 dper 임을밝혔다 (Chang 과 Reppert, 2003). Chang 등은이연구에서 dper 에서 dclk 의활성을억제하는데필요한최소도메인을탐색하였고, 그결과 dper 에서아미노산 가내부적으로제거되었을때 dclk 의전사활성이 억제되지않았고이로부터 Chang 등은 dper 의 아미노산 를 dclk:cycinhibition Domain(CCID) 라명명하였다 (Chang 과 Reppert, 2003). 여러초파리종으로부터 CCID domain 의단백질서열을비교분석해보면종간보존성이높은부위 (Conserved region) 와종간보존성이상대적으로높지않은부위 (Non-conserved region) 로나뉘는것을알수있다. 특히 dper 에서종간보존성이높은부위인 C3 부위 ( 아미노산 ) 는 DBT 와 - 2 -

14 결합하는부위라는것을지도교수의이전연구에의해밝혀졌고 C4 부위 ( 아미노산 ) 도선임연구자에의해 dclk 과결합하는부위라는것이밝혀졌다.(Kim 등,2007 ; Sun 등,2010) 따라서본연구에서는생체시계의 interlocked transcriptionaltranslational feedback loop 에서 dclk 의전사활성을저해하기위해 dper 단백질이 dclk 에결합하는부위를찾고이도메인의기능을분자적 생화학적관점에서탐구하고자한다

15 Ⅱ. 재료및방법 A. plasmid 1. S2에서발현시키기위한 plasmid 들 (1) plasmid 종류 V5,pMT(A)-dClk V5, pmt(a)-dclk V5, pmt(a)-dclk DBD-V5,pMT(A)-dClk HLH-V5,pMT(A)- dclk V5,pMT(A)-dClk PAS-A-V5,pMT(A)-dClk V5,pMT(A)-dClk PAS-B-V5,pMT(A)-dClk pmt(a)-dclk V5,pMT-dClk ,pMTdClk ,pMT-dClk , pmt-dclk ,pMTdClk (2) Site-directed mutagenesis 를위한 primer (A) clk DBD Forward :5 - GAC AAG GAT GAT ACA TTC AAC TCG CTG GTC -3 Reverse :5 - GAC CAG CGA GTT GAA TGT ATC ATC CTT GTC -3 (B) clk HLH Forward :5 - AAG CGA CGA GAT CAG AAA AAT CAT AAT GAG -3 Reverse :5 - CTC ATT ATG ATT TTT CTG ATC TCG TCG CTT -3 (C) clk

16 Forward :5 - ACG ATA GCC TTC CTG CTG GAG TCT CTC GAT -3 Reverse :5 - ATC GAG AGA CTC CAG CAG GAA GGC TAT CGT -3 (D) clk PAS-A Forward :5 - TAC ACT CAC CTC ATG GAG GCG CTG CTG AAT -3 Reverse :5 - ATT CAG CAG CGC CTC CAT GAG GTG AGT GTA -3 (E) clk Forward :5 - TAT GAG ATG GAC CAT AGT AAT GAG TTC ACT -3 Reverse :5 - AGT GAA CTC ATT ACT ATG GTC CAT CTC ATA -3 (F) clk PAS-B Forward :5 - ATT ATT GAT CCC ACA GAC AGT ATT GTG GCG -3 Reverse :5 - CGC CAC AAT ACT GTC TGT GGG ATC AAT AAT -3 (G) clk Forward :5 - CAC TTT GAT GAT CTG GGC CAA AAA TCG GGA -3 Reverse :5 - TCC CGA TTT TTG GCC CAG ATC ATC AAA GTG -3 (H) clk Forward :5 - GAT AGT CGA AAG GAG AAT ATC AGC TCC ACA -3 Reverse :5 - TGT GGA GCT GAT ATT CTC CTT TCG ACT ATC -3 (I) clk Forward :5 - GCT TCG AGT TAT GGC ACT CCG AAA ATG GTG -3 Reverse :5 - CAC CAT TTT CGG AGT GCC ATA ACT CGA AGC -3 (AJ) clk Forward :5 - CTG CAA CAT ACA GTG CAC CAG CAC AAT CTC

17 Reverse :5 - GAG ATT GTG CTG GTG CAC TGT ATG TTG CAG -3 (K) clk Forward :5 - CTG CAA CAT ACA GTG CC GAT ACG GTG GTT -3 Reverse :5 - AAC CAC CGT ATC GGG CAC TGT ATG TTG CAG -3 (L) clk Forward :5 - CAA ACG GAT ATG CTG CCC ATG ATG TCG ATG -3 Reverse :5 - CAT CGA CAT CAT GGG CAG CAT ATC CGT TTG -3 (M) clk Forward :5 - TAC ACA TAT CTG CAG CAC CAG CAC AAT CTC -3 Reverse :5 - GAG ATT GTG CTG GTG CTG CAG ATA TGT GTA -3 (N) clk Forward :5 - CAC CAG CAC AAT CTC CAA AAT GAT ATT TTA -3 Reverse :5 - TAA AAT ATC ATT TTG GAG ATT GTG CTG GTG -3 (O) clk Forward :5 - CAA AAT GAT ATT TTA AAT CTG GTG CAG CAG -3 Reverse :5 - CTG CTG CAC CAG ATT TAA AAT ATC ATT TTG -3 (3)Site-directed mutagenesis QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene Co., La Jolla, CA,U.S.A) 을사용하여 site directed mutagenesis를수행하였다. 이때 pfuturbo DNA polymerase (Stratagene Co., La Jolla, CA, U.S.A) 를이용하였으며, 각 plasmid에대한 PCR 반응조건은 pfuturbo DNA polymerase - 6 -

18 (Stratagene Co., La Jolla, CA, U.S.A) 가제시하는방법을사용하였고 PCR 반응혼합액구성요소는 100 ng 의 pmt-hadclk-v5, 5 μl의 10X cloned Pfu reaction buffer, 2 μl의 10mM dntp, 각각 150 ng 의 primer (F)(R), 1μl의 Pfu Turbo DNA polymerase (Strata gene Co., La Jolla, CA,U.S.A) 그리고멸균수로최종반응양을 50 μl로맞추어조제하였다. PCR은핵산증폭기 (MJ Research, Inc., Waltham, MA, U.S.A) 를이용하였다. PCR 산물중 mutation되지않은주형 DNA를제거하기위해제한효소 Dpn I 1 μl를처리한후 37 에서 1 시간반응후, XL10-Gold Ultracompetent cells (Stratagene Co., La Jolla, CA,U.S.A) 에 42 로 45초간 heatshock을주고난후, 1 시간 30 분동안 shaking incubator에서배양하여 transformation 하였다. 재조합 plasmid를가진콜로니임을확인하기위해 sequencing을보내염기서열을확인하였다

19 2. 형질전환초파리제작을위한 plasmid AttbpAcman-dClk-V5 이 plasmid 의 NcoI-SphI 단편을 psp72 vector(promega Co., Madison, WI, U.S.A) 에subcloning하였다. 이 plasmid 를 psp72-dclk (NcoI/SphI) 로명명하였다. site-direct mutagenesis를수행후 psp72-dclk (NcoI/SphI) 를제작하였다. 아미노산 의제거는 DNA sequencing analysis를통해확인하였다.psp72-dclk (NcoI/SphI) 에서 NcoI 과 SphI 제한효소를이용하여 dclk 을잘라낸후 psp72-dclk(nhei-sphi) 에subclonning 하여 psp72-dclk (NheI/SphI) 를제작하였다. 이렇게준비된 plasmid를 attbpacman-dclk vector 에NheI-SphI을이용하여 subcloning 함으로써최종적으로 attbpacman-dclkd 을제작하였다 - 8 -

20 B. Schneider 2(S2) 세포의배양과 transfection S2 세포는 10% Fetal Bovine Serum, Certified(FBS) (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, U.S.A) 와 0.5% penicillin streptomycine (Sigma-Aldrich Co., Carlsbad, CA, U.S.A) 를사용하였고 23 항온기에서배양하였다. Transfection은 Effectene Transfection reagent (Qiagen Co., Hilden, Germany) 를사용하였고제조사가제시한실험방법에따라실험하였다. 각 transfection 은각각다른 0.4 μg의 pmt-hadclk 을포함한 plasmid 와 0.6 μg의 pact-per 또는각각다른 0.5 μg의 pmt-hadclk 을포함한 plasmid 와 0.5 μg의 pmt-cyc-3f 를사용하였다. pact-per와 pmtcyc-3f는 transfection 후최종 500 um CuSO 4 를넣어 induction 함으로써특정시간동안배양하여발현증가를유도하였다

21 C. 형질전환초파리 (Transgenic Drosophila melanogaster) 이 pacman-dclkd plasmid를 BestGeneInc (BestGene Inc., Chino Hills, CA, U.S.A) 에보내형질전환초파리제작을의뢰하였다. 이때 pacman-dclkd plasmid를주입하는초파리라인은 VK00018을 이용하였다. 그결과 4 개의독립적라인을얻었고각각의초파리를 Clk 을 발현하지않은 Clk OUT 초파리와교배하여유전적배경에서 ClkD 을 발현하는초파리라인을확립하였다. 초파리의유전형은다음과같다. W; ClkD ,4M;Clk OUT W; ClkD ,3M;Clk OUT W; ClkD ,2M;Clk OUT W; ClkD ,1M;Clk OUT

22 D. Locomoter activity assays 초파리각각의 locomotor activity 는 Drosophila Activity System (DAM) 을이용하여측정하였다. (Waltham MA) (Hemblen-Coyle 등, 1992). 측정을위해초파리는어린수컷성체를사용하였다. 25 항온기에서 12시간간격으로빛과어둠속에총 4일간노출하였고 (12:12LD, zeitgeber time zero [ZT0] sms light phase 가시작되는시점으로정의를내린다.), Constantdarkness condition (DD) 을 12:12LD 이후연속해서 7일간유지하였다. 각초파리의 Locomotor activity 는 Dr. F. Rouyer. (France) 로부터받은 Faax software (MacOSX 를위한 Fly Activity Analysis Suite) 를이용하여분석하였다. Period 는초파리각각을 chi-square periodogram analysis 하여, 각유전형의그룹별평균을산출하여그값을획득하였다. power는 DD동안 rhythm의 strength의정도이다. 각각의초파리들은 power 가 10 이상의값을가지고 width 값 (periodogram 95% confidence line 보다 30분위에 peak된수를표시 ) 이 2 이상의 rhythm을나타낸다

23 E. Immunoblot analysis 전기영동용 Gel은 6% polyacrylamide gel (Resolving gel mix; 1.2 ml의 30% polyacrylamide/bis solution,37.5:1(bio-rad),2.325 ml의 DW, 2.4 ml의 1M Tris-Hcl ph 8.8, 60μl의 10% SDS, 25 μl의 25% APS, 6μl의 TEMED) (Stacking gel ; 375 μl의 30% Acrylamide Bis,37.5:1,BIO-RAD 1.85 ml DW, 250 μl의 1M Tris-Hcl ph 6.8, 25 μl의 10% SDS, 10 μl의 25% APS, 3μl의 TEMED) 을제작하여사용했다. 시료의전처리를위해 S2 세포를거두어들인뒤 PBS로한번씻어준후 150 μl의 Modified RIPA(50mM Tris-Hcl ph 7.5, 1% NP-40, 0.25% deoxycholate, 50mM Nacl, 5% glycerol) 에신선한 1 mm EDTA, 100X Xpert protease inhibitor cocktail solution(gendepotco., U.S.A), 2.5M 의 NaF, 200mM Na 3 VO 4, 0.5mM의 PMSF 을추가하여세포를용해하였다. 용해방법은얼음위에서 5 분마다 10초씩세번 voltexing 하여총 15분간용해한후 4 에서 rpm 으로 15분간원심분리하여상층액만을회수하였다. 회수한각세포용해액은 ELIZA leader (BioTex Inc., Houston, TX, U.S.A) 를이용하여 595 nm 로농도를측정하여 OD3 과 OD6 으로정량한후 단백질을변성시키기위해 4X SDS-PAGE sample buffer(2.5ml 1M Tris-Hcl ph 6.8, 4ml의 Glycerol(100%), 0.8ml β-mercaptoethano, 0.8g SDS, 2.5ml Autoclaved water ) 를추가하여95 이상의온도에서 3 분간끓인후spindown하여 sample 들을 loading 하였다. 준비된 sample들은 SDS-PAGE 전기영동법 (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel Electrophoresis, Laemmli법 ) 을

24 수행하였다. Mini-PROTEIN Tetra Cell (BIO-RAD Laboratories, Inc., Hercures, CA, U.S.A) 을이용하였고, 전기영동용 buffer (1 L ; g Tris, 14.4 g Glycine, DW, 1% SDS) 를채운뒤전기영동하였다. Stacking gel에서는 130 V 로 Resolving gel에서는 190 V 로설정하였고 PRO-STAIN Prestained protein marker (Intron Biotechnology Inc., Korea) 을함께 loading 하여 marker의 90.5 kda 밴드가 gel의가장하단에위치할때까지전기영동하였다. 전기영동완료된 gel은 resolving gel 만을잘라낸후 transfer buffer 에충분히적신 Gel Blot Paper (Whatman Inc., Springfield Mill, Kent, U.K) 와 Immobilon-P Transfer Membrane(Millipore Inc.,U.S.A) 를함께 semi-dry blot sandwich를만들어 Trans-Blot SD semidry electrophoretic transfer cell (BIO-RAD Laboratories Inc., Hercures, CA, U.S.A) 에함께장착한다음 240mA 에서 45분간 transfer 하였고, Transfer 된 nitrocellulose transfer membrane 은 0.1% Ponceau S(0.1% Ponceau S, 5% acetic acid) 로확인하였다. Orbital shaker 위에서 5% Blocking 하였고, 1차항체가포함된 5% Blocking 용액에넣어냉장실에서하룻동안반응시킨뒤, 2차항체가포함된 5% Blocking 용액에넣어상온에서세시간동안반응하였다. 이때 Anti-V5(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, U.S.A) 는 1:10000, Anti-HA(3F10)(Roche Diagonostics Co., Mannheim, Germany) 은 1:4000으로희석하여사용하였고, Goat anti-mouse IgG(H+L)horseradish peroxidase(molecular Probes Inc., Eugene, OR, U.S.A) 는 1:10000,Goat anti rat IgG (H+L), (molecular Probes Inc., Eugene,

25 OR, U.S.A) 는 1:5000으로희석하여사용하였다. 항체반응이끝난뒤에는항상 15분간격으로 4번 TBST(4M NaCl, 1M Tris-HCl ph 7.5, 0.05% Tween-20, DW) 로세척하였다. 항체반응이끝나면 Immobilon Western chemiluminescent HRP substrate(millipore Co., Billerica, MA, U.S.A) 를 nitrocellulose transfer membrane 에적절히묻힌후 CP-BU NEW medical X-ray film blue (Agfa HealthyCare Co., Soptestraat, Mortsel,Belgium) 에적정시간동안노출시켜현상하였다

26 F. Immunoprecipitation(IP) pmt-hadclk또는 pmt-hadclk( ) series 0.4μg과함께 pactdper-v5/his(0.6μg ),pmt-hadclk또는 pmt-hadclk( ) series 0.5μg과함께 pmt-cyc-3f(0.5μg ) 을 S2 세포에 Effectene Transfection reagent (Qiagen Co., Hilden, Germany) 을사용하여제조사의설명에따라 transient transfection 하였다. 36 시간동안배양한뒤최종 500 um CuSO 4 를넣어 dclk의발현을유도한후 24 시간동안배양하였다. 세포를수확하고 PBS로한번씻어준후 Modified RIPA (50mM Tris-Hcl ph 7.5, 1% NP-40, 0.25% deoxycholate, 50 mmnacl, 5% glycerol) 에신선한 0.5mM PMSF,, 100X Xpert protease inhibitor cocktail solution(gendepot Co., U.S.A), 2.5M 의 NaF, 200mM Na 3 VO 4,1 mm EDTA 를추가한 lysis buffer 를이용하여세포를용해하였다. 용해방법은얼음위에서 5 분마다 10 초씩세번 voltexing 하여총 15 분간용해한후 rpm으로 15 분간 4 원심분리하여상층액만을회수하였다. 회수한세포용해액은 ELIZA leader (BioTex Inc., Houston, Tx, U.S.A) 를이용하여 595nm 에서 O.D값을측정한후단백질양을동일하게맞추고각각 dper에대한 anti-v5 항체 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, U.S.A) 또는 dclk 에대한 Anti-HA (12CA5) 항체 (Roche Diagonostics Co., Mannheim, Germany) 를 3μl씩을넣어준다음 4 냉장실에서하루동안 lotation 하였다. 다음날 GammaBind G sepharose (GE Health care Bio-Sciences AB.,Bjorkgatan, Uppsala, Sweden) bead 를사용할만큼미리준비하여세포용해시사용했던동일한 buffer (Modified- RIPA) 로약하게세번세척한후. 각 sample 마다준비한 bead를 25μl

27 씩넣고 4 에서세시간동안 lotation 하였다. Sample 들은 4 에서 2분동안원심분리한후상층액은따로모아두고, bead를다시 4 에서 5분간 lotation 하여 buffer(modified-ripa) 로세척하는과정을세번반복한후 buffer (Modified-RIPA) 를최대한제거한다. 1.2X Sample buffer 를각 sample 마다 30μl씩넣고 95 에서 5 분간끓인후 15 μl씩 loading 하여 immunoblottung 을수행하였다. Immunoblotting 에는 6% polyacrylamide gel 을사용하였고, IP 수행시 3F10(Roche Diagonostics Co., Mannheim, Germany) 로 dclk을검출한 sample 에는 dper를찾기위해 1 차항체로 Anti-HA(12CA5)(Roche Diagonostics Co., Mannheim, Germany) 로 dclk 을검출한 sample 에는 dper를찾기위해 Anti-V5 (incitrogen Co., Carlsbad, CA, U.S.A) 항체를사용하였다. 또한원래의세포용해액은dCLK과 dper 둘다 O.D 10 으로정량하여함께 loading 하여줌으로써세포내존재하는각단백질양과 dper 또는 dclk 의각각의결합도를비교하였다. 이것과함께 dclk과 CYC는EZ view tm Red ANTI-FLAG M2 Affinity gel( sigma-aldrich, Inc., Missouri U.S.A)bead 를 각 sample 마다 25μl씩넣고 4 냉장실에서하루동안 lotation 하였다.Sample 들은 4 에서 2분동안원심분리한후상층액은따로모아두고, bead만있는곳에 ph 2.7 의 0.1M Glycine-Hcl 을 27μl을넣고 10분동안 room temperature 에서 incubation 한다. 10분간의 incubation 동안 2분마다 tapping 을한다음 4 에서 2분동안원심분리한후상층액은새로운 e.tube 에옮긴다. 이때옮기는 e.tube 에는 3μl의 ph 8.8 tris-hcl 을미리넣어둔다. 총 30 μl의 sample 이들어있는 e.tube에 10μl의 4X sample buffer 를넣고 95 에서 3 분간 끓인 후 20μl 씩 loading 하여 immunoblottung 을

28 수행하였다.Immunoblotting 에는 8%, 10% polyacrylamide gel 을사용하였고, IP 수행시 Anti-FLAG( sigma-aldrich, Inc., Missouri U.S.A) 으로 CYC 를검출한 sample 에는 dclk 을찾기위해 1 차항체로 Anti- HA(12CA5)(Roche Diagonostics Co., Mannheim, Germany) 로 dclk 을검출한 sample 에는 CYC를찾기위해 Anti-FLAG(Monoclonal ANTI-FLAG M2) ( sigma-aldrich, Inc., Missouri U.S.A) 항체를사용하였다. 또한원래의세포용해액은dCLK 은 O.D 8, CYC 는 O.D 3 으로정량하여함께 loading 하여줌으로써세포내존재하는각단백질양과 CYC 또는 dclk 의각각의결합도를비교하였다

29 G. Luciferase Reporter Assay 와 β-galactosidase Enzyme Assay System Assay를위해서먼저세포용해액을준비해야한다. 24well plate에 S2 세포를배양한후 dclke-luc, pmt-dclk-v5/his 와 pmt-dclk V5/His 를 Effectene Transfection reagent (Qiagen Co., Hilden, Germany ) 을사용하여제조사의설명에따라서 transfection 하였고, 모든 sample의 transfection 효율을동일화시키기위해 pmtb로보정하였으며오차범위를줄이기위해 triplecation 하였다. 36 시간후최종 500mM CuSO4로 induction 한다음 12시간후 well을 PBS로두번세척하였다. 5X RepoterLysis Buffer (RLB)(Promega Co., Madison, WI, U.S.A) 를 1X로희석하여각 well의표면을충분히덮을수있을정도로 150μl를분주하였고, 4 shaker 로강하게 흔들면서 20 분가량 incubation 하면서세포를 최대한용해시켰다. 세포용 해액은 4 에서 13000rpm 으로 5 분간원심분리하여상층액만을회수하였다. Luciferase repoter assay 를위해서상온에서 Luciferase Assay Reagent(LAR) )(Promega Co., Madison, WI, U.S.A) 를녹인다음 1.5 ml microcentrifuge tube 에 100μl의 LAR 와세포용해액을넣어잘섞어서 delay 는 3초, integration time 은 15초, replication 은 1로설정된 Luminometer (Turner Designs Inc., Sunnyvale, CA, U.S.A) 에서측정하였다. 이때세포용해액중 dclk 이아닌 dclk을 2 ~ 10 μl을넣어측 정하였을경우측정값이약 3000 이나올때적절하다. β-galactosidase Enzyme Assay 를위해서 96 well plate 에각 sample 20 μl, 1X RLB 30 μl와 Assay 2X buffer (2 mm MgCl 2, 100mM 2-mercaptoethanol, 1.33 mg/

30 ml ONPG) 50 μl를넣고 37 에서노란색으로변할때까지약 30 분정도반응시킨후 150 μl의 1 M Sodium Carbornate 를넣어반응을중단시키고즉시 ELIZA leader (BioTex Inc., Houston, TX, U.S.A) 를이용해 420 nm 의파장으로측정하였다. β-galactosidase Enzyme Assay 값을이용하여 Luciferase Reporter Assay 값을보정하여 graph를작성하였다

31 H. Quantitative Real-time RT-PCR 초파리머리를 TRI reagent(molecular Research center, Inc) 로용해하여 RNA를획득한다. 이렇게얻은총 500ng 의 RNA 를 oligo-dt primer 와 amfirivert reverse transcriptase (GenDEPOT) 를이용하여 cdna를합성한다. cdna를주형으로 Quantitect SYBR Green PCR kit (Qiagen) 을이용하여 Corbett Rotor Gene 6000 instrument (Corbett Life Science) 에서real-time RT-PCR을수행하였다.primer sequence는 dclkforward : 5 CAGTTCAACTCGCTGGTCAA-3 ; dclk reverse : 5 TCAGGAAGGCTATCGTGGAC-3 timforward: 5 -CCCT ATACCCGAGGTGGAT-3 ;timreverse:5 - TGATCGAGTTGCAGTGCTTC-3. 여기에 mrna가 cycling 하지않는 CBP20 를첨가하여값을보정하였다 (Majercak et al. 2004). CBP20 의 sequence 는다음과같다.CBP20 forward: 5 - GTCTGATTCGTGTGGACTGG-3 ; CBP20 reverse: 5 - CAACAGTTTGCCATAACCCC-3. 수행후나온결과를Roter Gene 6000 software 를이용하여분석하였다. 그리고상대적인 mrna level을 2 - Ct 방법을이용하여양을측정하였다

32 III. 결과 A. S2 세포에서 dclk( ) 은 dper 가결합하지못하지만 CYC 단백질의결합에는영향이없다. 최근우리연구실에서는, dclk 의단백질에서전사억제제인 dper가결합하는부위인아미노산 을 dclk에서제거하게되면 dper 단백질이결합하지못한다는연구결과를얻게되었다.(Fig.1) 먼저 dclk( ) 단백질이 partner 단백질로알려진 CYC 단백질과의결합이되지않기때문일 가능성을먼저조사해보았다. dclk full length domain 을 12 가지종류로부분적 으로아미노산을내부적으로삭제를시켜 dclk 단백질에 dper 단백질이결 합하지못하는부위를찾아냈다. 그리고 dper 단백질이결합하지못하는부위에 partner 단백질인 CYC 단백질과의결합에는어떤영향을미치는지를 immunoprecipitation(ip) 를통해알아보았다. dclk( ) 는 dper 단백질이결합하지않았지만 dclk 단백질과이형접합체를형성하는 partner 단백질인 CYC 의경우dPER 단백질과는다르게결합하는데아무문제가없었다. 이와같은실험을진행하면서얻게된또다른실험결과는 dclk 과 CYC 가결합하는부위는 PAS-A 가중요한역할을할것이라는실험결과를얻게되었다. 또 dclk 단백질에서아미노산 PAS-A, , PAS-B, 부위가삭제가되면 dclk 의발현량에도영향을미치는것으로확인이되었다

33 Fig.1.Schematic diagram of internally deleted amino acid region on dclk protein bhlh, basic helix loop helix; A, PAS-A; B, PAS-B; Q-rich, glutamine rich; Poly Q, Poly glutamine; (1), DBD;(2). HLH;(3) ;(4). PAS-A;(5), ;(6). PAS-B;(7), ;(8), ;(9), ;(10), ;(11), ;(12),

34 Fig.2.Interaction between PERIODwith CLOCK internal deletion mutants S2 cells were co-transected with 400 ng of each variant form of Clkplasmids as indicated on top (numbers as same as in Fig. 1) in combination with 600ng pact-dper. At 36 h after transfection, cells were incubated in media containing 500 um CuSO 4 (final) to induce ectopic expression of target proteins and harvested 24 h later. Extracts were prepared and either subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed directly (input). Immune complexes were recovered with anti-dper (GP339) or anti-ha(12ca5)

35 Fig.3.Interaction between CYCLEwithCLOCK internal deletion mutants S2 cells were co-transected with 500 ng of each variant form of Clk plasmids as indicated on top (numbers as same as in Fig. 1) in combination with 500 ngpmt-cyc -3F. At 36 h after transfection, cells were incubated in media containing 500 um CuSO 4 (final) to induce ectopic expression of target proteins and harvested 24 h later. Extracts were prepared and either subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed directly (input). Immune complexes were recovered with anti-ha(12ca5) or anti-cyc (anti- FLAG)

36 B. S2 세포에서 dclk( ) 은 dper 과의결합을하지 못한다. 이전의결과에서 dclk( ) 이 dper와의결합을하지못하지만또다른중요단백질인cyc 와의결합에는문제가없음을 immunoprecipitation(ip) assay 를통해확인하였다. 앞서확인한아미노산 부위를더좁혀아미노산 부위가삭제가되면 dper 단백질이 dclk에결합하는데중요한최소 domain인것을앞서실험한방법과같이 immunoprecipitat ion(ip) 를통해서알아내었다. 이때도앞선결과와마찬가지로 CYC의결합은문제가없었다.dCLK wild-type 과 dclk( ) 의전사활성을 luciferase assay로측정해보았다. 그결과 dclk ( ) 는전사활성이 wild type에비해사라져버린것을확인할수있었다. 아미노산 이삭제되면 dper 단백질이결합하지못하고 dclk 자체의전사활성도없어지게된다

37 Fig.4. Amino acid is necessary for PERIOD binding to CLOCK S2 cells were transected with 400 ngpmt-dclk-wt,pmt-dclk( ) in combination with 600ng pact-dper.at 36 h after transfection, cells were incubated in media containing 500 um CuSO 4 (final) to induce ectopic expression of target proteins and harvested 24 h later. Extracts were prepared and either subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed directly (input). Immune complexes were recovered with anti-dper (GP339) or anti-ha(12ca5) S2 cells were transected with pmt-dclk-wt or pmt-dclk( ) in combination with pact-dper

38 Fig.5. CLOCK does not have transcriptional activity Shown are the average values for relative luciferase activity. S2 cells were transfected pmt-clk-wt and pmt-clk Cells were incubated with 500uM CuSO 4 (final in the media) to induce ectopic expression of dclk at 36h after transfection and harvested 24h later. Luc activity in the absence of transfecting pmt-dclk(bl)was set to 1, and all other values were normalized

39 Fig.6.Amino acid is not necessary for CYCLE binding to CLOCK. S2 cells were transected with 500 ngpmt-dclk-wt,pmt-dclk( ) in combination with 500ngpMT-cyc -3F.at 36 h after transfection, cells were incubated in media containing 500 um CuSO 4 (final) to induce ectopic expression of target proteins and harvested 24 h later. Extracts were prepared and either subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed directly (input). Immune complexes were recovered with anti-ha(12ca5) or anti-cyc (anti-flag).s2 cells were transected with pmt-dclk-wt or pmt-dclk( ) in combination with pact-dper

40 C. dclk( ) 을발현하는형질전환초파리는정상적 인생체리듬을가지지못한다. dclk 의아미노산 의 in vivo 에서의역할을탐색하기위하여아미노산 부위가제거된 dclk 을발현하는초파리를제작하였다..dCLK ( ) 을발현하는독립적인 2개의형질전환초파리라인 (3M, 4M) 을확립하였고 CLK OUT background 의초파리와교배후이를 dclk( ) 초파리라명명하였다. 정상적인 dclk을발현하는초파리역시 CLK OUT background 의초파리와교배후이를 dclk(wt) 이라명명하고대조군으로사용하였다. 생체리듬은 DAM(Drosophila Activity Monitoring)system을이용하여분석하였다. (Table. 1) 그결과 dclk(wt) 초파리는 homozygote 형태로존재할경우 24.4시간의주기를가지고 heterozygote의상태가되면 27.3 시간의주기를가지게된다. 이처럼 transgene 을넣어준경우에는 dose effect 가존재하기때문에 WT gene이 1copy (heterozygote) 가들어가면 2 copy (homozygote) 가들어갔을때에비해 rhythmicity가확연히떨어지는것을확인할수있다.dclk( ) 의경우에는 WT 과는확연히다른결과를보여주었다. Homozygote 와 heterozygote의형태에상관없이주기를가지는초파리가없다는실험결과가나왔다. 같은 mutant이지만 line 에따라다양성을나타내는데이는같은유전자를가지고발현을하더라도모두같은행동양상을나타내는것이아니라는것을알려주는데 3M 과 4M mutant line 같은경우

41 activity 양의차이는있으나이들의행동양상은비슷하게나타나는것을볼수있었다. 이는 dclk( ) 을발현하는초파리의경우주기를형성하는데중요한역할을하는dPER 단백질이 dclk 단백질에결합하지못해서앞선 in vitro 실험에서도보았듯이 dclk의전사활성이사라지는것에대한결과인것 으로말해준다. 그렇다면생체리듬주기가사라져버린 dclk( ) 형 질전환초파리의생체내에서 dper 는어떠한변화가있는지조사하기위해 dclk( ) 형질전환초파리를 12:12 LD cycle 에 entrainment 시킨후 4 시간간격으로초파리를수확하여, 머리로부터단백질액을얻어 western blot 을수행하였다. 정상의 dclk단백질은시간에따라그인산화정도가순환한다. 늦은저녁과이른아침에는과도하게인산화된 (hyperphosphorylation) isoform 들이많이존재하고하루의중간에는비교적적게인산화된 (hypophosphorylation) isoform들이많이존재한다 (Fig 8). 반면에 dclk( 단백질은하룻동안인산화 isoform의변화가없이일정한것을관찰할수있었고, 더욱이그양이정상의 dclk 단백질에비해매우높은것을관 찰하였다 PER 와 TIM 단백질은 dclk ;Clk OUT 초파리에서그양은 dclk;clk OUT 초파리보다낮지만시간에따라변화하는것을관찰하였다. 그리고 24 시간동안 constant - dark (DD) 상태일때는 WT은 LD와비슷하게 rhythmic한양상을나타내는데비해 mutant의 TIM과 PER는daily activity patterns 결과와동일하게 peak이뒤로점차밀리는것을확인할수있었다.dclk 단백질의전사활성을측정하기위해 dclk ;ClkOUT 에서하룻동안 tim mrna 양을측정하였다. CLK의 mrna 경우 LD와 DD 에 mutant는비슷한 graph를나타내는데 dclk의 level은 mutant의경우더높은것을확인할수있었다. 하지만 dclk의 repressor인

42 TIM의 mrna의변화량은zt에서 WT에비해 mrna의양이떨어져있음을확인할수있었다. 이것은 S2 cell 에서와같이 dclk 단백질이전사활성을완전히잃은것은아니고어느정도는가지고있는것을의미한다.DD에서는 mrna의 peak이뒤쪽으로밀리는것을볼수있었다. 이결과는앞선행동분석결과그리고 molecular rhythm의변화에일치하는결과를보여주고있다

43 Table.1 Circadian behavior of Clk; Clk OUT andclk ;Clk OUT flies Period ± SEM(h) Power a Rhythmicity (%) b Numberc Clk OUT AR AR AR 11 w;clk-wt,1a;clk OUT 24.4± w;clk-wt,1a/cyo;clk OUT 27.3± w;clk M;Clk OUT 26± w;clk M/CyO;Clk OUT 24.3± w;clk M;Clk OUT AR AR AR 10 w;clk M/CyO;Clk OUT AR AR AR 8 a Measure of the strength or amplitude of the rhythm. b Percentage of flies with activity rhythms having a power value of 10 and a width value of 2. c Total number of flies that survived until the end of the testing period. d AR = arrhythmic

44 Fig. 7.Daily activity patterns of Clk-WT; Clk OUT and Clk ; Clk OUT Flygenotypes are A(w;Clk-WT,1A;Clk out ),B(w;Clk- WT,1A/CyO;Clk out ),C(w;Clk M;Clk out ),D(w;Clk M/CyO;Clk out ),E(w;Clk M;Clk out ),F(w;Clk M/CyO;Clk out )

45 Fig.8. Amino acid is necessary for PERIOD binding to CLOCK atin vivo Adult flies of each genotype (indicated above the panel; WT, w;clk- WT;Clk OUT ; , w;clk ;Clk OUT ) were collected at the indicated ZT. Fly headextracts were preparedand either subjected to immunoprecipitation (IP) with anti-v5 antibody or analyzed directly (input). Immune complexes were recovered with anti-dper (Rb1) or antidclk(rb-v5)

46 Fig.9.Molecular rhythms of Clk-WT; Clk OUT andclk ;Clk OUT during Light/Dark Cycle Adult flies of each genotype (indicated above the panel; WT, w ;Clk ) were collected at the indicated ZT. Head extracts were prepared and analyzed by immunoblotting. Anti-CLK(V5) or anti-tim(tr-3) and anti- PER(Rb1) antibodies were used to visualize dper or TIM, respectively

47 Fig.10.Molecular rhythmsofclk-wt; Clk OUT andclk ;Clk OUT during Light/Dark Cycle Adult flies of each genotype (indicated above the panel) were collected at the indicated CT. Head extracts were prepared and analyzed by immunoblotting. Anti-CLK(V5) or anti-tim(tr-3) and anti-per(rb1) antibodies were used to visualize dper or TIM, respectively

48 Fig.11.. Daily levels of tim and clk mrnas Clk-WT; Clk OUT andclk ;Clk OUT flies cycles in dclkor timrna levels. Adult flies of the indicated genotypes (as shown in Fig.8.9 were collected at the indicated ZT and CT. RNA was extracted from fly heads and quantitative real-time RT-PCR used to measure the relative levels of total dclk or tim mrna. RNA levels from control flies (A,C =clk-wt )(B,D = clk ) at ZT4 were set to 1 and all other values were normalized. Shown are the average values from three independent experiments. Error bars denote S.E.M

49 IV. 고 찰 모든생물은생체시계를가지며이것을이용하여하루중생체리듬을조절한다. 그중에서도분자생물학적유전학적연구가치가뛰어나며인간과상동성이높은초파리동물모델생체시계의 transcriptional-translational feedback loop 에서중요한역할을수행하는 dclk 의분자생물학적 생화학적역할을규명하는것은생체시계연구분야에서매우중요한연구이다. dclk 의서열중 dper binding domain ( 아미노산 ) 의역할을찾고자하였다. 그결과우리는아미노산 중에서도중요한역할을하는부위를아미노산 로줄일수있었고이부위가제거되었을경우전사억제제역할을하는 dper 의결합이되지않는것을확인할수있었으며, dclk 의전사활성마저잃어버리는것을발견하였다. 한편 in vitro 뿐만아니라 in vivo 결과에서도중요한의미를가진다. dclk-wt gene 을발현하는형질전환초파리는약 24.4 시간의주기를가지며 rhythmic 한반면 dclk( ) 을발현하는형질전환초파리의독립적인라인에서모두주기가없어졌고정상적인생체리듬을가지지못하는것을알수있었다. 초파리세포배양에서확인한바에의하면, dclk ( ) 은 dper 와결합할수있는능력을잃어버려 dclk 의전사활성을억제하지못하였다. dclk ( ) 은일부분만이삭제가 되었음에도전사억제제역할을하는 dper 가결합할수있는능력도 잃어버릴뿐만아니라 dclk 의자체적인전사활성능력마저도잃어버린다는 사실은매우흥미롭다. 이러한 dclk ( ) 을발현시키는형질전환

50 초파리는주기도나타나지않을뿐아니라 arrhythmic 한현상을나타낸다. in vitro 에서는 dclk ( ) 이전사활성을잃어버리지만 in vivo 에서는 dper 와 TIM 이시간에따라 thythmic 하게생성되는것은매우흥미롭다. 이는 dclk ( ) 단백질의분자적생화학적결함이 in vivo 에서는다를수있다는것을시사하는것으로이에대한연구는앞으로더욱진행되어야할것이다. 이러한 dclk 의아미노산 의역할을현재기술한논문에서전사활성, 단백질의변화, 그리고행동학적측면에서관찰하였는데앞으로의또다른접근의연구가필요할것이라고생각된다. 그래서우리는첫째, 형질전환초파리의생체내 gene 들의 RNA level 을확인할것이다. 둘째, dclk 과 dper 가생채내에서도결합할수있는지 Immunoprecipitation(IP) 을통해조사할것이다. in vitro 의결과와동일하다면생체내에서도결합하지못할것이다. 현재진행중에있는이러한연구들이결실을맺게된다면생체시계연구분야의생화학적 분자생물학적기전을이해하는데매우중요한역할을할것이라생각된다

51 V. 결론 모든생명체는생체시계를가지고있으며, 생체시계의핵심기전은 interlocked transcriptional-translational feedback loop 으로써두개의 loop 이서로맞물려생체시계의핵심유전자들의발현이하루 24 시간을주기로진동할수있도록한다. 앞서발표된논문에서 dper 의아미노산 의역할이 dclk 이결합하는부위로밝혀졌고 (Sun 등 2010), 우리는 dclk 의아미노산 의역할을밝혀내기위해연구를진행하였다. 먼저 dclk 에서아미노산 이제거된 plasmid 를만들었고, 이것을이용하여 S2 세포에서 immunoprecipitation(ip) 을통해확인결과 dper 가결합하지 못하였다. 뿐만아니라 dper 의전사활성억제가일어나지않음에도 dclk 에서아미노산 이제거된 plasmid 는전사활성자체가없어지는것을관찰할수있었다. 이현상이 dclk 과이형이합체를형성하는 CYC 가결합하지못해서일어나는현상이아니라는것을 Immunoprecipitation (IP) 를수행함으로써알수있었다. 초파리수준에서 dclk 의아미노산 의역할을연구하기위해아미노산 이제거된 dclk 을발현하는초파리를제작하였다. 제작한형질전환초파리를이용하여하루중생체리듬을측정한결과 정상적인 dclk 을발현하는초파리는정상적인 rhythm 을나타내는데 비해 dclk( ) 을발현하는초파리는두개의독립적인라인에서 activity 에서는차이가보이긴했으나모두 arrhythmic 해지는것을알수

52 있었다. 그리고 dclk( ) 을발현하는초파리의 molecular rhythm 에서는 in vitro 의결과에서예상치못했던 PER 와 TIM 단백질의생성이 WT 에비해 level 이낮지만 rhythmic 하게만들어진다는사실을알게되었다. 이것을좀더자세히알아보기위해 12:12 LD 상태에둔초파리와하루동안어둠상태에둔초파리의 mrna 의변화량을확인한결과 dclk 의경우 WT 에비해 PER 에의한저해를받지않기때문에 level 이높은것을확인할수있었지만시간에따른변화량은 WT 과비슷한주기를가지고있었다. 하지만 tim 의경우에는 12:12 LD 상태에둔초파리의하루동안의변화량은 WT 에비해 level 이낮으며거의주기를가지지않는것으로 확인이되었다. 이결과는우리가만든 dclk( ) 을발현하는 초파리가전사활성을잃어버리는것에의해예측가능한결과였다. 하루동안에어둠상태에놓였던초파리의 dclk 의 mrna 변화량은 WT 과크게차이가없으며 level 이더높은것을볼수있는데 tim 의 mrna 변화량은 WT 에비해전사활성이더욱떨어진것을확인할수있었다.tim mrna 가시간에따른주기를가지지못하면서늦은저녁인 CT 20 에서 peak 을나타내는데 mrna 에서도시간에따른변화가 molecular level 의변화와일치하는현상을확인할수있었다

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55 DOUBLETIME kinase binding domain on the Drosophila PERIOD protein is essential for its hyperphosphorylation, transcriptional repression, and circadian clock function. Mol Cell Biol. 27(13): Sun WC, Jeong EH, Jeong HJ, Ko HW, Edery I, Kim EY Two distinct modes of PERIOD recruitment onto dclock reveal a novel role for TIMELESS in circadian transcription. J Neurosci. 30(43): Darlington TK, Wager-Smith K, Ceriani MF, Staknis D, Gekakis N, Steeves TD, Weitz CJ, Takahashi JS, Kay SA Closing the circadian loop: CLOCK-induced transcription of its own inhibitors per and tim.science. 280(5369): Hardin PE The circadian timekeeping system of Drosophila.Curr Biol. 15(17):R Cyran SA, Yiannoulos G, Buchsbaum AM, Saez L, Young MW, Blau J The double-time protein kinase regulates the subcellular localization of the Drosophila clock protein period. J Neurosci. 25(22): Glossop NR, Houl JH, Zheng H, Ng FS, Dudek SM, Hardin PE VRILLE feeds back to control circadian transcription of Clock in the Drosophila circadian oscillator. Neuron. 37(2):

56 Markstein M, Zinzen R, Markstein P, Yee KP, Erives A, Stathopoulos A, Levine M A regulatory code for neurogenic gene expression in the Drosophila embryo.development. 131(10):

57 -Abstract- Role of PERIOD binding domain for CLOCK in Drosophila circadian clock Doo-Hyun Kang Department of Medical Sciences (Neuroscience) The Graduate School, Ajou University (Supervised by Associate Professor Eun-Young Kim) Negative transcriptional feedback loops are a core feature of eukaryotic circadian clocks and are based on rhythmic interactions between clock-specific repressors and transcription factors. In Drosophila, the repression of CLOCK (CLK)-CYCLE (CYC) transcriptional activity by PERIOD (PER) is critical for driving circadian gene expression. To better understand how PER inhibits CLK-CYC transcriptional activity, we sought to identify PER binding domain of CLK. To this end, we made several versions of mutant CLK which is internally deleted with 100~ 200 amino

58 acids.we evaluated the interaction between each CLK internal deletion mutants and PER via immunoprecipitation. CLK internally deleted with aa , which is similar to 19 region of mammalian CLK, could not interact well with PER in S2 cells. To investigate the role for amino acid in vivo,we made transgenic flies expressing Clk while clk-wt rescued the arrhythmicity of clk OUT flies, CLK could not restore arrhythmic locomotorbehavior.this result suggest that as in the case of S2 tissue culture, amono acid might play critical roles for maintaining circadian clock system. Further study will be necessary to investigate the role of amino acid in vivo using Clk ;Clk OUT flies Keywords: Drosophila, Circadian clock, dperiod, dclock, per binding domain, Transcription