Custom ligonucleotides 깨끗하게 Dry 된 올리고는 Aqueous solution 에 대개 잘 녹습니다만 간혹 ligo 를 녹이시는데 약간의 시간이 더 걸리실 수 있습니다. 그럴 때는 약간의 ah 용액을 넣어주면 용해시킬 수가 있습니다. 그리고 용액상

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1 Custom ligonucleotides 취급 및 보관 Q. 올리고는 어떻게 보관하며 얼마나 오래 가나요 일반적으로 올리고는 20 에서 1 년 이상 안정하다고 볼 수 있습니다. 특히 건조한 상태에서는 매우 안정적이며 오래 보관하실 수 있습니다. 용액 상태에서도 안정하지만 nuclease 등의 contamination 에 의해 degradation 될 수도 있습니다. 또한 올리고는 얼렸다 녹였다 를 반복하게 되면 분해를 촉진시켜 품질의 이상이 발생될 수 있으므로 합성 올리고는 받으신 후에 여러 개로 분주하여 각각을 보관하신 뒤 필요량만큼 따로 사용하시는 것이 바람직하며, 용액 상태로 보관할 때에는 멸균 증류수에 녹이는 것 보다 TE (10mM Tri-HCl (ph8.0), 0.1mM EDTA) Buffer 에 녹여두시면 더 오래 보관할 수 있습니다. DA 의 경우는 acidic 한 조건에서는 depurination 에 의해 decompose 될 수 있으니 ph 를 낮추지 말아야 하며 RA 의 경우는 높은 ph 에서는 hydrolysis 에 의해 phosphodiester bond 가 깨질 수 있으니 주의를 요합니다. ligo 형상 및 보관 방법에 따른 Self life Storage Condition Shelf Life (Month) at RT in water 2 at 4 in water 9 at -20 in water 18 at -20 (Dry) 24 Q. 올리고는 어떻게 용해시키나요? 일반적으로 올리고는 20 에서 1 년 이상 안정하다고 볼 수 있습니다. ligo 는 일반적으로 Dry 된 형태로 공급됩니다. 때때로 Dry 된 올리고는 운반되는 도중에 바닥에서 떨어질 수 있습니다. 올리고가 이렇게 바닥에서 떨어지게 되면 맨 처음 제품의 뚜껑을 여는 순간 쉽게 날아가 버릴 수도 있습니다. 특히 사용자가 Latex Glove 등을 착용하고 뚜껑을 여신다면 마찰전기로 인해 날아갈 확률이 증가됩니다. 처음 올리고를 받으시고 뚜껑을 여시기 전 먼저 Centrifuge 에 잠시 돌리신 후 뚜껑을 열어주십시오. 1

2 Custom ligonucleotides 깨끗하게 Dry 된 올리고는 Aqueous solution 에 대개 잘 녹습니다만 간혹 ligo 를 녹이시는데 약간의 시간이 더 걸리실 수 있습니다. 그럴 때는 약간의 ah 용액을 넣어주면 용해시킬 수가 있습니다. 그리고 용액상태로 보관할 때에는 멸균증류수에 녹이는 것보다 TE (10mM Tri-HCl (ph8.0), 0.1mM EDTA) Buffer 에 녹여두시면 더 오래 보관할 수 있습니다. 만약 올리고가 잘 녹지 않을 경우 60~70 water bath 에 10~15 분간 incubation 시킨 후 vortex 하여 centrifuge 후에 사용하시기 바랍니다. Q. Fluorescent dye modified 올리고는 어떻게 보관해야 하나요? 빛에 노출되면 형광이 약해질 수 있으므로 빛이 차단된 용기에 보관하시고 또 저장하는 장소도 빛이 들어오지 않는 장소에서 보관하시는 것이 좋습니다. Preferred TE Buffer Reconstitution & Storage ph for Fluorescent Probes 6-FAM, HEX, TET, RX, and TAMRA TE Buffer ph 7.5 or 8.0 Cy3, Cy3.5, Cy5, and Cy5.5 TE Buffer ph 7.0 or 7.5 Cy dyes rapidly degrade in acidic ph Q. 올리고 용액을 상온에서 일주일 이상 방치했는데 괜찮을까요? Contamination 만 되지 않았다면 물론 큰 문제는 없습니다. 정량 및 농도 Q. 올리고의.D. 값은 무엇을 의미하나요? 합성 올리고는 매우 미량이라 어느 정도의 양이 있는지 무게를 재서 알아내기는 매우 힘듭니다. 따라서 올리고의 빛의 흡광도를 측정하여 간접적으로 합성 올리고의 정량을 하게 되는데 이때 빛의 흡수량을.D. (ptical density) 값으로 표시합니다 Q. 합성 올리고의 양을.D. 값으로부터 어떻게 얻어내나요? 합성 올리고를 파장 260nm 의 UV Light 에서.D. 값을 측정한 뒤 다음과 같은 수식을 이용하여 합성된 올리고의 양을 얻어냅니다..D. = εc 2

3 Custom ligonucleotides 이때는 Extinction Coefficient 로서 물질이 빛을 흡수하는 정도를 나타내는 상수로 물질에 따라 고유한 값을 가지며 C 는 올리고의 농도를 의미한다. 올리고의 Extinction Coefficient 값을 안다면 ε 값과.D. 값을 상기의 식에 적용하여 용액의 Concentration, 즉 올리고의 양을 알 수 있게 된다. 올리고의 ε 값은 각 base 의 Extinction Coefficient 값의 (표 1) 합으로 계산하는 방법과 base 간의 sequence 관섭에 의한 차이를 고려한 Extinction Coefficient 값의 (표 2) 합으로 계산하는 방법이 있는데 각각의 260nm UV Light 에서의 각 base 의 Extinction Coefficient 값과 관섭에 의한 Extinction Coefficient 값은 다음과 같습니다. (표1) da dc 7400 dg dt 8700 (표2) 5' -> 3' da dc dg dt da 27,400 21,200 25,000 22,800 dc 21,200 14,600 18,000 15,200 dg 25,200 17,600 21,600 20,000 dt 23,400 16,200 19,000 16,800 따라서 전체 올리고의 Extinction Coefficient 값은 계산방식에 따라 편차가 발생하게 됩니다 Q. 다음과 올리고 (3G, 4C, 5A, 6T / GGGCCCCAAAAATTTTTT) 18mer의 전체.D. 값이 0.7이었다면 올리고의 양은 얼마나 되나요? 올리고의 양은 흡광 계수 (Extinction Coefficient)를 구하는 방법에 따라 다음과 같이 계산됩니다. (표 1)에 의한 흡광 계수 (Extinction Coefficient) = G 의 염기개수 * C 의 염기개수 * A 의 염기개수 * T 의 염기개수 * 8700 = x x x x 6 = (ml/mole) 따라서.D. = εc 에 대입하여 계산하면 C = 0.7 /193.3 = (mmole/ml) = 3.6 (nmole/ml)이 된다. (표 2)에 의한 흡광 계수 (Extinction Coefficient) 3

4 Custom ligonucleotides = (GG + GG + GC + CC + CC + CC + CA + AA + AA + AA + AA + AT + TT + TT + TT + TT + TT) - (G + G + C + C + C + C + A + A + A + A + A + T + T + T + T + T) = ( ) - ( ) = (342,200) - (173,100) = 169,100 (ml/mole) 따라서.D. = εc 에 대입하여 계산하면 C = 0.7 /169.1 = (mmole/ml) = 4.14 (nmole/ml)가 된다. 자사에서는 (표 2)에 의한 방법을 도입하여 적용하고 있으며, 이 결과는 ligo Synthesis Report 상의 'Total nmole' 수치로 나타납니다. Q. 합성 올리고의 분자량 (Molecular Weight) 측정은 어떻게 하나요? 다음의 수식에 각 base 의 수를 대입하여 계산합니다. M.W. =(A x 249.2) + (C x 225.2) + (G x 265.2) + (T x 240.2) + (oligolength-1) x 63.98) A = Total number of A C = Total number of C G = Total number of G T = Total number of T Q. 합성 Scale의 umole 단위를 ng 단위로 변환하는 방법은 어떻게 되나요? 일반적으로 올리고의 합성 scale 은 umole 단위로 신청되며 합성된 결과도 보통 nmole 단위로 report 됩니다. 4

5 Custom ligonucleotides 하지만, 사용하고자 하실 때 ng 또는 ug 단위로 하신다면 mole 을 g 으로 환산하시면 됩니다. Report 에 올리고의 분자량이 표시되기 때문에 쉽게 바꿀 수 있습니다. 분자량 M.W (g) X mole 수 (nmole) = 올리고의 양 (ng) Q. 긴 올리고는 Base Composition을 몰라 정량 하기가 어려운데 대략적으로 알 수는 없을 까요? 대략적으로 single strand 올리고의 경우 1.D 값이 ~33 ug 이며 double strand DA 경우는 ~50 ug 정도가 됩니다. 하지만 짧은 길이의 올리고의 경우는 이 값과 차이가 많이 나기 때문에 정확한 정량을 위해서는 계산을 해서 사용하시는 것이 좋습니다. Q. 합성 올리고의 Tm값은 어떻게 계산하나요? Tm (melting temperature)는 oligonucleotide 중 50%가 duplex 형태를 이루고 나머지 50%는 single-strand 형태를 지닐 때의 온도를 말하며, 이에 영향을 미치는 Factor 로는 oligonucleotide 의 sequence 와 반응에 사용되는 oligonucleotide 의 농도, 그리고 반응 시 salt 농도 등이 있습니다. Tm 계산방법은 여러 가지가 있으나 이중 바이오니아에서는 nearest-neighbor 방법 (PAS 83, )을 이용합니다. 이 방법이 나오기 전에는 몇 가지 예측방법이 있었는데, 15base 미만에서 잘 예측되는 방법으로 A 와 T 에는 2 도를 곱하고 G 와 C 에는 4 도를 곱해서 이들 값을 더하는 방법 (Wallace rule)이 있었습니다. Tm = 2 C (A + T) + 4 C (G + C) 또 다른 방법으로 GC content 를 기초로 한 방법으로 긴 sequence 에서 잘 예측되는 방법이 있습니다. Tm = (%GC) - 500/[L] log [M] ([L]; oligonucleotide 길이, [M]; monovalent cation 의 농도) 하지만 이 같은 방법들은 base stacking effect 를 고려하지 못하고 있고 예측의 정확도가 떨어져서 현재로는 nearest neighbor 방법이 가장 많이 사용 되고 있습니다. (물론 nearest neighbor 방법도 bp 이상에서와 15 bp 이하에서는 예측의 정확성이 떨어진다.) 바이오니아에서 사용하는 earest neighbor 방법의 가장 큰 특징은 base 간의 sequence 의 서열에 따라 Hybridization 에 미치는 영향이 다르다는 것을 감안하여 예측하는 방법으로 열역학적으로 2 개의 base 간의 hybridization 효과를 모두 열역학적으로 측정하여 이를 통해 Tm 값을 예측해내고 있습니다. 5

6 Custom ligonucleotides 일 예로 5'-GC-3' 인 sequence 와 5'-CG-3'의 열역학적 측정치는 서로 다릅니다. 이와 같이 2base 간이 이룰 수 있는 가능한 조합을 모두 측정하여 변수로 사용하고 있습니다. nearest-neighbor 방법의 계산식은 아래와 같다. Enthalpy (dh) X 1000 Tm = (12.0 X log([salt])) Entropy(dS) + (R X ln([ligo])) 여기서 계산되는 Enthalpy 값과 Entropy 값은 위에서 미리 2base 간에 측정된 열역학 값을 이용하여 해당 oligonucleotide 의 sequence 에 따라 결정됩니다. 이때 Salt 반응에 참여하는 monovalent cation 의 농도를 말하며 ligo 는 반응에 들어가는 ligo 의 농도를 말한다. R 은 Gas Constant (1.987 cal K-1mole-1) 를 의미합니다. 당사의 Tm 값은 이 같은 식에 의거하여 계산되며, Salt 농도는 50 mm 로 그리고 oligo 농도는 1nM 을 기준으로 계산 되었습니다. 이상과 같은 방법으로 바이오니아는 합성유전자의 Tm 값을 예측하여 고객님께 제공하고 있습니다. 하지만 Tm 값은 예측치일 뿐이지 절대적인 값은 아닙니다. 특히 실험자기 Template 를 준비하는 과정에서 생기는 여러가지 불순물과 salt 들은 위의 식에 의해 예측할 수 없기 때문에 실험자는 Tm 값을 참고 자료로 실험을 수행하는 것이 좋으며, 실험결과가 나오지 않을 경우 해당 Tm 값보다 4-5 도 낮은 조건으로 실험에 이용하는 것이 좋습니다. 물론 기준 Tm 값에서 on-specific product 가 많은 경우에는 annealing temperature 를 높여가면서 원하는 정확한 product 를 얻을 수 있는 실험조건을 찾아가야 합니다. Q. 본인이 제작한 올리고의 Tm값과 바이오니아에서 제공한 Tm 값이 차이가 나는 이유는 무엇인가요? 바이오니아에서 사용하는 TM calculator 는 일반적으로 A, G, C, T 의 갯 수에 일정 값을 곱하기 하는 단순한 계산 방식과는 다른 것으로서 A, G, C, T 의 배열 순서에 따라 Tm 값은 차이가 나게 됩니다. 즉, 한 염기의 뒤에 오는 sequence 가 무엇이냐에 따라 전체 염기 수는 같아도 Tm 은 다르게 되며 보다 정밀하다고 할 수 있습니다. 6

7 Custom ligonucleotides Q. 합성 올리고의 농도 맞추는 방법에 대한 설명. 우선 올리고 합성 시트에 쓰여있는 'volume for 100 pmole/ul' 라는 말은 100 pmole/ul 의 농도로 만들기 위해 첨가해야 할 TE buffer 나 D.W 의 양을 이야기 합니다. 받으신 리포트용지에 각각 과 라고 적혔다면, 각 oligomer tube 에 적힌 대로 각각 D.W 등을 ul 와 ul 를 각각 첨가했을 때 농도가 100 pmole/ul 가 된다는 것입니다. 즉, 각 tube 에는 oligomer 가 ul x 100 pmole/ul = 18,900 pmole = 18.9 nmole, ul x 100 pmole/ul = 20,920 pmole = nmole 씩 들어 있습니다. 사용하시는 목적에 따라 primer 의 농도를 알맞게 설정하여야 하지만, 일반적으로 PCR 이나 sequencing 의 경우 100 pmole/ul 정도의 농도로 사용하실 때 편리하기에 본사에서 제공하는 sheet 에는 농도를 100 pmole/ul 로 만들기 위한 volume 을 제공하는 것입니다. 0.5 um 로 primer 를 사용하시려고 하신다면, 본사의 sheet 에서 제시하는 것처럼 primer 의 농도를 결정하였을 때, pmole/ul 농도를 um 농도로 바꾸어주면 100 pmole/ul = 100 x 106 pmole/106 ul = 100 x 106x mole/l = 10-4 mole/l = 10-4 x 106 umole/l = 102 umole/l = 100 um 즉, 100 um 가 됩니다. 이 농도는 사용하시려는 0.5 um 의 200 x 농도가 되므로, 최종반응 volume 의 1/200 만큼 primer 를 사용하시면 원하시는 0.5 um 가 됩니다. 50 ul 로 PCR 을 한다면, 50/200 = 0.25 ul 만큼을 첨가하시면 원하시는 농도로 반응을 할 수 있습니다. 만일 0.25ul 를 pipetting 하기 힘들다면, 100 um 의 primer 를 1/10 혹은 1/20 으로 dilution 한 후 사용하신다면, 각각 2.5 ul (1/10 의 경우), 혹은 5 ul (1/20 의 경우)를 최종 반응에 사용하면 됩니다. 7

8 Custom ligonucleotides Q. Morlarity와 mole의 단위변환. ligomer 의 기본농도는 M (mole/l) 이고, 경우에 따라서 그 앞에 붙는 u (micro), n (nano), p (pico) 등의 첨자들은 M 을 보조하는 단위들입니다. 이 단위들은 다른 길이, 질량 등의 unit 들과도 함께 사용되므로 이에 대해서는 다음을 참조하시기 바랍니다 = deci[d] 101 = deca[da] 10-2 = centi[c] 102 = hecto[h] 10-3 = milli[m] 103 = kilo [k] 10-6 = micro [u] 106 = mega [M] 10-9 = nano[n] 109 = giga[g] = pico[p] 1012 = tera[t] = femto[f] 1015 = peta[p] pmole/ul = 1x10-12 mole / 1x10-6 L = 1x10-6 mole / L = 1 umole/ L = 1 um 이므로, um 과 pmole/ul 는 같은 단위가 됩니다. 합성 및 주문 Q. 올리고는 어떻게 합성되는지 알고 싶습니다. 현재 ligonucleotide 합성기에서 가장 보편적으로 사용되는 합성방법은 Koster 에 의해 개발된 -cyanoethyl phosphoramidite 를 이용하여 DA 구조의 골격을 이루는 phosphodiester 결합을 연결해가는 phosphite triester 방법이다. 8

9 Custom ligonucleotides (ucl. Acids Res. 1984, 12, 4539 ; Tetrahedron Lett. 1983, 24,5843) 이를 통해 원하는 ligonucleotide 를 높은 효율로 합성할 수 있으며 (합성효율 : >98%) 합성 시 사용되는 phosphoramidite monomer 는 coupling 을 위해 활성화되기 전에는 상당히 안정되어있어 장기 보관도 가능하고 또한 이를 이용한 ligonucleotide 의 합성 시간도 다른 방법들에 비해 짧다는 장점을 지니고 있다. 합성 과정은 nucleoside 가 부착된 고형지지체 상으로부터 시작하여 deblocking, coupling, oxidation, capping 으로 이루어지는 cycle 을 반복함으로써 원하는 길이의 ligonucleotide 를 얻게 된다. <그림 1 참조> B n H P - Final Cleavage/Deprotection B P - n-2 B 1 H DMT B 2 * P B 1 * C Deblocking H B 1 * DMT B 1 * Ac B 1 * Capping xidation B 2 * DMT P Coupling B 1 * C DMT B 2 * (ipr) 2 P (CH 2 ) 2 C Activation w/ Tetrazole <그림 1 > (1) Deblocking 합성 cycle 의 첫 단계인 deblocking 과정은 고형지지체로부터 DMT 기를 떼어냄으로써 시작되며 이때 산성 조건이 요구되어 보통 3% trichloroacetic acid 를 사용한다. 한편 산성 조건 하에서는 purine 계열 염기와 sugar ring 사이의 결합이 끊어지는 depurination 반응이 일어날 수 있으며 특히 염기가 adenosine 인 경우에는 그 경향이 더 심할 수 있다고 보고되었다. Trichloroacetic acid 는 매우 강한 산으로 (pka : ~1.5) deblocking 에 사용할 때 depurination 시킬 가능성이 있어 너무 오랫동안 deblocking 반응을 하지않도록 주의가 요구된다. 상기의 문제점을 최소화하기 위해 trichloroacetic acid 대신 약한 산인 dichloroacetic acid 가 쓰여지기도 한다. Deblocking 시 고형지지체로부터 떨어져나가는 DMT 양이온은 진한 주황색을 띄는데 이의 흡광도를 통해 올리고 합성 시의 결합효율을 측정하는 데에 이용할 수 있다. 9

10 Custom ligonucleotides (2) Coupling Deblocking 과정을 통해 생성된 고형지지체내의 5'-hydroxyl 기는 nucleoside phosphoramidite monomer 와 coupling 반응을 통해 원하는 sequence 의 ligonucleotide 를 합성하게 된다. 이때 사용되는 nucleoside phosphoramidite monomer 는 그림 2 에서 보듯이 염기부분의 amine 기는 보통 benzoyl 기(adenosine, cytidine 경우) 또는 isobutyryl 기로(guanosine 경우) 보호되어있으며 모든 monomer 는 5 -hydroxyl 기가 DMT 로 보호되어있어 계속되는 결합반응의 연결부분 역할을 하게 된다. <그림 2 참조> CH 3 H CH 3 H H 3 C H 3 C H P P C da-phosphoramidite C dg-phosphoramidite CH 3 H CH 3 H CH 3 H 3 C H 3 C P P C dc-phosphoramidite C T-phosphoramidite < 그림 2 > 사용되는 phosphoramidite 구조는 그 자체로는 상당히 안정되어있으므로 고형지지체의 5 -hydroxyl 기와 결합하기 위해서는 활성화 과정이 필요하다. 보편적으로 사용되는 activator 로는 tetrazole 로서 phosphoramidite 와 반응하여 nitrogen 부분을 protonation 시킨 뒤 diisopropyl amino 기를 치환시켜 매우 반응성이 강한 tetrazolide 구조로 변환시킨다. 결과적으로 반응성이 강한 tetrazolide 와 고형지지체의 5 -hydroxyl 기간의 결합반응을 통해 ligonucleotide 의 사슬이 이어지게 되는데 이때 약간의 수분이라도 존재하면 반응성이 강한 tetrazolide 와 반응하여 원하지 않는 부산물을 생성하여 합성 수율을 저하시키기 때문에 coupling 과정에서는 무수 조건이 필수적이다. 10

11 Custom ligonucleotides (3) xidation Phosphoramidite 와 5 -hydroxyl 기간의 coupling 과정을 거쳐 생성된 결합 구조는 본래의 phosphodiester 구조가 아닌 phosphite triester 구조로서 더 안정된 phosphate 로 변환시키는 과정이 필요하게 된다. 이를 위해서는 iodine 을 사용한 oxidation 반응이 사용되며 결과적으로 phosphite 는 phosphate 로 바뀌게 된다. (4) Capping Coupling 반응은 정량적으로는 일어나지는 않기 때문에 (보통 >98%) coupling 후 고형지지체에는 반응하지 않은 5'- hydroxyl 기가 남아있게되며 이는 다음 cycle 의 coupling 과정에 참여하여 원하지 않는 염기배열을 갖는 (-1)mer 를 생성하는 주 원인이 된다. 이렇게 생성된 부 반응물들은 합성완료 후 원하는 ligonucleotide 의 정제를 어렵게 만들기 때문에 coupling 과정 후 반응하지 않고 남아있는 고형지지체내의 5 -hydroxyl 기를 blocking, 다시 말해 capping 할 필요가 있다. 이를 위해 acetic anhydride 와 -methylimidazole 을 사용하여 acetylation 시킴으로써 반응하지않고 남아있는 고형지지체내의 5'- hydroxyl 기를 capping 시키게 된다. 원하는 길이의 ligonucleotide 의 합성은 상기의 과정들을 반복하여 실시함으로써 이루어지며 합성이 완료되면 최종적으로 ammonia 처리를 하여 합성된 ligonucleotide 를 고형지지체로부터 떼어낸 뒤 정제과정을 거쳐 순수한 ligonucleotide 로 얻게 된다. 11

12 Custom ligonucleotides Q. Standard ligo structure Q. 50 nmoles scale로 주문했는데 합성량이 그 보다 적은 이유는? 50 nmole scale 합성은 최종 올리고의 양이 50 nmole 이 된다는 것이 아니라 합성 출발물질의 양을 50 nmole 로 하여 합성을 시작한다는 것을 의미합니다. 따라서 합성 및 정제된 최종 올리고의 양은 올리고의 길이, 합성효율(coupling efficiency, 보통 >98%), 염기조성 등에 따라 변하게 됩니다. Q. G가 여러 개 반복되는 올리고를 합성할 수 있을까요? G 가 여러 개 반복되는 올리고는 합성에 상당히 어려움이 있습니다. G 가 4 개이상 반복되면 guanie tetraplex (Poon and MacGregor (198) Biopolymers 45: )형태로 aggregation 되기 싶기 때문입니다. 이때는 Inosine 을 몇 개의 g 대신 첨가하여 aggregation 을 방지할 수 있습니다. 12

13 Custom ligonucleotides 저희 바이오니아 사에서는 오랜 합성 경험을 통해 얻은 기술로 10 연속 G 가 포함된 올리고도 큰 어려움 없이 합성해 오고 있습니다. Q. RA 합성도 가능한가요? 네, 가능합니다. 원래의 RA 구조와 같이 2 -H 구조의 A, C, G, U 를 원하시는 sequence 로 합성하실 수 있습니다. 또한 2 --Methyl 형태의 RA 합성도 가능하며 DA 와 RA 가 섞여있는 chimeric 올리고의 합성도 가능합니다. Q. 합성된 올리고에는 5 또는 3 위치에 phosphate가 붙어있습니까? 주문하실 때 별도로 지시하지 않으면 5 과 3 위치에는 H 기가 붙어있습니다. 따라서 5 phosphate 가 부착된 올리고를 원하시면 5 phosphorylation modification 된 올리고를 주문하셔야 합니다. Q. Degenerated primer와 universal primer의 정의에 대해 알고 싶습니다. 예를 들어, A 라는 종(species)에서 a 라는 gene 의 sequence 가 5'-gga ttc ggg ccc gag tct-3' 이고, B 라는 종에서는 5'-ggc ttc ggg ccc gaa tct-3' 이라고 가정한다면 또 다른 C 라는 종에서의 a 라는 gene 의 sequence 는 5'-gga/c ttc ggg ccc gag/a tct-3' 이라고 예측할 수 있습니다. (즉, 3 번째 염기는 adenine 이나 cytosine, 15 번째 염기는 guanine 이나 adenine) 이와 같은 경우, 이 유전자에 해당하는 degenerate primer 는 5'-ggM ttc ggg ccc gar tct-3' 가 됩니다. 약속하여 표기합니다.) ( 보통 아래처럼 R <- a or g Y <- c or t M <- a or c K <- g or t S <- g or c W <- a or t V <- a, c, or g H <- a, t, or c B <- g, t, or c 13

14 Custom ligonucleotides D <- g, a, or t <- a, c, g, or t 즉, degenerated primer 는 sequence 상의 유사성을 고려하여 유사한 sequence 에 binding 할 수 있도록 하나의 위치에 두개이상의 base 가 있는 primer 를 말합니다. 위의 경우에는 두 위치에서 각각 두개의 base 가 선택될 수 있으므로 모두 4 종류의 sequence 가 섞여있는 primer 를 design 할 수 있습니다. Universal primer 는, Cloning 작업에서 많이 사용되는 plasmid 들은 대부분 pbr322 계열을 기반으로 하여 M13 bacteriophage 의 sequence 를 이용하여 조금씩 변형된 것들입니다. 따라서, 대부분의 plasmid 들이 공통된 sequence 를 가지고 있습니다. 예를 들면, T7 promoter 나 SP6 promoter, T7 terminator, 혹은 M13 forward/reverse 등입니다. 이런 공통된 sequence 에 binding 할 수 있도록 design 된 것들이 universal primer 입니다. 보통 universal primer 를 이용하여 vector 에 삽입된 DA fragment 를 sequencing 합니다. Modified ligo Q. Modified ligo의 종류와 구조를 알고 싶습니다. 올리고의 다양한 응용을 위해서는 modified 된 올리고의 사용이 필요하며 올리고를 modification 하기 위해서는 여러가지 방법이 응용될 수 있으나 가장 간편한 것은 phosphoramidite 방법을 이용하여 올리고 합성기를 통해 올리고 상에 label 을 부착하는 것이다. 올리고의 5 위치에 modification 이 필요한 경우는 정해진 염기배열의 올리고의 합성이 완료된 후 label phosphoramidite 를 사용하여 5 위치에 결합시킴으로써 결과적으로 올리고의 5 위치에 label 을 부착하게 된다. 3 -Modification 의 경우는 5 -modification 보다 복잡해지는데 일반적으로는 label 이 미리 부착된 고형 지지체로부터 올리고의 합성을 수행함으로써 3 위치에 label 이 부착된 올리고를 합성할 수 있게 된다. Deoxyuridine 의 base 의 5 위치에 label 을 도입한 phosphoramidite 를 이용하면 올리고 합성 시 원하는 sequence 에 label 을 도입할 수 있어 결과적으로 internal modified 올리고의 합성이 가능하게 된다. 다음은 저희 바이오니아에서 합성 제공하는 modified 올리고입니다. 14

15 Custom ligonucleotides (1) 5 Amine & 3 amine modification : The presence of a primary aliphatic amine group at the terminus of an oligonucleotide allows the post synthesis attachment of a number of amine reactive molecules. The amino modified oligonucleotides can also be used for the immobilization of the desired oligonucleotide on the matrix to make the oligonucleotide-based microarray. H 2 5' 3' P oligonucleotide H H 5 -Amino Modified ligo 5' 3' H oligonucleotide H P H H H 2 3 -Amino Modified ligo (2) 5 Phosphorylation & 3 phosphorylation : 5 -Phosphorylated oligonucleotides are commonly used in site directed mutagenesis and linker insertion. H 5' 3' P H oligonucleotide H 5 -Phosphorylated ligo 5' 3' H oligonucleotide H P H 3 -Phosphorylated ligo 15

16 Custom ligonucleotides (3) 5 Thiol Modification : Thiol modification at the 5 end of an oligonulceotide allows further derivatization of thiol reactive molecules. The thiol moiety in the oligonucleotides can be conjugated to varieties of fluorophores for DA sequencing and hybridization. HS 5' 3' P oligonucleotide H H (4) 5 Biotin & Internal Biotin Modification : Biotinylated oligonucleotides are used for a number of applications, which include colorimetric detection of DA and solid phase capture by Streptavidin coated magnetic beads for use in restriction mapping, genomic walking and differential display. H H S H 5' 3' P oligonucleotide H H 5 -Biotinylated ligo 5' H H H S H P - 3' Internal Biotin Modified ligo 16

17 Custom ligonucleotides (5) 5 Fluorescein, 3 Fluorescein & Internal fluorescein modification : Fluorescent dye-labeled oligonucleotides have been widely used in automated DA sequencing, quantitative PCR, and in situ hybridization reactions. Among the variety of fluorescent dyes, fluorescein (excitation/emission maxima ~494/520nm) is one of the most commonly used fluorophores in labeling and detection of biomolecules. In addition to its relatively high absorptivity, excellent fluorescence quantum yield, fluorescein has an excitation maximum that closely matches the 488nm spectral line of the argon-ion laser, making it the predominant fluorophore of confocal laser scanning microscopy and flow cytometry applications. Fluorescein, however, has several drawbacks, including a relatively high rate of photobleaching, as well as phsensitive fluorescence (pka ~6.4) that is significantly reduced below ph 7. In spite of these drawbacks fluorescein has still been the mostly used fluorescent dye due to its good availability. H H H 5' 3' P H oligonucleotide H 5 -Fluorescein Modified ligo 5' 3' H oligonucleotide H P H H H H H 3 -Fluorescein Modified ligo 17

18 Custom ligonucleotides 5' H H H P - H 3' Internal Fluorescein Modified ligo (6) 5 Tamra & 3 Tamra modification : Rhodamines are considered more photostable fluorescent dyes compared with fluorescein s drawbacks of photobleaching susceptibility and ph dependency. Rhodamines spectra are not affected by changes in ph between 4 and 10, an important advantage over the fluoresceins for many biological applications. The most common member of these rhodamine groups is tetramethylrhodamine (Tamra) which is an important fluorophore for oligonucleotide labeling and automated DA sequencing applications. The fluorescence quantum yield of Tamra conjugates is usually only about one-fourth that of fluorescein conjugates. However, because Tamra is readily excited by the intense 546 nm spectral line form mercury-arc lamps used in most fluorescence microscopes and is intrinsically more photostable than fluorescein, Tamra conjugates often appear to be brighter than the corresponding fluorescein conjugates. Tamra is also efficiently excited by the 543 nm spectral line of the green He-e laser, which is increasingly being used for analytical instrumentation. Tamra conjugates are not well excited by the 568 nm line of the Ar-Kr mixed gas laser used in many confocal laser scanning microscopes. H 5' 3' P H oligonucleotide H 5 -Tamra Modified ligo 18

19 Custom ligonucleotides 5' 3' H oligonucleotide H P H H H 3 -Tamra Modified ligo (7) Spacer modification : Incorporation of a phosphoramidite containing a variety of spacers between the oligonucleotide and a subsequently attached label may be necessary in situations where a label interferes with oligonucleotide hybridization. H 5' 3' P H oligonucleotide H C-3 Spacer H 5' 3' P H oligonucleotide H C-6 Spacer H 5' 3' P H oligonucleotide H C-12 Spacer H 5' 3' P H oligonucleotide H 18-Atom Spacer 19

20 Custom ligonucleotides (8) Inosine modification : Deoxyinosine forms stable base pairing with an order of stability of I:C > I:A > I:T = I:G. ligonucleotides containing inosine may be used in applications where the detection or analysis of distinct but similar DA sequences by probe hybridization or PCR is carried out. 5' H P - 3' Inosine Modified ligo (9) Phosphorothioate modification : The modified backbone of an S-ligo is resistant to the degradation by most endo- and exonucleases. This property allows increased intracellular effectiveness of antisense oligonucleotides. The replacement of the inter-nucleotide phosphate groups with phosphorothioate groups (substituting one of the oxygen atoms of phosphate group with a sulfur atom) can be made in the entire of partial sequences of oligo depending on the customers needs. B (A,G,C,T) S P H Phosphorothioate Backbone (10) Dual modification (5 Fluorescein 3 Dabsyl & 5 Fluorescein 3 Tamra modification) : The dual probe oligonucleotides can be used in Real-time PCR detection by monitoring DA amplification in PCR. They are either cleaved in the reaction (as Taq-Man probes) or undergo a conformation change in the presence of a complementary DA 20

21 Custom ligonucleotides target (as Molecular Beacons). Many probe designs employ oligonucleotides that form reversible stem-loop configurations. In each case, the probes signal the reaction occurrence by eliminating the quenching influence on the donor fluorophore. (11) 5 nuclease assay for PCR monitoring (TaqMan probes) : The 5 nuclease assay was developed to allow the realexonuclease activity of Taq DA polymerase to monitor the ongoing reaction. TaqDA polymerase can cleave 5 terminal nucleotides from the strand of DA that it displaces while synthesizing a new strand. The cleavage primarily occurs at the junction between the displaced singlestranded portion and the double-stranded paired part of the DA strand. This results in the release of mono- and oligonucleotides from the 5 end of the displaced DA strand. That property of Taq DA polymerase was used to monitor the reaction. The FRET DA dual probes in the 5 nuclease assay are short oligonucleotides, complementary to the target sequence in the amplified DA and 3 -modified so that they cannot be extended on the 3 end. They are labeled with fluorophores at both the 3 and 5 ends. The reporter dye is positioned at the 5 end, and the quencher is positioned on the 3 end of the probe. With the probe intact, the reporter dye fluorescence is quenched. In the reaction, the probe hybridizes to the target sequence. During PCR, it is cleaved by the 5 nuclease activity of Taq DA polymerase. The cleavage separates the quencher from the reporter and restores its fluorescence. Two probes were used, one for the normal sequence and the other complementary to the sequence containing a 3-bp deletion. Each probe had a different reporter fluorophor at the 5 end and a common quencher dye attached to the seventh nucleotide from the 5 end. The identity of the target DA was determined from the fluorescence emission spectrum. (12) Molecular beacons : Strictly speaking, the fluorescence quenching in molecular beacons that use DABCYL is not FRET-related because it does not satisfy the spectral overlap criteri However, the FRET-based quenching can also be used. Molecular beacons found applications in PCR soon after their introduction as hybridization probes. They can monitor an ongoing reaction and discriminate alleles in real-time PCR assays using the same mechanism by hybridizing to their complementary DA targets. The products could be detected by adding the finished reaction to a microtiter well containing immobilized molecular beacon probes and by reading the generated fluorescence. Alternatively, the closed-tube, real-time format can be used. In this case, molecular beacons are added directly to the PCR mixture and hybridize to the newly synthesized DA in the course of the amplification reaction. Compared to Taq- Man probes, molecular beacons are advantageous in multiplex PCR assays because, in theory, they can determine more products simultaneously. Fluorescein 5' 3' oligonucleotide H P H S H 5 -Fluorescein 3 -Dabsyl Dual Modified ligo 21

22 Custom ligonucleotides Q. Antisense D으로서의 phosphorothioate 올리고에 대해 알고 싶습니다. As our understanding of molecular biology is increasing and we slowly gain insight on the molecular level of diseases, the rational design of drugs becomes more feasible. In particular, molecules interacting on the level of proteins were successfully designed and optimized for improved binding properties by biorational approaches. Synthetic oligodeoxynucleotides (Ds) have been proposed by Zamecnik and Stephenson as a new class of potential therapeutics that can interact in a rational way with the messenger RA (mra) of a disease related protein and thereby specifically inhibit its synthesis (Figure). The fascination aspect of this approach, which is referred to as antisense strategy, is the well-understood rules of Watson-Crick base pairing by which single stranded nucleic acids interact with complementary oligonucleotides forming a double helix. Every protein is synthesized by the principal mechanism of molecular biology : a gene (double stranded DA) carrying the genetic information for a particular protein is transcribed to single stranded mra as intermediate carrier of information, which then serves as a template for the protein synthesis (translation) by ribosomes. Therefore the antisense strategy is not limited to certain types of diseases but should be widely applicable. aturally occurring oligonucleotides (DA and RA) do not meet the criteria for potential antisense drug candidates, and different chemical modifications were proposed to overcome the existing hurdles, which are cellular uptake, resistance to nuclease and binding affinity toward mr First, the oligodeoxynucleotides (Ds) must be able to cross the cellular membrane to reach the cytoplasm or nucleus. nce inside the cell the Ds must be resistant to degradation caused by nucleases. Finally, the Ds must be able to bind specifically and with high-affinity to the mra target in order to inhibit expression of the disease causing gene. The observed activity of Ds in tissue culture was earlier thought to imply that these theoretical barriers were not a concern. However, analysis of the data from recent articles indicates that these theoretical barriers are indeed real. The focus of the recent researches is on the chemical approaches to improve the properties ofds, mainly concentrating on the increase of nuclease resistance and mra binding affinity. The mra binding affinity is of high importance for the antisense strategy and usually is reflected by melting temperatures (Tm s). Due t - duplex nucleic acids, the UV absorption at 260 nm is quenched. Upon heating, the annealed strands unpair and become single stranded, resulting in an increased absorption at 260 nm. Ideally, an S-shaped curve is obtained from which, assuming a two 22

23 Custom ligonucleotides state model, the thermodynamic parameters can be calculated. The midpoint of this absorption vs temperature profile is defined as Tm, reflecting the temperature at which equal fractions of oligonucleotides are paired and single stranded under equilibrium. For the oligonucleotide sequences and lengths, the following rule of thumb can be applied : an increase of Tm by 3-5 C ( Tm) corresponds roughly to a 10-fold increase of the association constant. Modifications of the oligonucleotides have been made mainly on the phosphodiester backbone. As the hydrolytic cleavage of the phosphodiester backbone is the main cause for the rapid degradation of oligonucleotides by nucleases, replacement by other moieties has been one of the major strategies to improve stability. In addition, backbone modifications cam influence other properties of oligonucleotides like RA binding affinity or behavior for cellular uptake. A first generation of backbone modifications retained the phosphorus atom as in the phosphorothioates. This derivative was shown to possess an increased resistance toward nucleases. Therefore, the corresponding oligonucleotides could be used for in vitro and in vivo experiments, but unfortunately they all displayed a lower binding affinity to the RA target. evertheless, phosphorothioates can be considered as oligonucleotide analogs of the first generation and were shown to be biologically active against different molecular targets. This beneficial behavior is mainly due to biological and chemical stability, favorable pharmacokinetic properties including cellular uptake, and Rase H promoted mra cleavage observed for this class of compounds. Phosphorothioates can be synthesized mainly by two different apporoaches : by the action of asolution of elemental sulfur (S8) in carbon disulfide, or by the more recent method of using Beaucage s reagent (3H-1,2-Benzodithiol-1-one 1,1-dioxide) sulfurizing phosphite triesters. The latter method avoids the problems of elemental sulfur's insolubility in most organic solvents and the toxicity of carbon disulfide. Beaucage s reagent also yields phosphorothioates with higher purity. Phosphorothioate synthesis yields two isomers (R and S) at each incorporation site resulting in 2n-1 diastereoisomers for an oligo of length n. Initially, there was much concern that this isomer mix would give unpredictable results. Fortunately, however, the isomer mix in any standard S-oligo preparation does not appear to affect the biological activity of the oligonucleotides. 실험 Q. Double-stranded DA 제작 방법 Single-stranded oligos 로부터 double-stranded DA 를 제작할 수 있는데 annealing 과정은 매우 간단한 반면, undesired single stranded material 을 제거하는데 상당한 주의가 요청됩니다. -. oligo 를 high concentration (1-10 D260 units/100 ul) 의 STE buffer (10mM Tris-HCl (ph8.0), 50nM acl, 0.1mM EDTA)에 녹인다. -. 같은 농도의 2 strands 를 섞는다 에서 가열 후 천천히 식힌다. (room temperature) 복잡한 hairpin 가능성이 큰 올리고는 좀더 느린 cooling/annealing step 이 필요하며, water bath 나 temp block 에서 할 수 있다. 23

24 Custom ligonucleotides -. 반응산물은 double-stranded form 으로서 안정하며, 4 에 얼려서 보관한다. 24