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진이 선
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1 대한수혈학회지:제21권 제2호, 2010 유전자 검사로 확인된 A 1 B weak 형 환자 1예 조치현ㆍ유병준ㆍ윤승규ㆍ최계령ㆍ최재열ㆍ김장수ㆍ임채승ㆍ김영기ㆍ이갑노 고려대학교 의과대학 진단검사의학교실 Using Genotyping to Identify an A 1 B weak Blood Group Chi-Hyun Cho, Byong-Joon Yoo, Seung-Gyu Yun, Gye-Ryung Choi, Jae-Yeoul Choi, Jang-Su Kim, Chae-Seung Lim, Young Kee Kim, Kap-No Lee Department of Laboratory Medicine, School of Medicine, Korea University, Seoul, Korea Since an exact ABO blood type match is essential for transfusion therapy, any ABO discrepancies should be resolved prior to the issuing of blood. The authors confirmed the ABO blood group of a 50-year-old male using genotyping. On a routine blood group test, the cell type was A+; however, anti-b was undetected in his serum. To determine the cause of this ABO discrepancy, an adsorption elution test and saliva test were performed. The presence of a weak B substance was suspected despite no evidence of the B antigen on red blood cells. Polymerase-chain-reaction restriction-fragment-length-polymorphism (PCR-RFLP) and sequencing analysis of exons 6 and 7 demonstrated that his blood type was A 1B weak (the A allele tested as the A105 subtype, while the B allele was most similar to the B302 subtype). Again, using genotyping, we subsequently confirmed the A 1B weak blood type in a leukemic patient who was in complete remission. (Korean J Blood Transfus 2010;21: ) Key words: Leukemia, ABO blood group, Genotyping 서 론 ABO 혈액형은 1900년 Karl Landsteiner에 의해 발견된 수혈에 가장 중요한 혈액형이다. 1) 안전한 수혈을 위해서는 먼저 정확한 혈액형의 판정이 선행되어야 하며 이를 위해서는 반드시 혈구혈액 형 검사와 혈청혈액형 검사를 동시에 시행하고 두 검사 결과가 일치해야 한다. 만약 불일치하면 추가 검사를 실시하여 그 원인을 규명해야 한다. ABO 불일치현상을 일으키는 원인은 한랭자가항 체, 동종항체, ABO 변이형, ABO 혈액형 항원의 획득, 소실 및 약화, 연전현상 및 면역결핍증, 약 제 등에 의해 항체가 저하되거나 나타나지 않을 접수일:2010년 8월 3일, 수정일:2010년 8월 20일, 승인일:2010년 8월 23일 책임저자:임 채 승 서울시 구로구 구로동길 97번지 고려대학교 의과대학 진단검사의학교실 TEL: 02) , FAX: 02) , malarim@korea.ac.kr

exact ABO blood type match is essential for transfusion therapy, any ABO discrepancies should be resolved prior to the issuing of blood.

2 유전자 검사로 확인된 A 1B weak형 환자 1예 Table 1. Phenotyping of patient s ABO & Rh blood group Anti-A Anti-B Anti-D Anti-A1 Anti-H Anti-AB A cell B cell O cell (I) O cell (II) I.S min Albumin AHG Abbreviations: AHG, antihuman globulin; I.S., immediate spin; 30 min., centrifugation after incubation for 30 minutes. 경우가 있다. 2) 이를 해결하기 위해서는 적혈구 세척, 항온시간 연장, 비예기 항체선별 및 동정검 사, 흡착 및 해리 검사, 혈청 내 A, B 전이효소검 사, 타액 중의 혈액형 물질 검사 및 면역글로불린 정량검사 등 다양한 방법을 이용하게 되지만 A 3, A m, A x, B 3, B el 등 여러 가지 아형은 일반적인 혈 청학적 검사로는 그 혈액형을 판단하는 데 어려 운 경우가 간혹 있다. 3) 이들 ABO 아형은 기본적 으로 ABO 유전자의 변이에 기인하고 현재까지 160여 종 이상의 대립유전자가 보고되어 있어 ABO 유전자형 검사가 혈액형 판정이 어려운 검 체들을 확인하는 데 도움이 된다고 알려져 왔 다. 4) 본 증례는 백혈병 완치 판정 후 자가 골수 이식 수술을 시행 받고 검진 혈액형 검사에서 ABO 불 일치가 발견되어 의뢰된 검체로 비예기항체검사, 흡착해리시험, 타액 응집 검사를 실시하였으나 확진이 되지 않아 ABO 유전형 검사를 시행하여 A 1 B weak 혈액형으로 판정하였기에 보고하는 바이 다. 증 례 50세 남자환자가 17년 전 미국에서 급성 골수 성 백혈병으로 진단 받고, 12년 전 완치 판정 후 자가 골수 이식술을 시행 받았다. 1년 전 심방 세 동으로 심장 전기 소작 치료술을 시행 받았으며 Table 2. The results of Anti-B adsorption and elution test A cell B cell O cell Eluate (heat) RT + 30 min incubation 2+ Antiglobulin 2+ Supernatant (wash) RT 30 min incubation Antiglobulin Abbreviation: RT, incubation at room temperature. 2010년 5월 채용 검진 시 ABO 혈액형 검사에서 불일치 소견을 보였다. 항-A, 항-B, 항-AB 시약 (Bioscot Limited, Livingston, United Kingdom)을 이용하여 ABO 혈액형검사를 실시한 결과 혈구 혈액형은 A형, 혈청혈액형은 AB형으로 불일치 를 보였다(Table 1). AB아형을 의심하고 환자 적 혈구와 항-B 혈청을 이용하여 흡착해리시험을 실 시하였으며 B혈구에 응집이 되어 적혈구에 B항 원이 있음을 확인할 수 있었고(Table 2), 타액응집 억제시험 결과 타액 내 B형 물질이 존재하지 않 는 것을 알 수 있었다(Table 3). O형 존재 유무를 판별하기 위해 전이효소 A 유전자의 특정 부분(235 bp)을 GA16/GA17 시발 체 쌍(Table 4)을 이용해 증폭하고, 235 bp 증폭 산물에 제한효소인 Kpn I (SolGent co., Ltd., Daejeon, Republic of Korea)을 5 unit 첨가하여 37 o C에서

2) 이를 해결하기 위해서는 적혈구 세척, 항온시간 연장, 비예기 항체선별 및 동정검 사, 흡착 및 해리 검사, 혈청 내 A, B 전이효소검 사, 타액 중의 혈액형 물질 검사 및 면역글로불린 정량검사 등 다양한 방법을 이용하게 되지만 A 3, A m, A x, B 3, B el 등 여러 가지 아형은 일반적인 혈 청학적 검사로는 그 혈액형을 판단하는 데

3 대한수혈학회지:제21권 제2호 Table 3. The result of saliva test Saliva 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 PC NC A +/ B H +/ Table 4. Primers used for ABO transferase gene amplification Primer Nucleotide sequence GA01N 5 -TCCTGGAGACGGCGGAGAAGCA-3 GA13 5 -ACCGACCCCCCGAAGAACG-3 GA14 5 -ACCGACCCCCCGAAGAACC-3 GA16 5 -AGAAGCTGAGTGGAGTTCCAGGTG-3 GA17 5 -TGATGGCAAACACAGTTAACCC-3 ABOex6-F 5 -CATGTGACCGCACGCCT-3 ABOex6-R 5 -TCGGCCACCTCACTGACTTA-3 ABOex7-F2 5 -GGAGAACGTGGTGCATCTG-3 ABOex7-R2 5 -GGCGCTCGTAGGTGAAGG-3 ABOex7-F3 5 -AGATCCTGACTCCGCTGTTC-3 ABOex7-R3 5 -CCCGTTCTGCTAAAACCAAG-3 Mo57a 5 -GGGTTTGTTCCTATCTCTTTGC-3 Mo71R19 5 -GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3 시간 반응시킨 후 2.5% agarose gel에서 전기영동 을 하였다. 반응 산물은 절단된 산물 없이 235 bp 를 보여 O형 대립유전자가 없음을 확인하였다 (Fig. 1). 또한 Cis-AB 형을 구분하기 위해, GA01N/ GA13 시발체 쌍(Table 4)을 이용해 증폭한 후 423 bp 증폭 산물에 제한효소인 Alu I (SolGent co., Ltd., Daejeon, Republic of Korea)을 5 unit 첨가하 여 37 o C에서 2시간 반응시킨 후 2.5% agarose gel 에서 전기영동을 하였다. 반응 산물에서는 cis- AB에서 나오는, 314 bp의 밴드는 관찰되지 않았 다(Fig. 1). ABO 아형을 구분하기 위해 먼저 exon 7의 염기 서열 분석을 시행하였다. PCR 산물을 수기로 ethanol을 사용하여 정제한 후 GA13/GA01N, GA14/ GA01N 두 개의 시발체 쌍(Table 4)으로 증폭 후 Fig. 1. Reactions by (A) Alu I restriction enzyme and (B) Kpn I restriction enzyme. The control sample (lane 1) with cis AB/O alleles shows digested 314 bp product which means it has cis-ab allele. The sample (lane 2) with A/B alleles shows digested 223 bp fragment. The control sample (lane 3) with cis AB/O alleles shows digested 110 bp product which means it has O allele. Lane 4 (sample with A/B allele) is undigested PCR product. Sequencher 4.9 (Applied Biosystems, USA)로 염기 서열 분석하였다(exon 7, bp까지의 범위). 정확한 아형 판별을 위해 Exon 6과 7, intron 6의 염기서열 분석도 시행하였는데 Seo 등 5) 이 이용한 방법에 따라 mo-57a/mo-71r19 시발체 쌍을 이용 하였다(Table 4). PCR은 총 25 μl 반응 액에 검 체 DNA 약 3 μl, 12.5 μl의 2ⅹ premixture, 1 μl 의 Primer (10 pmol/μl) mo-57a, 1 μl의 Primer (10 pmol/μl) mo-71r19, 7.5 μl의 DW를 혼합하 여 시행하였다. PCR 조건은 터치다운 방식으로 95 o C에서 5분간 처리한 후에 94 o C 1분, 65 o C 1분, 72 o C 2분씩 30회 증폭하고 마지막으로 72 o C에서 10분간 유지한 후 정지시켰다. PCR 산물을 수기

Primers used for ABO transferase gene amplification Primer Nucleotide sequence GA01N 5 -TCCTGGAGACGGCGGAGAAGCA-3 GA13 5 -ACCGACCCCCCGAAGAACG-3 GA14 5 -ACCGACCCCCCGAAGAACC-3 GA16 5

4 유전자 검사로 확인된 A 1B weak형 환자 1예 로 ethanol을 사용하여 정제한 후 적절한 시발체 (ABOex6-F, ABOex6-R, ABOex7-F2, ABOex7-R2, ABOex7-F3, ABOex7-R3, mo-57a, mo-71r19; Table 4)로 증폭 후 Sequencher 4.9 (Applied Biosystems, Foster City, USA)로 염기서열을 분석하였을 때 A 1B weak (A 대립 유전자는 A105이며, B 대립 유전 자는 B302와 가장 일치함)로 판독되었다. 고 찰 1990년 Yamamoto 등에 의해 ABO 혈액형의 유 전자 구조가 밝혀지면서 현재까지 160여 종이 넘 는 다양한 A 및 B 대립유전자가 발견되었다. 6) A, B 당전이효소를 발현하는 ABO유전자는 9번 염 색체 장완 9q34에 위치하며 1,065개의 염기로 구 성되어 있으며, 354개의 아미노산을 코딩하는 것 으로 밝혀졌다. 7) A와 B 대립 유전자는 7군데의 염기 서열 297, 526, 657, 703, 796, 803 및 930번에 차이를 보이며 이 중 염기 4군데 C526G (Arg/Gly), G703A (Gly/Ser), C796A (Leu/Met), G803C (Gly/ Ala)의 치환이 A와 B 전이효소 간의 특이성을 구 분 지어 준다. 이 중 특히 염기서열 796번과 803 번째의 염기변화가 당전이 효소의 기질특이성에 관여한다고 알려져 있다. 8) ABO 혈액형에는 기본 적으로 A, B, AB, O형 외에 A 3, A m, A x, B 3, B el 등 여러 가지 아형이 존재하며 국내에는 많은 아 형이 cis-ab 대립유전자에서 기인한 것으로 보고 되었다. 2) A 및 B아형은 기본적으로 전이효소들 을 만드는 유전자의 돌연변이, 즉 염기의 치환에 의해서 발생하며 주로 염기 서열 , , , 965 1,060 bp 부위에서 변화가 일 어난다. 9) 본 증례에서 환자의 혈액형은 A 1B weak형이었는 데, 환자의 A 대립 유전자는 미국 National Center for Biotechnology Information (Maryland, USA)의 Blood Group Antigen Gene Mutation Database에 등 록된 아형과 비교하였을 때 A105, A106과 염기 서열이 가장 일치하였다(exon 6, 7에서). 차이가 나는 부분은 intron 6의 코돈 163, 179였는데 A105 의 경우 염기는 각각 C, T였고, A106의 경우 각각 Fig. 2. Sequence analysis of the ABO gene in the case. Nucleotide position 657 in exon 7 shows C to T substitution but does not result in an amino acid change. The top chromatogram depicts the B allele only after the seperation of A and B allele (with the primer GA 13). The middle chromatogram shows the A allele (with the primer GA 14), and the bottom illustrates the heterozygous sequence for the allele in this case (with the primer GA 01N)

고 찰 1990년 Yamamoto 등에 의해 ABO 혈액형의 유 전자 구조가 밝혀지면서 현재까지 160여 종이 넘 는 다양한 A 및 B 대립유전자가 발견되었다. 6) A, B 당전이효소를 발현하는 ABO유전자는 9번 염 색체 장완 9q34에 위치하며 1,065개의 염기로 구 성되어 있으며, 354개의 아미노산을 코딩하는 것 으로 밝혀졌다.

5 대한수혈학회지:제21권 제2호 T, C였으며 환자 검체의 A 대립 유전자는 코돈 163, 179가 각각 C, T여서 A105 아형과 일치하였 다. 이 때 Blood Group Antigen Gene Mutation Database에 등록된 참고 유전자(Gene bank accession number: AB052645)가 intron 6부위만을 나타내고 있었고, 아형의 판별에 exon 6, 7외에도 intron 부 위 역시 중요함을 확인할 수 있었다. B 아형은 아직 밝혀진 종류가 A 아형보다는 적 지만 현재까지 Blood Group Antigen Gene Mutation Database에 등록된 아형을 보면 약 40개가 있고 새로운 아형이 계속 발견되어 늘어가고 있는 추 세이다. 국내에는 Seo 10) 및 Kim 등 11) 이 B 아형 중 한국인에서 특이적인 255C>T, 547G>A 치환을 발견하였으나 255C>T 치환은 아미노산의 변화 를 유발하지 않아 B 혈액형 전이효소의 구조변화 는 유발하지 않는 것으로 알려졌으며 547G>A 치환은 최근 Cho 등 12) 에 의해 아미노산의 변화를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 본 증례의 B 대립 유 전자는 Blood Group Antigen Gene Mutation Database에 등록된 아형 중 B302형과 가장 일치하였 는데, 기존의 reference gene (Gene bank accession number_abo052644)과 비교하면 657C>T 한 개 의 염기 치환을 보였다(Fig. 2). 이 치환은 아미노 산의 변화 및 구조변화는 유발하지 않지만, 환자 의 대립 유전자가 기존의 Database와 일치하지 않 아 새로운 아형으로 보아야 할 것으로 사료되었 다. 단, 본 연구의 한계로 인해 exon 6, 7 및 intron 6의 염기서열 확인만 가능했고, exon 1 5에 대한 추가적인 연구가 진행되면 새로운 아형에 대한 정확한 분석이 가능할 것이다. 혈청학적으로 B 3는 항-B 또는 항-AB 모두에 약 한 응집을 보이며 타액에 B 및 H항원이 있을 때 로 구분되지만, 13) 본 증례에서는 유전자 분석 결 과가 B302임에도 타액에 B 항원이 없어 표현형 이 기존의 B 3보다 약한 것으로 생각되었다. 그 원 인으로 항-A, 항-B, 항-AB 시약의 제조사간 강도 차이 및 단클론성(monoclonal) 또는 다클론성 (polyclonal)인 항혈청 종류에 따른 차이를 고려할 수 있다. 14) 이로 인해 A, B, AB, O형 아형에서는 혈구 및 혈청 응집이 미세하고, 육안 판단이 애매 하여 같은 실험실 내 검사자 간에도 다른 해석을 보일 수 있는 것이다. 15) 또한 최근 ABO 유전자의 exon 1번에서 5번, 6개의 intron, promoter 및 enhancer 부위의 분석으로도 새로운 혈액형 아형 을 발견함을 고려할 때, 16) B아형의 미세한 차이 를 보기 위해서도 추후 exon 1 5 부위에서 유전 자변이 분석이 필요할 것이다. 본 증례의 환자 본인은 A 1B weak로 혈액형이 판 정되기 전까지 A형으로 알고 있었고, 자가 골수 이식 전에 장 천공 및 심장 수술과 관련하여 A형 적혈구를 투여 받았던 수혈력이 있었다. 환자 본 인이 인지하는 혈액형과 검사 결과가 달랐던 원 인으로 두 가지를 생각해 볼 수 있다. 첫째는 환 자가 실제 A형이었지만, 백혈병으로 인해 적혈구 조혈 모세포 단계에서 유전자 변이가 발생하여 B 의 약한 아형이 발생하고, anti-b항체는 항암 치 료와 관련하여 사라졌을 수 있다. 이러한 가능성 은 Novaretti 등에 의해서도 제시되었는데, 6) 그들 은 백혈병 환자 108명을 대상으로 ABO 유전자의 직접 염기 서열 분석을 시행하여 25명의 환자에 서 발견된, 22개의 새로운 ABO 대립 유전자를 보 고하면서 조혈모세포의 성숙 과정에서 ABO 유전 자에 변이가 발생할 수 있음을 주장하였다. 6) 또 그 연구에서도 B 1의 한 아형이긴 했지만, 본 증례 와 동일한 657C>T 염기 치환이 있었음을 주지 해야 할 것이다. 두 번째 가능성으로 환자가 실제 AB형이었지만, 1990년대 초 검사의 제약으로 인 하여 A형으로 판독되었을 가능성이 있다. 본 증 례에서도 흡착 및 해리 검사로 약한 B항원이 검 출되기는 했지만 유전자 검사가 없었다면, 환자

B 아형은 아직 밝혀진 종류가 A 아형보다는 적 지만 현재까지 Blood Group Antigen Gene Mutation Database에 등록된 아형을 보면 약 40개가 있고 새로운 아형이 계속 발견되어 늘어가고 있는 추 세이다.

6 유전자 검사로 확인된 A 1B weak형 환자 1예 의 정확한 혈액형 판별은 어려웠을 것이다. 저자들은 혈청학적으로 ABO 불일치를 보인 혈액에서 정확한 혈액형 판단을 위해 유전자형 분석을 하여 판정을 할 수 있었던 증례를 소개함 으로써 이와 유사한 상황에 검사실에서 유전자형 검사를 해서 혈액형 오판을 줄일 수 있으며 잘못 된 수혈을 방지할 수 있을 것으로 생각된다. 또 한, 향후 ABO 유전자 분석 시 exon 6번과 7번의 주요염기서열 부위 및 1 5번 부위의 exon, intron 을 모두 분석하는 것이 A, B 아형을 밝히는 데 도움을 줄 것이라 생각된다. 요 약 수혈을 위해서는 정확한 혈액형의 판정이 필수 적이며 이를 위해서는 반드시 혈구혈액형검사와 혈청혈액형검사를 동시에 시행하여야 하고 양쪽 검사의 불일치는 원인을 규명하여 정확한 혈액형 을 판정하여야 한다. 저자들은 혈액형검사상 불 일치가 발견되어 비예기항체검사, 흡착해리시험, 타액응집억제시험을 실시하였으나 확진이 되지 않은 50세 남자 환자의 검체로 PCR-RFLP와 exon 6, 7 및 intron 6의 ABO 유전형 검사를 시행하였 다. 검사 결과 환자 혈액형은 A 1B weak로 판독되었 고, A 대립 유전자는 Blood Group Antigen Gene Mutation Database에 등록된 대립 유전자 중 A105 와 일치하였으며 B 대립 유전자는 B302와 가장 일치하였다. 저자들은 ABO 불일치를 보였으나 유전형 검사로 확진된 증례를 경험하였기에 보고 하는 바이다. 참고문헌 1. Yip SP. Sequence variation at the human ABO locus. Ann Hum Genet 2002;66: Chung HY, Yoon MS, Kim DC, Kim YJ, Park SS, Han KS. Detection of an AB weak blood group by genotyping. Korean J Blood Transfus 2006;17: Ogasawara K, Yabe R, Uchikawa M, Saitou N, Bannai M, Nakata K, et al. Molecular genetic analysis of variant phenotypes of the ABO blood group system. Blood 1996;88: Suzuki K, Iwata M, Tsuji H, Takagi T, Tamura A, Ishimoto G, et al. A de novo recombination inthe ABO blood group gene and evidence for the occurence of recombination products. Hum Genet 1997;99: Seo DH, Kim SY, Kim JY, Park KU, Kang SH, Park SS, et al. Molecular characteristics of A subgroups in Koreans. Korean J Blood Transfus 2003;14: Novaretti MC, Domingues AE, Manhani R, Pinto EM, Dorlhiac-Llacer PE, Chamone DA. ABO genotyping in leukemia patients reveals new ABO variant alleles. Genet Mol Res 2008; 7: Yamamoto F, Clausen H, White T, Marken J, Hakomori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature 1990; 345: Yamamoto F, Marken J, Tsuji T, White T, Clausen H, Hakomori S. Cloning and characterization of DNA complementary to human UDP-GalNAc: Fuc alpha Gal alpha GalNAc transferase (histo-blood group A transferase) mrna. J Biol Chem 1990;265: Seltsam A, Hallensleben M, Kollmann A, Blasczyk R. The nature of diversity and diversification at the ABO locus. Blood 2003;102: Seo DH, Kim SY, Kim JY, Park SS, Lee JB, Han KS. Molecular characteristics of B subgroups in Koreans. Korean J Lab Med 2005;25: Kim SH, Cho D, Choi KL, Kim KS, Ki CS, Song JW, et al. A case of A 1B 3 child from a

또 한, 향후 ABO 유전자 분석 시 exon 6번과 7번의 주요염기서열 부위 및 1 5번 부위의 exon, intron 을 모두 분석하는 것이 A, B 아형을 밝히는 데 도움을 줄 것이라 생각된다.

7 대한수혈학회지:제21권 제2호 group A mother and a group B father: New Group B Allele Arising from 547G>A. Korean J Blood Transfus 2004;15: Cho D, Kim SH, Ki CS, Choi KL, Cho YG, Song JW, et al. A novel B var allele (547 G>A) demonstrates differential expression depending on the co-inherited ABO allele. Vox Sang 2004;87: Estalote AC, Palatnik M, Chester MA, Olsson ML, Sant'Anna Gomes BM. A novel blood group B subgroup: serological and genetic studies. Transfus Med 2004;14: Olsson ML, Irshaid NM, Hosseini-Maaf B, Hellberg A, Moulds MK, Sareneva H, et al. Genomic analysis of clinical samples with serologic ABO blood grouping discrepancies: identification of 15 novel A and B subgroup alleles. Blood 2001;98: Seltsam A, Blasczyk R. Missense mutations outside the catalytic domain of the ABO glycosyltransferasecan cause weak blood group A and B phenotypes. Transfusion 2005;45: Olsson ML, Chester MA. Polymorphism and recombination events at the ABO locus: a major challenge for genomic ABO blood grouping strategies. Transfus Med 2001;11:

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(079-088)Kjbt015.hwp

(079-088)Kjbt015.hwp 대한수혈학회지:제18권 제2호, 2007 다중 단일염기 시발체 확장반응을 이용한 ABO 유전자형 검사 현정원 1 장호은 2 허세란 2 송상훈 1 박경운 1,2 송정한 1,2 한규섭 1 = Abstract = 서울대학교 의과대학 검사의학교실 1, 분당서울대학교병원 진단검사의학과 2 ABO Genotyping using a Multiplex Single-base