LG ENA Immunoblot 시약을 이용한 ENA 자가항체 검출 35 외에 항-Sm, 항-U1RNP, 항-SSA/Ro, 항-SSB/La 등의 검사 를 시행하여 진단에 도움을 받을 수 있으며, Sj gren 증후군의 경우는 항-SSA/Ro, 항-SSB/La, 혼합결합

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1 대한임상병리학회지 : 제22권 제1호 2002 Korean J Clin Pathol 2002; 22: 진단면역학 LG ENA Immunoblot 시약을 이용한 Extractable Nuclear Antigen 자가항체 검출 채정돈 오흥범 이창근* 유빈* 손미진** 유승범** 울산의대 서울중앙병원 임상병리과, 알레르기 및 류마티스 내과,* (주) LGCI 생명과학 연구원 바이오텍 연구소** Detection of Autoantibodies for Extractable Nuclear Antigens by LG Immunoblot Kit Jeong Don Chae, M.D., Heung Bum Oh, M.D., Chang Gun Lee, M.D.,* Bin Yoo, M.D.,* Mi-Jin Sohn, Ph.D.,** and Seung Bum Yoo, M.S.** Departments of Clinical Pathology and Allergy and Rheumatology,* University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul; Life Science Institute, LG Chem Investment, Ltd,** Daejon, Korea Background : Identification of antibodies recognizing extractable nuclear antigens (ENAs) is useful in the diagnosis and characterization of a variety of connective tissue diseases. Recently, LG ENA Immunoblot (LGCI, Korea) was introduced for detecting various autoantibodies to ENAs simultaneously. Performance of this kit was evaluated in this study. Methods : Sera from 108 SLE patients and 103 RA patients were tested for the presence of specific autoantibodies to ENAs by LG ENA Immunoblot and DID. Concordance rates in each autoantibody were obtained. After discordant results were resolved by EIA (ENA ELISA TEST SYSTEM, Zeus Scientific Inc., NJ, USA) and western blot (ANA Western Blot Immunoassay, IMMCO Diagnostics Inc., NY, USA), sensitivity and specificity of LG ENA Immunoblot were evaluated. Betweenday precision was also tested. Results : Concordance rates in each autoantibody in two methods were as follows: anti-rnp (88.0%, 95/108; 100.0%, 103/103), anti-sm (87.0%, 94/108; 97.1%, 100/103), anti-ssa (94.4%, 102/108; 99.0%, 102/103), anti-ssb (97.2%, 105/108; 98.1%, 101/103), anti-scl70 (99.1%, 107/108; 100.0%, 103/103) in SLE and RA patients, respectively. Sensitivity and specificity of Immunoblot were 92.0% and 99.6% for anti-rnp, 100.0% and 99.6% for anti-sm, 100% and 98.6% for anti-ssa, 90.0% and 98.5% for anti-ssb, and 100.0% and 100.0% for anti-scl70, respectively. Between-day precisions were 100% in all anti-ena antibodies. Conclusions : LG ENA Immunoblot showed good concordance rates with the conventional DID method and high sensitivity (>90%) and specificity (>98.5%) in detecting all kinds of anti-ena autoantibodies. LG Immunoblot has another merit in that it can detect several autoantibodies simultaneously. It is suggested that LG ENA Immunoblot can replace DID for anti-ena detection without any problem. (Korean J Clin Pathol 2002; 22: 34-41) Key words : ENA, LG ENA Immunoblot, Double immunodiffusion, EIA, Western blot 서 론 접 수 : 2001년 7월 3일 접수번호 : KJCP1512 수정본접수 : 2001년 11월 13일 교신저자: 오흥범 우 서울시 송파구 풍납동 울산의대 서울중앙병원 임상병리과 전화: , Fax: dsjun@dsmc.or.kr 추출성핵항원(extractable nuclear antigen; ENA)에 대한 자 가항체검사는 다양한 결체조직질환을 진단하고 특성화하는데 도 움이 된다[1]. 만약 전신성홍반성낭창(systemic lupus erythematosus; SLE)가 의심되면 항-이중선 DNA (anti-ds DNA) 34

2 LG ENA Immunoblot 시약을 이용한 ENA 자가항체 검출 35 외에 항-Sm, 항-U1RNP, 항-SSA/Ro, 항-SSB/La 등의 검사 를 시행하여 진단에 도움을 받을 수 있으며, Sj gren 증후군의 경우는 항-SSA/Ro, 항-SSB/La, 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease; MCTD)의 경우는 항-U1RNP, 경피증 (scleroderma)의 경우는 항-Scl70 (topoisomerase 1), 다발성 경화증/피부근염에서는 항-tRNA synthetase (anti-jo1)가 도움 이 된다[2-7]. ENA 자가항체의 성분및그특성분석을위한 검사법으로 1975년부터 이중면역확산법(double immunodiffusion, DID)이 이용되어 왔으며, 현재까지는 표준검사법으로 인식되고 있다[8]. 그러나 이 방법은 술식이 비교적 간편한 반면 민감도가 떨어지고 각 항체특이성 마다 따로 검사해야 하고, 반응시간이 길며 침강 선이 뚜렷하지 않으면 판정이 어려운 단점들이 있다[9, 10]. 또한 국내에서는 대부분의 경우 외국산 시약을 구입하여 사용하는 실 정이다. 토끼 흉선과 소 비장 추출물을 western blot하여 얻은 스트립 으로 자가항체의 반응양상을 분석한 국내 연구에서 항-DNA가 양성인 SLE 환자에서 양성밴드가 2-8개 였다는 보고가 있었다 [9]. 따라서 환자가 가지고 있는 자가항체의 특이성을 파악하려 면 DID로 검사할 경우 여러 종류의 시약을 사용해야 한다. 이런 경우 여러 항체를 동시에 검출하고 특이성을 분석하는 검사법이 더 효율적일 것이다. 재조합 자가항원을 스트립에 입혀서 여러 항체를 동시에 검사하는 것은 1990년도에 이미 소개된 바 있다 [11]. 당시의 연구결과로는 항체의 종류에 따라 차이가 있지만 DID를 기준으로 대략 90% 이상의 일치율을 보였다[11, 12]. Western blot, 효소면역검사법(enzyme immunoassay; EIA) 및 DID 비교 연구에서 검사간 차이를 보이는 경우 임상양상을 토대로 분석한 결과 western blot 법이 가장 예민한 검사라고 보 고하기도 하였다[8]. 최근 특이항체군인 항-Sm, 항-Sm/RNP, 항-SSA, 항-SSB, 항-Scl70, 항-Jo1 항체를 동시에 immunoblot법으로 반정량검사 를 할 수 있는 LG ENA Immunoblot (LGCI Inc., Seoul, Korea) 키트가 소개되었다. 본 연구는 LG ENA Immunoblot 검사의 임상적 유용성을 평가하고자 하였는데, SLE, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA) 환자 및 건강인 헌혈자를 대 상으로 DID 결과와 비교하여 불일치를 보인 경우 EIA 및 다른 종류의 western blot 키트로 재검을 실시한 후 시약의 예민도 및 특이도를 평가하였으며 각 개별항체에 대한 검사일간(betweenday) 정밀도를 평가하였다. 체를 연구 대상으로 하였다. 환자들은 American College of Rheumatologists에서 제시한 SLE와 RA의 진단기준에 따라 진 단된 환자들이었다[13-16]. 2. ENA 자가항체의 검출 ENA 자가항체 검출을 위하여 DID 원리를 이용한 ENA TEST (MBL, Japan) 키트와 western blot 원리를 이용하는 LG ENA Immunoblot 키트를 사용하였다. 1) Double immunodiffusion (DID) 방법에 의한 ENA 자가항 체의 검출 모든 검체는 DID법으로 항-RNP, 항-Sm, 항-SSA, 항-SSB, 항-Scl70 다섯 가지 항체 존재여부를 검사하였는데 그 방법은 다 음과 같다. ENA 항원 시약에 멸균 증류수 0.1 ml을 잘 혼합하 고 한천의 중앙 웰에 동정용 항원(rabbit thymus extracte)을 20 L 넣었다. 1, 3, 5번 웰에는 표준혈청을 각각 20 L씩 넣 고 2, 4, 6번 웰에는 피검혈청을 20 L씩 넣었다. 습윤상자에 넣 고 실온에서 48시간 항온한 후 결과를 판정하였다. 검체의 침강 선이 표준혈청 침강선과 융합하고 있을 때 양성으로 판정하고 그 렇지 않는 경우 음성으로 판정하였다. 항-Jo1은 표준혈청의 침강 선이 분명하지 않았으므로 DID 검사를 시행하지 않았고 분석에 서 제외되었다. 2) LG ENA Immunoblot을 이용한 ENA 자가항체 검출 LG ENA Immunoblot은 RNP/Sm, Sm, SSA, SSB, Scl70, Jo1 6개의 개별 항원이 코팅되어 있는 스트립이었다. RNP/Sm 밴드에서만 양성인 경우는 항-RNP/Sm 양성으로 판정하였으며, RNP/Sm 밴드와 Sm 밴드에 동시 양성인 경우는 항-RNP와 항-Sm 동시 양성으로 판정하였다. 항-Jo1의 경우는 DID 검사결 과를 신뢰할 수 없었으므로 분석에서는 제외되었다. 검사 방법은 다음과 같다. 반응 웰에 스트립을 넣고 시료희석액 2 ml을 넣은 후 20 L의 검체를 넣고 실온에서 100 rpm으로 2시간 항온하 였다. 1.5 ml의 세척액으로 100 rpm으로 2분씩 4회 세척한 후 1 ml의 working conjugate solution을 넣고 30분간 항온하였다. 1.5 ml 세척액으로 10회 흔들면서 세척하는 것을 4회 반복한 후 Table 1. Scoring system of LG ENA Immunoblot Band intensity Interpretation 1. 검체 재료 및 방법 no color intensity Negative (-) sample<a band* Negative (±) a band=sample Positive (1+) a band<sample<p band Positive (2+) sample=p band Positive (3+) P band<sample Positive (4+) 건강인 헌혈자 72명과 SLE 환자 108명, RA 환자 103명의 검 *reference color intensity of 1+ control; reference color intensity of 3+ control.

3 36 채정돈 오흥범 이창근 외 3인 증류수로 동일하게 2회 더 세척하였다. 기질용액 1 ml을 넣고 20분간 발색시켰다. 증류수로 2회 세척한 후 흡습지에서 습기를 빨아들이고 20분간 암소에서 건조시킨 다음 결과를 판정하였다. LG ENA Immunoblot은 6개의 밴드 외에 추가적으로 3+에 해 당하는 P밴드와 1+에 해당하는 a밴드가 있으며 Table 1에 따라 6단계로 결과를 판독하고 1+ 이상의 경우를 양성으로 간주하였다. 3. DID와 LG ENA Immunoblot 검사간 불일치를 보인 검체에 대한 추가검사 및 판독 DID와 LG ENA Immunoblot 검사간 불일치를 보이는 검체 들에 대하여 ENA ELISA TEST SYSTEM (Zeus Scientific Inc., NJ, USA)과 다른종류의 Anti-Nuclear Antibody (ANA) Western Blot Immunoassay (IMMCO Diagnostics Inc., NY, USA)를 이용한 추가검사를 시행하였고, 4종류의 검 사 결과 중 3종류가 양성이면 +, 음성이면 -, 2종류가 +이고, 2 종류가 -이면 +/-로 판독하였고, +/-는 민감도와 특이도를 산 출할 때 제외하였다. 검체 10 L를 각각의 웰에 넣어 최종 희석배수가 1:101이 되게 한 후 실온에서 60분간 흔들면서 항온하였다. 희석된 검체를 버 리고, washing buffer를 스트립 위에 뿌려 넣은 후 5분간 스트립 을 적셔서 세척하였으며, 이 과정을 4회 반복하였다. 각 웰에 1.0 ml의 blocking diluent를 넣은 후 10 L의 conjugate A를 넣 고, 실온에서 30분간 흔들면서 항온하였다. 4회 세척 후 blocking diluent 1.0 ml을 넣고 10 L의 conjugate B를 넣은 후 실온 에서 30분간 흔들면서 항온하였다. 4회 세척 후 1.0 ml의 기질 용액을 넣고 빛을 차단시킨 상태에서 천천히 흔들면서 실온에서 10분간 항온하였다. 4회 세척 후 흡습지로 습기를 빨아들이고 15-20분간 말렸다. Molecular maker와 나란히 검사스트립을 두 고 판독하였다. 음성대조 스트립에는 125 kd, 77 kd, 70 kd, 45 kd와 14.5 kd의 밴드만 나타난 경우, 양성대조 스트립에는 dsdna, Scl70 (100 kd), SSA (60 kd), Jo1 (56 kd), SSB (La) (48 kd), RNP (68 kd), Sm B/B1 (28/29 kd)와 Cenp A (17 kd) 등이 함께 보일 경우 판독을 시행하였다. 4. LG ENA Immunoblot의 정밀도 평가 1) 효소면역검사법 (ELISA)를 이용한 추가검사 ENA ELISA TEST SYSTEM의 검사방법을 요약하면 다 음과 같다. 10 L의 검체에 200 L의 희석액을 혼합하여 넣고 키트에 포함되어 있는 calibrator 100 L를 희석하지 않은 채로 두 웰에 분주하여 실온에서 20분간 항온하였다. 각 웰을 5회 세 척한 다음에 100 L의 conjugate를 넣고 실온에서 20분간 항온 한 후 다시 세척하였다. 효소기질액 100 L를 넣고 실온에서 10 분간 반응시킨 후 반응정지액 50 L를 넣고 450 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 각 검체의 autoantibody unit (AAU)를 시약 설명서에 따라 구한 후 150 AAU/mL 미만인 경우 음성으로, 150 AAU/mL 이상 180 AAU/mL 이하인 경우 미확정(equivocal), 180 AAU/mL을 넘는 경우를 양성으로 판독하였다. 2) Western Blot 키트를 이용한 추가검사 ANA Western Blot Immunoassay 검사방법을 요약하면 다 음과 같다. 반응 웰에 스트립을 넣고 blocking diluent 1.0 ml을 각 웰에 넣은 후 30분간 두었다. 양성 대조군, 음성 대조군, 환자 DID에 사용하는 항-RNP, 항-Sm, 항-SSA, 항-SSB, 항- Scl70, 항-Jo1 각각의 양성 대조혈청을 이용하여 10일간 연속하 여 LG ENA immunoblot으로 검사를 시행하여 검사일간 정밀 도(between-day precision)을 구하였다. 결 과 1. DID와 LG ENA Immunoblot 검사의 일치율 및 자가 항체 검출률 건강인 헌혈자 72명에서는 DID와 LG ENA Immunoblot 시 약 모두에서 음성을 보였다. 개별 환자 수준에서는 SLE의 경우 72.2% (78/108), RA 94.2% (97/103)의 일치율을 보였으며 항 체특이성 수준에서는 SLE의 경우 540 (108 5=540)개 중 503 개가 일치하여 93.1%, RA의 경우 98.8% (509/515)의 일치율을 보였다. 각 항체별 일치율은 SLE에서 항-RNP 88.0% Table 2. Comparison of results between two anti-ena tests (Immunoblot and DID) in 108 patients with systemic lupus erythematosus Antibody specificity Concordant results Discordant results Blot +/DID + Blot -/DID - Blot +/DID - Blot -/DID + % concordant Anti-RNP % (95/108) Anti-Sm % (94/108) Anti-SSA % (102/108) Anti-SSB % (105/108) Anti-Scl % (107/108) Total % (503/540) *Blot: LG ENA Immunoblot, DID: Double immunodiffusion.

4 LG ENA Immunoblot 시약을 이용한 ENA 자가항체 검출 37 Table 3. Comparison of results between two anti-ena tests (Immunoblot and DID) in 103 patients with rheumatoid arthritis Antibody specificity Concordant results Discordant results Blot +/DID + Blot -/DID - Blot +/DID - Blot -/DID + % concordant Anti-RNP % (103/103) Anti-Sm % (100/103) Anti-SSA % (102/103) Anti-SSB % (101/103) Anti-Scl % (103/103) Total % (509/515) *Blot: LG ENA Immunoblot, DID: Double immunodiffusion. Table 4. Positive rate of ENA autoantibody in patients with SLE and RA according to detection methods (LG ENA Immunoblot vs DID) Autoantibody Disease & Methods Immunoblot* SLE (n=108) DID Immunoblot RA (n=103) Anti-RNP 22.2 (24/108) 28.7 (31/108) 0 (0/103) 0 (0/103) Anti-Sm 18.5 (20/108) 5.6 (6/108) 2.9 (3/103) 0 (0/103) Anti-SSA 57.4 (62/108) 55.6 (60/108) 8.7 (9/103) 7.8 (8/103) Anti-SSB 11.1 (12/108) 8.3 (9/108) 1.0 (1/103) 1.0 (1/103) Anti-Scl (4/108) 2.8 (3/108) 0 (0/103) 0 (0/103) *LG ENA Immunoblot. DID (95/108), 항-Sm 87.0% (94/108), 항-SSA 94.4% (102/108), 항-SSB 97.2% (105/108), 항-Scl % (107/108) 이었다. 불일치한 37건 중 Immunoblot 양성/DID 음성이 25건, Immunoblot 음성/DID 양성이 12건이었다(Table 2). RA의 경 우는 항-RNP 100% (103/103), 항-Sm 97.1% (100/103), 항- SSA 99.0% (102/103), 항-SSB 98.1% (101/103), 항-Scl % (103/103)이었다. 불일치한 6건 중 Immunoblot 양성/ DID 음성이 5건, Immunoblot 음성/DID 양성이 1건이었다 (Table 3). SLE와 RA 환자에서 LG ENA Immunoblot과 DID 검사의 자가항체 검출률은 Table 4와 같다. 항-Sm을 제외하고 두 검사 간 차이를 보이지 않았다. SLE에서 항-Sm은 LG ENA Immunoblot의 경우 18.5%, DID의 경우 5.6%를 보여 두 검사 방법의 검출률 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P value =0.0073). 2. ELISA 및 western blot 검사 결과를 토대로 LG ENA Immunoblot의 예민도 및 특이도 분석 SLE 환자에서 불일치를 보였던 37건 중 ELISA와 western blot 추가검사로 LG ENA Immunoblot을 지지한 경우는 9건 (24.3%)이었으며, DID를 지지한 경우는 8건(21.6%)이었고 20 개는 어느 쪽을 더 지지한다고 판정할 수 없었다. RA 환자에서 불일치를 보였던 6건 중 추가검사로 DID를 지지한 경우는 4건 (66.7%)이었고 2건은 어느 쪽을 더 지지한다고 판정할 수 없었 다(Table 5). 103개 RA 검체 중 항-Sm 및 항-SSA에서 각각 1개 검체가 1+ 양성을 보였으나 추가 검사에 의해 최종 위양성 으로 판정되었다. 항-SSB의 경우에는 불일치를 보인 5건 모두 두 가지 추가검사에서 DID 결과를 지지하였는데 DID에서 단독 양성의 경우가 1건, LG ENA Immunoblot에서 단독양성이었던 경우가 2건, LG ENA Immunoblot에서 항-SSA/항-SSB 둘 다 양성인 경우가 2건이었고 후자의 2건은 항-SSB가 모두 1+ 이었다. DID 검사를 기준으로 LG ENA Immunoblot 검사의 예민도 및 특이도를 분석할 경우 항-RNP는 각각 67.7% (21/31), 98.3% (177/180), 항-Sm은 각각 100.0% (6/6), 91.7% (188/205), 항-SSA는 각각 97.1% (66/68), 96.5% (138/143), 항-SSB는 각각 90.0% (9/10), 98.0% (197/201), 항-Scl70은 각각 100.0% (3/3), 99.5% (207/208)이었고, 건강인 헌혈자를 포함한 특이도는 항-RNP는 98.8% (249/252), 항-Sm은 93.9% (260/277), 항-SSA는 97.7% (210/215), 항-SSB는 98.5% (269/273), 항-Scl70은 99.6% (279/280)이었다(Table 6). DID 검사와 western blot 추가검사를 기준으로 LG ENA Immunoblot 검사의 예민도 및 특이도를 분석할 경우 항-RNP는 각각 92.0% (23/25), 99.5% (185/186), 항-Sm은 각각 100.0% (20/20), 98.4% (188/191), 항-SSA는 각각 100% (67/67), 97.2% (140/144), 항-SSB는 각각 90.0% (9/10), 98.0% (197/201), 항-Scl70은 각각 100% (4/4), 100% (207/207)이 었고, 건강인 헌혈자를 포함한 특이도는 항-RNP는 99.6% (257/258), 항-Sm은 98.9% (260/263), 항-SSA는 98.1%

5 38 채정돈 오흥범 이창근 외 3인 Table 5. Resolution of discordant results by ELISA and Western blot Autoantibody Disease (sample N) Discordant results Blot DID ELISA Western N* Final interpretation Anti-RNP SLE (13) /- Anti-Sm SLE (14) / /- RA (3) / /- Anti-SSA SLE (6) / / RA (1) Anti-SSB SLE (3) RA (2) Anti-Scl70 SLE (1) + - NT *Number; not tested. Table 6. Sensitivity and specificity of LG ENA Immunoblot kit for anti-ena test Standard DID DID & western blot DID & ELISA DID & western blot & EIA Autoantibody Sensitivity Specificity Sensitivity Specificity Sensitivity Specificity Sensitivity Specificity anti-rnp (98.8)* (99.6) (99.6) (99.6) anti-sm (93.9) (98.9) (96.3) (99.6) anti-ssa (97.7) (98.1) (98.6) (98.6) anti-ssb (98.5) (98.5) (98.5) (98.5) anti-scl (99.6) (100) NT NT (100) *Specificity of total samples including both SLE/RA patients and blood donors, not tested. (212/216), 항-SSB는 98.5% (269/273), 항-Scl70은 100% (279/279)이었다(Table 6). DID 검사와 EIA 추가검사를 기준으로 예민도 및 특이도를 분 석할 경우 항-RNP는 각각 69.7% (23/33), 99.4% (177/178), 항-Sm은 각각 100% (13/13), 94.9% (188/198), 항-SSA는 각 각 97.1% (68/70), 97.9% (138/141), 항-SSB는 각각 90.0% (9/10), 98.0% (197/201)이었고, 건강인 헌혈자를 포함한 특이 도는 항-RNP는 99.6% (249/250), 항-Sm은 96.3% (260/270), 항-SSA는 98.6% (210/213), 항-SSB는 98.5% (269/273)이었 으며, 항-scl70 항목은 EIA 검사가 시행되지 않았다(Table 6). DID 검사와 western blot/eia 추가검사로 양성 혹은 음성 여 부를 확인할 수 있었던 검체들을 기준으로 LG ENA Immunoblot 검사의 예민도 및 특이도를 분석할 경우 항-RNP는 각각 92.0% (23/25), 99.4% (177/178), 항-Sm은 각각 100.0% (11/11), 99.5% (188/189), 항-SSA는 각각 100% (67/67), 97.9% (138/141), 항-SSB는 각각 90.0% (9/10), 98.0% (197/201), 항-Scl70은 각각 100% (4/4), 100% (207/207)이 었고, 건강인 헌혈자를 포함한 특이도는 항-RNP는 99.6% (249/250), 항-Sm은 99.6% (260/261), 항-SSA는 98.6% (210/213), 항-SSB는 98.5% (269/273), 항-Scl70은 100% (279/279)이었다(Table 6). 3. LG ENA Immunoblot의 정밀도 평가 LG ENA Immunoblot 검사에서 양성으로 검출된 항- RNP/Sm, 항-Sm, 항-SSA, 항-SSB, 항-Scl70, 항-Jo1 각각의 개별항체는 3+ 이상의 검체로, 10일간 연속 검사에서도 3+ 이상 으로 변화를 보이지 않아, 정밀도는 100%이었다. 고 찰 ENA의 표준검사법으로 현재까지는 이중면역확산법(DID)이 인정되고 있다[8]. 그러나 민감도가 떨어지고 침강선이 뚜렷하지

6 LG ENA Immunoblot 시약을 이용한 ENA 자가항체 검출 39 Cenp-A P RNP&Sm Sm SS-A SS-B Sd-70 Jo-1 a Sm B B SS-B Jo-1 SS-A RNP Sd-70 ds DNA A B Fig. 1. Comparison of reactivity of autoantibodies to LG ENA Immunoblot (A) and ANA Western Blot Immunoassay (B). (A): Lane 1 through 9 depict reactivity of autoantibodies (anti-rnp, anti-sm, anti-ssa, anti-ssb, anti-scl70, and anti-jo1, respectively). Compared to the left western blot, bands on the strip are spaced at regular distances and display more distinct reactivity. (B): Lane 1 shows reactivity to positive control serum containing several autoantibodies, while Lane 2 shows normal human serum. Lanes 3 through 7 depict reactivity of each autoantibody that is hard to read because of background noise and uncertainty of location of autoantigens on the strip. 않으면 판정이 어려운 단점들[9, 10] 외에도 시약이 고가이고 국 내에서는 이런 고가의 시약을 대부분 외국에서 수입하여 사용하 는 문제점들이 있다. 또한 여러 자가항체를 동시에 검사하기에는 부적합한데 이를 위하여 western blot 등이 고려될 수 있다. 그 런데 Anti-Nuclear Antibody (ANA) Western Blot Immunoassay (IMMCO Diagnostics Inc., NY, USA)의 경우는 Fig. 1 에서 보는 바와 같이 여러 종류의 항원이 스트립 상에 불규칙하 게 분포하고 있기 때문에 결과를 판독하기가 어려운 단점이 있다. 반면 LG ENA Immunoblot (LGCI Inc., Seoul, Korea)은 순 수 분리된 자가항원을 스트립상에 일정한 간격으로 입혀 만든 것 이기 때문에 western blot 보다는 판독이 용이한 편이다. 본 연구에 사용된 LG ENA Immunoblot 시약은 DID 결과와 의 일치율이 개별 항체 수준에서 SLE 환자에서는 93.1%, RA 환자에서는 98.8%, 헌혈자에서 100%로 매우 높았고, 불일치 결 과에 대한 ELISA 및 western blot 추가검사를 시행한 경우 예 민도는 모두 90% 이상, 특이도는 모두 98.5% 이상을 보여 DID 를 대체하여도 무방할 것으로 판단된다. Evans[17]와 Nakamura 등[18]은 SLE 환자의 30-40%에서 항-RNP가 양성을 보이는데 항-Sm 항체와 동반되어서 나타나는 경우가 많으며 일부에서만 단독 양성을 보인다고 하였다. 항- RNP가 다른 종류의 항핵항체가 존재하지 않고 단독으로 높은 역가를 나타내면 MCTD의 가능성을 강력히 시사한다고 김 등 [19]과 Combe 등[20]은 보고하였다. 본 연구의 108명 SLE 환 자군에서는 LG ENA Immunoblot의 경우 항-RNP/Sm과 항- Sm 동시 양성은 10.2% (11/108), 항-Sm 단독 양성은 8.3% (9/108), 항-RNP/Sm 단독 양성은 12.0% (13/108)이어서 항- RNP/Sm 전체 양성률은 22.2% (24/108), 항-Sm 전체 양성률 은 18.5% (20/108)이었다. 반면 DID 검사에서는 항-RNP/Sm 동시 양성 3.7% (4/108), 항-Sm 단독 양성 1.9% (2/108), 항- RNP 단독 양성 25% (27/108)로 항-RNP 전체 양성률은 28.7% (31/108), 항-Sm 전체 양성률은 5.6% (6/108)이었다. 따라서 항-RNP의 전체 양성률은 두 시약간에 차이가 없는 반면 항-Sm 양성률은 두 시약간에 차이가 많은 것을 알 수 있었다. 또한 SLE의 경우에는 항-RNP/Sm 동시 양성률이 높다고 알려 져 있는데 본 연구의 SLE 대상군에서는 LG ENA Immunoblot 의 경우 항-RNP 전체 양성의 45.8% (11/24)가 항-Sm 동시양 성인 반면 DID는 12.9% (4/31)만 동시양성이어서 두 시약간 검 출양상에 차이가 있음을 알 수 있었다. Evans[17]와 Nakamura 등[18]은 SLE 환자의 대략 15-30%에서 항-Sm이 양성을 보이는데, 단독으로 보이는 경우는 드 물고 거의 대부분 항-RNP와 동반되어 나타난다고 하였다. 이는 SLE의 경우 U1RNP에 대한 자가면역반응이 일어난 후에 Sm determinant에 대해서도 자가면역반응이 확장되어지기 때문이라 고 Craft[21]는 설명하였다. 따라서 본 연구에서도 LG ENA Immunoblot을 판독하는데 있어 RNP/Sm 밴드에서만 양성인 경우는 RNP 단독 양성으로 판정하였고, RNP/Sm 밴드와 Sm 밴드에 동시 양성인 경우는 항-RNP와 항-Sm 동시 양성으로 판 정하였다. 그러나 일부 Sm 단독 양성의 가능성을 배제할 수는 없었다. 본 연구의 108명 SLE 환자군에서도 LG ENA Immunoblot의 경우 항-RNP/항-Sm 동시 양성은 11명, 항-Sm 단독 양성은 9명이어서 55.0% (11/20)가 동시 양성이었고 DID 에서는 항-RNP, 항-Sm 동시 양성 4명 항-Sm 단독 양성 2명이 어서 66.7% (4/6)로 둘 다 유사한 수준의 동시 양성률을 보여주 었다. 반면 항-Sm 전체 양성률은 LG ENA Immunoblot의 경 우 18.5% (20/108), DID의 경우 5.6% (6/108)로 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 항-Sm은 SLE에 매우 특이적이며 대략 15-30%의 양성을 보인다는 점과 오히려 아시아인과 아프리카인 에서 더 높은 양성률을 보인다는 Evans[17]의 보고를 고려하면

7 40 채정돈 오흥범 이창근 외 3인 LG ENA Immunoblot과 큰 차이를 보이는 DID 성적은 문제점 이 있는 것으로 여겨진다. Meyer 등[22]은 DID에서 항-Sm 음 성인 SLE 환자들의 검체를 immunoblot으로 재검한 결과 82% 에서 양성을 보였다고 하면서 이는 Immnoblot이 침강을 일으키 지 않는 자가항체도 검출하였기 때문이라고 하였다. Williams 등 [23]도 immunoblot에서 검출된 13개의 항-Sm 중 4개가 DID에 서 음성이었다고 보고하였다. 그런데 103개 RA 검체 중 1개가 항-Sm에 1+ 양성을 보였으나 추가 검사에 의해 최종 위양성으 로 판정되었기 때문에 LG ENA Immunoblot의 항-Sm 민감도 를 조정을 위해 유사 반응도를 보이는 검체들을 대상으로 추가연 구가 필요하다고 여겨진다. 항-SSA는 SLE 환자의 대략 24-60%에서 양성을 보인다고 Evans[17]와 Nakamura 등[18]이 보고하였는데, 본 연구의 경 우에도 LG ENA Immunoblot의 경우 57.4%, DID의 경우 55.6%를 보여 기존의 연구와 유사한 수준이었다. 항-SSA에서 불일치를 보인 7건 중 1건은 두 가지 추가검사가 LG ENA Immunoblot을, 3건은 DID를 지지하였다. 후자의 3건은 모두 LG Immunoblot에서 1+ 반응을 보였던 것이었다. 따라서 항- SSA의 경우에도 LG ENA Immunoblot에서 1+ 반응을 보이는 검체의 일부는 위양성의 가능성이 있으나, 전체 양성률이 기존의 보고와 유사하고 키트의 특이도가 98.6%인 점을 고려하면 일상 적인 업무에서는 DID를 대체하여도 문제가 될 정도는 아니라 사 료된다. 항-SSB는 SLE 환자의 대략 9-35%에서 양성을 보인다고 Evans[17]와 Nakamura 등[18]이 보고하였고, 종종 항-SSA와 동시에 검출된다. 본 연구에서는 LG ENA Immunoblot의 경우 11.1%, DID의 경우 8%를 보여 기존의 보고보다 낮은 양성률을 보였다. 그런데 불일치를 보인 5건 모두 두 가지 추가검사에서 DID 결과를 지지하였는데 DID에서 단독양성의 경우가 1건, LG ENA Immunoblot에서 단독양성이었던 경우가 2건, LG ENA Immunoblot에서 항-SSA/항-SSB 둘 다 양성인 경우가 2건이 었다. 후자의 2건은 항-SSB가 모두 1+이었다. 따라서 항-SSB의 경우에도 LG ENA Immunoblot에서 1+ 양성을 보이는 경우 일부 위양성이 포함될 수 있음을 보여주었다. 항-Scl70에 대한 LG ENA Immunoblot 양성 검체 4건 중 3 건은 DID와 일치하였고, 불일치한 1건은 western blot 검사에서 양성을 보여 LG ENA Immunoblot 검사와 일치하는 것으로 판 정하였으므로 모든 예에서 LG ENA Immunoblot 결과를 모두 지지하였다. 항-Jo1의 경우는 양성 대조 혈청에 대한 DID 결과 를 판정하기가 어려워 본 연구에 포함되지 않았으나, LG ENA Immunoblot의 경우는 항-Jo1 양성 대조 혈청을 이용한 정밀도 평가에서 100%를 보여 향후 항-Jo1의 경우는 LG ENA Immunoblot을 통해 더 정확한 결과를 낼 수 있을 것이 기대된다. 결론적으로 LG ENA Immunoblot은 DID와의 일치율이 개별 항체 수준에서 SLE 환자에서는 93.1%, RA 환자에서는 98.8%, 헌혈자에서 100%로 매우 높았고, 예민도는 모두 90% 이상, 특 이도는 모두 98.5% 이상을 보여 일차 선별검사로 DID와 성능이 유사한 것으로 판단되었다. 하지만 항-Sm에서의 민감도는 추후 보완되어야 할 것으로 사료된다. 국내에 사용하는 대부분의 DID 시약이 외산이어서 수입대체 효과가 있다는 점, 여러 자가항체를 동시에 검사할 수 있다는 점, 항-Jo1의 경우 현재의 DID로 검출 이 어렵다는 점 등을 함께 고려하면 ENA 자가항체 검사를 LG ENA Immunoblot으로 대체하는 것이 바람직하다고 사료된다. 요 약 서론 : ENA는 자가항체의 성분 및 그 특성 분석을 위한 검사 법이다. 최근 우리 나라 LG 화학에서 항-RNP/Sm, 항-Sm, 항- SSA, 항-SSB, 항-Scl70, 항-Jo1 항체를 동시에 반정량으로 검 출할 수 있는 LG ENA Immunoblot 키트를 제작하였다. 이에 본 연구에서는 LG ENA Immunoblot (LGCI Inc., Seoul, Korea) 검사의 임상적 유용성을 기존의 DID와 비교하고 필요한 경우 western blot 및 ELISA를 추가하여 비교평가 하였다. 방법 : SLE 환자 108명, RA 환자 103명, 헌혈자 72명의 검 체를 대상으로 DID와 LG ENA Immunoblot으로 특이 자가항 체를 검출하였다. 이들 시약간의 불일치 결과를 보이는 검체는 ELISA (ENA ELISA TEST SYSTEM, Zeus Scientific Inc., NJ, USA)와 western blot (ANA Western Blot Immunoassay, IMMCO Diagnostics Inc., NY, USA)으로 추 가검사를 실시한 후 LG ENA Immunoblot의 민감도와 특이도 를 구하였고 10일간 between-day 정밀도를 구하였다. 결과 : DID와 LG ENA Immunoblot간 개별 항체 수준에서 의 일치율은 SLE, RA 환자에서 각각 항-RNP 88.0% (95/ 108), 100.0% (103/103), 항-Sm 87.0% (94/108), 97.1% (100/103), 항-SSA 94.4% (102/108), 99.0% (102/103), 항- SSB 97.2% (105/108), 98.1% (101/103), 항-Scl % (107/108), 100.0%(103/103)이었다. DID 검사를 시행하고 불일 치 검체에 대하여 western blot과 ELISA 추가검사로 양성 혹은 음성 여부를 확인할 수 있었던 검체를 기준으로 LG ENA Immunoblot 검사의 예민도 및 특이도를 분석할 경우 항-RNP는 92.0%, 99.6%, 항-Sm은 각각 100.0%, 99.6%, 항-SSA는 각각 100%, 98.6%, 항-SSB는 90.0%, 98.5%, 항-Scl70은 모두 100.0%이었다. 검사일간 정밀도는 100%이었다. 결론 : 국내에서 최근 개발된 LG ENA Immunoblot은 DID 와의 일치율이 매우 높고 개별 항체 수준에서 예민도는 모두 90% 이상, 특이도는 모두 98.5% 이상을 보여 일차 선별검사로 DID와 성능이 유사한 것으로 판단되었다. 국내에 사용하는 대부 분의 DID 시약이 외산이어서 수입대체 효과가 있다는 점, 여러 자가항체를 동시에 검사할 수 있다는 점 등을 함께 고려하면 ENA 자가항체 검사를 LG ENA Immunoblot으로 대체하는 것 이 바람직하다고 사료된다.

8 LG ENA Immunoblot 시약을 이용한 ENA 자가항체 검출 41 참고문헌 1. Hiepe F, D rner T, Burmester G. Antinuclear antibody- and extractable nuclear antigen-related diseases. Int Arch Allergy Immunol 2000; 123: Tan EM. Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 1989; 44: Sharp GC, Irvin WS, May CM, Holman HR, McDuffie FC, Hess EV, et al. Association of antibodies to ribonucleoprotein and Sm antigens with mixed connective-tissue disease, systematic lupus erythematosus and other rheumatic diseases. N Engl J Med 1976; 295: Hiertarenta M and Lassila O. Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic rheumatic diseases. Ann Med 1996; 28: McCarthy GA. Autoantibodies and their relation to rheumatic diseases. Med Clin North Am 1986; 70: Shero JH, Bordwell B, Rothfield NF, Earnshaw WC. High titers of autoantibodies to topoisomerase I (Scl-70) in sera from scleroderma patients. Science 1986; 231: Vazquez-Abad D and Rothfield NF. Sensitivity and specificity of anti- Jo-1 antibodies in autoimmune diseases with myositis. Arth Rheum 1996; 39: Bridges AJ, Lorden TE, Havighurst TC. Autoantibody testing for connective tissue diseases. Comparison of immunodiffusion, immunoblot, and enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 1997; 108: 김현숙, 이미경, 이삼열. 항DNA 항체 양성인 전신성 홍반성 낭창 환자의 혈청내 자가항체 성분 분석. 대한임상병리학회지 1991; 11: James K and Meek G. Evaluation of commercial enzyme immunoassays compared to immunofluorescence and double diffusion for autoantibodies associated with autoimmune diseases. Am J Clin Pathol 1992; 97: Paxton H, Bendele T, O Connor L, Haynes DC. Evaluation of the RheumaStrip ANA profile test: a rapid test strip procedure for simultaneously determining antibodies to autoantigens U1-ribonucleoprotein (U1- RNP), Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, and to native DNA. Clin Chem 1990; 36: Prince HE and Hogrefe WR. Evaluation of a line immunoblot assay for detection of antibodies recognizing extractable nuclear antigens. J Clin Lab Anal 1998; 12: Tan EM, Cohen AS, Fries JF, Masi AT, McShane DJ, Rothfield NF, et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 25: Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus [letter]. Arthritis Rheum 1997; 40: Gladman DD, Urowitz MB, Esdaile JM, Hahn BH, Klippel J, Lahita R, et al. Guidelines for referral and management of systemic lupus erythematosus in adults. Arthritis Rheum 1999; 42: Evans J. Antinuclear antibody testing in systemic autoimmune disease. Clin Chest Med 1998; 19: Nakamura RM and Tan EM. Update on autoantibodies to intracellular antigens in systemic rheumatic diseases. Clin Lab Med 1992; 12: 김신규 및 김성윤. 이중면역확산법(DID)에의한anti-Sm, anti-rnp 검사에 관한 연구. 대한임상병리학회지 1990; 10: Combe B, Rucheton M, Graafland H, Lussiez V, Brunel C, Sany J. Clinical significance of anti-rnp and anti-sm autoantibodies as determined by immunoblotting and immunoprecipitation in sera from patients with connective tissue diseases. Clin Exp Immunol 1989; 75: Craft JE. Anti-snRNP antibody. In: Wallace DJ, Hann BH. Dubois Lupus Erythematosus, 5th ed., Williams & Willkins, Maryland, USA, 1997: Meyer O, Bourgeosi P, Aeschlimann A, Haim T, Mery JP, Kahn MF. Immunoblotting profiles in 55 systemic lupus erythematosus sera lacking precipitating antibodies to extractable nuclear antigens. Ann Rheum Dis 1989; 48: Williams DG, Stocks MR, Charles PJ, Maini RN. Antibodies to La, Jo- 1, nrnp and Sm detected by multi-track immunoblotting using a novel filter holder: a comparative study with counterimmunoelectrophoresis and immunodiffusion using sera from patients with systemic lupus erythe-.. matosus and Sjogren s syndrome. J Immunol Methods 1986; 91: