한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 서울대학교 식품의약품안전청

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1 한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 주관연구기관 연구책임자 서울대학교 강삼식 발행년월 주관부처 사업관리기관 NDSL URL 식품의약품안전청 식품의약품안전청 IP/ID 이용시간 2018/01/08 19:06:15 저작권안내 1 NDSL 에서제공하는모든저작물의저작권은원저작자에게있으며, KISTI 는복제 / 배포 / 전송권을확보하고있습니다. 2 NDSL 에서제공하는콘텐츠를상업적및기타영리목적으로복제 / 배포 / 전송할경우사전에 KISTI 의허락을받아야합니다. 3 NDSL 에서제공하는콘텐츠를보도, 비평, 교육, 연구등을위하여정당한범위안에서공정한관행에합치되게인용할수있습니다. 4 NDSL 에서제공하는콘텐츠를무단복제, 전송, 배포기타저작권법에위반되는방법으로이용할경우저작권법제 136 조에따라 5 년이하의징역또는 5 천만원이하의벌금에처해질수있습니다.

2 한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 서울대학교 식품의약품안전청

3 제출문 식품의약품안전청장귀하 이보고서를 한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 )( 서울대학 교 / 강삼식 ) 과제의연차실적 계획서로제출합니다 주관연구기관명 : 서울대학교 주관연구책임자 : 강삼식 제 1세부과제명 : 금은화및인동으로부터한약재생리활성성분의분리 ( 제 1세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 서울대학교약학대학 / 강삼식 제 2세부과제명 : 지표물질동시정성정량분석법개발및패턴분석 ( 제 2세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 서울대학교약학대학 / 신종헌 - 1 -

4 목 차 당해년도연구개발사업실적 연구개발과제의최종연구개발목표와당해년도연구개발목표 연구개발과제의당해년도연구개발내용 연구개발과제의당해년도연구성과 연구수행에따른문제점및대책 실적요약문 차년도연구개발사업계획 < 총괄연구과제 > 요약문 연구개발비총괄표 연구책임자인적사항및연구개발실적 ( 변경된경우만작성 ) 참여연구원편성표 총괄연구과제의차년도연구개발목표 총괄연구과제의차년도연구개발계획 연차별연구수행일정 첨부서류 < 제1 세부연구과제 > 요약문 차연도연구개발비총괄표 ( 세부과제 ) 제1 세부연구과제의차년도연구개발목표 제1 세부연구과제의차년도연구개발계획 첨부서류 < 제2 세부연구과제 > 요약문 차연도연구개발비총괄표 ( 세부과제 ) 제1 세부연구과제의차년도연구개발목표 제1 세부연구과제의차년도연구개발계획 첨부서류

5 당해년도연구개발사업실적 1. 연구개발과제의최종연구개발목표와당해년도연구개발목표 (1) 최종연구개발목표 구분최종연구개발목표 총괄연구과제 제 1 세부과제 제 2 세부과제 금은화및인동으로부터유효성분중심의한약재관리에필요한생리활성성분의분리, 확인및이들생리활성성분을이용한 HPLC/UV 및 LC-MS(MS) 법에의한동시분석법을개발하고 pattern인식법에의한기원별, 산지별한약재정보를구축하고자한다. 분석을위한표준품을제조, 공급하고, 차후연구를위한시료를확보하여제공하고자한다. 1차년도연구목표금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을분리하고구조를구명하여, 이들을이용한동시분석법을개발하기위하여표준품들을제조확보한다. 2차년도연구목표금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을대량분리하여분석용표준품및연구용시료로제공한다. Pattern인식법에의한기원별, 산지별한약재정보를구축하고자함. 금은화및인동으로부터유효성분중심의한약재관리에필요한생리활성성분의분리, 확인하고 pattern인식법에의한기원별, 산지별한약재정보를구축하고자한다. 기원별, 산지별분석을위한표준품을제조, 공급하고, 차후연구를위한시료를확보하여제공하고자한다. 1차년도연구목표금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을분리하고구조를구명하여, 이들을이용한동시분석법을개발하기위하여표준품들을제조확보한다. 2차년도연구목표금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을대량분리하여분석용표준품및연구용시료로제공한다. 금은화및인동활성성분의효과적인정성정량분석법확립, 순도결정및 5성분이상의지표물질동시분석법개발과산지기원에따른 20품목이상의시료에대한패턴인식 / 지문인식법에의한한약재평가 1차년도연구목표한방생약금은화에함유된생약성분의정량및정성분석을위한 TLC, HPLC-DAD 및 LC-MS/MS 동시분석법개발및기원과산지별 20품목이상의한약재패턴인식 / 지문인식법에의한평가. 한방생약인동에함유된생약성분의정량및정성분석을위한기초실험 2차년도연구목표한방생약인동에함유된생약성분의정량및정성분석을위한 TLC, HPLC-DAD 및 LC-MS/MS 동시분석법개발및기원과산지별 20품목이상의한약재패턴인식 / 지문인식법에의한평가 - 3 -

6 (2) 당해년도연구개발목표 구분당해년도연구개발목표 총괄연구과제 금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을분리하고구조를구명하여, 이들을이용한동시분석법을개발하기위하여표준품들을제조제출한다. 제 1 세부과제 금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을각각 10종이상분리하고구조를구명하며, 이들을이용한동시분석법및효능연구를위한시료로제공한다. 제 2 세부과제 금은화활성성분의효과적인정성정량분석법확립, 순도결정및 5성분이상의지표물질동시분석법개발과산지기원에따른 20품목이상의시료에대한패턴인식 / 지문인식법에의한한약재평가한다. 인동활성성분의정성정량분석법을위한기초실험을수행한다. 2. 연구개발과제의당해년도연구개발내용 (1) 총괄연구개발과제 총괄연구개발과제명 한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 총괄연구책임자 강삼식 / 서울대학교 / 천연물화학 1. 인동및금은화의성분분리인동의 70% EtOH엑스를제조하고분획하여얻은이들분획들에대하여크로마토그라피를반복실시하여다음과같은물질들을분리하였다. 즉 CH 2 Cl 2 분획으로부터 trilinolein (1), bis(2-ethylhexyl)phthalte (DOP, 2), C16-C26의지방산혼합물 (3), hexacosanol (7) 같은 hydrocarbon alcohol 및지방산유도체들과, obtusifoliol (11), gramisterol (12), citrostadienol (13) 과같은 4α-methyl ergosterol 유도체들과, β-sitosterol (4) 및 daucosterol (8) 같은 phytosterol유도체들을분리하여확인하였다. EtOAc분획도각종크로마토그라피를반복실시하여 β-sitosterol 및 daucosterol, triterpene계화합물들인 pomolic acid (5) 와 ursolic acid (6), euscaphic acid (16) 및 23-hydroxytormentic acid (15) 등을분리확인하였고, iridoid인 loganin (10) 을분리하였다. BuOH분획으로부터는이미분리된 β-sitosterol 및 daucosterol, 지방산이외에 loganin (10) 과 secologanin dimethyl acetal (14) 등총 16종의화합물들은분리하여확인하였다

7 O O α β O γ O O O Trilinolein (1) R 2 O 8' 3 7' 2 1 O 1' 2' 6' COOH O R 1 O HO CH 2 R 3 Bis(2-ethylhexyl)phthalate (DOP, 2) Pomolic acid (5) R 1 =R 3 =H R 2 =OH Ursolic acid (6) R 1 =R 2 =R 3 =H 23-Hydroxytormentic acid (15) R 1 =R 2 =R 3 =OH HO HO Obtusifoliol (11) Gramisterol (12) - 5 -

8 COOCH 3 H HO 6 HO O HO HO HO 5 9 H 1' OH 3 1 O O Citrostadienol (13) Loganin (10) COOCH 3 OH H 3 CO OCH O COOH HO HO 10 O 1' O HO HO HO OH Secologanin dimethyl acetal (14) Euscaphic acid (16) 금은화의 EtOAc분획으로부터 β-sitosterol 및 daucosterol 이외에 flavonoid성분들인 luteolin (3), luteolin 7-O-glucoside (7) 과 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester (6) 와 caffeic acid (4), protocatethuic acid (9), azelaic acid (8) 및 4,5-dicaffeoylquinic acid (10) 등을분리하여확인하였다. CH 2 Cl 2 분획으로부터 hexacosanol (11) 을분리하였다. 따라서인동으로부터 16종, 금은화로부터 11종의화합물들을분리하였으며, 이들성분중금은화로부터분리한 azelaic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester와, 인동으로부터분리된 triterpene계화합물들인 ursolic acid, pomolic acid, euscaphic acid와 23-hydroxytormentic acid들과, 4α-methyl ergosterol 유도체들인 obtusifoliol, gramisterol 및 citrostadienol 등은이식물로부터처음으로분리된화합물들임을알았다. 제2세부과제에 19종의화합물들을동시분석용지표물질들로제공하였고, 인동의성분 12종, 금은화의성분 10종을제공하여활성평가를위한실험재료로제공하였다

9 OH 8 COOH HO O OH OH O HO 3 OH Luteolin (3) Caffeic acid (4) OH 3' OH ROOC O 9' O ' 8' O O 1' 8' OH 4' OH 1' 4' OH HO HO HO O OH O OH O O OH OH OH 4,5-Dicaffeoylquinic acid methyl ester (6) Luteolin 7-O-glucoside (7) 4,5-Dicaffeoylquinic acid (10) R=CH 3 R= H COOH HOOC COOH OH OH Azelaic acid (8) Protocatechuic acid (9) - 7 -

10 2. 시료의선정및 LC 조건의확립 Flavonoids, phenolic compounds, 그리고 iridoids 계열인 protocatechuic acid, chlorogenic acid, loganin, caffeic acid, rutin, lonicerin, hyperin, caffeic acid methyl ester, luteolin, quercetin 등 10종의시료를일차적으로선정하여 MeOH 1 ml에녹인 stock solution을만든후사용하였다. 내부표준물질은 2,3,4-trihydroxybenzoic acid를사용하였으며, column으로는 Agilent사의 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (C18, mm, 5 μm) 을사용하였고, 최상의조건으로이동상으로는 0.1% formic acid가첨가된 100% acetonitrile (A 용매 ) 과 100% water (B 용매 ) 로서용매기울기용리를사용하였다. 용매기울기용리의조건으로는 A용매를 0~3분까지 15% 유지하였다가 3~20분까지 40% 기울기용리로서분석한후 20~25분까지는 40% 로유지, 25~30분까지는이를다시 15% 로기울기용리, 30~40분까지는원래의초기이동상인 A용매 15% 로안정화시켰다. 유속은 0.3 ml/min 이고, 검출기파장은 210 nm에서측정하였다. min Fig. 1. The HPLC chromatogram of standard compounds by DAD detector min Fig. 2. The HPLC chromatogram of crude samples 1. protocatechuic acid, 2. 2,3,4-trihydroxybenzoic acid (I.S), 3. chlorogenic acid, 4. loganin, 5. caffeic acid, 6. rutin, 7. lonicerin, 8. hyperin, 9. caffeic acid methyl ester, 10. luteolin, 11. quercetin - 8 -

11 최적추출방법을정하기위해용매별, 실험방법별, 추출시간별분석을통해비교하였다. 1) 용매별분석으로 100%, 70% 에탄올수용액과 100%, 70% 메탄올수용액을각각시료에 10 ml 를넣은후 ultrasonication 방법으로 60분추출, 분석하였다. 2) 실험방법별분석으로는시료에 70% 에탄올수용액을첨가한후, 각시료를 vortex, reflux 그리고 ultrasonication의방법으로 60분간추출하여분석비교하였다. 3) 추출시간별분석으로는각시료에 70% 에탄올수용액을첨가한후, ultrasonication법을사용하여 10분, 20분, 30분, 60분, 90분을각시료별로추출하여분석비교하였다. 추출용매로서는 70% 에탄올수용액이비교한다른용매에비해추출효율이좋았으며, 추출방법으로는 ultasonicaton 법이 reflux나 vortex법에비해비교적간단하며, 추출효율또한비슷하거나더좋았다. 마지막추출시간별분석으로여러추출시간을비교한결과 60분이가장효율적인시간이었다. 3. Validation 상기 10종의표준물질에대하여제반 validation parameter를측정하였다. 가 ) Specificity 시료에대한 specificity는 LC에서의 retention time의차이로완전히분리되었으며각각의화합물의확인은표준시료를하나씩주입하여확인되었다. 시료의머무름시간은각각 10.34분에 protocatechuic acid, 12.38분에 chlorogenic acid, 14.72분에 loganin, 분에 caffeic acid, 18.88분에 rutin, 19.39분에 lonicerin, 19.89분에 hyperin, 26.66분에 caffeic methyl ester, 분에 luteolin, 29.03분에 quercetin 성분들이용출되었다. 나 ) Linearity and Range 각각의시료에대한 range 1~20 mg/l 구간에서 conversion equation을획득하였으며 correlation coefficient (R 2 ) 는모두 0.99 였다. conversion equation의기울기는 procatechuic acid가가장높았고 (0.9517X), loganin이가장낮았다 (0.0576X). 다 ) Detection Limit and Quantitation Limit 각시료의 detection limit는모두 mg/l 이하였으며 quantitation limit는 mg/l 이하였다. 이들중에서 chlorogenic acid가가장높은한계 (detection limit mg/l, quantitation limit mg/l) 을나타내었고 quercetin이가장낮은한계 (detection limit mg/l, quantitation limit mg/l) 를보여주었다. 여타의물질들은중간값을나타내었으나대체로 quercetin과유사하였다. 라 ) Accuracy and Precision Accuracy와 precision을측정하는방법으로는 spiking recovery 방법을이용하였다. 일내 (intra-day) 와일간 (inter-day) 에서의회수율를측정한결과최하 97.8 최고 109.7% 의회수율을보여주었으며 RSD는 % 를나타내었다. 마 ) Robustness 1 Phenomenex 사의 Gemini 5 μ C18 컬럼과 Shiseido사의 CAPCELL PAK C18 UG120 을사용하여비교하였다. Phenomenex 사의 Gemini 5 μ C18 컬럼의경우같은이동상조건에서대부분의 standard compounds는분리가되었으나각각근접해있는 rutin과 lonicerin의분리능이떨어졌고전체적인머무름시간이길어졌다. Shiseido사의 CAPCELL PAK C18 UG120의경우전체적인머무름시간은비슷했으나 luteolin과 quercetin의분리능이약간떨어 - 9 -

12 졌다. 따라서컬럼은 Agilent사의 ZORBAX Eclipse XDB-C18 컬럼이금은화 standard compounds 분리에는훨씬더우수하였다. 2시료분석시컬럼의온도에따른분리능을비교한결과동일한이동상과컬럼에온도를 20, 25, 30, 35, 40 로바꾸어분석해본결과온도가높아질수록머무름시간 19~20분대의 lonicerin과 hyperin 그리고 28~29분대의 luteolin과 quercetin이겹치는경향을보였다. 따라서컬럼의분석온도는모든 standard compound가뚜렷이분리가이루어지는 20 가우수하였다. 4. LC-MS/MS 분석 HPLC-DAD 분석에사용된 10종의지표물질에대하여각물질별 SRM mode에서의최적분석조건을확립하였으며현재동시분석이진행중이다. 5. 시판한약재의함량분석및패턴분석사업단에서제공된 5종의시료와자체적으로수집한다양한산지의 16종의시료등 21종의시료에대하여 2) 최적추출방법에따라유기물질을추출하여현재각시료별표준물질의정량이진행중이다. (2) 제 1 세부과제 제1세부과제명제1세부과제책임자 금은화및인동으로부터한약재생리활성성분의분리강삼식 / 서울대학교 / 천연물화학 1. 인동 (Lonicera japonica, Vine) 으로부터활성성분의분리 인동 ( 忍冬 ) 은우리나라생약규격집에수재되어있으며, 인동과식물인인동덩굴 (Lonicera japonica) 의줄기와가지를말한다. 인동의성분은 flavonoid, iridoid 및 saponin이주성분으로알려지고있다. Flavonoid 성분으로는 luteolin 1) 및 chrysin 1) 같은 flavone계성분들과이의 dimer인 3'-O-methyl loniflavone, 1) loniflavone 1) 같은 biflavonoid성분들이보고되었다. Monoterpene계성분중의하나인 iridoid성분으로는 loganin 2) 이주성분이며이외에도 vogeloside, 2) epi-vogeloside 2) 와 secologanin dimethylacetal, 2) L-phenylalaninosecologanin, 3) (Z)- aldosecologanin, 3) (E)-aldosecologanin, 3) 7-O-(4-β-D-glucopyranosyloxy-3-methoxy-benzoyl)seco loganolic acid, 3) 6'-O-(7α-hydroxyswerosyloxy)loganin, 3) 등이보고되었다. Saponin성분으로는 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-[3-O-acetyl-β-D-xylopyran osyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 4) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-xylopyranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 4) hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside, 5) hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranoside, 5) hederagenin 3-O-α-L-rhamno pyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranoside, 5) 3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopy ranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 5) 3-O-β-D-glucopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hedera

13 genin 28-O-β-D-glucopyranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 5) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-Larabinopyranosyl hedearagenin 28-O-β-D-glucopyranoside, 5) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-Larabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 5) 3-O-α-Lrhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-[6-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl](1 6)-β-D-glucopyranoside, 5) 3-O-α-L-arabinopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl(1 6)- β-d-glucopyranoside, 5) oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranoside, 5) 3-O-α -L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl(1 6)-β- D-glucopyranoside 5) 및 3-O-β-D-glucopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl oleanolic acid 28-O-β- D-glucopyranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside 5) 등이보고되어있다. 이들 saponin성분들은모두 aglycon으로 oleanolic acid와 hederagenin으로구성되어있으며, 이들 saponin성분들은지역적으로서로다른구조를갖는 saponin성분들이보고되고있다. 국내의연구결과인동의성분은 flavonoid 성분으로는 quercetin, 6) ochnaflavone, 6) ochnaflavone 4'-O-methyl ether 6) 같은성분들과, flavonoid 배당체들인 astragalin, 6) isoquercitrin, 6) rhoifolin (apigenin 7-O-neohesperidoside), 6) diosmetin 7-O-glucoside 7) 및 lonicerin 7) 등이보고되었으며, 이외에도 flavonolignan성분인 hydnocarpin 6) 도보고되었다. Monoterpene계성분중의하나인 iridoid성분으로는 loganin 8) 이주성분이며이외에도 vogeloside 7) 도보고되었다. Saponin성분으로는 loniceroside A, 9) loniceroside B, 9) loniceroside C 10) 등이보고되었다. 1. Neeraj Kumar, Bikram Singh, Pamita Bhandari, Ajai P. Gupta Sanjay K. Uniyal, and Vijay K. Kaul, Biflavonoids from Lonicera japonica. Phytochemistry, 66, (2005) 2. Hideaki Kawai, Masanori Kuroyanagi and Akira Ueno, Iridoid Glucosides from Lonicera japonica Thunb. Chem. Pharm. Bull., 36, (1988) 3. Koichi Machida, Hiromi Sasaki, Takeyoshi Iijima, and Masao Kikuchi, Studies on the Constituents of Lonicera Species. XVII. 1) New Iridoid Glycosides of the Stems and Leaves of Lonicera japonica Thunb. Chem. Pharm. Bull., 50, (2002) 4. Shoji Yahara, Naomi Kobayashi and Toshihiro Nohara, Studies on the Triterpenoid Glycosides in Lonicerae Caulis et Folium. Shoyakugaku Zasshi, 44, (1990) 5. Hideaki Kawai, Masanori Kuroyanagi, Kaoru Umehara,, Akira Ueno, and Motoyoshi Satake, Studies on the Saponins of Lonicera japonica Thunb. Chem. Pharm. Bull., 36, (1988) 6. Kun Ho Son, Jung Ok Park, Kyu Charn Chung, Hyeun Wook Chang, Hyun Pyo Kim, Ju Sun Kim, and Sam Sik Kang, Flavonoids from the Aerial Parts of Lonicera japonica. Arch. Pharm. Res., 15, (1992) 7. Kun Ho Son, Ju Sun Kim, Sam Sik Kang, Hyun Pyo Kim, and Hyeun Wook Chang, Isolation of Flavonoids from Lonicera japonica. Kor. J. Pharmacogn., 25, (1994) 8. Song Jin Lee, Eun Joo Shin, Kun Ho Son, Hyeun Wook Chang, Sam Sik Kang, and Hyun Pyo Kim. Anti-inflammatory activity of the major constituents of Lonicera japonica. Arch. Pharm. Res., 18, (1995) 9. Kun Ho Son, Keun Young Jung, Hyeun Wook Chang, Hyun Pyo Kim, and Sam Sik Kang,

14 Triterpenoid Saponins from the Aerial Parts of Lonicera japonica. Phytochemistry, 35, (1994) 10. Wie Jong Kwak, Chang Kyun Han, Hyeun Wook Chang, Hyun Pyo Kim, Sam Sik Kang, and Kun Ho Son, Loniceroside C, Antiinflammatory Saponin from Lonicera japonica. Chem. Pharm. Bull., 51, (2003) 실험재료 - 동국대이제현교수가제공한검체 ( 경북봉화산, 약 17 kg, 2007년 3월인수 ) 를사용하였다. 추출및분획 - 인동 15.6 kg을세절한후 70% EtOH로 reflux하여 3시간씩 5회추출하여 70% EtOH 엑스를얻었다. 이를 H 2 O로현탁시켜동량의 hexane을가하여진탕방치하여 hexane 분획 (81.3 g) 을얻고, 수층에동량의 CH 2 Cl 2 를가하여진탕방치하여 CH 2 Cl 2 분획 (97.8 g) 을, 수층에동량의 EtOAc를가하여진탕방치하여 EtOAc 분획 (127.2 g) 을, 다시수층에동량의 BuOH을가하여진탕방치하여 BuOH 분획 (491.5 g) 을얻고, 수층을농축하여 H 2 O 분획을얻었다 (Scheme 1). 분리및정제 - 인동의 CH 2 Cl 2 분획 (96.8 g) 에대하여 hexane, hexane/ch 2 Cl 2 (1:1), CH 2 Cl 2 /MeOH (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여 35개소분획을얻었다. 얻어진소분획들가운데먼저소분획 C-1319 (0.8 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 C (0.36 g) 에대하여 benzene으로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 C 로부터화합물 1 (20 mg ) 을얻었으며, 소분획 C (0.25 g) 에대하여 CHCl 3 으로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 C 으로부터화합물 7 (210 mg ) 을얻었다. 다음소분획 C-2225 (0.2 g) 에대하여 hexane, hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 C (11 mg ) 을 MeOH로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 C 로부터화합물 11 (2 mg ) 을, 소분획 C 로부터화합물 12 (2 mg ) 을, 소분획 C 으로부터화합물 13 (3 mg ) 을각각얻었다. 소분획 C-3337 (6.0 g) 에대하여 hexane, hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 C 로부터화합물 2 (30 mg ) 을, 소분획 C 로부터 CH 2 Cl 2 /MeOH 혼합용매로재결정을반복하여화합물 3 (10 mg ) 을각각얻었다. 소분획 C-3940 (2.0 g) 에대하여 hexane, hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography 를실시하여얻어진소분획 C 로부터 CH 2 Cl 2 /MeOH 혼합용매로재결정을반복하여화합물 3 (15 mg ) 을얻었다. 소분획 C-2631로부터 CH 2 Cl 2 /MeOH 혼합용매로재결정을반복하여화합물 4 (910 mg ) 을, 소분획 C-8487로부터 CH 2 Cl 2 /MeOH 혼합용매로재결정을반복하여화합물 8 (15 mg ) 을각각얻었으며계속정제중에있다. 다음소분획 C-6670 (3.8 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography 를진행중에있다

15 - Lonicera japonica Vine - CH 2 Cl 2 Cl 2 fraction 2 (96.8 g) g) hexane, hexane-ch 2 Cl 2 (1:1), CH 2 Cl 2 -MeOH gradient (SiO ) C-1319(0.8 g) C-2225(0.2 g) C-2631 C-3337(6.0 g) C-3940(2.0 g) C-8487 SiO 2 H/E gradient C (0.36 g) SiO 2 benzen C C (0.25 g) 1 (20 mg) Trilinolein SiO 2 CHCl 3 C SiO 2 7 (210 mg) Hexacosanol H/E gradient C RP-18 MeOH C ; CH 2 Cl 2 -MeOH 4 (910 mg) β-sitosterol 11(2 mg) Obtusifoliol C ; 12(2 mg) Gramisterol C ; 13(3 mg) Citrostadienol SiO 2 H/E gradient C (30 mg) DOP SiO 2 C C (10 mg) Fatty acids H/E gradient CH 2 Cl 2 -MeOH 3 (15 mg) Fatty acids CH 2 Cl 2 -MeOH CH 2 Cl 2 -MeOH 8 (15 mg) Daucosterol EtOAc 분획 (126.2 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획들가운데소분획 E-5371 (3.0 g) 에대하여 hexane, hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여소분획 E 로부터 CH 2 Cl 2 /MeOH 혼합용매로재결정을반복하여화합물 4 (189 mg ) 를얻었으며, E (0.26 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:0.1:0.5 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를진행중에있다. 다음소분획 E-7290 (5.0 g) 에대하여 hexane, hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (0.2 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:0.1:0.5 7:3:1의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (0.1 g) 에대하여 MeOH/H 2 O=95:5의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여소분획 E A로부터화합물 5 (8 mg ) 를, 소분획 E B로부터화합물 6 (20 mg ) 을각각얻었다. 소분획 E (6.05 g) 을 hexane/etoac (gradient의) 용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여 10:3에서얻어진 E 을 MeOH/H 2 O (gradient) 용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여 8:2로용출시켜얻은분획으로부터화합물 16 (10 mg) 을얻었다. 소분획 E (8.14 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (800 mg ) 을 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:0.5:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no

16 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E A로부터재결정을통해화합물 8 (21 mg ) 을얻었으며그모액 (53 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=65:35의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여화합물 15 (16 mg) 를얻었다. 다음소분획 E B (60 mg ) 에대하여도마찬가지로 MeOH/H 2 O=65:35의용출용매로 RP-18 column chromatography를진행중에있다. 소분획 E (15 mg ) 과 E (30 mg ) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5, 7:1.5:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를진행중에있으며, 소분획 E (37 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=65:35의용출용매로 RP-18 column chromatography를진행중에있다. 또한소분획 E (4.4 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography 를진행중에있다. 다음소분획 E (7.0 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (800 mg ) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:0.5:0.5, 7:1:0.5, 7:1.5:0.5, 7:2:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E A (285 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=65:35의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E A-A (271 mg ) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5, 7:1.5:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를진행중에있으며, 소분획 E (38 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=65:35의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E 로부터화합물 9 (10 mg ) 를얻어구조를확인중에있다. 또한소분획 E (500 mg ) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5, 7:1.5:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를진행중에있다. 소분획 E (3.0 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (700 mg ) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography 를진행중에있다. 소분획 E (12.0 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (3.0 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH:/H 2 O=7:0.5:0.5 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1.5:0.5 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E A로부터화합물 10 (10 mg ) 을얻었다. 소분획 E (7.2 g) 에대하여 hexane-etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography 를진행중에있으며, 소분획 E-Y (E ~8 + E ~10 + E ~22) (1.1 g) 에대하여 MeOH/H 2 O=1:1의용출용매로 RP-18 column chromatography를계속진행중에있다. 다음소분획 E (6.0 g) 과 E (4.0 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를진행중에있다

17 - Lonicera japonica Vine - EtOAc fraction (126.2 g) g) CH 2 Cl 2 -MeOH gradient (SiO ) E-5371(3.0 g) E-7290(5.0 g) E (6.0 g) E (8.4 g) E (7.0 g) E (12.0 g) SiO 2 E H/E gradient CH 2 Cl 2 4 (189 mg) β-sitosterol E A 5 (8 mg) Pomolic acid SiO 2 H/E gradient E (0.2 g) SiO 2 CMW E (0.1 g) RP-18 M:W=95:5 E B 6 (20 mg) Ursolic acid SiO 2 SiO 2 H/E gradient H/E gradient E (0.8 g) E (3.0 g) E E (0.8 g) RP-18 M:W=8:2 SiO 2 CMW SiO 2 8 (21 mg) M:W=65:35 Daucosterol 15(16 mg) 23-Hydroxytormentic acid H/E gradient SiO 2 SiO 2 H/E gradient CMW SiO 2 CMW E A E A E (38 mg) E A 16 (10 mg) Euscaphic acid RP-18 RP-18 M:W=65:35 E (10 mg) 10 (10 mg) Loganin BuOH 분획 (150.0 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5, 7:1.2:0.5, 7:1.5:0.5, 7:2:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를진행중에있으며, CH 2 Cl 2 /MeOH 혼합용매를이용한재결정을통해소분획 B-04로부터화합물 4 (25 mg ) 을, 소분획 B-05로부터화합물 3 (10 mg ) 을, 소분획 B-1314로부터화합물 8 (20 mg ) 을각각얻었다. 또한소분획 B-2122 (200 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=4:6의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여소분획 B 로부터화합물 14 (36 mg ) 을얻었으며, 소분획 B-4243으로부터 MeOH/CH 2 Cl 2 의혼합용매로재결정을반복하여화합물 10 (400 mg ) 을얻어구조를확인하였다

18 - Lonicera japonica Vine - BuOH fraction (150.0 g) g) CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O=7:1:0.5, 7:1.2:0.5, 7:1.5:0.5, 7:2:0.5 (SiO ) B-04 B-05 B-1314 CH 2 Cl 2 -MeOH 4 (25 mg) β-sitosterol CH 2 Cl 2 -MeOH 3 (10 mg) Fatty acids CH 2 Cl 2 -MeOH 8 (20 mg) Daucosterol B-2122(0.2 g) B-4243 RP-18 M:W=65:35 B-2122(0.2 g) 14 (36 mg) Secologanin dimethyl acetal CH 2 Cl 2 -MeOH 10 (1,200 mg) Loganin Trilinolein (glyceryl trilinoleate, 1,2,3-trilinoleoylglycerol, 1,2,3-tri(cis,cis-9,12-octa decadienoyl)glycerol, 1) - 백색의 oil. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: (9H, m, 3 CH 3 ), 1.30 (CH 2 ), 1.61 (6H, m, 3 3-CH 2 ), 2.04 (12H, q, J = 6.3 Hz, 3 8-CH 2, 3 14-CH 2 ), 2.31 (6H, t, J = 7.5 Hz, 3 COCH 2 ), 2.77 (6H, t, J = 6.3 Hz, 3 11-CH 2 ), 4.14 (2H, dd, J = 6.0, 12.0 Hz, α,γ-ch 2 ), 4.29 (2H, dd, J = 4.5, 12.0 Hz, α,γ-ch 2 ), (13H, m, β-ch, 12 CH=CH). 13 C-NMR (75.5 MHz, CDCl 3 ) δ: 14.0, 14.1 (CH 3 ), 22.5, 22.7 (C-17), 24.8, 24.9 (C-3), 25.6 (C-11), 27.2 (C-8, 14), (CH 2 ), 29.2 (C-6), 29.3 (C-15), 29.6 (C-7), 31.5 (C-16), 34.0, 34.2 (C-2), 62.1 (C-α,γ), 68.9 (C-β), (C-12), (C-10), (C-9), (C-13), 172.8, (CO). FAB-MS m/z 879 [M + H] +, 600 [(M + H) - 279] +, 337 [(M + H) ] +, 263. Bis(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP, DOP, dioctyl phthalate, 1,2-benzenedicarboxylic acid bis(2-ethylhexyl) ester, di(2-ethylhexyl)phthalate, 2) - 미황색의 oil. [α] 19 D = +3.8 (c = 0.4, CHCl 3 ). IR υ max (CCl 4 ) (CH), 1729 (C=O), 1462 (CH 2 ), 1381 (CH 3 ), 1280, 1125 (ester), 743 cm -1 (O-substituted phenyl). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 7.67 (2H, dd, J = 2.3, 6.5 Hz, H-3), 7.51 (2H, J = 3.3, 5.7 Hz, H-4), (4H, m, H-1 a, 1 b), 1.66 (2H, m, H-2 ), (16H, m, H-3, 4, 5, 7 ), (12H, m, H-6, 8 ). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ: (C-1), (C-2), (C-4), (C-3), 68.1 (C-1 ), 38.7 (C-2 ), 30.3 (C-3 ), 28.9 (C-7 ), 23.7 (C-4 ), 22.9 (C-5 ), 14.0 (C-6 ), 10.9 (C-8 ). EIMS m/z 390 [M] + (1), 279 [M - C 8 H 17 ] + (40), 166 [M - C 16 H 33 ] + (61), 149 [M - C 16 H 33 O]

19 (100). Fatty acids (C16 - C26 fatty acids, 3) - 백색무정형분말. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: 0.88 (3H, t, J = 6.6 Hz, CH 3 ), 1.25 (CH 2 ), 1.63 (2H, m, COCH 2 CH 2 ), 2.34 (2H, t, J = 7.5 Hz, COCH 2 ). 13 C-NMR (75.5 MHz, CDCl 3 ) δ: 14.1 (CH 3 ), 22.7, 24.7, 29.1, 29.2, 29.4, 29.6, 29.7, 31.9, 34.0, (CO). GC/MS t R 19.5: m/z 270 [M] +, 227, 143, 87, 74 (palmitic acid methyl ester, 4.8%). t R 20.5: m/z 284 [M] +, 241, 143, 87, 74 (heptadecanoic acid methyl ester, 1.2%). t R 21.5: m/z 298 [M] +, 255, 199, 143, 87, 74 (stearic acid methyl ester, 5.8%). t R 22.4: m/z 312 [M] +, 269, 143, 87, 74 (nonadecanoic acid methyl ester, 0.9%). t R 23.3: m/z 326 [M] +, 283, 199, 143, 87, 74 (arachidonic acid methyl ester, 10%). t R 24.3: m/z 340 [M] +, 297, 241, 143, 87, 74 (heneicosanoic acid methyl ester, 4.0%). t R 25.5: m/z 354 [M] +, 311, 255, 199, 143, 87, 74 (behenic acid methyl ester, 28.3%). t R 26.9: m/z 368 [M] +, 325, 269, 199, 143, 87, 74 (tricosanoic acid methyl ester, 7.8%). t R 28.8: m/z 382 [M] +, 339, 283, 199, 143, 87, 74 (lignoceric acid methyl ester, 30.3%). t R 30.9: m/z 396 [M] +, 353, 297, 199, 143, 87, 74 (pentacosanoic acid methyl ester, 3%). t R 33.9: m/z 410 [M] +, 367, 311, 255, 199, 143, 87, 74 (cerotic acid methyl ester, 3.1%). β-sitosterol (stigmast-5-en-3β-ol, 4) - 백색침상결정. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: 0.68 (3H, s, CH 3-18), 0.81 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH 3-26), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz, CH 3-27), 0.84 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH 3-29), 0.92 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH 3-21), 1.01 (3H, s, CH 3-19), 3.52 (1H, m, H-3), 5.35 (1H, d, J = 5.1 Hz, H-6). Pomolic acid (19α-hydroxyursolic acid, benthamic acid, 3β,19α-dihydroxyurs-12-en- 28-oic acid, 5) - 백색무정형분말. [α] 22 D = (c = 0.15, MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, pyridine-d 5 ) δ : 0.90, (3H, s, 25-CH 3 ), 1.01 (3H, s, 23-CH 3 ), 1.10 (3H, s, 26-CH 3 ), 1.22 (3H, s, 24-CH 3 ), 1.44 (3H, s, 29-CH 3 ), 1.71 (3H, s, 27-CH 3 ), 1.10 (3H, d, J = 6.6 Hz, 30-CH 3 ), 2.33 (1H, ddd, J = 4.5, 13.6, 13.6 Hz, H-15β), 3.05 (1H, br s, H-18), 3.12 (1H, J = 4.0, 12.9, 12.9 Hz, H-16α), 3.42 (1H, dd, J = 5.2, 10.9 Hz, H-3), 5.60 (1H, br s, H-12). 13 C-NMR (125.8 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 39.0 (C-1), 28.1 (C-2), 78.2 (C-3), 39.3 (C-4), 55.8 (C-5), 18.9 (C-6), 33.6 (C-7), 40.3 (C-8), 47.7 (C-9), 37.3 (C-10), 24.0 (C-11), (C-12), (C-13), 42.1 (C-14), 29.3 (C-15), 26.4 (C-16), 48.3 (C-17), 54.6 (C-18), 72.7 (C-19), 42.3 (C-20), 27.1 (C-21), 38.5 (C-22), 28.7 (C-23), 16.7 (C-24), 15.5 (C-25), 17.2 (C-26), 24.6 (C-27), (C-28), 26.9 (C-29), 16.5 (C-30). EIMS m/z 472 [M] + (2), 454 [M- H 2 O] + (5), 439 [M - CH 3 - H 2 O] + (2), 426 [M - (COOH + H)] + (18), 354 (10), 264 (14), 246 (23), 220 (24), 207 (35), 201 (34), 190 (50), 146 (100). 23 Ursolic acid (3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid, 6) - 백색무정형분말. [α] D = (c = 0.2, MeOH). 1 H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) δ : 0.87, (3H, s, 25-CH 3 ), 1.22 (3H, s, 23-CH 3 ), 1.00 (3H, s, 26-CH 3 ), 1.02 (3H, s, 24-CH 3 ), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, 29-CH 3 ), 1.21 (3H, s, 27-CH 3 ), 0.93 (3H, d, J = 5.8 Hz, 30-CH 3 ), 2.09 (1H, dt, J = 4.0, 13.1 Hz, H-16α), 2.30 (1H, dt, J = 4.8, 13.4 Hz, H-15β), 2.61 (1H, br d, J = 11.2 Hz, H-18), 3.44 (1H, t, J = 8.8 Hz, H-3), 5.46 (1H, br s, H-12). 13 C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 39.0 (C-1), 28.0 (C-2), 78.1 (C-3), 39.3 (C-4), 55.8 (C-5), 18.7 (C-6), 34.2 (C-7), 39.9 (C-8), 48.0 (C-9),

20 (C-10), 23.6 (C-11), (C-12), (C-13), 42.2 (C-14), 28.6 (C-15), 24.8 (C-16), 48.0 (C-17), 53.5 (C-18), 39.4 (C-19), 39.3 (C-20), 31.0 (C-21), 37.4 (C-22), 28.7 (C-23), 16.5 (C-24), 15.6 (C-25), 17.5 (C-26), 23.8 (C-27), (C-28), 17.4 (C-29), 21.4 (C-30). EIMS m/z 456 [M] + (2), 438 [M- H 2 O] + (1), 423 [M - CH 3 - H 2 O] + (1), 248 [a] + (100), 207 [b] + (26), 203 [a - (COOH + H)] + (44), 133 (32). Hexacosanol [ceryl alcohol, 7] - 백색무정형분말. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH 3 ), 1.25 (CH 2 ), 1.56 (2H, m, HOCH 2 CH 2 ), 3.64 (2H, t, J = 6.6 Hz, HOCH 2 ). EIMS m/z 336 [M - H 2 O] +, 111, 97, 83. β-sitosterol 3-O-β-D-glucoside (daucosterol, 8) - 백색무정형분말. 1 H-NMR (300 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 0.65 (3H, s, CH 3-18), 0.85 (3H, d, J = 6.3 Hz, CH 3-26), 0.87 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH 3-27), 0.88 (3H, t, J = 7.8 Hz, CH 3-29), 0.98 (3H, d, J = 6.3 Hz, CH 3-21), 0.93 (3H, s, CH 3-19), 3.96 (1H, m, H-5 ), 3.98 (1H, m, H-3), 4.05 (1H, t, J = 8.7 Hz, H-2 ), 4.27 (1H, t, J = 8.7 Hz, H-3 ), 4.30 (1H, t, J = 8.4 Hz, H-4 ), 4.41 (1H, dd, J = 5.1, 11.7 Hz, H-6 a), 4.56 (1H, dd, J = 2.1, 11.7 Hz, H-6 b), 5.05 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1 ), 5.34 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-6). 13 C-NMR (75.5 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 37.6 (C-1), 30.4 (C-2), 78.7 (C-3), 39.6 (C-4), 40.2 (C-5), (C-6), 32.4 (C-7), 32.3 (C-8), 50.6 (C-9), 37.1 (C-10), 21.5 (C-11), 40.1 (C-12), 42.7 (C-13), 57.0 (C-14), 24.7 (C-15), 28.7 (C-16), 56.5 (C-17), 12.1 (C-18), 19.4 (C-19), 36.5 (C-20), 19.2 (C-21), 34.4 (C-22), 26.7 (C-23), 46.3 (C-24), 29.7 (C-25), 19.5 (C-26), 20.1 (C-27), 23.6 (C-28), 12.3 (C-29), (C-1 ), 75.5 (C-2 ), 78.6 (C-3 ), 71.7 (C-4 ), 78.4 (C-5 ), 63.1 (C-6 ). Loganin (1-(β-D-glucopyranosyl-oxy)-1,4a,5,6,7,7a-hexahydro-6-hydroxy-7-methyl cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid methyl ester, 7-hydroxy-6-desoxy-verbenalin, 10) - 백색무정형분말. [α] 24 D = (c = 0.14, H 2 O). IR υ max (KBr) 3551, 3511, 3298 (OH), 1713 (ester), 1649 (α,β-unsat. C=O), 1443 (CH 2 ), 1300, 1275 (ester), 1073, 1038 (glycosidic C-O), 901, 862 cm H-NMR (300 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 1.18 (3H, d, J = 7.2 Hz, 10-CH 3 ), 1.73 (1H, ddd, J = 4.5, 7.5, 13.8 Hz, H-6eq), 2.01 (1H, m, H-8), 2.43 (1H, ddd, J = 4.5, 9.3, 9.3 Hz, H-9), 2.62 (1H, ddd, J = 1.2, 7.8, 13.8 Hz, H-6), 3.50 (1H, dd, J = 8.1, 16.2 Hz, H-5), 3.55 (3H, s, COOCH 3 ), 4.37 (1H, dd, J = 5.4, 12.0 Hz, H-6 a), 4.54 (1H, dd, J = Hz, H-6 b), 5.39 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1 ), 5.67 (1H, d, J = 4.5 Hz, H-1), 7.68 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-3). 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 1.08 (3H, d, J = 6.9 Hz, 10-CH 3 ), 1.61 (1H, ddd, J = 4.8, 7.5, 14.0 Hz, H-6b), (1H, m, H-8), 2.02 (1H, dt, J = 4.5, 13.8 Hz, H-9), 2.22 (1H, ddd, J = 1.5, 8.0, 14.0 Hz, H-6a), 3.10 (1H, br q, J = 7.8 Hz, H-5), 3.65 (1H, dd, J = 5.7, 12.0 Hz, H-6 a), 3.68 (3H, s, COOCH 3 ), 3.88 (1H, dd, J = 2.1, 12.0 Hz, H-6 b), 4.03 (1H, br t, J = 4.5 Hz, H-7), 4.64 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-1 ), 5.26 (1H, d, J = 4.5 Hz, H-1), 7.38 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-3). 13 C-NMR (75.5 MHz, CD 3 OD) δ: 97.7 (C-1), (C-3), (C-4), 32.1 (C-5), 42.7 (C-6), 75.0 (C-7), 42.1 (C-8), 46.5 (C-9), 13.4 (C-10), (C-1 ), 74.7 (C-2 ), 78.3 (C-3 ), 71.6 (C-4 ), 78.0 (C-5 ), 62.8 (C-6 ), (COOCH 3 ), 51.6 (COOCH 3 ). FABMS m/z 413 [M + Na] +, 391 [M + H] +, 359 [(M + H) - CH 3 OH] +, 229 [(M + H) - 162)]

21 Obtusifoliol (4α,14α-dimethyl-5α-ergosta-8,24(24 )-dien-3β-ol, 11) - 백색무정형분말. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: 0.71 (3H, s, 18-CH 3 ), 0.89 (3H, s, 14-CH 3 ), 0.93 (3H, d, J = 6.3 Hz, 21-CH 3 ), 0.97 (3H, s, 19-CH 3 ), 1.00 (3H, d, J = 6.3 Hz, 4-CH 3 ), 1.02 (3H, d J = 6.9 Hz, 26-CH 3 ), 1.03 (3H, d, J = 6.9 Hz, 27-CH 3 ), 3.09 (1H, m, H-3), 4.66 (1H, d, J = 1.5 Hz, C=CH 2 ), 4.72 (1H, br s, C=CH 2 ). EIMS m/z 426 [M] + (12), 411 [M - CH 3 ] + (28), 393 [M - CH 3 - H 2 O] + (8), 383 (7), 327 (10), 245 (24), 105 (88), 55 (100). Gramisterol (4α-methyl-5α-ergosta-8,24(24 )-dien-3β-ol, 12) - 백색 무정형분말. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: 0.54 (3H, s, 18-CH 3 ), 0.83 (3H, s, 19-CH 3 ), 0.95 (3H, d, J = 6.3 Hz, 21-CH 3 ), 0.99 (3H, d, J = 6.3 Hz, 4-CH 3 ), 1.02 (3H, d, J = 6.9 Hz, 26-CH 3 ), 1.03 (3H, d, J = 6.9 Hz, 27-CH 3 ), 3.13 (1H, m, H-3), 4.66 (1H, d, J = 1.2 Hz, C=CH 2 ), 4.71 (1H, br s, C=CH 2 ), 5.18 (1H, m, H-7). 13 C-NMR (75.5 MHz, CDCl 3 ) δ: 37.0 (C-1), 31.1 (C-2), 76.2 (C-3), 40.3 (C-4), 46.7 (C-5), 26.6 (C-6), (C-7), (C-8), 49.6 (C-9), 34.6 (C-10), 21.4 (C-11), 39.6 (C-12), 43.4 (C-13), 55.0 (C-14), 22.9 (C-15), 27.9 (C-16), 56.0 (C-17), 11.8 (C-18), 14.1 (C-19), 36.2 (C-20), 18.8 (C-21), 34.8 (C-22), 29.7 (C-23), (C-24), 33.8 (C-25), 21.9 (C-26), 22.0 (C-27), 15.1 (4-CH 3 ), (C=CH 2 ). EIMS m/z 412 [M] + (6), 397 [M - CH 3 ] + (7), 379 [M - CH 3 - H 2 O] + (3), 328 (19), 313 (7), 285 (100), 241 (11). Citrostadienol (24-ethylenelophenol, (24Z)-4α-methyl-5α-stigmasta-7,24(24 )-dien-3β -ol, 13) - 미백색분말. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: 0.54 (3H, s, 18-CH 3 ), 0.83 (3H, s, 19-CH 3 ), 0.95 (3H, d, J = 6.3 Hz, 21-CH 3 ), 0.98 (6H, d, J = 6.9 Hz, 26, 27-CH 3 ), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, 4-CH 3 ), 1.59 (3H, dt, J = 1.2, 6.6 Hz, 29-CH 3 ), 2.83 (1H, septet, J = 6.9 Hz, H-25), 3.12 (1H, dt, J = 3.3, 11.1 Hz, H-3), 5.11 (1H, q, J = 6.6 Hz, H-28), 5.18 (1H, dd, J = 1.5, 6.0 Hz, H-7). 13 C-NMR (75.5 MHz, CDCl 3 ) δ: 37.0 (C-1), 31.0 (C-2), 76.2 (C-3), 40.3 (C-4), 46.7 (C-5), 26.6 (C-6), (C-7), (C-8), 49.7 (C-9), 34.8 (C-10), 21.4 (C-11), 39.5 (C-12), 43.4 (C-13), 55.0 (C-14), 22.9 (C-15), 28.0 (C-16), 56.0 (C-17), 11.8 (C-18), 14.1 (C-19), 36.6 (C-20), 18.9 (C-21), 35.9 (C-22), 28.0 (C-23), (C-24), 28.6 (C-25), 21.0 (C-26), 21.1 (C-27), 15.1 (4-CH 3 ), (C-28), 12.7 (C-29). EIMS m/z 426 [M] + (1), 411 [M - CH 3 ] + (1), 408 [M- H 2 O] + (1), 328 (33), 313 (6), 285 (100), 267 (6), 245 (5), 227 (8). Secologanin dimethyl acetal ((4S,5R,6S)-methyl 4-(2,2-dimethoxyethyl)-6-((2S,3S, 4R,5S)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-5-24 vinyl-5,6-dihydro-4h-pyran-3-carboxylate, 14) - 미백색분말. [α] D = (c = 0.12, MeOH). IR υ max (KBr) 3422 (OH), 1707 (ester), 1630 (α,β-unsat. C=O), 1439 (CH 2 ), 1389 (CH 3 ), 1287 (ester), 1074 (glycosidic C-O) cm H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 1.63 (1H, ddd, J = 4.5, 8.1, 13.8 Hz, H-6a), 2.05 (1H, dt, J = 6.9, 13.8 Hz, H-6b), 2.66 (1H, dt, J = 5.4, 8.7 Hz, H-9), 2.90 (1H, br dd, J = 6.6, 12.3 Hz, H-5), 3.28, 3.29 (3H each, s, 2 CH 3 O), 3.69 (3H, s, COOCH 3 ), 4.48 (1H, dd, J = 4.5, 6.9 Hz, H-7), 5.25 (1H, dd, J = 1.8, 10.5 Hz, H-10a), 5.29 (1H, dd, J = 1.8, 17.4 Hz, H-10b), 5.50 (1H, d, J = 5.4 Hz, H-1), 5.72 (1H, ddd, J = 8.7, 10.2, 17.4 Hz, H-8), 7.42 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-3), 4.66 (1H, d, J =

22 Hz, H-1 ), 3.65 (1H, dd, J = 5.7, 12.0 Hz, H-6 a), 3.89 (1H, dd, J = 2.4, 12.0 Hz, H-6 b). 13 C-NMR (75.5 MHz, CD 3 OD) δ: 97.8 (C-1), (C-3), (C-4), 29.4 (C-5), 33.2 (C-6), (C-7), (C-8), 45.3 (C-9), (C-10), (C-1 ), 74.6 (C-2 ), 78.0 (C-3 ), 71.5 (C-4 ), 78.4 (C-5 ), 62.7 (C-6 ), (COOCH 3 ), 51.7 (COOCH 3 ), 52.6, 53.9 (OCH 3 ). FABMS m/z 457 [M + Na] +, 403 [(M + H) - CH 3 OH] +, 241 [(M + H) - (CH 3 OH + 162)] Hydroxytormentic acid (19α-hydroxyasiatic acid, 2α,3β,19α,23-tetrahydroxyurs- 12-en-28-oic acid, 15) - 백색무정형분말. [α] 23 D = -6.4 (c = 0.1, pyridine). 1 H-NMR (300 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 1.06, 1.08, 1.11, 1.40, 1.64 (3H each, s, 5 CH 3 ), 1.09 (3H, d, J = 6.6 Hz, 30-CH 3 ), 2.33 (1H, ddd, J = 3.9, 11.4, 11.4 Hz, H-15β), 3.04 (1H, br s, H-18), 3.08 (1H, ddd, J = 4.2, 13.5, 13.5 Hz, H-16α), 3.71 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-23a), 4.18 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-3α), 4.25 (1H, ddd, J = 3.6, 9.3, 9.3 Hz, H-2β), 4.19 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-23b), 5.57 (1H, br s, H-12). 1 H-NMR (300 MHz, pyridine-d 5 + D 2 O) δ: 1.00, 1.01, 1.05, 1.38, 1.59 (3H each, s, 5 CH 3 ), 1.07 (3H, d, J = 6.9 Hz, 30-CH 3 ), 2.27 (1H, ddd, J = 3.9, 12.0, 12.0 Hz, H-15β), 2.98 (1H, br s, H-18), 3.02 (1H, ddd, J = 3.6, 13.0, 13.0 Hz, H-16α), 3.66 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-23a), 4.15 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-3α), 4.22 (1H, ddd, J = 4.2, 9.9, 10.1 Hz, H-2β), 4.13 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-23b), 5.52 (1H, br s, H-12). 13 C-NMR (125.8 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 47.7 (C-1), 68.8 (C-2), 78.3 (C-3), 43.6 (C-4), 47.9 (C-5), 18.6 (C-6), 33.1 (C-7), 40.4 (C-8), 47.7 (C-9), 38.3 (C-10), 24.1 (C-11), (C-12), (C-13), 42.1 (C-14), 29.3 (C-15), 26.3 (C-16), 48.2 (C-17), 54.5 (C-18), 72.6 (C-19), 42.3 (C-20), 26.9 (C-21), 38.4 (C-22), 66.5 (C-23), 14.2 (C-24), 17.3 (C-25), 17.3 (C-26), 24.6 (C-27), (C-28), 27.0 (C-29), 16.7 (C-30). FABMS m/z 527 [M + Na] +. EIMS m/z 504 [M] + (8), 486 [M- H 2 O] + (5), 468 [M - (2 H 2 O)] + (7), 458 [M - (COOH + H)] + (35), 386 (12), 264 (D/E ring, 16), 246 (25), 218 (23), 201 (33), 146 (69), 72 (100). Euscaphic acid (jacarandic acid, acuminatic acid, 2α,3α,19α-trihydroxyurs-12-en- 28-oic acid, 16) - 백색무정형분말. [α] 24 D = (c = 0.2, MeOH). 1 H-NMR (300 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 0.89 (3H, s, 23-CH 3 ), 0.97 (3H, s, 25-CH 3 ), 1.09 (3H, s, 26-CH 3 ), 1.10 (3H, d, J = 6.3 Hz, 30-CH 3 ), 1.25 (3H, s, 24-CH 3 ), 1.40 (3H, s, 29-CH 3 ), 1.63 (3H, s, 27-CH 3 ), 1.74 (1H, t, J = 11.7 Hz, H-1α), 1.88 (1H, dd, J = 4.5, 12.0 Hz, H-1β), 2.32 (1H, ddd, J = 4.2, 13.2, 13.2 Hz, H-15β), 3.03 (1H, br s, H-18), 3.10 (1H, ddd, J = 4.5, 12.9, 13.2 Hz, H-16α), 3.75 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-3β), 4.29 (1H, ddd, J = 2.7, 4.2, 11.6 Hz, H-2β), 5.57 (1H, br s, H-12). 13 C-NMR (75.5 MHz, pyridine-d 5 ) δ: 42.4 (C-1), 66.1 (C-2), 79.3 (C-3), 38.8 (C-4), 48.8 (C-5), 18.6 (C-6), 33.5 (C-7), 40.6 (C-8), 47.6 (C-9), 38.7 (C-10), 24.1 (C-11), (C-12), (C-13), 42.9 (C-14), 29.2 (C-15), 26.4 (C-16), 48.3 (C-17), 54.6 (C-18), 72.7 (C-19), 42.2 (C-20), 26.9 (C-21), 38.5 (C-22), 29.4 (C-23), 22.3 (C-24), 16.8 (C-25), 17.3 (C-26), 24.6 (C-27), (C-28), 27.1 (C-29), 16.6 (C-30). EIMS m/z 488 [M] + (6), 470 [M - H 2 O] + (5), 455 [M - H 2 O - CH 3 ] + (9), 452 [M - (2 H 2 O)] + (7), 442 [M - (COOH + H)] + (38), 424 (11), 409 (8), 370 (15), 264 (D/E ring, 29), 246 (77), 223 (44), 218 (69), 201 (99), 146 (100)

23 2. 금은화 (Lonicera japonica, Flower) 로부터생리활성성분분리 금은화 ( 金銀花 ) 는대한약전에수재된생약으로인동덩굴 (Lonicera japonica) 또는그변종의 꽃봉오리로규정되어있다. 금은화로부터분리된성분으로는 cerebroside로 lonijaposide A 1-1) A 4, B 1, B 2 등이보고되었다. Phenol성성분들로는 3,5-di-O-caffeoylquinic acid butyl ester, 2) 3-O-caffeoylquinic acid, 2) 3-O-caffeoylquinic acid methyl ester, 2) 3,5-di-O-caffeoylquinic acid, 2,3) 3,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester, 2,3) chlorogenin tetraacetate, 4) chlorogenic acid, 3,5) methyl chlorogenic acid, 3) 3,4-di-O-caffeoylquinic acid, 3) 3,4-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester 3) 같은 chlorogenic acid 유도체들과, protocatechuic acid, 3) caffeic acid 5) 및 methyl caffeate 3) 같은단순 phenol성물질및 benzyl alcohol β-d-xylopyranosyl(1 6 )-β-d-glucopyranoside 6) 등이발표되 었다. Flavonoid성분으로는 luteolin, 3,5) quercetin, 7) luteolin 7-O-galactoside, 7) lonicerin, 7) tricin 7-O-neohesperidoside, 7) hyperoside 5) 및 rutin 7) 등이보고되었다. Saponin 성분들로서는 3-O-β- D-glucopyranosyl(1 4)-β-D-glucopyranosyl(1 3)-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 8,9) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-[β-D-xylopyranosyl(1 6)-β -D-glucopyranoside], 4,9,10) hederagenin3-o-α-l-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranoside, 9) 3-O-α -L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-xylopyranosyl(1 6)-β -D-glucopyranoside, 8-10) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β -D-glucopyranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 4) 3-O-β-D-glucopyranosyl(1 3)-α-L-rhamnopyrano syl(1 2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl(1 6)-β-D-glucopyranoside, 9) 3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-[β-D-xylopyranosyl(1 6)- β-d-glucopyranoside] 4,10) 등이 보고되었다. Iridoid성분으로는 loganin, 16,17) epiloganin, 17) sweroside, 11,17) vogeloside, 12) 7-epi-vogeloside, 11,12) kingiside, 12) morroniside, 12) secoxyloganin, 11) dimethylsecologanoside, 11) centauroside 11) secologanin, 12) secologanin dimethylacetal, 12) secologanin 7-methyl ester, 12) loniceracetalide A 및 B도보고 12) 되었으며, 기타성분으로는 (2E,6S)-8-[α- L-arabinopyranosyl(1 6 )-β-d-glucopyranosyloxy]-2,6-dimethyloct-2-eno-1,2 -lactone 6) 이알려졌 다. 이외에도정유성분들이보고되었는데이의구성은 36종의 hydrocarbon, 28종의 alcohol, 21종의 aldehyde, 12종의 ketone, 38종의 ester 및기타성분 15종으로구성되어있으며, 주성 분들로서는 linalol, (Z)-jasmone, (Z)-jasmin lactone, methyl jalsmonate 및 methyl epijalsmonate 13) 등으로알려지고있다. 이들금은화의성분중 iridoid성분 14) 및 saponin성분 15) 등은 ELSD를 사용하여 HPLC로정량분석한결과가보고되었다. 또한 5종의 Lonicera속식물에서 8종의 iridoid성분들에대하여 capillary HPLC-ESI/MS로분석한결과도보고되었으며, 11) 8종의 flavonoid성분들에대한동시분석법 7) 도발표되었다. 이외에도과실로부터 phytofluene, β- carotene, ζ-carotene, γ-carotene, lycopene, cryptoxanthin, zeaxanthin 및 auroxanthin같은 carotinoid 성분들도보고된바있다. 16) 국내의연구결과금은화로부터분리된성분으로는 apigenin, 17) luteolin 17) 및 chlorogenic acid 17) 가보고되었다. 1. Neeraj Kumar, Bikram Singh, Ajai P. Gupta and Vijay K. Kaul, Lonijaposides, novel

24 cerebrosides from Lonicera japonica. Tetrahedron, 62, (2006) 2. Li-Yan Peng, Shuang-Xi Mei, Bei Jiang, Hong Zhou, and Han-Dong Sun, Constituents from Lonicera japonica. Fitoterapia, 71, (2000) 3. W.-C. Chang and F.-L. Hsu, Inhibition of Platelet Activation and Endothelial Cell Injury by Polyphenolic Compounds Isolated from Lonicera japonica Thunb. Prostagalandins Leuko. Essent. Fatty Acids, 45, (1992) 4. Hongxiang Lou, Weijun Lang, and Mujian Lu, Water Soluble Constituents from Japanese Honeysuckle (Lonicera japonica). Zhongcaoyao, 27, (1996) 5. Youyuan Peng, Fanghua Liu and Jiannong Ye, Determination of Phenolic Acids and Flavones in Lonicera japonica Thunb. by Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection. Electroanalysis, 17, (2005) 6. Rie Kakuda, Mio Imai, Koichi Machida, Yasunori Yaoita, and Masao Kikuchi, A New Glycoside from the flower buds of Lonicera japonica. Nat. Med., 54, (2000) 7. Xiong Huang, Song-Lin Li, Ping Li, Hui-Jun Li, Xing-Yun Chai, Yue Song, Simultaneous determination of eight main flavonoids in Flos Lonicerae by high performance liquid chromatography. Acta Pharm. Sin., 40, (2005) 8. Rong Wei Teng, De Zu Wang, and Chang-Xiang, Chen, Two Triterpenoid Saponins from Lonicera japonica. Chin. Chem. Lett., 11, (2000) 9. Chang-Xiang, Chen, Wei-Wei Wang, Wei Ni, Neng-Yu Chen, Jun Zhou, Triterpenoid Glycosides from the Lonicera japonica. Acta Bot. Yun., 22, (2000) 10. Hongxiang Lou, Jinguo Tian, Huiqing Yuan, and Mei Ji, Triterpenoid Saponins from Flos Lonicera japonica. Chin. J. Med. Chem., 5, (1995) 11. Yue Song, Song-Lin, Li, Meng-Hua Wu, Hui-Jun Li and Ping Li, Qualitative and quantitative analysis of iridoid glycosides in the flower buds of Lonicera species by capillary high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometric detector. Anal. Chim. Acta, 564, (2006) 12. Rie Kakuda, Mio Imai, Yasunori Yaoita, Koichi Machida, Masao Kikuchi, Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry, 55, (2000) 13. Nobuo Ikeda, Masakazu Ishihara, Tomoyuki Tsuneya, Masayuki Kawakita and Masaki Yoshihara, Volitile Components of Honeysuckle (Lonicera japonica Thunb.). Flavour & Fragrance J., 9, (1994) 14. Hui-Jun Li, Ping Li, and Wen-Cai Ye, Determination of five major iridoid glucosides in Flos Lonicerae by high-performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection. J. Chromatogr. A, 1008, (2003) 15. Xing-Yun Chai, Song-Lin Li, and Ping Li, Quality evaluation of Flos Lonicerae through a simultaneous determination of seven saponins by HPLC with ELSD. J. Chromatogr. A, 1070, (2005) 16. T. W. Goodwin, The Carotenoids of the Berries of Lonicera japonica. Biochem. J., 51,

25 (1952) 17. 정규찬, 권동렬, 백석환, 김성환, 장현욱, 금은화 (Lonicerae Flos) 의 Ethyl Acetate 분획이 돌연변이원성에미치는영향. 약학회지, 32, (1988) 실험재료 - 이제현교수가제공한검체 ( 중국산, 약 22.4 kg, 2007년 4월인수 ) 를사용하였다. 추출및분획 - 금은화 19.4 kg을쇠절구로빻은후 70% EtOH로 reflux하여 3시간씩 5회추출하여 70% EtOH 엑스를얻고, 인동과같은방법으로분획을진행하여 hexane 분획 (389.6 g), CH 2 Cl 2 분획 (271.1 g), EtOAc 분획 (375.7 g), BuOH 분획 (1,767.5 g) 을각각얻고, 수층을농축하여 H 2 O 분획을얻었다. 분리및정제 - 금은화의 EtOAc분획 (187.6 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O= 7:0.8:0.5 13:7:2의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여 16개의소분획을얻었다. 얻어진소분획 E-2로부터 CH 2 Cl 2 로재결정을반복하여화합물 1 (42 mg ) 을, 소분획 E-6으로부터 CH 2 Cl 2 /MeOH의혼합용매로재결정을반복하여화합물 2 (175 mg ) 를각각얻었다. 다음소분획 E-5 (4.6 g) 에대하여 hexane/etoac 및 EtOAc/MeOH (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여소분획 E 로부터 MeOH로재결정을반복하여화합물 3 (128 mg ) 을얻었으며, 소분획 E (126 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=1:1의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E 로부터화합물 9 (10 mg) 를, E 로부터화합물 8 (7 mg) 을얻었으며, E 및 E 로부터는화합물을정제중에있다. 또한소분획 E-8 (11.8 g) 에대하여 hexane/etoac 및 EtOAc/MeOH (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여소분획 E-8-7로부터 CH 2 Cl 2 /MeOH 혼합용매로재결정을반복하여화합물 4 (5 mg ) 을얻었으며, 소분획 E-8-10 (354 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=1:1의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E 로부터화합물을정제중에있다. 소분획 E (1.8 g) 에대하여 MeOH/H 2 O=6:4의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (500 mg ) 에대하여다시 MeOH/H 2 O=6:4의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E 로부터화합물 5 (2 mg ) 를분리하였다. 또한소분획 E A (3.6 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5, 7:1.2:0.5, 7:1.5:0.5, 7:2:0.5, 7:3:0.8의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하고 CH 2 Cl 2 /MeOH로재결정하여화합물 10 (3 mg) 을얻었다. 소분획 E-9 (29.3 g) 에대하여 hexane/etoac 및 EtOAc/MeOH (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (617 mg ) 에대하여 MeOH/H 2 O=6:4의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E (399 mg ) 에대하여다시 MeOH/H 2 O=6:4의용출용매로 RP-18 column chromatography를실시하여얻어진소분획 E 로부터화합물 6 (4 mg ) 을분리하였으며, 소분획 E (9.3 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5, 7:1.2:0.5, 7:1.5:0.5, 7:2:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를진행중에있다. 다음소분획 E-12 (37.2 g) 에대하여 EtOAc/MeOH/H 2 O=100:4:3 100:20:15의용출용매로

26 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E-12-5로부터 MeOH로재결정을반복하여화합물 7 (183 mg ) 을분리하였으며, 소분획 E-12-3 (3.7 g) 과 E (4.9 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH/H 2 O=7:1:0.5, 7:1.2:0.5, 7:1.5:0.5, 7:2:0.5의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를각각진행중에있다. - Lonicera japonica Flower - EtOAc fraction (187.6 g) g) CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O= 7:0.8: > 13:7:2 (SiO ) E-2 E-5(4.6 g) E-6 E-8(11.8 g) E-9(29.3 g) E-12(37.2 g) 1 (42 mg) β-sitosterol RP-18 E CH 2 Cl 2 H/E -E/M SiO2 gradient M:W=1:1 E E (7 mg) Azelaic acid 2 (175 mg) Daucosterol E-8-7 E MeOH 3 (128 mg) Luteolin 9 (10 mg) Protocatechuic acid CH 2 Cl 2 -MeOH 4 (5 mg) Caffeic acid SiO 2 H/E -E/M gradient E A(3.6 g) SiO 2 CMW 10 (3 mg) 4,5-Dicaffeoylquinic acid E (1.8 g) RP-18 M:W=6:4 E (0.5 g) RP-18 M:W=6:4 E (2 mg) H/E -E/M SiO 2 SiO gradient 2 EMW E (0.617 g) RP-18 M:W=6:4 E (0.399 g) RP-18 M:W=6:4 E E (183 mg) Luteolin 7-Oglucoside 6 (4 mg) 4,5-Dicaffeoylquinic acid methyl ester CH 2 Cl 2 분획 (114.8 g) 에대하여 CH 2 Cl 2 /MeOH (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를진행중에있으며, 소분획 C-1325 (6.0 g) 과 C (4.2 g) 에대하여 hexane/etoac (gradient) 의용출용매로 silica gel (Merck no. 7734) column chromatography를각각진행하여 C-1325 분획으로부터 hydrocarbon alcohol인 hexacosanol (11) 을분리하였다

27 - Lonicera japonica Flower - CH 22 Cl Cl 22 fraction (114.8 g) g) CH 2 Cl 2 -MeOH gradient (SiO ) C-1325 (6.0 g) C (4.2 g) SiO 2 H/E gradient SiO 2 H/E gradient C (10 mg) Hydrocarbon alcohol Luteolin (5,7,3,4 -tetrahydroxyflavone, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4H- 1-benzopyran-4-one, 3) - 미황색분말. UV, λ max (log ε) (MeOH) 253 (4.75), 267 (sh, 4.72), 348 (4.81); (MeONa) 265 (4.84), 400 (4.92); (NaOAc) 267 (4.79), 366 (4.66); (NaOAc + H 3 BO 3 ) 261 (4.82), 374 (4.79); (AlCl 3 ) 272 (4.85), 300 (sh, 4.45), 331 (4.28), 425 (4.96); (AlCl 3 + HCl) 274 (4.72), 295 (sh, 4.55), 361 (4.71), 388 (4.74). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 6.18 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.43 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.66 (1H, s, H-3), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5 ), 7.38 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2 ), 7.40 (1H, dd, J = 2.4, 8.4 Hz, H-6 ), 13.0 (1H, s, 5-OH). 13 C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (C-2), (C-3), (C-4), (C-5), 99.0 (C-6), (C-7), 94.0 (C-8), (C-9), (C-10), (C-1 ), (C-2 ), (C-3 ), (C-4 ), (C-5 ), (C-6 ). FABMS m/z 287 [M + H] +. Caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid, 4) - 미백색분말. 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 6.20 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8), 6.77 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5), 6.92 (1H, dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6), 7.02 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2), 7.52 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7). 13 C-NMR (75.5 MHz, CD 3 OD) δ: (C-1), (C-2), (C-3), (C-4), (C-5), (C-6), (C-7), (C-8), (C-9). EIMS m/z 180 [M] + (100), 163 [M - OH] + (24), 136 [M - CO 2 ] + (83), 135 [M - CO 2 H] + (28), 134 [M - (CO 2 H + H)] + (56), 117 (18), 107 (17), 89 [C 7 H 5 ] + (64). 4,5-Dicaffeoylquinic acid methyl ester (methyl 3,4-bis((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)

28 acryloyloxy)-1,5-dihydroxycyclohexanecarboxylate, 6) - 미백색분말. [α] 24 D = (c = 0.10, MeOH). UV, λ max (log ε) (MeOH) 245 (sh, 4.16), 295 (4.20), 330 (4.33). 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 2.08 (1H, dd, J = 6.3, 14.1 Hz, H-6a), 2.24 (2H, m, H-2b, 6b), 2.32 (1H, dd, J = 3.3, 13.8 Hz, H-2a), 3.71 (3H, s, COOCH 3 ), 4.34 (1H, quintet, J = 3.3 Hz, H-3), 5.10 (1H, dd, J = 3.0, 7.8 Hz, H-4), 5.53 (1H, ddd, J = 5.4, 7.5, 7.7 Hz, H-5), 6.16, 6.29 (1H each, d, J = 15.6 Hz, H-8 ), 6.75 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-5 ), 6.91 (1H, dd, J = 1.8, 8.4 Hz, H-6 ), 6.92 (1H, dd, J = 2.1, 8.1 Hz, H-6 ), 7.00 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2 ), 7.02 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2 ), 7.50, 7.59 (1H each, d, J = 15.6 Hz, H-7 ). 13 C-NMR (75.5 MHz, CD 3 OD) δ: 75.8 (C-1), 38.4 (C-2), 68.6 (C-3), 74.9 (C-4), 69.1 (C-5), 38.5 (C-6), 127.5, (C-1 ), (C-2 ), (C-3 ), (C-4 ), (C-5 ), (C-6 ), (C-7 ), 114.6, (C-8 ), (C-9 ), (COOCH 3 ), 53.1 (COOCH 3 ). FABMS m/z 553 [M + Na] +, 531 [M + H] +. Luteolin 7-O-glucoside (cynaroside, 5,7,3,4 -tetrahydroxyflavone 7-O-β-D-gluco pyranoside, 7) - 미황색분말. UV, λ max (log ε) (MeOH) 254 (4.64), 349 (4.63); (MeONa) 261 (4.64), 403 (4.70); (NaOAc) 258 (4.68), 372 (4.59); (NaOAc + H 3 BO 3 ) 259 (4.72), 373 (4.66); (AlCl 3 ) 272 (4.71), 297 (sh, 4.38), 331 (4.218), 429 (4.77); (AlCl 3 + HCl) 267 (4.60), 296 (sh, 4.38), 362 (4.53), 388 (4.55). 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 4.55 (1H, dd, J = 2.4, 12.0 Hz, H-6 a), 5.80 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1 ), 6.83 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.91 (1H, s, H-3), 6.98 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 7.26 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5 ), 7.50 (1H, dd, J = 2.4, 8.4 Hz, H-6 ), 7.87 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2 ), 13.6 (1H, s, 5-OH). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 5.06 (1H, d, J = 6.9 Hz, H-1 ), 6.43 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.74 (1H, s, H-3), 6.78 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.89 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5 ), 7.41 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2 ), 7.44 (1H, dd, J = 2.1, 8.1 Hz, H-6 ), 13.0 (1H, s, 5-OH). 13 C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (C-2), (C-3), (C-4), (C-5), 99.8 (C-6), (C-7), 95.0 (C-8), (C-9), (C-10), (C-1 ), (C-2 ), (C-3 ), (C-4 ), (C-5 ), (C-6 ) (C-1 ), 73.3 (C-2 ), 77.4 (C-3 ), 69.8 (C-4 ), 76.6 (C-5 ), 60.8 (C-6 ). FABMS m/z 449 [M + H] +, 287 [(M + H) - 162] +. Azelaic acid (Nonanedioic acid, 1,7-heptanedicarboxylic acid, 8) - 백색 분말. 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 1.34 (6H, br s, 3 CH 2 ), 1.60 (4H, m, 2 CH 2 CH 2 COOH), 2.27 (4H, t, J = 7.5 Hz, 2 CH 2 COOH). 13 C-NMR (75.5 MHz, CD 3 OD) δ: 26.0, 30.1, 34.9, EIMS m/z 171 [M - OH] + (2), 152 (31), 124 (23), 111 (23), 98 (25), 84 (66), 69 (39), 60 (36), 55 (100). Protocatechuic acid (3,4-dihydroxybenzoic acid, 9) - 백색분말. 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 6.74 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 7.38 (1H, dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6), 7.42 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2). 13 C-NMR (75.5 MHz, CD 3 OD) δ: (C-1), (C-2), (C-3), (C-4), (C-5), (C-6). EIMS m/z 154 [M] + (48), 137 [M - OH] + (73), 114 (12), 109 [M - COOH] + (28), 101 (58), 55 (100). 4,5-Dicaffeoylquinic acid (3,4-bis((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyloxy)-1,5-dihy droxycyclohexanecarboxylic acid, 10) - 백색분말. [α] 24 D = (c = 0.13, MeOH)

29 UV, λ max (log ε) (MeOH) 247 (sh, 4.03), 293 (4.04), 328 (4.10). 1 H-NMR (300 MHz, pyridine-d 5 + D 2 O) δ: 2.33 (1H, br d, J = 14.1 Hz, H-2ax), 2.55 (1H, br d, J = 2.7, 12.9 Hz, H-6eq), 2.66 (1H, dd, J = 11.4, 12.9 Hz, H-6ax), 2.70 (1H, dd, J = 3.0, 14.7 Hz, H-2eq), 4.62 (1H, br dt, J = 3.0, 3.0 Hz, H-3), 5.55 (1H, dd, J = 3.0, 10.2 Hz, H-4), 6.22 (1H, ddd, J = 4.8, 10.5, 10.5 Hz, H-5), 6.29, 6.42 (1H each, J = 15.9 Hz, H-8 ), 6.83 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz, H-6 ), 6.89 (1H, dd, J = 2.1, 8.1 Hz, H-6 ), 7.09 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5 ), 7.13 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5 ), 7.37 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2 ), 7.41 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2 ), 7.75, 7.82 (1H each, d, J = 15.9 Hz, H-7 ). 1 H-NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ: (2H, m, H-2, 6), 5.10 (1H, dd, J = 2.6, 9.5 Hz, H-4), 5.65 (1H, m, H-3), 6.19, 6.27 (1H each, d, J = 15.9 Hz, H-8 ), 6.73 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-5 ), 6.88, 6.90 (1H each, J = 1.8, 8.2 Hz, H-6 ), 6.99, 7.01 (1H each, d, J = 1.8 Hz, H-2 ), 7.50, 7.58 (1H each, d, J = 15.9 Hz, H-7 ). 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ: 76.1 (C-1), 38.3 (C-2), 69.8 (C-3), 69.0 (C-5), 39.8 (C-6), 127.3, (C-1 ), (C-2 ), (C-3 ), (C-4 ), (C-5 ), (C-6 ), 147.2, (C-7 ), (C-8 ), (C-9 ). Hexacosanol [ceryl alcohol, 11] - 백색무정형분말. 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ: 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH 3 ), 1.25 (CH 2 ), 1.56 (2H, m, HOCH 2 CH 2 ), 3.64 (2H, t, J = 6.6 Hz, HOCH 2 ). GC/MS t R 40.6: m/z 392 [M - H 2 O] + (1), 364, 139, 125, 111, 97 (100), 83, 69, 57 (n-octacosanol, 18.4%). t R 32.8: m/z 364 [M - H 2 O] + (1), 336, 139, 125, 111, 97, 83, 69, 57 (100) (n-hexacosanol, 28.5%). t R 27.8: m/z 336 [M - H 2 O] + (1), 308, 139, 125, 111, 97, 83, 69, 57 (100) (n-tetracosanol, 12.1%)

30 Table 1. 인동으로부터분리한화합물목록 No. Compound name 6월 7월 8월 9월 10월총량 (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) 1 trilinolein DOP fatty acids β-sitosterol ,124 5 pomolic acid ursolic acid hexacosanol daucosterol E loganin , obtusifoliol gramisterol citrostadienol secologanin dimethyl acetal hydroxytormentic acid euscaphic acid

31 Table 2. 금은화로부터분리한화합물목록 No. Compound name 6월 7월 8월 9월 10월총량 (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) 1 β-sitosterol daucosterol luteolin caffeic acid E ,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester luteolin 7-O-glucoside azelaic acid protocatechuic acid ,5-dicaffeoylquinic acid hexacosanol 인동, 금은화의산지별추출물의제조 3.1. 인동 - 잎 ; 산지별인동잎을건조한후잘게부수고일정량 (100 g) 을 70% EtOH (2 l) 로 reflux하여 3시간씩 2회추출하여 70% EtOH 엑스를제조하였다. - 줄기 ; 산지별인동줄기를세절하여분쇄기로분쇄한후일정량 (100 g) 을 70% EtOH (1 l) 로 reflux하여 3시간씩 2회추출하여 70% EtOH 엑스를제조하였다

32 기원식물학명산지 No.1 Lonicera japonica Thunb. 국산경북봉화 No.2 Lonicera japonica Thunb. 야생국산경북경주 No.3 Lonicera japonica Thunb. 야생국산경북경주 70% EtOH ext (g) 서울시장수집줄기 채취줄기 채취잎 38.8 No.4 Lonicera japonica Thunb. 약초원국산서울 채취줄기 17.6 No.5 Lonicera japonica Thunb. 약초원국산서울 채취잎 39.3 No.6 Lonicera japonica Thunb. 중국산동서녕시장수집줄기 14.0 No.7 Lonicera japonica Thunb. 중국산동안국시장수집줄기 17.7 No.8 Lonicera japonica Thunb. 국산영천영천시장수집줄기 금은화 - 산지별금은화를분쇄기로분쇄한후일정량 (50 g) 을 70% EtOH (300 ml ) 로 reflux 하여 3 시간씩 2 회추출하여 70% EtOH 엑스를제조하였다. 기원식물학명 산 지 No.1 Lonicera japonica Thunb. 미개화 중국 밀현 서울시장수집 H 70% EtOH ext (g) 21.6 No.2 Lonicera japonica Thunb. 거의개화국산경북안동서울시장수집 20.6 No.3 Lonicera japonica Thunb. 미개화중국 하남정주 ( 온현 ) 정주시장수집 21.9 No.4 Lonicera japonica Thunb. 개화 + 미개화 중국 산동 서녕시장수집 20.7 No.5 Lonicera japonica Thunb. 미개화 중국 하남 안국시장수집 19.0 No.6 Lonicera japonica Thunb. 개화중국산동영천시장수집

33 4. 제공된화합물및추출물목록 4.1. 제2세부과제에제공한추출물및화합물 1. 금은화 70% EtOH ex. ; 10.0 g 2. 인동 70% EtOH ex. ; 10.1 g 3. 화합물 화합물명 무게 (mg) Total rutin chlorogenic acid caffeic acid loniceroside A protocatechuic acid hyperin rhoifolin astragalin lonicerin luteolin loganin ochnaflavone quercetin diosmetin caffeic acid methyl ester isoquercitrin chrysin α-hederin luteolin 7-O-glucoside

34 4.2. 효능팀에제공한추출물 1. 금은화 70% EtOH ex. ; 10.0 g 2. 인동 70% EtOH ex. ; 10.0 g 3. 상기 3 에서제조한인동 8 종, 금은화 6 종의 70% EtOH 엑스각 1 g ( 2) 씩 사업단에제출한화합물목록 ( 현재 ) 한약재명 화합물명 무게 (mg) 인동 quercetin 1,500 ochnaflavone 192 astragalin 101 isoquercitrin 200 rhoifolin 500 diosmetin 7-O-glucoside 100 lonicerin 22 loniceroside A 1,000 loganin 2,000 α-hederin 200 luteolin 23 chrysin 1,000 금은화 chlorogenic acid 500 methyl caffeate 100 rutin 1,000 hyperoside 105 protocatechuic acid 1,000 caffeic acid 1,000 luteolin 7-O-glucoside 100 luteolin 100 β-sitosterol 40 daucosterol

35 4.4. DNA 분석에의한한약재종감별연구팀에제공한원시료목록 인동 기원식물학명산지제공량 (g) 1 Lonicera japonica Thunb. 국산경북봉화 서울시장수집 줄기 Lonicera japonica Thunb. 야생국산경북경주 채취 줄기 Lonicera japonica Thunb. 야생국산경북경주 채취 잎 Lonicera japonica Thunb. 약초원국산 서울 채취 줄기 Lonicera japonica Thunb. 약초원국산서울 채취잎 Lonicera japonica Thunb. 중국산동서녕시장수집줄기 Lonicera japonica Thunb. 중국산동안국시장수집줄기 Lonicera japonica Thunb. 국산영천영천시장수집줄기 구입경기, 의정부 구입강원, 홍천 구입경기, 군포 구입경북, 청송 구입경기, 포천 구입경북, 영천, 완당동 구입경북, 영천, 화산면 구입경기, 양평, 용문 구입경북, 상주, 모서면 구입경북, 안동, 와룡면 구입대전, 유성, 세동 구입경기, 강화 구입대전, 동구, 중동 구입경북, 김천 구입중국산

36 금은화 기원식물학명산지제공량 (g) 1 Lonicera japonica Thunb. 미개화중국밀현서울시장수집 H Lonicera japonica Thunb. 거의개화국산경북안동서울시장수집 Lonicera japonica Thunb. 미개화 하남정주중국 ( 온현 ) 정주시장수집 Lonicera japonica Thunb. 개화 + 미개화 중국 산동 서녕시장수집 Lonicera japonica Thunb. 미개화 중국 하남 안국시장수집 Lonicera japonica Thunb. 개화중국산동영천시장수집 구입강원, 홍천, 내면 구입경북, 안동, 낙문동 구입전남, 고흥 구입강원, 양양 구입경북, 봉화 구입강원, 강릉, 교이 구입충남, 부여 구입강원, 고성, 거진 구입경북, 의성 구입설악산 구입경북, 청송 구입경북, 군위, 부계 구입경북, 울진, 읍내 구입경북, 안동 구입중국산

37 (3) 제 2 세부과제 제2세부과제명제2세부과제책임자 지표물질동시정성정량분석법개발및패턴분석신종헌 / 서울대학교 / 천연물화학 1) 시료의선정, TLC 패턴분석및 LC 조건의확립 Flavonoids, phenolic compounds, 그리고 iridoids 계열인 protocatechuic acid, chlorogenic acid, loganin, caffeic acid, rutin, lonicerin, caffeic acid methyl ester, luteolin, luteolin 7-O-glucoside, quercetin (Fig. 1) 등 10종의시료를일차적으로선정하여 MeOH 1 ml에녹인 stock solution을만든후사용하였다. 내부표준물질은 2,3,4-trihydroxybenzoic acid를사용하였다. OH HO O OH O Rutin OH OH O-Glo-Rha OH HO O O O OH OH OH O Luteolin-7-O-glucoside OH HO O OH O Quercetin OH OH OH OH HO O OH OH HO HO O O O O OH O OH OH O OH CO 2 H OH O H 3 C OH OH HO OH Luteolin Lonicerin Caffeic acid CO 2 H O OH COOH OH HO OH HOOC OH O OH OH OH OH OH Protocatechic acid Chlorogenic acid 2,3,4-Trihydroxy benzoic acid(i.s) HO HO COOCH 3 Caffeic methyl ester O OCH 3 H HO O H 3 C H HO OH O O OH CH 2 OH Loganin Fig. 1. Chemical structures of standard compounds and an internal standard

38 2) TLC 패턴분석선정된시료에대하여 silica 와 ODS plate에서의일차적인분리조건과개략적패턴을분석하였다 (Fig. 2). 다양한시도결과적합한용리액은 silica의경우 EtOAc : EtOH : H 2 O = 8.5 : 1 : 0.5, ODS의경우 MeCN : H 2 O : F.A = 7.5 : 2.5 : 0.1% 를사용하였고발색조건은 H 2 SO 4, FeCl 2, I 2 를각각사용하였다 (Fig 2, 3). EtOAc : MeOH : H 2O = 8.5 : 1 :0.5 Detection reagent Compound H 2SO4 FeCl2 I2 1. Rutin 2. Chlorogenic acid 3. Caffeic acid 4. Protocatechic acid 5. Hyperin 6. Loganin 7. Quercetin 8. Caffeic m ethly ester 9. Lonicerin 10. Luteolin 11. Luteolin-7-Oglucoside Fig. 2. TLC pattern analysis in silica plate 75% ACN(0.1% F.A) Detection reagent Compound H 2S O4 FeCl2 I 2 1. Rutin 2. Chlorogenic acid 3. C a ffe ic a c id 4. P rotocatechic acid 5. Hyperin 6. Loganin 7. Q uercetin 8. C affeic m e thly ester 9. L o n ic e rin 10. Luteolin 11. Luteolin-7-Oglucoside Fig. 3. TLC pattern analysis in ODS plate 3) LC 조건의확립 Column으로는 Agilent사의 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (C18, mm, 5 μm) 을사용하였고, 최상의조건으로이동상으로는 0.1% formic acid가첨가된 100% acetonitrile (A 용매 ) 과 100% water (B 용매 ) 로서용매기울기용리를사용하였다. 용매기울기용리의조건으로는 A용매를 0~3분까지 15% 유지하였다가 3~20분까지 40% 기울기용리로서분석한후 20~25 분까지는 40% 로유지, 25~30분까지는이를다시 15% 로기울기용리, 30~40분까지는원래의초기이동상인 A용매 15% 로안정화시켰다. 유속은 0.3 ml/min 이고, 검출기파장은 210 nm 에서측정하였다 (Fig. 4). 또한동일한패턴을추출물에서도확인하였다 (Fig. 5)

39 min Fig. 4. The HPLC chromatogram of standard compounds by DAD detector Fig. 5. The HPLC chromatogram of crude samples 1. Protocatechuic acid, 2. 2,3,4-Trihydroxybenzoic acid (I.S), 3. Chlorogenic acid, 4. Loganin, 5. Caffeic acid, 6. Rutin, 7. Lonicerin, 8. Luteolin 7-O-glucoside, 9. Caffeic acid methyl ester, 10. Luteolin, 11. Quercetin min 상기의 chromatogram에서 base-line이직선을이루지못하고있는이유는구조가매우상이한다수의시료를동시에측정하기위하여 ( 지표물질이아직미확정되었으므로 ) gradient system의사용이불가피하였고또주요화합물인 chlorogenic acid의검출을명확히하기위하여 UV의흡광파장을 210 nm로지정하였기때문이다. 이러한문제점은시료를종류별로나누어서분석하였을때는완전히해소되었다 (5-가. specificity 참조 ). 4) 시료의추출방법비교 1) 용매별분석으로시료 200 mg에 100%, 70% 에탄올수용액과 100%, 70% 메탄올수용액을각각 10 ml를넣은후 ultrasonication 방법으로 60분추출하였다. 추출된에탄올수용액을 0.2 μm membrane filter로거른후 1 ml를취해 20 μg내부표준물질을포함한메탄올을첨가, 이것의절반을취하여농축시킨후, 이동상인 15% acetonitrile 수용액으로녹여 20 μl를컬럼속으로주입하여분석하였다. 2) 실험방법별분석으로는시료에 70% 에탄올수용액을첨가한후, 각시료를 vortex, reflux

40 그리고 ultrasonication의방법으로 60분간추출하여분석비교하였다. 3) 추출시간별분석으로는각시료에 70% 에탄올수용액을첨가한후 ultrasonication법을사용하여 10분, 20분, 30분, 60분, 90분을각시료별로추출하여분석비교하였다. 상기의분석결과는 Table 1~3 에요약되었다. 추출용매로서는 70% 에탄올수용액이비교한다른용매에비해추출효율이높았으며, 추출방법으로는 ultasonicaton 법이 reflux나 vortex법에비해비교적간단하며, 추출효율또한비슷하거나더우수하였다. 추출시간별분석에서는여러추출시간을비교한결과 60분이가장효율적인시간으로판명되었다. Table 1. Comparison of extraction efficiency by solvents (n=3) Compound 100%MeOH 70%MeOH 100%EtOH 70%EtOH Protocatechicacid 43.34± ± ± ±2.69 Chlorogenicacid ± ± ± ± Loganin ± ± ± ±24.21 Caffeicacid ± ± ± ±10.06 Rutin ± ± ± ±12.75 Lonicerin ± ± ± ±4.52 Luteolin 7-O-glucoside 86.85± ± ± ±2.13 Caffeicmethylester 47.00± ± ± ±4.84 Luteolin 7.40± ± ± ±2.67 Quercetin 38.15± ± ± ±1.03 Table 2. Comparison of extraction efficiency by methods (n=3) Compound Vortex(mg/L) Reflux(mg/L) Ultrasonication(mg/L) Protocatechicacid 58.37± ± ±23.60 Chlorogenicacid ± ± ± Loganin ± ± ± Caffeicacid ± ± ±38.45 Rutin ± ± ±66.96 Lonicerin ± ± ±9.42 Luteolin 7-O-glucoside 78.21± ± ±4.27 Caffeicmethylester 56.88± ± ±5.17 Luteolin 12.15± ± ±4.31 Quercetin 43.90± ± ±

41 Table 3. Comparison of extraction efficiency by time (n=3) Compound 10min 20min 30min 60min 90min Protocatechicacid 35.84± ± ± ± ±11.01 Chlorogenicacid ± ± ± ± ± Loganin ± ± ± ± ±38.88 Caffeicacid ± ± ± ± ±78.98 Rutin ± ± ± ± ±66.46 Lonicerin ± ± ± ± ±3.75 Luteolin 7-O-glucoside 67.39± ± ± ± ±0.30 Caffeic methyl ester 38.23± ± ± ± ±3.58 Luteolin 7.41± ± ± ± ±4.53 Quercetin 41.53± ± ± ± ±1.69 5) Validation 상기 10종의표준물질에대하여제반 validation parameter를측정하였다. 가 ) Specificity 시료에대한 specificity는 LC에서의 retention time의차이로완전히분리되었으며각각의화합물의확인은표준시료를각각주입하여확인되었다. 시료의머무름시간은각각 10.34분에 protocatechuic acid, 12.38분에 clorogenic acid, 14.72분에 loganin, 분에 caffeic acid, 18.88분에 rutin, 19.39분에 lonicerin, 19.89분에 luteolin 7-O-glucoside, 26.66분에 caffeic acid methyl ester, 28.49분에 luteolin, 29.03분에 quercetin 성분들이용출되었다 (Fig. 3 참조 ). 모든실험은위와같이 10종의 standard compounds을동시분석하여 data를구하였지만각 signal들이지나치게밀집하고 base-line이고르지않아이를해소하기위하여 type 별로 flavonoids와기타의물질 (phenolic compounds, iridoid) 로나누어상이한조건에서분석한결과 base-line이일정하고시료별용출시간이확연히구분되는우수한결과를얻었다 (Fig. 6, 7). Fig. 6. The chromatogram of standard compounds (Flavonoids) by DAD detector 1. Rutin, 2. Lonicerin, 3. Luteolin 7-O-glucoside, 4. Luteolin, 5. Quercetin, I.S. 2,4,5-Trimethoxybenzoic acid

42 Flavonoids계열의 standard compounds는 rutin, lonicerin, luteolin 7-O-glucoside, 그리고 quercetin이며, 이때사용한 I.S는 2,4,5-trimethoxybenzoic acid였다. 분리조건은이동상으로 0.1% formic acid가첨가된 100% acetonitrile (A 용매 ) 과 100% water (B 용매 ) 를용매기울기용리로서사용하였다. 용매기울기용리의조건으로는 A용매를처음 25% 에서 15분까지 65% 기울기용리로서분석한후 분까지는 65% 으로유지, 분까지는이를다시 25% 으로기울기용리, 분까지는원래의초기이동상인 A용매 25% 으로안정화시켰다. 유속은 0.3 ml/min 이고, 검출기파장은 254 nm에서측정하였다. mau D AD1 C, Sig= 250,4 Re f=360,1 00 (LON ICERA\RSK \ D) I.S min Fig. 7. The chromatogram of standard compounds (phenolic compounds and an iridoid) by DAD detector 1. Protocatechuic acid, 2. Chlorogenic acid, 3. Loganin, 4. Caffeic acid, 5. Caffeic acid methyl ester, I.S. 2,3,4-Trihydroxybenzoic acid 금은화의함유된 phenolic compounds 그리고 iridoid계열의 standard compounds는 protocatechuic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, caffeic acid methyl ester 그리고 loganin이며, 이때사용한 I.S는 2,3,4-trihydroxybenzoic acid였다. 분리조건은이동상으로 0.1% formic acid가첨가된 100% MeOH (A 용매 ) 과 100% water (B 용매 ) 를용매기울기용리로사용하였다. 용매기울기용리의조건으로는 A용매를 0-3분까지 25% 유지하였다가 3-20분까지 60% 기울기용리로서분석한후 20-25분까지는 60% 으로유지, 25-30분까지는이를다시 25% 으로기울기용리, 30-40분까지는원래의초기이동상인 A용매 25% 으로안정화시켰다. 유속은 0.5 ml/min 이고, 검출기파장은 250 nm에서측정하였다. 나 ) Linearity and Range 각각의시료에대한 range 1-20 mg/l 구간에서 conversion equation을획득하였으며 correlation coefficient (R 2 ) 는모두 0.99 였다. conversion equation의기울기는 protocatechuic acid가가장높았고 ( X), loganin이가장낮았다 ( X). Table 4 에표준시료에대한범위와직선성의결과를요약하였다

43 Table 4. Validation data from calibration curves, LOD, and LOQ of standard compounds by HPLC/DAD system compound Conversion equation Correlation coefficient(r 2 ) LOD (mg/l) LOQ (mg/l) Protocatechic acid Y = X Chlorogenic acid Y = X Loganin Y = X Caffeic acid Y = X Rutin Y = X Lonicerin Y = X Luteolin 7-O-glucoside Y = X Caffeic methyl ester Y = X Luteolin Y = X Quercetin Y = X 다 ) Detection Limit and Quantitation Limit 각시료의 detection limit는모두 mg/l 이하였으며 quantitation limit는 mg/l 이하였다. 이들중에서 chlorogenic acid가가장높은한계 (detection limit mg/l, quantitation limit mg/l) 을나타내었고 quercetin이가장낮은한계 (detection limit mg/l, quantitation limit mg/l) 를보여주었다. 여타의물질들은중간값을나타내었으나대체로 quercetin과유사하였다 (Table 4). 라 ) Accuracy and Precision Accuracy는 spiking recovery 방법을사용하였다. powder 상태의금은화를 20 mg을잰후여기에 rutin, protocatechuic acid, luteolin 7-O-glucoside, quercetin, caffeic acid methyl ester, lonicerin, luteolin은 800 μg, 1200 μg, 그리고 1500 μg, chlorogenic acid, caffeic acid, loganin 은 1600 μg, 2000 μg, 그리고 2400 μg의양을첨가하고, 70% 에탄올수용액 10 ml가되게넣은후 ultrasonication 방법으로 60분간추출하였다. 추출된에탄올수용액을 0.2 μm membrane filter로거른후 1 ml를취해 10 μg내부표준물질을포함한메탄올을첨가, 이것을농축시킨후, 이동상인 15% acetonitrile 수용액으로녹여 20 μl를컬럼속으로주입하여분석하였다. 회수율을측정한결과최하 96.10, 최고 의회수율을보여주었으며 RSD는 를나타내었다. Table 5에 accuracy 대한결과가요약되었다

44 Table 5. Validation data from accuracy of standard compounds by HPLC-DAD system Compound Spiked conc. (μg/ml) Recovery (%) RSD( %) Compound Spike conc. (μg/ml) Recovery (%) RSD (%) Protocatechuic Lonicerin acid Chlorogenic acid Luteolin-O-glucoside Loganin Caffeic methyl ester Caffeic acid Luteolin Rutin Quercetin Precision을측정하는방법은분말의금은화 200 mg을 70% 에탄올수용액 10 ml에넣은후 ultrasonication 방법으로 60분간추출하였다. 추출된에탄올수용액을 0.2 μm membrane filter로거른후 1 ml를취해 10 μg내부표준물질을포함한메탄올을첨가, 이것을농축시킨후, 이동상인 15% acetonitrile 수용액으로녹여 20 μl를컬럼속으로주입하여분석하였다. 일내 (intra-day) 의 RSD는최하 (mg/l), 최고 (mg/l) 이었고일간 (inter-day) 의 RSD는최하 (mg/l), 최고 (mg/l) 이었다. Table 6 에 precision 대한결과를요약하였다. Table 6. Validation data of precision by HPLC-DAD system Compound Intra-day Inter-day Mean(mg/L) SD RSD(%) Mean(mg/L) SD RSD(%) Protocatechuic acid Chlorogenic acid Loganin Caffeic acid Rutin Lonicerin Luteolin 7-O-glucoside Caffeic methyl ester Luteolin Quercetin 마 ) Robustness 1 Phenomenex 사의 Gemini 5 μ C18 컬럼과 Shiseido사의 CAPCELL PAK C18 UG120 을사용하여이를용량계수 (k ), 선택성 (α), 이론단수 (N), 분리도 (Rs) 로나타내어비교하였다 (Table 7). Phenomenex 사의 Gemini 5 μ C18 컬럼의경우같은이동상조건에서대부분의

45 standard compounds는분리가되었으나각각근접해있는 rutin과 lonicerin의분리능이떨어졌고전체적인머무름시간이길어졌다. Shiseido사의 CAPCELL PAK C18 UG120의경우전체적인머무름시간은비슷했으나 luteolin과 quercetin의분리능이약간떨어졌다. 따라서컬럼은 Agilent사의 ZORBAX Eclipse XDB-C18 컬럼이금은화 standard compounds 분리에는훨씬더우수하였다 (Fig. 8, 9). 2 시료분석시컬럼의온도에따른분리능의비교분석으로서동일한조건하에컬럼의온도만을 20, 25, 30, 35, 40 로바꾸어이를비교분석하여용량계수 (k ), 선택성 (α), 이론단수 (N), 분리도 (Rs) 로나타내었다 (Table 8). 분석결과온도가높아질수록머무름시간 19~20분대의 lonicerin과 luteolin 7-O-glucoside 그리고 28~29분대의 luteolin과 quercetin이겹치는경향을보였다. 따라서컬럼의분석온도는모든 standard compound가뚜렷이분리가이루어지는 20 가우수하였다. Table 7. Comparison of robustness by columns Surfa Pore Analytes Columns ce size area/c m2 (Ao) Protocatechuic acid Chlorogenic acid Loganin Caffeic acid Theoreticalplate(N) Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ± ± phenomenex Gemini 5μ C ± ± ± ± Shiseido CAPCELL PAK C18 UG ± ± ± ± Capacityfactor(k ) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ± ±0.34 Gemini 5μ C ± ± ± ±0.33 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ± ±0.27 Separationfactor(α) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±0.00 Gemini 5μ C ± ± ±0.00 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±0.01 Resolution(Rs) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±0.65 Gemini 5μ C ± ± ±0.73 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±

46 Table 7. continued. Surface Pore Analytes Columns area/c size( m2 Ao) Rutin Lonicerin Luteolin-7-O-glucoside Theoreticalplate(N) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ± Gemini 5μ C ± ± ± CAPCELL PAK C18 UG ± ± ± Capacityfactor(k ) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±0.19 Gem ini 5μ C ± ± ±0.17 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±0.51 Separationfactor(α) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±0.00 Gem ini 5μ C ± ± ±0.00 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±0.00 Resolution(Rs) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±0.09 Gem ini 5μ C ± ± ±0.05 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±0.03 Table 7. Continued. Columns Surface area/cm Pore size( Analytes Caffeic methyl Luteolin Quercetin 2 Ao) ester Theoreticalplate(N) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ± Gemini 5μ C ± ± ± CAPCELL PAK C18 UG ± ± ± Capacityfactor(k ) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±58.13 Gemini 5μ C ± ± ±0.30 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±0.35 Separationfactor(α) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±0.00 Gemini 5μ C ± ± ±0.00 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±0.00 Resolution(Rs) ZORBAX Eclipse XDB-C ± ± ±0.00 Gemini 5μ C ± ± ±0.03 CAPCELL PAK C18 UG ± ± ±

47 min Fig. 8. The chromatogram of standard compounds by phenomenex Gemini 5μ C18 column min Fig. 9. The chromatogram of standard compounds by Shiseido CAPCELL PAK C18 UG protocatechuic acid, 2. 2,3,4-trihydroxybenzoic acid (I.S), 3. chlorogenic acid, 4. loganin, 5. caffeic acid, 6. rutin, 7. lonicerin, 8. luteolin 7-O-glucoside, 9. caffeic acid methyl ester, 10. luteolin, 11. quercetin

48 Table 8. Comparison of robustness by temperatures Teperature( ) Theoreticalplate(N) Protocatechuic acid Chlorogenic acid Analytes Loganin Caffeic acid Rutin ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Capacityfactor(k ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.12 Separationfactor(α) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.01 Resolution(Rs) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

49 Table 8. Continued. Teperature( ) Lonicerin Luteolin-7-O -glucoside Analytes Caffeic methyl ester Luteolin Quercetin Theoreticalplate(N) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Capacityfactor(k ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.33 Separationfactor(α) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.00 Resolution(Rs) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.01 6) LC-MS/MS 분석 1 LC/MS 분석조건의확립 MS/MS 기기는 Thermo Finnigan사의 LCQ Advantage Mass Spectrometer 시스템을사용하였다. Table 9 에 MS 분석파라미터들을요약하였다. 먼저시료들을컬럼을연결하지않고 scan 모드에서각성분들의특성피크를확인하였다. 시료들중모든 standard compounds는양이온모드에서검출이되었다. 분석시표준물질이여러 type으로이루어졌기때문에하나의 method로는감도가좋지않아전체의물질을용출시간에따라 3개의 method를사용하여분석하였는데각각의군별에따른파라미터는 Table 10에요약되었다. Fig. 10 에시료들의 scan 스펙트럼을나타내었다. 각성분들의특성피크를선택하여 SIM 모드를사용하여분석하였으며, 이를 MS/MS의 SRM 모드로서각피크의 fragment를확인하였다. 내부표준물질인 2,3,4-trihydroxybenzoic acid (I.S) 는 MS1: 171 MS2: 153, protocatechuic acid는 MS1:

50 155 MS2: 111, chlorogenic acid는 MS1: 355 MS2: 377, loganin은 MS1: 413 MS2: 251, caffeic acid는 MS1: 181 MS2: 163, rutin 은 MS1: 611 MS2: 465, lonicerin 은 MS1: 595 MS2: 287, luteolin 7-O-glucoside 는 MS1: 449 MS2: 287, caffeic acid methyl ester는 MS1: 195 MS2: 163, luteolin은 MS1: 287 MS2: 269, quercetin 은 MS1: 303 MS2: 285이었다. 컬럼과 HPLC 시스템은앞에서와같은조건으로분리를하였다. Table 9. MS/MS analysis parameters on SIR and SRM mode Ion monitoring parameter MW ms1 ms2 Collision energy Ion mode Protocatechic acid Positive Chlorogenic acid Positive Loganin Positive Caffeic acid Positive Rutin Positive Lonicerin Positive Luteolin-7-O-Glc Positive Caffeic acid methyl ester Positive Luteolin Positive Quercetin Positive 2,3,4-THBA Positive Table 10. Analytical methods by compounds ESI source Method 1 Method2 Method 3 Sheath gas flow rate(arb) Aux gas flow rate(arb) Spray voltage(kv) Capillary temp( ) Capillary voltage(v) Tubelens offest(v) Ion optics Octapole 1offset(V) Lens voltage(v) Octapole 2 offset(v) OctapoleRFamplitude(Vp-p) Protocatechuic acid Chlorogenic acid I.S Loganin Caffeic acid Rutin Lonicerin Luteolin-7-O-Glc Caffeic methyl ester Luteolin Quercetin

51 Protocatechuic acid MS [M+H+] MS/MS Chlorogenic acid MS [M+H+] MS/MS Relative Abundance m/z Loganin MS [M+H+] MS/MS Relative Abundance m/z

52 Caffeic methyl ester MS [M+H+] MS/MS Relative Abundance m/z Caffeic acid MS MS/MS [M+H+] R elative A bundance m/z Rutin MS MS/MS [M+H+] Relative Abundance Relative Abundance m/z m/z

53 Lonicerin MS [M+H+] MS/MS Relative Abundance R elative A bundance m/z m/z Quercetin MS [M+H+] MS/MS 70 Relative Abundance m/z Luteolin Relative Abundance MS [M+H+] Relative Abundance MS/MS m/z m/z

54 Luteolin-7-O-glucoside 2,3,4-Trihydroxy benzoic acid MS [M+H+] R e lative Abund ance MS/MS m/z Fig. 10. Mass spectrum (scan mode) of standard compounds 각 standard compounds는 LC에서의 retention time의차이로완전히분리되었으며각각의화합물의확인은 positive electrospray MS로서완전히확인되었다. 시료의머무름시간은각각 9.96분에 protocatechuic acid, 11.68분에 chlorogenic acid, 13.05분에 loganin, 15.88분에 caffeic acid, 18.43분에 rutin, 분에 lonicerin, 분에 luteolin 7-O-glucoside, 분에 caffeic acid methyl ester, 분에 luteolin, 분에 quercetin 이용출되었다. Fig. 11과 12에분리된 SIM 크로마토그램을정리하였다

55 Protocatechic acid 2,3,4-trihydroxybenzoic acid Chlorogenic acid Loganin Caffeic acid Rutin Lonicerin Luteolin-7-O-Glc Ceffeic methyl ester Luteolin Quercetin Fig. 11. The chromatograms of standard compounds of L. japonica by LC/MS (SIM mode) system Fig. 12. The chromatogram of standard compounds of L. japonica by LC/MS 1: Chlorogenic acid, 2: Loganin, 3: Caffeic acid, 4: Rutin, 5: Lonicerin, 6: Luteolin 7-O-Glc, 7: Caffeic acid methyl ester, 8: Luteolin, 9: Quercetin

56 7) 금은화시료의정량분석시중에서구입한금은화를제시된실험방법으로정량분석하였다. Crude sample의분리된크로마토그램을 Fig 에서나타내었고, Table 11, 12 에구체적인수치를정리하였다. 밀현, 하남정주, 하남, 산동에서구입한중국산과홍천, 낙문, 고흥, 양양, 봉화, 강릉, 부여, 고성, 의성, 설악산, 청송, 군위, 울진, 안동에서구입한국내산을비교한결과국내산안동에서구입한제품이 chlorogenic acid의함량이많았으며, 국내산청송에서구입한제품은 rutin의함량이많이들어있는것으로나타났다 (u g /g ) G - 1 G - 2 G - 3 G - 4 G - 5 G - 6 G - Fig. 13. Quantitative analysis of L. japonica from various regions (phenolic compound and iridoid, μg /g) G-1: Hong-cheon, gang-won do G-2: Nak-moon, an-dong si G-3: Go-heung, jeon-nam G-4: Yang-yang, gang-won do G-5: Bong-hwa, gyung book G-6: Kyo-yi, gang-reung si G-7: Bu-yeo, chung nam G-8: Geo-jin eup, go-seong gun G-9: Ui-seong, gyung book G-10: Mt. seolak G-11: Cheong-song, gyung boo

57 (ug/g) G G G G G G Fig. 14. Quantitative analysis of L. japonica from various region (phenolic compounds and iridoid, μg /g) G-12: Goon-wi, gyung book G-13: ul-jin gun, gyung book G-14: An-dong, gyung book G-15: China G-16: Mil-hyun(China) G-17: An-dong, gyung-book G-18: Ha-nam Jeong-ju(on-hyun, (China) G-19: Sandong(China) G-20: Hanam(China) G-21: Sandong(China) (u g /g ) Fig. 15. Quantitative analysis of L. japonica from various regions (flavonoids, μg /g) G-1: Hong-cheon, gang-won do G-2: Nak-moon, an-dong si G-3: Go-heung, jeon-nam G-4: Yang-yang, gang-won do G-5: Bong-hwa, gyung book G-6: Kyo-yi, gang-reung si G-7: Bu-yeo, chung nam G-8: Geo-jin eup, go-seong gun G-9: Ui-seong, gyung book G-10: Mt. seolak G-11: Cheong-song, gyung book

58 (ug/g) G G G G G G Fig. 16. Quantitative analysis of L. japonica from various regions (flavonoids, μg /g) G-12: Goon-wi, gyung book G-13: ul-jin gun, gyung book G-14: An-dong, gyung book G-15: China G-16: Mil-hyun(China) G-17: An-dong, gyung-book G-18: Ha-nam Jeong-ju(on-hyun, (China) G-19: Sandong(China) G-20: Hanam(China) G-21: Sandong(China) Table 11. Quantitative analysis of L. japonica by sources (phenolic compounds and iridoid, μg /g) source Protocatechuic acid Chrologenicacid Loganin Caffeicacid Caffeic methyl ester Hong-cheon , Nak-moon , Go-heung , Yang-yang , Bong-hwa , Kyo-yi , Bu-yeo , Geo-jin eup , Ui-seong , Mt. seolak , Cheong-song , Goon-wi , Ul-jin gun , An-dong , China , Mil-hyun(China) , An-dong , Ha-nam (China) , , Sandong(China) , Hanam(China) , Sandong(China) ,

59 Table. 12. Quantitative analysis of L. japonica (flavonoids, μg/g) source Rutin Lonicerin Luteolin-7-O-glucoside Luteolin Quercetin Hong-cheon Nak-moon Go-heung Yang-yang Bong-hwa Kyo-yi Bu-yeo Geo-jin eup Ui-seong Mt. seolak Cheong-song Goon-wi Ul-jin gun An-dong China Mil-hyun(China) An-dong Ha-nam (China) Sandong(China) Hanam(China) Sandong(China) 현재화합물들의안정성, 추가적인 validation (recovery rate, reproducibility), 추출물에서의 LC-MS/MS 패턴확인등의보완작업과함께시판시료의지표물질함량에대한패턴분석이진행중이다. 아울러현재까지분석된 10종의화합물중에서생리활성의결과에따라지표물질 3종을최종적으로선정하고이들에대한제반동시정성정량분석법을확립할계획이다

60 3. 연구개발과제의당해년도연구성과 (1) 성과내용 1) 총괄연구개발과제 총괄과제명한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 총괄과제책임자 강삼식 / 서울대학교 / 천연물화학 가. 연구논문 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 Immunoregulatory activity by daucosterol, a β -sitosterol glycoside, induces protective Th1 immune response against disseminated Candidiasis in mice Jue-Hee Lee, Ju Young Lee, Ji Hye Park, Hye Sil Jung, Ju Sun Kim, Sam Sik Kang, Yeong Shik Kim, Yongmoon Han Vaccine 국내 / 국외 국제 SCI SCI 여부 2 Quantitative Evaluation of Radix Astragli through the Simultaneous Detremination of Bioactive Isoflavonoids and Saponins by HPLC/UV and LC-ESI-MS/MS Jin Hee Kim, So-Young Park, Hyun Kyun Lim, Ah Yeon Park, Ju Sun Kim, Sam Sik Kang, Jeong-Rok Youm, and Sang Beom Han Bull. Korean 28 Chem. Soc 국내 SCI

61 나. 학술발표 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지국내 / 국제 1 한약재생리활성성분분리 구두발표 한약재생리활성성분분리및효능유전자확인연구포스터 Constituents from the roots of Astragalus membranaceus 구두발표 A new cycloartane glycoside isolated from 구두발표 Astragalus membranaceus 다. 지적재산권 강삼식 한약재평가기술과학화1단계 연구사업성과 16 발표회 강삼식, 김주선, 한약재평가기연민혜, 이은주, 술과학화1단계 정혜실, 이주영, 연구사업성과 16 김윤정발표회 22nd 정혜실, 김주선, Symposium 강삼식 on Natural Products 22nd 연민혜, 김주선, Symposium 강삼식 on Natural Products 한약재평가기술과학화1 단계연구사국내업성과발표회자료집한약재평가기술과학화1 단계연구사국내업성과발표회자료집 22nd Symposium on Natural 국제 Products Program and Papers 22nd Symposium on Natural 국제 Products Program and Papers 번호출원등록 / 1 2 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 라. 정책활용 인동, 금은화의품질평가를위한기초자료제공으로대한약전등개정시기준시험법등에반영 마. 타연구 / 차기연구에활용 제1세부과제에서분리한성분들을제2세부과제와효능분석팀에제공하여연구에활용하였음. 약효, 독성, 임상등관련학문분야의실험을위한기초자료로활용 한약재의활성성분에대한 high throughput screening을위한기반기술확보 한약재의 dereplication을위한기반기술확보

62 바. 언론홍보및대국민교육 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 사. 기타 한약재평가기술과학화 1 단계연구사업성과발표를위한심포지움개최 2) 제 1 세부과제 제 1 세부과제명금은화및인동으로부터한약재생리활성성분의분리 제 1 세부과제책임자 강삼식 / 서울대학교 / 천연물화학 가. 연구논문 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 Immunoregulatory activity by daucosterol, a β -sitosterol glycoside, induces protective Th1 immune response against disseminated Candidiasis in mice Jue-Hee Lee, Ju Young Lee, Ji Hye Park, Hye Sil Jung, Ju Sun Kim, Sam Sik Kang, Yeong Shik Kim, Yongmoon Han Vaccine 국내 / 국외 국제 SCI SCI 여부 2 Quantitative Evaluation of Radix Astragli through the Simultaneous Detremination of Bioactive Isoflavonoids and Saponins by HPLC/UV and LC-ESI-MS/MS Jin Hee Kim, So-Young Park, Hyun Kyun Lim, Ah Yeon Park, Ju Sun Kim, Sam Sik Kang, Jeong-Rok Youm, and Sang Beom Han Bull. Korean 28 Chem. Soc 국내 SCI

63 나. 학술발표 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지국내 / 국제 1 한약재생리활성성분분리 구두발표 한약재생리활성성분분리및효능유전자확인연구포스터 Constituents from the roots of Astragalus membranaceus 구두발표 A new cycloartane glycoside isolated from 구두발표 Astragalus membranaceus 다. 지적재산권 강삼식 한약재평가기술과학화1단계 연구사업성과 16 발표회 강삼식, 김주선, 한약재평가기연민혜, 이은주, 술과학화1단계 정혜실, 이주영, 연구사업성과 16 김윤정발표회 22nd 정혜실, 김주선, Symposium 강삼식 on Natural Products 22nd 연민혜, 김주선, Symposium 강삼식 on Natural Products 한약재평가기술과학화1 단계연구사국내업성과발표회자료집한약재평가기술과학화1 단계연구사국내업성과발표회자료집 22nd Symposium on Natural 국제 Products Program and Papers 22nd Symposium on Natural 국제 Products Program and Papers 번호출원 / 등록 1 2 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 라. 정책활용 인동, 금은화의품질평가를위한기초자료제공으로대한약전등개정시기준시험법등에반영 마. 타연구 / 차기연구에활용 제1세부과제에서분리한성분들을제2세부과제와효능분석팀에제공하여연구에활용하였음. 약효, 독성, 임상등관련학문분야의실험을위한기초자료로활용 한약재의활성성분에대한 high throughput screening을위한기반기술확보 한약재의 dereplication을위한기반기술확보

64 바. 언론홍보및대국민교육 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 사. 기타 한약재평가기술과학화 1 단계연구사업성과발표를위한심포지움개최 2) 제 2 세부과제 제 2 세부과제명 제 2 세부과제책임자 지표물질동시정성정량분석법개발및패턴분석 신종헌 / 서울대학교 / 천연물화학 가. 연구논문번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 2 나. 학술발표 국내 / 국외 SCI여부 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지 1 2 국내 / 국제 다. 지적재산권 번호출원 / 등록 1 2 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 라. 정책활용 인동, 금은화의품질평가를위한기초자료제공으로대한약전등개정시기준시험법등에반영

65 마. 타연구 / 차기연구에활용 바. 언론홍보및대국민교육 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 사. 기타 임상시험, 관련 DB 구축, 워크샾또는심포지움개최등의경우구체적으로기술함. 4. 연구수행에따른문제점및대책 HPLC-UV(DAD) 분석은목표대로완료하였으나 LC-MS/MS 분석은최적분리조건의확립에당초예상보다많은시간이소요되고있음. 또한 20 종의시료에대한함량의비교분석은 5종의표준시료의도착지연으로분석이늦게시작되었음. 현재 LC-MS/MS는개개의시료에대한분석조건이모두확립되었고, 20종의시판시료는추출을완료하여각시료별정량이진행중에있는등문제점이모두해결되었으므로연구기간종료시까지당초의목표를충분히달성할것으로사료됨

66 5. 실적요약문 총괄연구과제요약 과제번호 한약재 321 공개가능여부공개 / 비공개 단위과제명 한약재생리활성성분의분리및분석연구 과제명한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 주관 연구책임자 성 명 강삼식 주민등록번호 소속기관명 서울대학교약학대학 전자우편 전화번호 02) 연구목표 (400~600 자 ) 금은화및인동으로부터유효성분중심의한약재관리에필요한생리활성성분의분리, 확인및이들생리활성성분을이용한 HPLC/UV 및 LC-MS(MS) 법에의한동시분석법을개발하고 pattern인식법에의한기원별, 산지별한약재정보를구축하고자한다. 분석을위한표준품을제조, 공급하고, 차후연구를위한시료를확보하여제공하고자한다. 연구내용 (1000~1200 자 ) 인동및금은화의 70% EtOH extract 를통상적인방법에따라분획을실시하여각각분획들을얻었다. 이들분획들에대하여각종크로마토그라피를반복실시하여인동으로부터 trilinolein, hexacosanol, C16-C26 의지방산혼합물, bis(2-ethylhexyl)phthalte (DOP) 같은 hydrocarbon alcohol 및지방산유도체들과, obtusifoliol, gramisterol, citrostadienol 과같은 4α-methyl ergosterol 유도체들과, β-sitosterol 및 daucosterol 같은 phytosterol 유도체들, triterpene 계화합물들인 ursolic acid, pomolic acid, euscaphic acid 및 23-hydroxytormentic acid 를분리확인하였고, iridoid 인 loganin 및 secologanin dimethyl acetal 등총 16 종을분리하였다. 금은화로부터 β -sitosterol 및 daucosterol 이외에 flavonoid 성분들인 luteolin, luteolin 7-O-glucoside 과 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester 와 caffeic acid, protocatechuic acid, azelaic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid 등 11 종의화합물들분리하여확인하였다. 이들성분중인동으로부터분리된 triterpene 계화합물들인 ursolic acid, pomolic acid, euscaphic acid 및 23-hydroxytormentic acid 들과 4α-methyl ergosterol 유도체들인 obtusifoliol, gramisterol 및 citrostadienol 등은이식물로부터처음으로분리된화합물들임을알았다. 또한금은화로부터얻은 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester 와 azelaic acid 도처음으로이식물로부터분리되었다. 제 2 세부과제에 19 종의화합물들을제공하였고, 인동의성분 12 종, 금은화의성분 10 종을제공하여활성평가를위한실험재료로제공하였다. Flavonoid 등 10 종의활성성분의함량분석을위한기초실험을 TLC 로완료하였으며이들을동시에정성, 정량분석할 HPLC-DAD 조건을 gradient system 에서확립하였다. 제반 validation parameters 의측정으로이를검증하였고이를바탕으로금은화시료에대한실제적인적용을입증하였다. LC-MS/MS 상에서각각의화합물에대한최적분석조건을파악하였으며현재이들을동시에정성, 정량분석하는실험이진행중이다. 금은화활성성분의최적추출조건을확립하고시중에유통되는금은화의지표물질함량에따른패턴인식 / 지문인식법에의한기원별, 산지별한약재평가를위하여 20 종의시료를확보하여추출을완료하였고각시료별표준물질의농도분석이진행중이다

67 연구성과 ( 응용분야및활용범위포함 ) (400~600 자 ) 인등및금은화이 70% EtOH엑스를제조하여이들을분획하고통상적인방법에따라성분분리를시도하여인동으로부터 16종, 금은화로부터 11종등총 27종의화합물들을분리하여이들의구조를확인하였다. 이들성분중인동으로부터분리된 triterpene계화합물들인 ursolic acid, pomolic acid, euscaphic acid 및 23-hydroxytormentic acid들과 4α-methyl ergosterol 유도체들인 obtusifoliol, gramisterol 및 citrostadienol 등과 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester와 azelaic acid는이식물로부터처음으로분리된화합물들이다. 분리된화합물들을동시분석법개발을위한시료 (19종) 및효능검색용시료 (22종) 로제공하였으며, 효능이확인된화합물들에대하여서는국가표준품으로이용가능하리라고사료된다. 또한금은화의주요성분인플라보노이드와페놀계화합물의합리적이고효과적인동시정량및정성분석법이개발되었으며이방법이천연물분석의기본지표인 validation의제반요소를모두충족시킴을입증하였다. 이로서체계적인천연물성분분석에의거한생약의과학화를위한기초자료의확보에성공하였고이는현재다양한생산조건과유통경로를통하여난립된금은화및금은화함유한방제제의실효적활성을모니터링하는근거를제공한것이다. 본연구결과는금은화를비롯한생약유래천연물의정량, 정성적지표를활용한생약성분의규격화및관리를위한기본자료로활용될것이며나아가생약의과학화를위한정책적인자료로도널리활용될것이다. 총괄참여연구원 성 명 주민등록번호 성 명 주민등록번호 강삼식 신종헌 김주선 장경화 이은주 송주은 정혜실 유성광 김윤정 이주영 연민혜 박수연 김은혜 Keywords (5개내외 ) 한글 영문 인동, 금은화, 활성성분분리, 동시분석법 Lonicera japoninca, Vine and Flower, Isolation, Bioactive components, simultaneous determination 주1) 연구목표, 연구내용, 연구성과를서술형으로기재 2) 국가연구개발사업 DB를통한공개를희망하지않는경우공개가능여부란에 공개불가 " 로표시 3) 연구성과는그간의연구결과및기대성과를서술

68 주관연구책임자의견 연구의범위 인동, 금은화의활성성분분리는현재까지진행된결과로는화합물수에있어서는계획대비초과하여달성하였으나, 양적인관계에있어서는아직충분한양을확보하지못하였으므로 2차년도에는이를중점적으로수행할것임. 이를위하여서는함량이많은극성분획에함유된성분분리위주로 2차년도에는과제를수행할예정임. 연구의한계점 분리한성분들이효능팀에게효능검색을실시한후효능이확인된성분들을지표성분으로제공할예정임으로금은화 / 인동에함유되어있는성분중어느정도양이많이함유된성분위주로분리를수행하여제공하고있음. 특히금은화 / 인동의함유성분들의종류나양등은이미검체의채집장소, 시기등에따라성분들의종류및함량의차이가크다고보고되어있음으로이를고려하여야할것임. 인용시주의사항 본과제는식약청용역사업으로인용시식약청주관부서의승인을득한후에인용하여야함. 주관부서연락처식품의약품안전청생약규격팀 ( 380 ~ 1730)

69 세부연구과제요약 과제번호 한약재 321 공개가능여부공개 / 비공개 주관과제명 제 1 세부과제명 한약재생리활성성분의분리및분석연구 금은화및인동으로부터한약재생리활성성분의분리 성명강삼식주민등록번호 연구책임자 소속기관명 서울대학교 전자우편전화번호 02) 연구목표 (400~600 자 ) 금은화및인동으로부터유효성분중심의한약재관리에필요한생리활성성분의분리, 확인하고 pattern인식법에의한기원별, 산지별한약재정보를구축하고자한다. 기원별, 산지별분석을위한표준품을제조, 공급하고, 차후연구를위한시료를확보하여제공하고자한다. 연구내용 (1000~1200 자 ) 인동및금은화의 70% EtOH extract를통상적인방법에따라분획을실시하여각각분획들을얻었다. 이들분획들에대하여각종크로마토그라피를반복실시하여인동의 CH 2 Cl 2 분획으로부터 trilinolein, hexacosanol, C16-C26의지방산혼합물, bis(2-ethylhexyl)phthalate (DOP) 같은 hydrocarbon alcohol 및지방산유도체들과, obtusifoliol, gramisterol, citrostadienol과같은 4α -methyl ergosterol 유도체들과, β-sitosterol 및 daucosterol같은 phytosterol유도체들을분리하여확인하였다. EtOAc분획도각종크로마토그라피를반복실시하여 β-sitosterol 및 daucosterol, triterpene계화합물들인 ursolic acid, pomolic acid, euscaphic acid 및 23-hydroxytormentic acid를분리확인하였고, iridoid인 loganin을분리하였다. BuOH분획으로부터는이미분리된 β -sitosterol 및 daucosterol, 지방산이외에 loganin과 secologanin dimethyl acetal들은분리하여확인하였다. 금은화의 EtOAc분획으로부터 β-sitosterol 및 daucosterol 이외에 flavonoid성분들인 luteolin, luteolin 7-O-glucoside과 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester와 caffeic acid, protocatechuic acid, azelaic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid 등을분리하였으며, CH 2 Cl 2 분획으로부터 hexacosanol을분리하여확인하였다. 따라서인동으로부터 16종, 금은화로부터 11종의화합물들을분리하였으며, 이들성분중인동으로부터분리된 triterpene계화합물들인 ursolic acid, pomolic acid, euscaphic acid 및 23-hydroxytormentic acid들과 4α-methyl ergosterol 유도체들인 obtusifoliol, gramisterol 및 citrostadienol 등과금은화로부터분리한 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester, azelaic acid 등은이식물로부터처음으로분리된화합물들임을알았다. 제2세부과제에 19종의화합물들을제공하였고, 인동의성분 12종, 금은화의성분 10종을제공하여활성평가를위한실험재료로제공하였다

70 연구성과 ( 응용분야및활용범위포함 ) (400~600 자 ) 인등및금은화이 70% EtOH엑스를제조하여이들을분획하고통상적인방법에따라성분분리를시도하여인동으로부터 16종, 금은화로부터 11종등총 27종의화합물들을분리하여이들의구조를확인하였다. 이들성분중인동으로부터분리된 triterpene계화합물들인 ursolic acid, pomolic acid, euscaphic acid 및 23-hydroxytormentic acid들과 4α-methyl ergosterol 유도체들인 obtusifoliol, gramisterol 및 citrostadienol 등은이식물로부터처음으로분리된화합물들이다. 또한금은화로부터분리한 4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester, azelaic acid 등도처음으로분리된화합물들이다. 분리된화합물들을동시분석법개발을위한시료 (18종) 및효능검색용시료 (22종) 로제공하였으며, 효능이확인된화합물들에대하여서는국가표준품으로이용가능하리라고사료된다. 현재까지의연구수행결과를종합하여인동및금은화의지표성분으로는각각 loganin 및 chlorogenic acid를포함하여 2차년도연구결과를검토하여각각 2-3종씩추가할예정이다. 참여연구원 성명주민등록번호성명주민등록번호강삼식김주선이은주정혜실김윤정이주영연민혜박수연김은혜 Keywords (5개내외 ) 한글 인동, 금은화, 활성성분분리 영문 Lonicera japoninca, Vine and Flower, Isolation, Bioactive components 주1) 연구목표, 연구내용, 연구성과를서술형으로기재 2) 국가연구개발사업 DB를통한공개를희망하지않는경우공개가능여부란에 공개불가 " 로표시 3) 연구성과는그간의연구결과및기대성과를서술 4) 세부과제가없을시작성하지않음 ( 세부과제별로작성 )

71 과제번호 한약재 321 공개가능여부공개 / 비공개 주관과제명 제 2 세부과제명 한약재생리활성성분의분리및분석연구 지표물질동시정성정량분석법개발및패턴분석 성명신종헌주민등록번호 연구책임자 소속기관명 서울대학교 전자우편전화번호 02) 연구목표 (400~600 자 ) 한방생약인금은화는국내의대표적인생약이며이에함유된대표적활성성분인플라보노이드와페놀화합물은항산화, 항균등의활성이보고되어있다. 그러나이들의함량은소재와유통공정별로상당한편차를나타내고있으며그약효가의문시되는경우가많아금은화에유래한신약의개발과고부가가치화를저해하고있다. 본연구과제는다양한조건에서의동태분석자료를토대로이들을효과적으로동시에정량및정성분석을가능케하는크로마토그래피분석법을개발하여금은화의품질규격화를위한자료를제공하고나아가한방생약의과학화를위한기초를제공하는것을목표로한다. 이를위하여금은화에함유된생약성분의정량및정성분석을위한 TLC, HPLC-DAD 및 LC-MS/MS 동시분석법개발및기원과산지별 20품목이상의한약재패턴인식 / 지문인식법에의한평가를한다. 연구내용 (1000~1200 자 ) 제1 세부과제로부터입수한 flavonoids (5종), phenolic compounds (4종) 및 iridoid (1종) 등 10종의활성성분의함량분석을위한기초실험을 thin layer chromatography로완료하였으며이들을동시에정성, 정량분석할 HPLC-DAD 조건을 gradient system에서확립하였고 specificity, detection limit, quantitation limit, accuracy, precision, robustness 등제반 validation parameters의측정으로이를검증하였고이를바탕으로금은화시료에대한실제적인적용을입증하였다. 또한 LC-MS/MS 상에서각각의화합물에대한최적분석조건을파악하였으며현재이들을동시에정성, 정량분석하는실험이진행중이다. 또한금은화활성성분의효과적인추출방법을추출용매, 추출방법, 시간등다양한조건하에서실험하여최적추출조건을확립하였다. 개발된추출방법을이용하여시중에유통되는금은화의지표물질함량에따른패턴인식 / 지문인식법에의한기원별, 산지별한약재평가를위하여 20종의시료를확보하여추출을완료하였고각시료별표준물질의농도분석을완료하였으며현재패턴분석이진행중이다

72 연구성과 ( 응용분야및활용범위포함 ) (400~600 자 ) 본연구결과로금은화의주요성분인플라보노이드와페놀계화합물의합리적이고효과적인동시정량및정성분석법이개발되었으며이방법이천연물분석의기본지표인 validation 의제반요소를모두충족시킴을입증하였다. 이로서체계적인천연물성분분석에의거한생약의과학화를위한기초자료의확보에성공하였고이는현재다양한생산조건과유통경로를통하여난립된금은화및금은화함유한방제제의실효적활성을모니터링하는근거를제공한것이다. 본연구결과는금은화를비롯한생약유래천연물의정량, 정성적지표를활용한생약성분의규격화및관리를위한기본자료로활용될것이며나아가생약의과학화를위한정책적인자료로도널리활용될것이다. 참여연구원 성명주민등록번호성명주민등록번호신종헌장경화송주은유성광 Keywords (5개내외 ) 한글 영문 금은화, 활성성분, 플라보노이드, 페놀화합물, 정성및정량분석, 패턴분석 Lonicera japonica flower buds, bioactive components, flavonoids, phenolics, qualitative & quantitative analyses, pattern analysis 주1) 연구목표, 연구내용, 연구성과를서술형으로기재 2) 국가연구개발사업 DB를통한공개를희망하지않는경우공개가능여부란에 공개불가 " 로표시 3) 연구성과는그간의연구결과및기대성과를서술 4) 세부과제가없을시작성하지않음 ( 세부과제별로작성 )

73 차년도연구개발사업계획

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75 총괄연구과제 1. 요약문 과제번호 한약재 321 연구과제명한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 주관연구책임자 성명강삼식소속서울대학교 전공 천연물화학 색인단어 국문생리활성성분, 함량분석, 패턴인식법, 지문인식, 표준품, 인동덩굴, 금은화 영문 bioactive component, assay, pattern recognition analysis, chemical fingerprint, control reference standard, Lonicera japonica 차년도연구개발목표 금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을대량분리하여분석용표준품및연구용시료로제공한다. Pattern 인식법에의한기원별, 산지별한약재정보를구축하고자함. 차년도연구개발내용및방법 금은화및인동의효능확인을위한성분들을대량제조공급하며, 아울러유효성분으로확인된 3 종이상의지표물질들에대한정량용표준품을제조하여공급한다. 한약재감별, LC/MS(MS), HPLC, DNA 분석연구팀및효능확인팀들과공조하여금은화및인동의대한정보를구축하고평가를도출한다. 분리한이들엑스및표준품들을이용하여 TLC, HPLC/UV 법에의한동시분석법을개발하고, 개발한방법에대한 validation 을수행한다. LC-MS(/MS) 법을이용하여기원별 / 산지별한약재 20 종이상에대한분석을실시하여 fingerprint analysis 를실시한다. 기대효과 ( 응용분야및활용방안 ) 금은화및인동의유효성분에대한표준품확보및활성검색을위한실험재료확보 금은화및인동의유효성분에대한분석법개발하고이를이용한기원별, 산지별한약재정보를구축및평가 금은화및인동의품질관리를유효성분위주로하므로서한약재의품질수준향상및안전성제고 금은화및인동의 dereplication 을위한기반기술구축 기능성식품과같은한약재관련산업의동반발전기대 한약재품질에대한국민의신뢰성제고

76 2. 연구개발비총괄표 1) 총괄용역연구원가계산서구비목 분 금액구성비비고 책임연구원 - 원 - % 연구원 24,089,390 원 15.1 % 인건비 연구보조원 30,095,310 원 18.8 % 보조원 - 원 - % 인건비소계 54,184,700 원 33.9 % 국내여비 2,925,400 원 1.8 % 직 여비 국외여비 - 원 - % 여비소계 2,925,400 원 1.8 % 경 접 비 유인물비 1,156,000 원 0.7 % 전산처리비 631,000 원 0.4 % 시약및재료비 90,165,660 원 56.4 % 직접비소계 94,878,060 원 59.3 % 비 간 접 회의비 2,950,000 원 1.8 % 임차료 - 원 - % 교통통신비 696,000 원 0.4 % 비 감가상각비 - 원 - % 간접비소계 3,646,000 원 2.2 % 일반관리비 7,291,240 원 4.6 % 총원가 160,000,000 원 100 % * 원가계산에의한예정가격작성준칙 ( 예산회계법회계예규 ) 을참고하여구체적으로기입하시기바랍니다. * 별첨 : 비목별산출내역 ( 비목별산정기준을참고하여작성제출 ) * 일반관리비 = [ 인건비 + 경비 ( 직접비 + 간접비 )] 의 5% 미만으로책정할것

77 2) 세부과제별용역연구비 ( 세부과제가없는경우 (1) ~ (4) 까지작성하지마십시오.) (1) 인건비 세부과제책임연구원연구원연구보조원보조원인건비소계 1 - 원 24,089,390 원 10,735,310 원 - 원 34,824,700 원 2 - 원 - 원 19,360,000 원 - 원 19,360,000 원 3 원원원원원 4 원원원원원 5 원원원원원 합계 - 원 24,089,390 원 30,095,310 원 - 원 54,184,700 원 비중 (%) - % 15.1 % 18.8 % - % 33.9 % * 인건비소계는책임연구원 + 연구원 + 연구보조원 + 보조원의합계임 (2) 직접비 ( 여비 ) 세부과제국내여비국외여비여비소계 1 1,938,600 원원 1,938,600 원 2 986,800 원원 986,800 원 3 원원원 4 원원원 5 원 원 원 합계 2,925,400 원 - 원 2,925,400 원 비중 (%) 1.8 % - % 1.8 % * 여비소계는국내여비 + 국외여비의합계임

78 (3) 직접비빛간접비 세부과제 유인물비 전산처리비 시약및재료비회의비임차료교통통신비 감가상각비 소계 1 1,075,00 0 원 631,00 0 원 53,990, ,000 원 - 원 36,175,200 원 2,650, 000 원 300,00 0 원 - 원 456,00 0 원 - 원 240,00 0 원 - 원 58,80 2,460 원 원 - 원 36,79 6,200 원 3 원원원원원원원원 4 원원원원원원원원 5 원원원원원원원원 합계 1,156,00 0 원 631,00 0 원 90,165,660 원 2,950,0 00 원 - 원 696,00 0 원 - 원 95,59 8,660 원 비중 (%) 0.7 % 0.4 % 56.4 % 1.8 % - % 0.4 % - % 59.7 % * 소계는유인물비 + 전산처리비 + 시약및재료비 + 회의비 + 임차료 + 교통통신비 + 감가상각비의합계임 (4) 일반관리비 세부과제금액총원가 1 4,434,240 원 100,000,000 원 2 2,857,000 원 600,000,000 원 3 원원 4 원원 5 원 원 합계 7,291,240 원 160,000,000 원 비중 (%) 4.6 % 100 % * 총원가는각세부과제별 (1) 합계 + (2) 합계 + (3) 합계 + 일반관리비를계산함

79 비목별산출내역 (1) 인건비 (54,184,700원) 직급 단가 참여개월 ( 월 ) 인원 ( 명 ) 참여율 (%) 계 책임연구원연구원 2,676, ,089,390 연구보조원 1,789, ,735, , ,360, , 보조원 (2) 경비 (98,524,060 원 ) 1 여비 (2,925,400 원 ) 국내여비 (2,925,400 원 ) 직급 인원수 ( 명 ) 왕복교통비일비 ( 일 ) 식비 ( 일 ) 숙박비 ( 야 ) 계 134,000( 서울부산 ) 108,000( 서우동대구 ) 20,000 9회 25,000 9일 46,000 4회 1 30,800( 서울안동 ) 1명 1명 1명책임연구원 60,200( 서울대전 ) 1 45,800 2회 20,000 2회 25,000 2일 46,000 2회 2일 2회 1일 134,000( 서울부산 ) 연구원 1 108,000( 서우동대구 ) 20,000 7회 20,000 7일 30,000 4회 30,800( 서울안동 ) 1명 1명 1명 60,200( 서울대전 ) 연구보조원 20,000 2회 20,000 2일 30,000 1회 2 30,800( 서울안동 ) 2명 2명 2명 2 45,800 2회 20,000 2회 20,000 2회 30,000 2회 2일 2일 1일 보조원 953, , , , ,

80 2 직접비 (91,952,660 원 ) 유인물비 (1,156,000 원 ) 항목 단가 수량 금액 복사용지 25,000 5box 125,000 CD 10, ,000 인쇄비 50 10, ,000 도서구입비 200,000 2회 400,000 복사비용 30 2,700 81,000 전산처리비 (631,000 원 ) 품목 단가 수량 금액 레이저프린터토너 100, ,000 잉크 ( 흑 ) 42, ,000 잉크 ( 칼라 ) 47, ,000 시약및재료비 (90,165,660원) - 시험분석료 7,427,500원 NMR (500 MHz) 232,500원 15회 = 3,487,500원 FAB mass 34,000원 10회 = 340,000원고해상 NMR 사용료 : 20,000원 50 시간 = 1,000,000원고해상질량분석료 : 60,000원 10개 = 600,000원 LC tandem MS사용료 : 50,000원 40일 = 2,000,000원 품 명 규격 단위 수량 단가 ( 천원 ) 금액 ( 천원 ) 비고 증류flask 1,000ml 개 삼각flask 50ml , ml ,000ml column 5cm cm pasteur pipette 230mm box vial 5ml 500개 /box ,170 모세관 box ,440 CHCl 3 EP 18l ,

81 품 명 규격 단위 수량 단가 ( 천원 ) 금액 ( 천원 ) 비고 MeOH EP 18l ,320 EtOAc " " ,350 BuOH " " hexane " " ,400 CH 2 Cl 2 " " ,470 cyclohexane " " benzene " " HCl " " MeOH HPLC용 4l acetonitrile " 4l toluene EP l tert-buoh EP l EtOAc EP l HOAc EP l 무수 CaCl 2 " kg TLC plate 5715 box ,720 역상TLC plate box ,540 silica gel 7734 kg ,280 silica gel 9385 kg silica gel blue kg polyamide C g packing material C , 50μl 500g 4 2,275 9,100 MCI gel 100ml ,430 Sephadex LH20 500g ,190 분액여두 250ml 개 분액여두 3,000ml " funnel 9cm " cm " 증류flask 250ml " ml " ml "

82 품명규격단위수량단가 ( 원 ) 금액 ( 원 ) 비고 Hexane 18 L bt 24 50,000 1,200,000 Acetone 18 L bt 32 30, ,000 Acetonitrile 18 L bt 8 65, ,000 Methylene chloride 18 L bt 12 80, ,000 EtOAc 18 L bt 32 45,000 1,440,000 MeOH 18 L bt 20 40, ,000 n-buoh 1 L bt 80 7, ,000 Dry ice 30 Kg ea 32 25, ,000 N2 gas tank ea 24 20, ,000 Compressed air tank ea 24 15, ,000 Pipette 1 mlx100 box 2 50, ,000 Pipette 5 mlx200 box 4 75, ,000 Pipette 10 mlx200 box 4 75, ,000 HPLC column ODS 1x25 cm ea 1 1,300,000 1,300,000 HPLC column CN 1x25 cm ea 1 1,300,000 1,300,000 HPLC column silica 1x25 cm ea 1 900, ,000 HPLC guard column 1x3 cm set ,000 1,500,000 Silica gel 60 F x20 cm box 8 70, ,000 ODS Si-gel 60 F 254 5x20 cm box 9 120,000 1,080,000 Silica F kg bt 6 80, ,000 YMC-ODS gel 1 kg bt 1 1,600,000 1,600,000 Sephadex LH g bt 1 600, ,000 Vial 4 dram box 20 40, ,000 Vial 2 dram pack 8 60, ,000 Vial 1 dram pack 8 60, ,000 Cryogenic vial 5 ml box 4 150, ,000 Rotavapor trap Buchi ea 1 900, ,000 Rotavapor seal Buchi pack 4 60, ,000 Dry ice condenser Buchi ea 1 950, ,000 Pear-shape flask 100 ml ea 50 15, ,000 Pear-shape flask 50 ml ea 50 13, ,000 Pear-shape flask 25 ml ea 50 13, ,000 Round bottom flask 1 L ea 20 40, ,000 Round bottom flask 500 ml ea 20 27, ,000 Round bottom flask 250 ml ea 20 25, ,000 Erlenmeyer flask 4 L ea 10 35, ,000 Erlenmeyer flask 1 L ea 30 15, ,000 Erlenmeyer flask 500 ml ea 30 10, ,000 Pasteur pipette box 24 20, ,000 Glass filter 5 L ea 1 300, ,000 Suction flask 4 L ea 6 50, ,

83 품명규격단위수량단가 ( 원 ) 금액 ( 원 ) 비고 Separatory funnel 4 L ea 4 60, ,000 NMR tube 5 ea bx ,000 1,300,000 Syringe 0.5 ml ea 6 50, ,000 Spartan filter bx 2 150, ,000 Sep-Pak filter bx 5 180, ,000 NaCl 1 Kg bt 8 12,000 96,000 NaHCO 3 1 Kg bt 8 32, ,000 MgSO 4 1 Kg bt 8 25, ,000 CaCl 2 1 Kg bt 8 15, ,000 Foil, wrap 등일반소모품 243,200 합계 32,575,200 3 간접비 (3,646,000 원 ) 회의비 (2,950,000 원 ) 내역 1회경비 횟수 금액 자문료 200,000 2인 2회 800,000 수당 70,000 5인 1회 350,000 식음료대 20,000 5인 4회 400,000 학회참가비 50,000 8인 2회 800,000 논문게재비 300,000 2회 600,000 교통통신비 (696,000 원 ) - 우편료 1,750원 30부 8회 = 420,000원 - 택배료 12,000원 3회 = 36,000원 - 우편료 20,000 원 12 월 = 240,000 원 (3) 일반관리비 (7,291,240 원 ) [ 인건비 (34,824,700 원 )+ 경비 (60,741,060 원 ) 4.64% = 4,434,240 원 ( 제 1 세부 ) [ 인건비 (19,360,000 원 )+ 경비 (37,783,000 원 ) 5.00% = 2,857,000 원 ( 제 2 세부 )

84 3. 연구책임자인적사항및학 경력 선정당시연구사업계획서와다를경우만작성 (1) 인적사항 성명 국문 영문 전공 소속 기관명직위전화 법인등록번호 사업자등록번호 직장휴대전화 주소 FAX 주민등록번호전자우편 (2) 학력 연도학교 ( 대학교, 단과대, 과 ) 학위부터까지대학교단과대학과전공명코드 최종학위논문명 학위코드 ( 택 1) : 1. 학사, 2. 석사과정, 3. 석사, 4. 박사과정, 5. 박사 (3) 경력 부터 연도 까지 기관직위 ( 직명 ) 비고 (4) 연구수행실적총괄 ( 최근 3 년간 ) 연구비수혜실적 수행중인연구과제 저서연구논문발표 국외국내 SCI 비 SCI 기타 건과제편편편편편

85 (5) 주요정책연구연구비수행실적 ( 최근 3 년간, 우선순위 10 과제 ) 연구과제명역할 연구비연구기간 금액지원기관부터까지 원 논문발표학술지명 역할코드 : 책임연구원 : 1, 연구원 : 2 (6) 저서실적 ( 최근 3 년간 ) 발행년도저서명츨판사발행지비고 발행지코드 : 국내 : 1, 국외 : 2 (7) SCI 연구논문발표실적 ( 최근 3 년간 ) 연구과제명 연구기간 부터 까지 연구논문발표지명 발행년도 역할 연구비지원기관 * 연구논문발표학술지는국외, 국내순서로기재하여주십시오. 역할코드 : 책임자 : 1, 연구원 : 2 (8) 수행중및수행예정연구과제 과제명지원기관연구비 부터 기간 까지 역 할 원 역할코드 : 책임연구원 : 1, 연구원 : 2 (9) 본연구와동일한또는유사한과제를타기관에신청하였을경우 신청대상기관 연구기간부터까지 참여역할신청연구비 역할코드 : 책임연구원 : 1, 연구원 :

86 4. 참여연구원편성표 1) 연구책임자인적사항및학 경력 ( 선정당시연구사업계획서와다를경우만작성 ) (1) 인적사항 성명 국문 영문 전공 소속 기관명직위전화 법인등록번호 사업자등록번호 직장휴대전화 주소 FAX 주민등록번호전자우편 (2) 학력 연도학교 ( 대학교, 단과대, 과 ) 학위 부터까지대학교단과대학과전공명 코드 최종학위논문명 학위코드 ( 택 1) : 1. 학사, 2. 석사과정, 3. 석사, 4. 박사과정, 5. 박사 (3) 경력 부터 연도 까지 기관직위 ( 직명 ) 비고 (4) 연구수행실적총괄 ( 최근 3 년간 ) 연구비수혜실적 수행중인연구과제 저서연구논문발표 국외국내외국학술지국내학회지기타 건과제편편편편편 (5) 연구비수행실적 ( 최근 3 년간 )

87 연구과제명역할 연구비연구기간 금액지원기관부터까지 원 논문발표학술지명 역할코드 : 책임연구원 : 1, 연구원 : 2 (6) 저서실적 ( 최근 3 년간 ) 발행년도저서명츨판사발행지비고 발행지코드 : 국내 : 1, 국외 : 2 (7) 연구논문발표실적 ( 최근 3 년간 ) 연구과제명 연구기간 부터 까지 연구논문발표지명 발행년도 역할 연구비지원기관 * 연구논문발표학술지는국외, 국내순서로기재하여주십시오. 역할코드 : 책임자 : 1, 연구원 : 2 (8) 수행중및수행예정연구과제 과제명지원기관연구비 부터 기간 까지 역 할 원 역할코드 : 책임연구원 : 1, 연구원 : 2 (9) 본연구와동일한또는유사한과제를타기관에신청하였을경우 신청대상기관 연구기간부터까지 참여역할신청연구비 역할코드 : 책임연구원 : 1, 연구원 :

88 2) 참여연구원편성표 (1) 참여연구원편성표 세부과제 주관연구책임자 : 강삼식 역할성명주민등록번호소속기관부서 책임연구원 연구원 인건비지급 참여율 (%) 강삼식서울대학교약학대학 김주선서울대학교약학대학 산학연구분 1 연구보조원 보조원 이은주 서울대학교 약학대학 정혜실 서울대학교 약학대학 이주영 서울대학교 약학대학 연민혜 서울대학교 약학대학 박수연 서울대학교 약학대학 김은혜 서울대학교 약학대학 책임연구원 신종헌서울대학교약학대학 연구원 연구보조원 보조원 장경화 서울대학교 약학대학 송주은 서울대학교 약학대학 유성광 서울대학교 약학대학 책임연구원 3 연구원 연구보조원 보조원 * 세부과제가있는경우주관연구책임자가제1세부과제책임자이어야한다. 학위코드 : 박사 (1) 박사수료 (2) 박사과정중 (3), 석사 (4), 석사수료 (5), 석사과정중 (6), 학사 (7), 전문학사 (8), 기타 (9) 인건비지급코드 : 지급 : 1, 미지급 : 2 산학연구분코드 : 산 (1), 학 (2), 연 (3)

89 참여연구원 학계 12 명총참여연구자 12 명 연구계 0 명책임연구원 2 명연구원 1 명 산업계 0 명연구보조원 9 명보조원명 * 위표의참여연구원에는주관연구책임자를모두포함하여계상함. (2) 다른기관에서수행중인연구과제참여율 ( 정확하게기입할것 ) 이름주민등록번호수행기관과제명비율 (%) 역할 역할코드 : 연구책임자 : 1, 연구원 : 2 5. 총괄연구과제의차년도연구개발목표 금은화및인동으로부터유효성분중심의한약재관리에필요한생리활성성분의분리, 확인및이들생리활성성분을이용한 HPLC/UV 및 LC-MS(MS) 법에의한동시분석법을개발하고 pattern인식법에의한기원별, 산지별한약재정보를구축하고자한다. 분석을위한표준품을제조, 공급하고, 차후연구를위한시료를확보하여제공하고자한다. 이를위하여 2차년도에는금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을대량분리하여분석용표준품및연구용시료로제공한다. 금은화및인동활성성분의효과적인정성정량분석법확립, 순도결정및 5성분이상의지표물질동시분석법개발과산지기원에따른 20품목이상의시료에대한패턴인식 / 지문인식법에의한한약재평가완료한다. 6. 총괄연구과제의차년도연구개발계획 - 연구내용 금은화및인동의효능확인을위한성분들을대량제조공급하며, 아울러유효성분으로확인된 3종이상의지표물질들에대한정량용표준품을제조하여공급한다. 한약재감별, LC/MS(MS), HPLC, DNA분석연구팀및효능확인팀들과공조하여금은화및인동의대한정보를구축하고평가를도출한다. 1차년도에진행중인금은화활성성분의 TLC finger-printing, HPLC-UV 및 LC-MS/MS 분석을완료하고효능검색에의하여선정된지표물질의패턴분석을완료한다. 1차년도에이어인동유래활성성분의함량분석을위한 5종이상정성, 정량적으로검색할 liquid chromatography 조건의파악 ( 표준시료를이용한표준검정곡선의분석, 회기계수의도출, LC (DAD detector) 및 LC-MS/MS 조건각각파악 ) 인동생약재료로부터활성성분의다양한추출방법 ( 물중탕법, sonication법, reflux법, vortex법등 ) 을비교분석하고, 분석법의 validation을확립

90 시중에유통되는인동생약약재 20품목이상의한약재에대해기원별, 산지별분석을하고, 패턴인식 / 지문인식법등에의한한약재평가 - 연구방법 1. 금은화및인동의효능확인을위한성분들을대량제조공급하기위하여 1차년도에확립된분석법을활용하여분리한다. 2. 금은화및인동의유효성분으로확인된 3종이상의지표물질들에대한정량용표준품을제조하여규격서를작성한후이들을공급한다. 3. 한약재감별, LC/MS(MS), HPLC, DNA분석연구팀및효능확인팀들과공조하여금은화및인동의대한정보를구축하고평가를도출한다. 1) 1차년도에진행중인금은화시료 20종의제반표준물질함량분석및패턴분석의완료 2) 1차년도에분석한 10종의화합물중에서효능이입증된지표물질을선정하여이들에대한제반분석을완료 3) 검체 5종이상에대한지표물질의 TLC fingerprinting 분석 4) 인동유래활성성분의최적의분리, 분석실험 5) 확보한생약재료로부터활성성분의다양한추출방법비교분석 ( 물중탕법, sonication법, reflux법, vortex법등 ) 6) 인동의활성성분을동시에 5종이상정성, 정량적으로검색할 liquid chromatography 조건의개발 ( 표준시료를이용한표준검정곡선의분석, 회기계수의도출, LC (DAD detector) 및 LC-MS/MS 조건각각파악 ) 7) 위과정에서개발한분석방법의실제적적용범위검증 (20품목이상의시료에적용 ) 8) 인동유래활성물질의벨리데이션완료 (DAD detector를활용한 LC 분석, 시료간함량분석 ) 9) 시중에유통되는인동한약재 20품목이상의정량분석 10) 패턴인식 / 지문인식법에의한기원별, 산지별분석후평가 * 표준분석법은다음의각요인을만족시켜야함 (LC 및 LC-MS-MS). 1) 생리활성성분분석조건 MS/(MS) 조건확립 - 각성분에극성에따라 ESI(electrospray ionization) 와 APCI(atmospheric pressure chemical ionization) ion source 중검출이잘되는조건선택 - 각성분의산도, 염기도와이동상의 ph, 산의종류, 농도등에따라 (+) ion mode 또는 (-) ion mode 선택 - LC/MS 분석시 SIM (selected ion monitoring) mode로분석하며, 이때각성분별로 ion의

91 response 나 specificity를고려하여최적의 ion 선택 - LC/MS/MS 분석시 MRM(multiple reaction monitoring) mode 로분석하며, 이때각성분별로 collision cell에서강도를조절하여 product ion의 response나 specificity를고려하며, 최적의 precursor/product ion pair를선정 - 각성분별로 ion source와 ion detection polarity가결정되면 LC/MS(/MS) 의 Curtain gas, Collision gas, Ion spray Temp., Ion spray Voltage, Declustering potential, Entrance potential 등과같은파라미터를최적화하여, 각성분채널별로최적의감도와분리능을갖도록조건을설정. HPLC 조건확립 - 이동상은유기용매의종류와조성, 기울기용리유무, 완충용액의 ph, buffer 농도, 유량등을변화시켜가며동시에유효성분들을분석할수있는최적의조건을결정. - 컬럼은 C18, C8, CN, NH2 컬럼과기타특수컬럼등을검토하여최고의감도와분리능을보이는것으로선정. - 기타컬럼온도와주입량등에따른분리능변화도검토함. 2) 분석법 Validation 확립 Specificity ( 특이성 ) - Specificity는다른성분이존재할때분석물만을명확하게식별 (assess) 해낼수있는능력을의미하며, 확인시험, 순도시험및정량시험에서특이성을입증. - 특이성을입증하기위하여개개의성분들이적절히표시된크로마토그램을제시. Linearity ( 직선성 ) - Linearity는 ( 주어진범위에서 ) 시료중의분석물농도 ( 양에직접비례하는분석결과를얻을수있는능력을의미하며, 직선관계는분석과정의전범위에걸쳐평가. - 직선성은주어진과정에따라표준 stock solution을희석하여각활성물질에대하여평가. - 분석시그널을분석대상물질의농도또는함량에대한함수로작성한플롯을시각적으로검사하여직선성을평가. - 상관계수 (correlation coefficient), y -절편, 회귀직선의기울기를첨부자료에기재. Range( 범위 ) - 범위는직선성평가시결정하며, 규정하는범위내또는그범위의양극의농도를포함한검체를이용하여분석법의직선성, 정확성및정밀성을확인함으로써범위의타당성을입증. - 여기에서얻은내부표준물질의피크면적에대한작약의각생리활성성분의피크면적비를가지고검량선을작성한다. 하루에실험을 5번시행하여일내재현성을구하고 5일간실험을행하여일간재현성증명. Accuracy ( 정확성 )

92 - 정확성은규정된범위를포함하여최소한 3농도에대해서분석법의전조작을각농도당 3 회씩반복측정한결과로부터평가. - 정확성은기지량의분석대항물질을첨가하여회수율 (%) 측정. Precision( 정밀성 ) - 규정된범위를포함한 3 농도에대해서분석법의전조작을각농도 3회씩반복측정하여상대표준편차 ( 변동계수 ) 계산. Detection limit ( 검출한계 ) - 시그널 (signal) 대노이즈 (noise) 에근거하는방법 : 시그널대노이즈비는기지의저농도분석대상물질을포함한검체의시그널과공시험검체의시그널을비교하여구하고, 일반적으로 3~2 : 1의시그널대노이즈비가산출되는분석대상물질의최저농도를검출한계로규정. - 반응의표준편차와검량선의기울기에근거하는방법 : DL= 3.3*δ/S 여기서 δ는반응의표준편차를, S는검량선의기울기를말한다. 기울기 S는분석대상물질의검량선으로부터산출. - 시그널대노이즈비에의해검출한계를결정할경우에는그타당성을입증할수있는크로마토그램을제출. Quantitation limit( 정량한계 ) - 시그널 (signal) 대노이즈 (noise) 에근거하는방법 : 시그널대노이즈비는기지의저농도분석대상물질을포함한검체의시그널과공시험검체의시그널을비교하여구하고, 일반적으로 10:1의시그널대노이즈비가산출되는분석대상물질의최저농도를정량한계로규정. - 반응의표준편차와검량선의기울기에근거하는방법 : DL= 10*δ/S 여기서 δ는반응의표준편차를, S는검량선의기울기를말한다. 기울기 S는분석대상물질의검량선으로부터산출. Robustness( 완건성 ) - 완건성은분석법을개발하는단계에서수행하며, 분석조건을고의로변동시켰을때의분석법의신뢰성을평가. - 측정값이분석조건변경에따라영향을받기쉬운경우라면, 분석조건을적절히조정하거나분석법중에사전조심문구를포함. - 완건성을평가함에따라시스템적합성에관한일련의파라미터를확립. - 액체크로마토그래프법의대표적인다음의변동인자에대한완건성평가 이동상의 ph 이동상조성 (composition) 의변경 컬럼의변경 (different lots or suppliers)

93 온도 유속등 System suitability test( 시스템적합성시험 ) - tailing factor, capacity factor, theoretical Plates, resolution 등의 parameter 를평가. 7. 연차 / 단계별연구수행일정 연구개발추진내용 제 1 세부과제 - 인동 / 금은화의추출 - 산지별 / 기원별한약재의 70% EtOH 엑스제조 - 분획 - 분리및정제 - 구조결정 - 대량분리 - 표준품확보및규격서작성 - 정보구축및평가도출제 2 세부과제 - 금은화유래활성성분의패턴분석을위한기초실험 (TLC, 추출법비교 ) - 금은화활성성분의동시정성및정량분석법개발 (HPLC-DAD, LC-MS/MS) - 한약재금은화의패턴분석 / 지문인식법에의한한약재평가 (20 품목 ) - 인동유래활성성분의패턴분석을위한기초실험 (TLC, 추출법비교 ) - 인동활성성분의동시정성및정량분석법개발 (HPLC-DAD, LC-MS/MS) - 한약재인동의패턴분석 / 지문인식법에의한한약재평가 (20 품목 ) 및약전수록 연구개발연차 1 차년 2 차년

94 ( 2 ) 차년도연구수행일정 연구내용월별추진일정비고 제 1 세부과제 인동 / 금은화의추출 산지별 / 기원별한약재의 70% EtOH 엑스제조 분획 분리및정제 구조결정 대량분리 표준품확보및규격서작성 정보구축및평가도출 제2세부과제 금은화활성성분의정성및정량분석법개발 (LC-MS/ MS) 완료 금은화의패턴분석 / 지문인식법에의한한약재평가 (20품목) 완료 인동유래활성성분의패턴분석을위한기초실험 (TLC, 추출법비교 ) 인동활성성분의동시정성정량분석법개발 (HPLC- DAD, LC-MS/MS) 인동의패턴분석 / 지문인식법에의한한약재평가 (20품목) 금은화와인동지표물질의약전수록자료제출 추진진도 ( % ) 연구비 ( 백만원 ) 10, , , , , 160, 첨부서류

95 - 93 -

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111 제 1 세부연구과제 세부과제명 : 금은화및인동으로부터한약재생리활성성분의분리세부과제책임자 : 강삼식 / 서울대학교 / 천연물화학

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113 1. 요약문 과제번호 한약재 321 총괄과제명한약재생리활성성분의분리및분석연구 ( 금은화, 인동 ) 주관연구책임자세부과제명세부연구책임자 성명강삼식주민등록번호직위교수소속서울대학교금은화및인동으로부터한약재생리활성성분의분리성명강삼식주민등록번호직위교수소속서울대학교 색인단어 국문인동, 금은화, 성분분리, 표준품 영문 bioactive component, isolation, reference standard, Lonicera japonica 차년도연구목표 금은화및인동의효능확인을위한성분들을대량제조공급하며, 아울러유효성분으로확인된 3종이상의지표물질들에대한정량용표준품을제조하여공급한다. 차년도연구개발내용및방법 1. 금은화및인동의효능확인을위한성분들을대량제조공급하기위하여 1차년도에확립된분석법을활용하여분리한다. 2. 금은화및인동의유효성분으로확인된 3종이상의지표물질들에대한정량용표준품을제조하여규격서를작성한후이들을공급한다. 3. 한약재감별, LC/MS(MS), HPLC, DNA분석연구팀및효능확인팀들과공조하여금은화및인동의대한정보를구축하고평가를도출한다. 기대효과 ( 응용분야및활용방안 ) 금은화및인동의유효성분에대한표준품확보및활성검색을위한실험재료확보 금은화및인동의유효성분에대한분석법개발하고이를이용한기원별, 산지별한약재정보를구축및평가 금은화및인동의품질관리를유효성분위주로하므로서한약재의품질수준향상및안전성제고 금은화및인동의 dereplication을위한기반기술구축 기능성식품과같은한약재관련산업의동반발전기대 한약재품질에대한국민의신뢰성제고

114 2. 차년도연구개발비총괄표 ( 제 1 세부과제 ) 1) 총괄용역연구원가계산서구비목 분 금액구성비비고 책임연구원 - 원 % 연구원 24,089,390 원 24.1 % 인건비 연구보조원 10,735,310 원 10.7 % 보조원 - 원 % 인건비소계 34,824,700 원 34.8 % 국내여비 1,938,600 원 1.9 % 직 여비 국외여비 - 원 % 여비소계 1,938,600 원 1.9 % 경 접 비 유인물비 1,075,000 원 1.1 % 전산처리비 631,000 원 0.6 % 시약및재료비 53,990,460 원 54.0 % 직접비소계 57,635,060 원 57.6 % 비 간 접 회의비 2,650,000 원 2.7 % 임차료 - 원 % 교통통신비 456,000 원 0.5 % 비 감가상각비 - 원 % 간접비소계 3,106,000 원 3.2 % 일반관리비 4,434,240 원 4.4 % 총원가 100,000,000 원 100 % * 원가계산에의한예정가격작성준칙 ( 예산회계법회계예규 ) 을참고하여구체적으로기입하시기바랍니다. * 별첨 : 비목별산출내역 ( 비목별산정기준을참고하여작성제출 ) * 일반관리비 = [ 인건비 + 경비 ( 직접비 + 간접비 )] 의 5% 미만으로책정할것

115 비목별산출내역 (1) 인건비 (34,824,700원) 직급 단가 참여개월 ( 월 ) 인원 ( 명 ) 참여율 (%) 계 책임연구원연구원 2,676,599원 10월 1명 90% 24,089,390 원 연구보조원 1,789,219원 10월 2명 30% 10,735,310원 보조원 (2) 경비 (60,741,060 원 ) 1 여비 (1,938,600 원 ) 국내여비 (1,938,600 원 ) 직급 인원수 ( 명 ) 책임연구원 1 연구원 1 왕복교통비일비 ( 일 ) 식비 ( 일 ) 숙박비 ( 야 ) 계 134,600( 서울부산1) 108,000( 서울동대구1) 30,800( 서울안동2) 60,200( 서울대전1) 134,600( 서울부산1) 108,000( 서울동대구1) 30,800( 서울안동1) 60,200( 서울대전1) 연구보조원 2 30,800( 서울안동 ) 보조원 20,000 9회 1 25,000 9일 1 46,000 4회 1 명명명 20,000 7회 1 20,000 7일 1 30,000 3회 1 명명명 20,000 2회 2 20,000 2회 2 30,000 1회 2 명명명 953, , ,600 2 직접비 (55,696,460 원 ) 유인물비 (1,075,000 원 ) 항목 단가 수량 금액 복사용지 25,000 5box 125,000 CD 10, ,000 인쇄비 50 10, ,000 도서구입비 200,000 2회 400,

116 전산처리비 (631,000 원 ) 품목 단가 수량 금액 레이저프린터토너 100, ,000 잉크 ( 흑 ) 42, ,000 잉크 ( 칼라 ) 47, ,000 시약및재료비 (53,990,460 원 ) 품 명 규격 단위 수량 단가 ( 천원 ) 금액 ( 천원 ) 비고 MeOH EP 18l ,320 EtOAc " " ,350 BuOH " " hexane " " ,400 CH 2 Cl 2 " " ,470 cyclohexane " " benzene " " HCl " " MeOH HPLC용 4l acetonitrile " 4l toluene EP l tert-buoh EP l EtOAc EP l HOAc EP l 무수 CaCl 2 " kg TLC plate 5715 box ,720 역상TLC plate box ,540 silica gel 7734 kg ,280 silica gel 9385 kg silica gel blue kg polyamide C g packing material C , 50μl 500g 4 2,275 9,100 MCI gel 100ml ,430 Sephadex LH20 500g ,190 분액여두 250ml 개 분액여두 3,000ml " funnel 9cm " cm " 증류flask 250ml " ml " ml "

117 품 명 규격 단위 수량 단가 ( 천원 ) 금액 ( 천원 ) 비고 증류flask 1,000ml 개 삼각flask 50ml , ml ,000ml column 5cm cm pasteur pipette 230mm box vial 5ml 500개 /box ,170 모세관 box ,440 CHCl 3 EP 18l ,010 - 시험분석료 3,827,500 원 NMR (500 MHz) FAB mass 232,500원 15회 = 3,487,500원 34,000원 10회 = 340,000원 3 간접비 (3,106,000 원 ) 회의비 (2,650,000 원 ) 내역 1회경비 횟수 금액 자문료 200,000 2인 2회 800,000 수당 70,000 5인 1회 350,000 식음료대 20,000 5인 4회 400,000 학회참가비 50,000 5인 2회 500,000 논문게재비 300,000 2회 600,000 교통통신비 (456,000 원 ) - 우편료 1,750원 30부 8회 = 420,000원 - 택배료 12,000원 3회 = 36,000원 (3) 일반관리비 (4,434,240 원 ) [ 인건비 (34,824,700 원 )+ 경비 (60,741,060 원 ) 4.64% = 4,434,240 원

118 3. 제 1 세부연구과제의당해연도연구개발목표 금은화및인동으로부터주성분들을포함한활성성분들을대량분리하여연구용시료로제공한다. 이중각한약재로부터 3종이상의표준품들을제조하여분석용표준품으로확보한다. 4. 제 1 세부연구과제의당해연도연구개발계획 - 연구내용금은화및인동의효능확인을위한성분들을대량제조공급하며, 아울러유효성분으로확인된 3종이상의지표물질들에대한정량용표준품을제조하여공급한다. 한약재감별, LC/MS(MS), HPLC, DNA분석연구팀및효능확인팀들과공조하여금은화및인동의대한정보를구축하고평가를도출한다. - 연구방법 1. 금은화및인동의효능확인을위한성분들을대량제조공급하기위하여 1차년도에확립된분석법을활용하여분리한다. 2. 주성분이많이함유되어있는극성분획을중점적으로수행하여유효성분들을분리정제한다

119 2.1. 인동으로부터성분의분리 가. 인동 CH 2 Cl 2 분획의 column chromatography (a) - β-sitosterol major part (b) - ursolic acid major part (c) - β-sitosterol glucoside major part 상기 chromatogram상에서 (1) 부분은 subfraction C-4146으로 SiO 2 column chromatography를실시하여 hexane-etoac (gradient) 로용출시켜얻은분획들을다시 SiO 2 column chromatography에걸어 CHCl 3 :MeOH:H 2 O=7:0.5:0.5로용출시켜순수물질을얻는다. (2) 위치는 subfraction C-4754에해당하는분획으로 SiO 2 column chromatography 을실시하여 hexane-etoac (gradient) 로용출시켜얻은분획들을다시 SiO 2 column chromatography에걸고 CHCl 3 :MeOH:H 2 O=7:0.5:0.5로용출시켜순수물질을얻는다. (3) 위치는 subfraction C-6064으로 SiO 2 column chromatography에걸어 hexane-etoac (gradient) 로용출시켜얻은소분획들을다시 SiO 2 column chromatography에걸어 CHCl 3 :MeOH:H 2 O=7:1:0.5로용출시켜순수한성분들을분리할예정이다. (4) 위치는 subfraction C-6670으로위와마찬가지로 SiO 2 column chromatography에걸어 hexane-etoac (gradient) 시켜얻은소분획들을다시 SiO 2 column chromatography에걸고 CHCl 3 :MeOH:H 2 O=7:1:0.5로용출시켜정제할예정이다

120 나. 인동 EtOAc 분획의 column chromatography 상기 chromatogram상에서이미분리한화합물들을지표물질로사용하여 TLC한결과 (1) β-sitosterol, (2) pomolic acid, (3) ursolic acid, (4) β-sitosterol glucoside, (5) 19αhydroxyasitic acid, (6) Loni(V)-E A, (7) loganin으로확인되었다. 따라서이 EtOAc분획을 column chromatography를실시하여얻은소분획들인 E-91101분획과 E 분획은각각다시 SiO 2 column chromatography에걸어 CHCl 3 :MeOH:H 2 O=7:0.5:0.5로용출시켜순수물질을얻을예정이다. 또한소분획 E 와 E 도각각 SiO 2 column chromatography에걸어물포화etoac-meoh (gradient) 로용출시켜이들소분획들에함유되어있는성분들을분리할예정이다

121 다. 인동 BuOH 분획의 column chromatography (1) - Loganin major part (2)~(4) - iridoid 추정부분 (5) - other compounds (6) - saponin 추정부분 상기 chromatogram상에서 (1) 부분은 subfraction B-4052에해당한다. 주성분으로알려진 loganin으로 TLC에서확인할수있으며이를 SiO 2 column에걸고 EtOAc:MeOH:H 2 O=100:16.5:13.5로용출시켜얻은조loganin을다시 RP-18 column에걸어 MeOH:H 2 O 로용출시켜재결정하여순수한 loganin을분리할예정이다. (2) 부위는 subfraction B-1820에해당하는소분획으로 SiO 2 column에걸고물포화etoac-meoh (gradient) 로용출시킨후얻은소분획들을다시 RP-18로역상 column에걸고meoh:h 2 O 로용출시켜정제시킨다. (3) 및 (4) 부위는각각 subfraction B-2429와 B-3036에해당하며각각 SiO 2 column에걸고물포화etoac-meoh (gradient) 로용출시켜얻은소분획들을다시 RP-18 역상칼람에걸고 MeOH:H 2 O로용출시켜정제시킨다. (5) 부위는소분획 B-5865에해당하며SiO 2 column에걸고 EtOAc:MeOH:H 2 O=100:16.5:13.5로용출시켜얻은소분획들을다시 RP-18을사용하여역상 column에걸고 MeOH:H 2 O 용매로용출시켜얻은소분획들을재결정시켜순수한물질들을얻는다. (6) 부위는 saponin에해당하는부위로 subfraction B-7577에해당하며 SiO 2 column에걸고 EtOAc:MeOH:H 2 O=100:16.5:13.5 혼합용매를사용하여용출시킨후 RP-18 역상칼람에재칼람을실시하여 MeOH:H 2 O를사용하여용출시켜얻은소분획들을재결정을반복시켜순수 saponin성분들을분리할예정이다

122 2.2. 금은화로부터성분의분리가. 금은화 hexane 및 CH 2 Cl 2 분획의 column chromatography 금은화의 CH 2 Cl 2 분획은현재 SiO 2 column chromatography를실시중에있다. 이 CH 2 Cl 2 분획의 TLC chromatogram은금은화의 hexane 분획과매우유사하므로 column chromatography가끝나면정리하여이결과를활용하여 hexane분획의분리유무를결정하고자한다. 나. 금은화 EtOAc 분획의 column chromatography 소분획 E-2 (1.5 g) 에대하여 hexane/etoac의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E-2(5) 로부터화합물을정제중에있다. 소분획 E-9(38) 를재결정 ( 용매 : CH 2 Cl 2 + MeOH) 을반복하여화합물을 (2 mg) 을얻었다. 소분획E-12-3(17-22) (848 mg) 에대하여 EtOAc : MeOH: H 2 O = 100:4:3 100:8:6 100% MeOH의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E-12-3(17-22)4 (19 mg) 을얻었으며, 소분획 E-12-3(23-26) (1.65 g) 에대하여 EtOAc : MeOH: H 2 O = 100:4:3 100:8:6 100% MeOH의용출용매로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여얻어진소분획 E-12-(3)23-26(5-9) (238 mg) 을분리하였다. 분리된화합물들의화학구조를구명중에있다

123 또한상기 chromatogram상에서 E-12(3)17-22(2) 의주성분은 TLC를수행한결과화합물 10과 12이므로 silica gel (Merck no. 7729) column chromatography를실시하여 CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O=7:1.2:0.5 7:1.5:0.5 7:2:0.5 7:3:1 100% MeOH의순서로순차적으로용출시켜얻은소분획들을정제하여이를화합물들을분리할예정이다. 마찬가지로소분획 E-12(26-31) 도 silica gel (Merck no. 7729) column에걸고 EtOAc:MeOH:H 2 O=100:4:3 100:8:6 100:16.5: % MeOH의순서로용출시켜얻은소분획들을정제하여화합물 10, 12 및 14를분리할예정이다. 소분획 E-5(17-51) 을 silica gel (Merck no. 7729) column에걸고 CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O=7:1.0:0.5 7:1.5:0.5 7:2: % MeOH의순서로용출시켜얻은소분획들을정제하여화합물 6을분리할예정이다. 소분획 E-12(3)11-16은 Rp-18 column에걸어 MeOH:H 2 O=6:4로용출시켜화합물 12을분리할예정이다. 소분획 E-13을 silica gel (Merck no. 7729) column에걸고 CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O=7:1.5:0.5 7:2:0.5 7:3:1 520:280:80 100% MeOH의순서로용출시켜얻은소분획들을정제하여화합물 10, 12 및 14를각각분리할예정이다. 다. 금은화 BuOH 분획의 column chromatography BuOH분획의 chromatogram은 EtOAc분획과매우유사하며극성이낮은쪽은동일한것으로사료되었다. 먼저 BuOH분획을 silica gel column chromatography에걸어 CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O =7:1.0:0.5 7:1.5:0.5 7:2:0.5 7:3:1 520:280:80 100% MeOH로용출시켜대략적인소분획들로나누고, 각각의소분획들을다시 silica gel, MCI gel 또는 Sephadex등을사용하여재column을실시하여각각을순수분리할예정이다

124 3. 금은화및인동의유효성분으로확인된 3종이상의지표물질들에대한정량용표준품을제조하여규격서를작성한후이들을공급한다. 4. 한약재감별, LC/MS(MS), HPLC, DNA분석연구팀및효능확인팀들과공조하여금은화및인동의대한정보를구축하고평가를도출한다. 5. 첨부서류 5.1. 연구논문 5.2. 인동 / 금은화로부터분리한성분들의 1 H- 및 13 C-NMR spectrum

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