(52) CPC 특허분류 C12R 1/07 ( ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/2 산업통상자원부 한국산업기술평가관리원 산업융합원천기술개발사업 효과지속형광범위프로바이오틱작물보호

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형석 양
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 1/20 ( ) A01N 63/02 ( ) C12R 1/07 ( ) (52) CPC 특허분류 C12N 1/20 ( ) A01N 63/02 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2015 년 04 월 30 일 심사청구일자 2015 년 04 월 30 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2016 년 11 월 09 일 (56) 선행기술조사문헌 KR B1 KR A WO A1 Plant Omics Journal, Vol.6, pp (2013.)* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2017년07월19일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2017년07월13일 (73) 특허권자 한국생명공학연구원 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) (72) 발명자 최수근 대전광역시유성구과학로 125 정다은 대전광역시유성구과학로 125 박승환 대전광역시유성구과학로 125 (74) 대리인 한윤호 전체청구항수 : 총 6 항심사관 : 김지연 (54) 발명의명칭식물저장병방제용조성물및이를이용한식물저장병방제방법 (57) 요약 본발명은수탁번호 KCTC18379P 로기탁된, 신규바실러스테퀼렌시스 (Bacillus tequilensis) BOR1 균주를제공한다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (52) CPC 특허분류 C12R 1/07 ( ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/2 산업통상자원부 한국산업기술평가관리원 산업융합원천기술개발사업 효과지속형광범위프로바이오틱작물보호제개발 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 ~ 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 KGM 미래창조과학부 국가과학기술연구회 연구사업명주요사업 ( 연구개발과제 ) 연구과제명 기여율 1/2 수퍼박테리아및감염병제어 / 진단기술개발사업 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 수탁번호 KCTC18379P로기탁된, 과채류표면정착능력이우수한신규바실러스테퀼렌시스 (Bacillus tequilensis) BOR1 균주. 청구항 2 제1항에있어서, 16S rdna가서열번호 1로기재되는핵산서열을갖는, 신규바실러스테퀼렌시스 BOR1 균주. 청구항 3 제1항의균주를포함하는푸른곰팡이병균 (Penicillium expansum), 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea), 근부병균 (Fusarium solani), 뿌리썩음병균 (Pythium ultimum) 또는검은곰팡이병균 (Alternaria alternata) 에의해서유발되는식물저장병방제용조성물. 청구항 4 삭제청구항 5 제3항에있어서, 상기식물은사과, 배, 고추, 배추, 무, 당근, 마늘, 양파, 오이, 참외, 토마토또는감귤인, 식물저장병방제용조성물. 청구항 6 제3항에있어서, 상기저장병은저장병해, 수송병해또는시장병해인, 식물저장병방제용조성물. 청구항 7 제1항의균주또는제3항, 제5항및제6항중어느한항의조성물을식물에처리하는단계를포함하는푸른곰팡이병균 (Penicillium expansum), 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea), 근부병균 (Fusarium solani), 뿌리썩음병균 (Pythium ultimum) 또는검은곰팡이병균 (Alternaria alternata) 에의해서유발되는식물저장병방제방법.. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은식물저장병방제용조성물에관한것으로서, 더상세하게는식물저장병방제용조성물및이를이용 한식물저장병방제방법에관한것이다. [0002] 배경기술현재국내원예작물생산액은 11조원에이르지만수확후유통되는과정에서약 3조원정도의손실이발생할정도로저장병의피해는심각하다. 일반적으로곡물, 과실및채소류등을저장할때온도와습도를조절하지않으면병원균의증식으로인해수확후의작물이큰피해를입게되는데이러한식물병방제에있어서화학적합성농약의사용은전세계적으로리오 (Rio) 협약등에의하여감소추세에있으며인체에무해하고친환경적인병방제방법이요구되면서저장과실의부패를막기위한저독성및친환경농약을이용한방제방법들의개발이중요시되고있다. 천연물유래의생물농약을이용한방제방법은미생물제제가가지고있는문제점을해결하고 - 3 -

4 화학농약에비해개발비가저렴한장점을가지고있다. 이에따라스몬산 (jasmonic acid), 아미노산 (amino acid) 과그유도체인베타 - 아미노부틸산 (β-aminobutyric acid) 과같은천연화합물을이용한방제방법또는 UV 와뜨거운물로씻는등의물리적인병방제방법에관한연구가활발히진행되고있다. [0003] 대한민국등록특허제 호는천산용추출물과미생물균주를포함하는과실저장병방제용조성물을개시 하고있다. 발명의내용 [0004] [0005] 해결하려는과제그러나현재까지천연물유래의생물농약의개발은제한적이고극소수에불과하다. 본발명은상기와같은문제점을포함하여여러문제점들을해결하기위한것으로서, 미생물을이용한식물저장병방제용조성물및이를이용한식물저장병방제방법을제공하는것을목적으로한다. 그러나이러한과제는예시적인것으로, 이에의해본발명의범위가한정되는것은아니다. [0006] [0007] [0008] 과제의해결수단본발명의일관점에따르면, 수탁번호 KCTC18379P로기탁된, 신규바실러스테퀼렌시스 (Bacillus tequilensis) BOR1 균주가제공된다. 본발명의다른일관점에따르면, 상기균주를포함하는식물저장병방제용조성물이제공된다. 본발명의다른일관점에따르면, 상기균주또는상기조성물을식물에처리하는단계를포함하는식물저장병방제방법이제공된다. [0009] 발명의효과 상기한바와같이이루어진본발명의일실시예에따르면, 과채류표면에서분리한미생물을이용하여효과가 우수한저장병방제효과를구현할수있다. 물론이러한효과에의해본발명의범위가한정되는것은아니다. [0010] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주의항균활성을측정한사진이다. 도 2는본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주의사과저장병예방효과를측정한그래프이다. 도 3은본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주의귤과배저장병예방효과를측정한그래프이다. 도 4는본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주의염기서열의분석에따른계통학적결과를분석한그림이다. [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 발명을실시하기위한구체적인내용용어의정의 : 본문서에서사용되는용어 " 식물저장병 (plant storage disease)" 은수확후저장중인농산물에발생하는병으로저장시온도와습도를조절하지않으면병원균의번식을조장하여수확후의작물이큰피해를입게된다. 일반적으로수확후수송중에발생하는병을수송병해, 시장및소매점포등농산물의유통과정에서발생하는병을시장병해, 시장병해중에서도채소, 과실에발생하는병을청과 ( 靑果 ) 병해라고한다. 본문서에서사용되는용어 " 잿빛곰팡이병 (gray mold rot)" 은식물병원균인 Botrytis cinerea에의해유발되는저장병으로잎가장자리부터갈색으로변하고, 병반주변에는물결모양의주름이생긴다. 본문서에서사용되는용어 " 푸른곰팡이병 (green mold rot)" 은식물병원균인 Penicillium expansum에의해유발되는저장병으로수확후저장고내에서또는수송중인상자안에서차례로접촉전염을통해과일껍질에상처가나면발병한다. 발명의상세한설명 : 본발명의일관점에따르면, 수탁번호 KCTC18379P로기탁된, 신규바실러스테퀼렌시스 (Bacillus - 4 -

5 tequilensis) BOR1 균주가제공된다. [0017] [0018] [0019] 상기균주는 16S rdna가서열번호 1로기재되는핵산서열을가질수있다. 본발명의다른일관점에따르면, 상기균주를포함하는식물저장병방제용조성물이제공된다. 상기균주를포함하는식물저장병방제용조성물은배양물의용도에따라액제또는입제의미생물제제로제조가가능하다. 미생물농약의제형에대하여는선행기술에잘기술되어있다 ( 한국등록특허제 호 ). 예컨대, 액제의경우바실러스테퀼렌시스 (Bacillus tequilensis) 10 9 cfu/ml 이상, 글라이콜 1 w/v%, NaCl 1 w/v%, Tween 80 1 w/v% 및소르빈산칼륨 (potassium sorbate) 을이용하여제조할수있고, 입제의경우바실러스테퀼렌시스 (Bacillus tequilensis) 10 9 cfu/ml 이상, NaNO wt%, 글루코스 (glucose) 1.0 wt% 및잔부의제올라이트 (zeolite) 를이용하여제조가능하다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] 상기식물저장병은푸른곰팡이병균 (Penicillium expansum), 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea), 근부병균 (Fusarium solani), 뿌리썩음병균 (Pythium ultimum) 또는검은곰팡이병균 (Alternaria alternata) 에의해서유발될수있고상기식물은사과, 배, 고추, 배추, 무, 당근, 마늘, 양파, 오이, 참외, 토마토또는감귤일수있으며상기저장병은저장병해, 수송병해또는시장병해일수있다. 본발명의다른일관점에따르면, 상기균주또는상기조성물을식물에처리하는단계를포함하는식물저장병방제방법이제공된다. 본발명에따른균주를포함하는생물농약의유효성분은전체미생물제제조성물에대하여 0.001~90% 를사용하거나균주배양액추출물을 100~500배희석하여분제로제제화시키는것이바람직하다. 상기제조된식물병방제제를잿빛곰팡이병, 근부병, 점무늬병, 모잘록병, 뿌리썩음병, 검은곰팡이병및푸른곰팡이병등을방제하기위하여, 작물을정식한후 10일부터또는발병직전시기에식물체지상부에경엽처리방법으로처리하는것이바람직하다. 상기미생물제제는식물병방제제, 종자코팅제, 미생물영양제및토양개량제등의전반적인농약제로사용될수있다. 이하, 실시예를통하여본발명을더상세히설명한다. 그러나본발명은이하에서개시되는실시예에한정되는것이아니라서로다른다양한형태로구현될수있는것으로, 이하의실시예는본발명의개시가완전하도록하며, 통상의지식을가진자에게발명의범주를완전하게알려주기위해제공되는것이다. 실시예 1: 균주의분리본발명의일실시예에따라과채류표면에서항균활성을나타내는바실러스균주를분리하였다. 구체적으로, 시중에판매되는오렌지를구입하여표면으로부터바실러스균주를분리하기위해오렌지껍질을작은조각으로자르고 50 ml의멸균증류수를첨가하여믹서기를이용해곱게갈아주었다. 상기시료로부터 0.1 ml을취하여 2 ml의 2X SG 액체배지 (1.6% 영양배지, 0.05% MgS0 4, 0.2% KCl, 1 mm CaN0 3, 0.1 mm MnCl 2, 1 ㅅM FeS0 4 및 0.1% 글루코스 ) 와혼합하고 37 에서 3일동안진탕배양하였다 배희석한배양액 0.1 ml을 LB 한천배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% NaCl, 0.1% 글루코스, ph 7.0) 에도말하고, 37 배양기에서하룻밤동안배양후생성되는콜로니를순수분리하였다. 상기여러콜로니중에서바실러스속 (Bacillus sp.) 으로추정되는균주를선발하여평판배양을반복하여육안으로고유의모양을가지는지확인하였고, 현미경관찰을통해단일균주여부를확인함으로써최종적으로본발명균주인 BOR1을분리하였다. [0027] [0028] 실시예 2: 균주의동정본발명의일실시예에따라 16S rdna 염기서열시퀀스분석법을이용하여상기 BOR1 균주를동정하였다. 상기분석은한국미생물보존센터 (KCCM) 에의뢰하였고 16S rdna 유전자의전체염기서열분석을이용한미생물동정서비스를요청하였다. 상기균주의염기서열의분석에따른계통학적결과를분석한결과, 상기균주의 16S rdna 염기서열 ( 서열번호 1) 은바실러스테퀼렌시스 (Bacillus tequilensis) 와 99% 상동성을나타내는것을확인하여상기분리된 BOR1 균주를 Bacillus tequilensis로동정하였다.( 도 4). 또한상기분리한균주를 2015년 04월 23일자로대전유성구과학로 125의한국생명공학연구원내에소재하고있는국제특허기탁기관인미생물자원센터 (KCTC) 에기탁하여, 수탁번호 KCTC18379P를부여받았다. 상기기탁균주는부다페스트조약의규정에따른요건을모두충족하는조건하에기탁된것이다

6 [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] 실험예 1: 식물병원균에대한항균활성검정본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주의항균활성을측정하였다. 구체적으로, 미국 AgraQuest 社의생물농약인세레나데 (Serenade, Bacillus subtilis QST 713) 는우수한식물병방제활성을가지고있으며가장성공적인생물농약으로알려져있으므로상기세레나데제품에서분리된 QST 713 균주와본발명의 BOR1 균주의항균활성을비교하였다. 상기항균활성실험에사용된식물병원균은 Botrytis cinerea KACC40573( 잿빛곰팡이병균 ), Fusarium solani KCTC6326( 근부병균 ), Pythium ultimum KACC40705( 뿌리썩음병균 ) 및 Alternaria alternata KCTC6326( 검은곰팡이병균 ) 으로한국생명공학연구원생물자원센터와한국농업미생물자원센터에서분양받아이용하였다. 상기분리한 BOR1 균주와 QST 713 균주는 TSB(Difco) 액체배지에접종하여 37 에서 220 rpm으로하룻밤동안배양한후사용하였다. PDA(Potato dextrose broth, Difco) 한천배지의한쪽에필터페이퍼디스트 (8 mm) 를올리고그위에각균주배양액을 10 μl씩접종하였다. 그후, 약 3 cm 정도떨어진부위에 PDA 배지에서왕성하게자라고있는식물병원균의배양체로부터얻은균사조각을접종한다음 30 에서 3일이상배양하여식물병원균이가장자리까지생장할때균주에의한생장저해정도를측정하였다. 그결과, 본발명의 BOR1 균주는 QST 713 균주와유사하게대부분의식물병원균에대한생장을저해하는것을확인할수있었다 ( 도 1). 실험예 2: 사과저장병예방효과검정본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주의저장병예방효과를측정하였다. 구체적으로, 대부분의과일은수확후저장중여러가지병에의해피해를입게되는데그중저장고내에서병원균의생장에적당한환경이되면잿빛곰팡이병 (gray mold rot) 과푸른곰팡이병 (green mold rot) 이발생하여막대한피해가생긴다. 특히사과의경우수확후에는농약을전혀사용할수없어수확후과일부패를억제할수있는새로운농약대체기술이필요하므로사과에서의저장병예방효과를관찰하였다. 상기의식물병원균생장저해활성을가진 BOR1 균주를병원균을함께사과에처리하여저장병억제효과를관찰하기위해먼저사과를흐르는물에깨끗하게씻고말린다음표면에이쑤시개를사용하여 5 mm 깊이의구멍을삼각형모양으로 3곳에뚫고 P3 배지 (15 g/l 대두박, 10 g/l 당밀, 10 g/l 당밀및 1 g/l CaCO 3 ) 에접종하여 37 에서 3일간배양한 BOR1과 QST 713 배양액 (2ㅧ10 9 CFU/ml) 을각각 20 μl씩처리하였고대조군으로멸균수를사용하였다. 양성대조군으로는상기 QST 713 균주를사용하였다. 그후상기처리한균주와멸균수가사과내로흡수된다음, PDA 배지에서왕성하게자란 Penicillium expansum KCTC6434( 푸른곰팡이병균 ) 과 Botrytis cinerea KACC40573( 잿빛곰팡이병균 ) 의균사체를 0.1% tween 20이첨가된멸균수를이용하여획득한용액을 20 μl씩접종하였다. 상기 BOR1 균주와식물병원균이접종된사과는 20, 습도 80% 의인큐베이터에저장한다음병원균접종 5일후부터사과에형성된병징 (symptom) 을관찰하였다. 상기실험에사용된사과는홍옥과아오리품종을사용하였고푸른곰팡이병의병징정도는병징의크기를재거나부패과율을측정하였으며, 잿빛곰팡이병의병징의크기를관찰하였다. 상기병징의크기는하기표 1에표시한인덱스를이용하여측정하였다. 표 1 [0036] 수준 병징의크기 0 병발생없음 1 병원균접종부위로부터 5 mm 이하병발생 2 병원균접종부위로부터 6-10 mm 병발생 3 병원균접종부위로부터 mm 병발생 4 병원균접종부위로부터 mm 병발생 5 병원균접종부위로부터 21 mm 이상병발생 [0037] [0038] [0039] 그결과, 본발명의 BOR1 균주는생물농약으로사용되는 QST 713 균주와유사하거나더낮은발병도 (disease severity) 를보여, BOR1 균주가사과에서잿빛곰팡이병과푸른곰팡이병에대한우수한방제활성을나타내는것을확인하였다 ( 도 2). 실험예 3: 귤과배저장병예방효과검정본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주가사과가아닌다른과일에서도저장병방제효과를나타내는지 - 6 -

7 측정하였다. [0040] 구체적으로, 실험방법은상기실시예 3 과동일한방법으로귤과배를흐르는물에깨끗하게씻고건조후상기 과일표면에이쑤시개를이용하여 5 mm 깊이의구멍을 3곳에뚫고 BOR1, QST 713 배양액 (2ㅧ10 9 CFU/ml) 및멸균수를각각 20 μl씩처리하였다. 그후, PDA 배지에서왕성하게자란 Botrytis cinerea KACC40573 ( 잿빛곰팡이병 ) 의균사체를획득한용액을 20 μl씩접종하고 20, 습도 80% 의인큐베이터에배양한다음병원균접종 5일후부터귤과배에형성된병징을관찰하였다. 마찬가지로귤과배에서병징정도는상기표 1의인덱스를이용하여측정하였다. [0041] [0042] [0043] [0044] 그결과, 귤과배에서도본발명의 BOR1 균주가우수한병방제활성을나타내는것을관찰하였다 ( 도 3). 실험예 4: 균주의과수표면에의정착능확인저장병방제를위한미생물제제는병원균에대한길항력과더불어기주의표면에잘정착하는것이유리하므로본발명의일실시예에따라분리한 BOR1 균주의과일표면정착능을관찰하였다. 구체적으로, BOR1 균주를 P3 배지에서 3일정도배양하고, 사과를바실러스배양액 (1X10 7 CFU/ml) 에 1시간담금처리하였다. 상기처리된시료는 1시간건조한후 20, 습도 80% 인큐베이터에서일주일동안배양하였다. 이후사과표면에처리한균주의정착능을판단하기위해사과껍질을잘게자른후믹서기를이용하여곱게갈아 주고시료를 10-1 ~10-3 까지연속희석하여 LB 한천배지에도말후 37 에서배양하였고대조군으로 QST 713 과 Bacillus subtilis 분리균을사용하였다. [0045] 그결과, 본발명의 BOR1 균주는 QST 713 뿐만아니라다른 Bacillus subtilis 에비해약 10 배높은균주수를 나타내어, BOR1 균주의사과표면정착능이다른 Bacillus 균주보다우수함을확인하였다. 상기 BOR1 균주의사 과표면정착능측정결과를하기표 2 에표시하였다. [0046] 사과무게 (g) 균주수사과 1g 당균주수 표 2 대조군 QST ㅧ ㅧ 10 2 Bacillus subtilis BOR ㅧ ㅧ ㅧ ㅧ 10 2 [0047] [0048] 결론적으로현재까지항균활성을가진다양한미생물이보고되었지만본발명에서는과채류의표면에서식하는미생물에주목하여오렌지표면에서황균활성을가진신규한바실러스균주를분리하고이를대량배양하여과채류에처리한결과, 항균활성, 저장병방제활성및사과표면정착능력이우수하였으므로과채류의저장병방제에유용하게사용될수있다. 본발명은상술한실시예및실험예를참고로설명되었으나이는예시적인것에불과하며, 당해기술분야에서통상의지식을가진자라면이로부터다양한변형및균등한다른실시예및실험예가가능하다는점을이해할것이다. 따라서본발명의진정한기술적보호범위는첨부된특허청구범위의기술적사상에의하여정해져야할것이다. 수탁번호 [0049] 기탁기관명 : 미생물자원센터 ( 한국 ) 수탁번호 : KCTC18379P 수탁일자 :

8 도면 도면 1 도면 2 도면 3-8 -

9 도면 4 서열목록 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Composition for preventing plant storage disease and a control method of plant storage disease using the same <130> PD <160> 1 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Bacillus tequilensis BOR1 <400> 1 ctatcatgca gtcgagcgga agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg 60 agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata 120 ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg tggcttcggc taccacttac 180 agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcaacgatgc 240 gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300 gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt 360 gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtaccgttcg 420 aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag

10 ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag 540 gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact 600 ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga 660 gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc 720 gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt 780 gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc 840 tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 900 ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg 960 acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc 1020 gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta 1080 gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1140 gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac 1200 agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg 1260 gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat 1320 gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt 1380 aacacccgaa gtcggtgagg taacctttta ggagccagcc gcgcgaaggt g

미생물유래물질을이용한식물병방제용작물보호제의산업화

미생물유래물질을이용한식물병방제용작물보호제의산업화 - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 - - 17 - - 18 - - 19 - - 20 - - 21 - - 22 - - 23 - - 24 - - 25 - - 26 -