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1 Original Article J Sasang Constitut Med 2018;30(2): 고지방식이로유도된비만생쥐모델에서저령차전자탕의항비만효과 장순우 고영미 곽진영 안택원 * 대전대학교한의과대학사상체질과 Abstract Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model SoonWoo Jang Young-mee Kho Jin-young Kwak Taek-won Ahn * Dept. of Sasang Constitutional Medicine, College of Korean Medicine, Daejeon Univ Objective This study investigated the effects of Jeoreongchajeonja-tang in a high-fat diet-induced obesity mouse model. Methods The study examined 9-week-old male mice (C57bl/6J) divided into four groups: the normal(c57bl/6j-nr), control (high-fat diet only; HFD-CTL), positive-control (high-fat diet with Garcinia cambogia), and experimental (high-fat diet with Jeoreongchajeonja-tang; HFD-JCT) groups. After 7 weeks, the body weight, food efficiency ratio, organ weight, and visceral fat weight of the mice were measured. Blood serum tests, mrna, liver histopathology, and epididymis adipocytes were also examined. Results Compared with the Control(HFD-CTL) group, the Experimental(HFD-JCT) group given Jeoreongchajeonja-tang showed significant reductions in absolute body weight and food efficiency ratio. The serum alanine aminotransferase, total-cholesterol, triglyceride, low-density lipoprotein (LDL)-cholesterol, high-density lipoprotein (HDL)-cholesterol, insulin-like growth factor-1, and leptin levels were significantly lower in the experimental group than in the control group. The serum adiponectin levels were significantly higher in the experimental group than in the control group. Compared with the control group, the experimental group showed significant reductions in absolute abdominal subcutaneous fat, epididymal adipose tissue, kidney adipose tissue, intestine adipose tissue, and liver, kidney and spleen adipose tissue weights. The C/EBP-β, leptin, and SREBP1c/ADD1 mrna expression were significantly lower in the experimental group than in the control group, while the UCP-2 and adiponectin mrna expression were significantly higher. Compared with the control group, the experimental group showed a significant reduction in the absolute adipocyte area in the liver and epididymal adipose tissue. Conclusion Jeoreongchajeonja-tang has an anti-obesity effect. Additional clinical studies are expected. Key Words : Obesity, Jeoreongchajeonja-tang, obesity mouse model, cholesterol Received March 5, 2018 Revised March 12, 2018 Accepted June 25, 2018 Corresponding author Taek-won Ahn Notaesan-ro 4, Seongbuk-gu, Cheon-an, Choongchungnamdo, South Korea. Tel: , Fax: , twahn@dju.ac.kr C The Society of Sasang Constitutional Medicine. All rights reserved. This is an open acess article distributed under the terms of the Creative Commons attribution Non-commercial License ( creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/)

2 SW Jang et al. 9 Ⅰ. 緖論 과체중과비만이다양한합병증및사망과연관되어있다는점은 2500년전히포크라테스시대부터의료종사자들에게알려져있었다 1. 비만은체내지방의과잉축적상태로, 비만의정도가심할수록대사증후군의빈도및합병증이증가하는데, 비만은관상동맥질환의위험을 50% 높일뿐만아니라심혈관계질환, 관상동맥질환에의한사망률을모두 50% 높인다 2. 비만은인슐린저항성및고혈당, 이상지질혈증을유발함으로서제2형당뇨병발생위험성을증가시키며 3, 암의위험성도증가시킨다 4. 이처럼비만은많은심각한합병증을발생시키기에의학계에서비만을조기에진단하고치료하는것은주요한관심사안이며. 체중을감량하여합병증을예방하는것이비만치료의일차적인목표가된다. 비만및대사증후군의치료는현대의학에서는 Therapeutic life style change 로일컬어지는행동치료, 식사치료, 운동치료가주가되고있으며보조적으로약물치료가사용되고있고적응증에따라고도비만의경우수술치료등을고려해볼수있다. 현대의학에서비만의약물치료는식사, 운동, 행동수정요법에보조적으로만사용하여야하며 BMI 30kg/ m2이상, 혹은 BMI 27kg/ m2이상이며비만관련합병증이있어야하는적응증이있어야고려할수있다. 또한, 약물치료에는다양한부작용이있다. 이에비만의약물치료는폭넓은임상적용의한계점을지닌다 5,6. 이로인해, 비만치료에있어임상에두루사용할수있는한의학및대체의학요법에대한수요가있다. 비만의한방치료는 BMI, 복부비만의감소에효과적이라는보고가있으며 7, 현재단일한약복용, 복합한약복용등을시행하여비만의한방치료에대한안전성, 효과성, 통계적인유의성을입증한다양한실험논문, 증례보고및임상연구가진행되어왔다 8. 고는비만쥐에서熱多寒少湯의항비만효과를규명하였고 9, 박은비만쥐에서凉膈散火湯의효과를규명하였고 10, 고와김은太陰調胃湯으로한약의비만치료및항산화효과에대한보고를하였다 11,1 2. 따라서, 한약중비만및대사증후군치료의약물요법으로활용할수있는약을추가적으로조사해볼필요성이있다. 위의실험및임상연구들은주로東武李濟馬선생이쓴東醫壽世保元에집필된四象體質醫學의體質論的原理에입각하여四象體質處方을비만치료에적용및응용한것으로이에본인도四象醫學의體質論的관점에서여러處方중에비만에응용해볼수있는處方을고민하여선정하였다. 東醫壽世保元에서李濟馬先生은사람을容貌詞氣性質材幹體型氣像病證藥理에따라 4 개의體質로분류하였다. 少陽人의경우怒性宏抱而哀情促急하여脾大腎小한臟局을지니게되어, 納積之氣의太過와出放之氣의不足이되기쉬우므로少陽人의病證은주로水穀之氣의代謝障礙에서發生하는疾患이된다. 그러므로, 少陽人의保命之主는陰淸之氣가되며, 근본적인治療法은淸陽上升裏陰降濁이된다 13. 비만도이러한관점에서病理機轉과治療法을생각해볼수있다. 豬苓車前子湯은 東醫壽世保元 제 9장 少陽人脾受寒表寒病論 에나오는처방이며東武先生은亡陰證身熱頭痛泄瀉, 腹痛의治方으로豬苓車前子湯을제시하였다 14. 豬苓車前子湯을실제로少陽人중偏頭痛및急性泄瀉, 小便不利로亡陰證을진단받은환자에사용하여치료한治驗例가있다 15. 하지만, 東武先生의豬苓車前子湯은기존에創方의목표였던주치증인身熱頭痛泄瀉, 腹痛외에도실제임상에서다양한증상에활용되고있으며, 豬苓車前子湯과유사한구성의方劑로少陽人肥滿方에서비만유도흰쥐모델에서유의한비만억제효과및지질대사장애예방효과가있음을입증하였고 16 豬苓車前子湯이 100microgram/ml 의농도에서유의하게전지방세포의분화및증식을억제한다는보고도있다 17. 하지만실질적으로, 豬苓車前子湯이체중증가량, 식이효율, 혈중호르몬단백질지질농도, 지단백, 비만관련유전자등에미치는영향에대한연구는없는실정이다. 이에저자는豬苓車前子湯의항비만효과에대

3 10 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model 해알아보기위해비만동물모델을통해체중증가량및식이효율, Creatinine과 AST, ALT, 유리지방산 (fatty acid), 혈중총콜레스테롤, 혈중중성지방, 혈중고밀도지방단백질, 혈중저밀도지방단백질, 혈중호르몬단백질 (IGF-1, Leptin, Adiponectin), 장기및부위별지방중량의변화 ( 복부피하지방, 부고환, 신장, 창자, 간, 신장, 비장 ) 를측정하였다. 또, 간과부고환주변지방조직에서비만과관련된유전자발현 (AP2/FABP4 mrna, C/EBP-β mrna, UCP-2 mrna, Adiponectin mrna, Leptin mrna, SREBP1c/ADD1 mrna) 을분석하였고병리조직학적간과, 부고환, 지방세포크기를분석하였다. 이를통해유의한결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 硏究材料및硏究方法 1. 재료 1) 시약및실험기기본실험에사용된시약은 Oil red O, ocarbonate(depc), chloroform, trichloroacetic acid, isopropanol, Tri-HCl, KCl, MgCl2, 적혈구용혈액 (ACK lysis solution), DMEM (Dubecco's modified Eagle's medium) 배양액, dulbecco's phosphate buffered saline(d-pbs), sulforhodamin B(SRB), 2-isopropanol, sodium dodecyl sulfate(sds), Streptomycin (Giboo, USA) 을사용하였다. HPLC 표준시료는 citric acid (Sigma, USA) 과 epigallocatechin gallate (EGCG) (Sigma, USA) 제품을사용하였다. 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS) 은 Hyclone 사 (Logan, USA) 제품을, Taqman master mix 와 SYBR master mix는 ABi (USA) 사제품을, Lepin. IGF-1, Adiponectin ELISA kit R&D system (USA) 을, 기타일반시약은특급시약을사용하였다. 본실험에사용한기기는열탕추출기 (DWT-1800T, 대웅, Korea), 감압증류장치 (rotary vaccum evaporator, BUCHI B-480, Switzerland), 동결건조기 (freeze dryer, EYELA FDU-540, Japan), CO2 배양기 (Forma scientific Co., USA), 원심분리기 ( 한일과학, Korea), plate shaker(lab-line, USA), spectrophotometer (Shimazue, Japan), Bio-freezer(Sanyo, Japan), Quantitative Real-Time PCR (Applied Biosystems, USA), ELISA reader (Molecular Devices, USA), HPLC (High performance liquid chromatography ; Waters Co. USA) 등을사용하였다. 2) 생약및생약추출물분리본실험에서사용한저령차전자탕은정량후 1l의증류수를가하여 2시간동안전탕추출법 ( 대웅약탕기, 한국 ) 에의하여얻은액을 3 mm 여과지 (Whatman, Maidstone, England) 를이용하여감압여과한후, 여과된추출물은감압농축기 (Eyela, Japan) 를이용하여농축한후, 동결건조하여 (Freezedryer, Matsushita, Japan), 그리고 1첩분량인 54g의저령차전자탕에서 13.6g 의분말을얻었다. 동결건조 (Freezedryer, Matsushita, Japan) 하여얻은분말을 70 초저온냉동고에보관사용하였다. (Table 1). Table 1. The Composition of Jeoreongchajeonja-tang(JCT) Herb name Scientific name Amounts (g) 茯苓 Poria 8 澤瀉 Rhizoma Alismatis 8 豬苓 Polyporus umbellatus 6 車前子 Semen Plantaginis 6 知母 Anemarrhena asphodeloides Bunge 4 石膏 Gypsum 4 防風 Saposhnikovia divaricata Schischkin 4 荊芥 Schizonepeta tenuifolia Briquet 4 羌活 Rhizoma Notopterygii 4 獨活 Radix Angelicae Pubescentis 4 Total 52

4 SW Jang et al 연구방법 1) 비만유발동물모델및실험설계 Diet Induced Obesity Diet Formulas(D12492) 60 kcal% fat 식이섭취 (Table 2.) 하여평균체중이 28g~29g사이에도달하면 9주령부터저령차전자탕추출물을경구투여용금속제존대 (Zonde) 를이용하여위내로강제경구투여하였다. 실험군으로는정상식이를투여한 Normal 군 ( 이하정상군 (C57bl/6J-Nr)), 고지방식이 (High fat diet; HFD) 를투여한 control군 ( 이하대조군 (HFD- CTL)), HFD 에저령차전자탕 300mg/kg를투여한군 ( 이하 HFD-JCT), HFD 에 garcinia cambogia 245mg/kg를투여한양성대조군 ( 이하 HFD-GK) 으로나누었으며, 각그룹당 6마리씩으로 7주동안투여하였다. 양성대조군 Garcinia cambogia은건강기능식품으로보통사람에게투여하는용량을사람- 마우스상수를통하여결정하여 245mg/kg로결정하였고, 저령차전자탕은의약품으로 Tablet 으로만들어지게될경우를마우스로환산하면 300mg/kg가가장큰용량이어서독성에대한확인도필요하므로이렇게용량을결정하였다. 2) 체중, 식이섭취량및식이효율의측정식이섭취량및체중은 7주간매주수요일 9시에 측정하여기록하였다. 3) 혈청생화학적검사저령차전자탕추출물을 7주간투여후각실험동물로부터분리한혈장 (plasma) 에서간기능의지표인 ALT(alanine transaminase) 및 AST(aspartate transaminase) 를, 혈장및간의지질함량의지표인총콜레스테롤 (total cholesterol), HDL (High-density lipoprotein), LDL (Low-density lipoprotein), 중성지방 (triglyceride), FFA(free fatty acid) 의함량을생화학자동분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan) 를이용하여측정하였다. Leptin, IGF-1, adiponectin 의수준을 ELISA 법으로측정하였다. 모든실험과정과검사법은진단검사의학적가이드라인에준하여수행하였다. 4) 장기및부위별지방중량측정저령차전자탕추출물을 7주간투여후복부피하지방 (abdominal subcutaneous fat), 부고환주변지방조직 (epididymal adipose tissue), 신장주변지방조직 (kidney adipose tissue), 창자주변지방조직 (intestine adipose tissue) 의중량을산출하였다. 또한간, 신장, 비장을적출한후조직의중량을산출하였고 g 단위를사용하였다. Table 2. Diet Induced Obesity Diet Formulas (D12492) 60 kcal% fat Ingredient gm Kcal Casein, 80 Mesh L-Cystine 3 12 Corn Starch 0 0 Maltodextrin Sucrose Cellulose, BW Soybean Oil Lard Mineral Mix, S Dicalcium Phosphate 13 0 Calcium Carbonate Potassium Citrate,1 H2O Vitamine Mix, V Choline Bitatrate 2 0 FD&C Blue Dye# Total

5 12 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model 5) 간, 부고환지방세포유전자발현분석저령차전자탕을 7주간투여후각실험동물로부터적출한간과지방조직들의유전자발현양상을 real-time PCR 증폭법을사용하여알아보았다. 부고환주변지방조직 (epididymis adipose tissue) 및간 (liver) 등조직은 RNAsolB(Tel-Test) 용액을사용하여각조직으로부터 RNA 를추출한뒤 One-step SYBR Green PCR kit (AB science) 를사용하여 cdna 및 real-time PCR 분석을하였다. Real time quantitative PCR 은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA) 를이용하여수행하였다 (Table 3). 유전자발현은 TaqMan probe (FAM dye-labeled, ABi, USA), internal standard 는마우스 GAPDH probe set; Endogenous Control (VICR/MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems ( E) 를사용하였고, primer의최종농도가 200 nm이되게반응시켰다. Real time quantitative PCR 의조건은 : pre-denaturation 은 2 min at 50, 10 min 94, 그리고 40 cycles을 0.15 min at 95, 1 min at 45 에서수행하였다. 실험군과대조군은 internal standard로 G3PDH 를사용하여 target group의 Quantitative PCR y = x(1+e)n x = starting quantity y = yield n = number of cycles e = efficiency을계산하여 RQ (relative quantitative) 을측정하였다. 6) 병리조직학적분석저령차전자탕을 7주간투여후주요장기들에대한조직병리학적관찰을수행하기위해간과지방조직등 을절취하여 10% neutral buffered formalin 에 24시간동안고정시킨다음 graded alcohol 로탈수시키고파라핀으로포매하여 block 을제작한다음 microtome 으로 4 μm두께의조직절편을제작하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색및오일- 레드 O를시행한뒤 xylene clearing 을거쳐 permount로처리한후광학현미경 (NIKON, Japan) 위에서 100x배율로관찰하였고, 조직또는장기별특이병변의유무를관찰하였다. 지방세포크기는부고환지방조직을 H&E 염색을시행한후광학현미경 Nikon ACT-1 version 2.51 (Nikon, Japan) 를사용하여 50 μm단위로설정하여지방세포크기를측정하였다. 3. 통계처리각실험군결과값은 SPSS 통계프로그램을사용하여통계처리하였으며, unpaired student's T-test에서 p<0.05 이하의수준에서유의성검정을실시하였다. Ⅲ. 硏究結果 1. 체중변화, 체중증가량, 식이효율에미치는영향에미치는영향실험시작일과종료일의체중의변화는정상군 (C57BL/6J_Nr) 에서는약 17.5% 증가하였으며, 대조군 (HFD-CTL) 에서는약 90% 가증가하였고, 양성대조군 (HFD-GK) 에서는약 64.4% 증가, 실험군 (HFD-JCT) 에 Table 3. Mouse Probe & Oligonucleotide Gene Probe & Primer Sequence C/EBP-β Forward 5'-AAGCTGAGCGACGAGTACAAGA-3' Reverse UCP-2 sence 5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT-3' antisence 5'-ACCGATACAGTACAGTACAGTA-3' Adiponectin sence 5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT-3' antisence 5'-ACCGATACAGTACAGTACAGTA-3' Leptin sence 5'-AACCCTTACTGAACTCAGATTGTTAG-3' antisence 5'-TAAGTCAGTTTAAATGCTTAGGG-3' SREBP1c/ADD1 Forward 5'-AGCCTGGCCATCTGTGAGAA-3' Reverse

6 SW Jang et al. 13 서는약 54.5% 의증가율을보였다. 대조군 (HFD-CTL) 의체중평균은 44.1±2.1 g으로정상군 (C57BL/6J_Nr) 26.8±1.7 에비하여 64.5% 높은수준의체중증가를보였다. 양성대조군 (HFD-GK) 은평균 6.6 g, 실험군 (HFD- JCT) 은대조군 (HFD-CTL) 과비교하여평균 8.1 g 감소경향을나타냈다. 실험군 (HFD-JCT) 이고지방식이에의한체중증가유도를효율적으로억제할수있음을알수있었다. 일일평균식이섭취량에대한일일평균체중증가량의비율을계산하여식이효율을구하였다. 대조군 (HFD-CTL) 의식이효율은 15.97±0.39% 로정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 3.02±0.33 에비해약 5배의유의미한증가를보였다 (p<0.001). 실험군 (HFD-JCT) 의식이효율은 12.01±0.60% 로, 대조군 (HFD-CTL) 에비해유의미한차이를보였다 (p<0.001). 양성대조군 (HFD-GK) 14.89±0.94% 에비해서도실험군 (HFD-JCT) 의식이효율은약 19.3% 낮은것을확인할수있었다 (Table 4). 2. 혈청생화학적변화에미치는영향 1) 독성검사 (1) 신장독성 (creatinine) 에미치는영향혈청중 creatinine 의함량을분석한결과, 정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 은 0.23 mg/dl, 대조군 (HFD-CTL) 은 0.28 mg/dl, 양성대조군 (HFD-GK) 은 0.30 mg/dl, 실험군 (HFD-JCT) 은 0.27 mg/dl 이측정되었다. 대조군 (HFD-CTL) 과실험군 (HFD-JCT) 의 creatinine 수준에차이가거의없었으므로신장독성은나타나지않는것을확인할수있었다 (Table 5). (2) 간독성 (AST, ALT) 에미치는영향혈청중 AST, ALT의함량을분석한결과, 정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 은 AST 80.8 U/L, ALT U/L, 대조군 (HFD-CTL) 은 AST 98.8 U/L, ALT 80.5 U/L, 양성대조군 (HFD-GK) 은 AST U/L, ALT U/L, 실험군 (HFD-JCT) 은 AST 85.3 U/L, ALT U/L 이측정되었다. 대조군 (HFD-CTL) 은정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 에비해 AST 수치가유의하게높았고 (p<0.01), ALT 수치도유의하게높게나타났다 (p<0.01). AST 는대조군 (HFD-CTL) 에비해실험군 (HFD-JCT) 에서약 13.6% 감소하였으며, 유의미하지않았다. ALT 는대조군 (HFD-CTL) 에비해실험군 (HFD-JCT) 이 67.9% 유의미하게감소 (p<0.001) 하였다. (Table 5). 2) 혈중지질학적변화에미치는영향 (1) 혈중총콜레스테롤 (T-Cholesterol) 량에미치는영향혈청중 T-cholesterol 의함량을분석한결과, 정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 은 mg/dl, 대조군 (HFD-CTL) 은 mg/dl, 양성대조군 (HFD-GK) 은 mg/dl, 실험군 (HFD-JCT) 은 mg/dl이측정되었다. 대조군 (HFD-CTL) 의혈중 T-cholesterol 수치는정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 에비해약 98.3% 유의하게높았고 (p<0.001), 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) Table 4. Average Body weight, Food intake, Body weight gain, and Food Efficiency Ratio Group AverageBody weight Food intakes Body weight gain Food efficiency (g) (g/day) (g/day) ratio (FER, %) Normal ± ±0.33 HFD-CTL ± ± HFD-GK_ ± ±0.94 ** HFD-JCT_ ± ±0.60 *** Normal; normal diet group, Control; High Fat Diet-Negative Control group, HFD-GK; High Fat Diet-Positive Control group(garcinia cambogia), HFD-JCT: High Fat Diet-Jeoreongchajeonjatang administered group(extracts, 300mg/kg). The values are expressed as mean±sem(n=6). The significance were determined by Student t-test; + p < 0.05, ++ p < 0.01 and +++ p < (compared with ND), * p<0.05, ** p<0.01, and *** p<0.001(compared with HFD-CTL).

7 14 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model 에비해약 8.8% 유의하게낮았다 (p<0.001). 실험군 (HFD-JCT) 의 T-cholesterol 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해유의하게감소 (p<0.001) 하였다. 실험군 (HFD-JCT) 과양성대조군 (HFD-GK) 의 T-cholesterol 수치를비교하였을때에도실험군 (HFD-JCT) 이약 9.6% 낮은결과를보였다 (Table 5). (2) 혈중중성지방 (Triglyceride) 량에미치는영향혈청중중성지방 (Triglyceride) 의함량을분석한결과, 정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 은 mg/dl, 대조군 (HFD-CTL) 은 mg/dl, 양성대조군 (HFD-GK) 은 mg/dl, 실험군 (HFD-JCT) 은 mg/dl이측정되었다. 대조군 (HFD-CTL) 의혈중 Triglyceride 수치는정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 에비해약 56.9% 유의하게높았고 (p<0.01), 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD- CTL) 에비해약 37.7% 유의하게낮았다 (p<0.001). 실험군 (HFD-JCT) 의 Triglyceride 수치는대조군 (HFD- CTL) 에비해유의하게감소 (p<0.001) 하였다 (Table 5). (3) 혈중고밀도지방단백, 저밀도지방단백콜레스테롤 (HDL-cholesterol, LDL-cholesterol) 량에미치는영향혈청중 HDL-cholesterol, LDL-cholesterol의함량을분석한결과, 대조군 (HFD-CTL) 은정상군 (C57BL/6J_Nr) 에비하여 HDL-cholesterol 이유의하게높았고 (p<0.01), LDL-cholesterol 은약 41.8% 유의하게높았다 (p<0.001). 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해 HDL-cholesterol이약 2.5% 높았지만유의미하지않았고, LDL-cholesterol 은약 19.5% 유의미하게낮은결과를보였다 (p<0.001). 실험군 (HFD-JCT) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해 HDL-cholesterol이약 8.4% 유의미하게낮았으며 (p<0.01), LDL-cholesterol 은약 33.8% 유의미하게낮았다 (p<0.001) (Table 5). 3. 혈중호르몬단백질량변화에미치는영향 1) 혈중 IGF-1 단백질량에미치는영향혈중 IGF-1 의함량을분석한결과, 대조군 (HFD-CTL) 의 IGF-1 수치는정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 에비해약 38 배유의하게높았고 (p<0.001), 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 18.2% 유의미하게낮았다 (p<0.01). 실험군 (HFD-JCT) 의 IGF-1 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해약 24% 유의하게감소 (p<0.001) 하였다. 실험군 (HFD-JCT) 과양성대조군 (HFD-GK) 의 IGF-1 수치를비교하였을때에도실험군 (HFD-JCT) 이약 7% 낮은결과를보였다 (Table 5). 2) 혈중 Leptin 단백질량에미치는영향혈중 Leptin 의함량을분석한결과, 대조군 (HFD- CTL) 의 Leptin 수치는정상군 (C57BL/6JJ_Nr) 에비해유의미하게높았고 (p<0.001), 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 22.4% 유의미하게낮았다 (p<0.01). 실험군 (HFD-JCT) 의 Leptin 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해약 22.6% 유의하게감소 (p<0.001) 하였다.(Table 5). 3) 혈중 Adioponectin 단백질량에미치는영향혈중 Adiponectin 의단백질량을분석한결과, 대조군 (HFD-CTL) 의 Adiponectin 수치는정상군 (C57BL/ 6JJ_Nr) 에비해약 40.8% 유의미하게낮았고 (p<0.001), 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 5.4% 높았다. 실험군 (HFD-JCT) 의 Adiponectin 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해약 27.9% 유의하게높았다 (p<0.01). 실험군 (HFD-JCT) 과양성대조군 (HFD- GK) 의 Adiponectin 수치를비교하였을때에도실험군 (HFD-JCT) 이약 25.3% 높은결과를보였다 (Table 5). 4. 장기및부위별지방중량변화에미치는영향 1) 복부피하지방, 부고환, 신장, 창자주변중량변화에미치는영향복부피하지방, 부고환, 신장, 창자주변을구분하여적출한후지방조직의중량을측정하였다. 대조군

8 SW Jang et al. 15 (HFD-CTL) 의복부피하지방량은정상군 (C57BL/6J_Nr) 의복부피하지방량에비하여약 8.69배유의하게증가하였고 (p<0.001) 부고환주변지방량은정상군 (C57BL/ 6J_Nr) 의부고환지방량에비하여약 6.9배유의하게증가하였다 (p<0.001). 대조군 (HFD-CTL) 의신장주변지방량은정상군 (C57BL/6J_Nr) 의신장주변지방량에 비하여 배유의하게증가하였고 (p<0.001) 창자주변지방량은정상군 (C57BL/6J_Nr) 의창자주변지방량에비하여 5.08 배유의하게증가하였다 (p<0.001). 대조군 (HFD-CTL) 에비해실험군 (HFD-JCT) 의복부피하지방, 부고환, 신장, 창차주변지방량이모두감소하는것을확인하였다 (Figure 1). Table 5. The Effect of Jeoreongchajeonja-tang Extracts on Blood Biochemistry Parameters in Mice Fed with High Fat Diet Group Normal HFD-CTL HFD-GK_245 HFD-JCT Creatinine AST ALT *** *** Total cholesterol *** *** Triglyceride *** *** HDL-cholesterol ** LDL-cholesterol *** 13.9 *** IGF ** *** Leptin *** *** Adiponectin ** Normal; normal diet group, Control; High Fat Diet-Negative Control group, HFD-GK; High Fat Diet-Positive Control group(garcinia cambogia), HFD-JCT: High Fat Diet-Jeoreongchajeonjatang administered group(extracts, 300mg/kg). The values are expressed as mean±sem(n=6). The significance were determined by Student t-test; + p < 0.05, ++ p < 0.01 and +++ p < (compared with ND), * p<0.05, ** p<0.01, and *** p<0.001(compared with HFD-control). Figure. 1. The effect of Jeoreongchajeonja-tang extracts on adipose weight of mice fed with high fat diet The abdominal subcutaneous fat, epididymal adipose tissue, kidney adipose tissue, intestine adipose tissue weight of each group of mice was detected for 7 weeks. Normal; normal diet group, Control; High Fat Diet- Control group, HFD-GK; High Fat Diet-Positive Control group(garcinia cambogia), HFD-JCT: High Fat Diet-Jeoreongchajeonjatang administered group(extracts, 300mg/kg). The values are expressed as mean±sem(n=6). The significance were determined by Student t-test; + p < 0.05, ++ p < 0.01 and +++ p < (compared with ND), * p<0.05, ** p<0.01, and *** p<0.001(compared with HFD-control).

9 16 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model 2) 간, 신장, 비장중량변화에미치는영향장기를적출하여간, 신장, 비장의중량을칭량하였다. 대조군 (HFD-CTL) 의간무게 (liver weight) 는정상군 (C57BL/6J_Nr) 에비해약 51.5% 유의하게증가하였고 (p<0.001) 신장무게 (kidney weight) 는정상군 (C57BL/ 6J_Nr) 에비해약 18.9% 증가하였다. 비장무게 (spleen weight) 는정상군 (C57BL/6J_Nr) 에비하여평균약 0.02 감소하였다. 양성대조군 (HFD-GK) 의간, 신장, 비장의무게는모두대조군 (HFD-CTL) 에비해낮은것을확인할수있었다. 실험군 (HFD-JCT) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해간무게 (liver weight) 약 30.4% 유의하게감소하였고 (p<0.001), 신장무게 (kidney weight) 는약 4.5% 감소, 비장무게 (spleen weight) 는약 22.2% 감소하였다 (Figure 2). 5. 비만관련유전자발현에미치는영향 1) AP2/FABP4 mrna 유전자발현분석간의 AP2/FABP4 mrna 유전자발현을분석한결과대조군 (HFD-CTL) 의유전자발현이 1.405±0.311로정상군 (C57BL/6J_Nr) 의 0.37±0.033에비하여약 3.79 배유의한증가를나타내었다 (p<0.01). 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 4.62배유의하게낮았다 (p<0.01). 실험군 (HFD-JCT) 의 AP2/FABP4 mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 37.7% 낮았지만유의하지않았다 (Table 6). 2) C/EBP-β mrna 유전자발현분석간의 C/EBP-β mrna 유전자발현을분석한결과대조군 (HFD-CTL) 의유전자발현이 2.051±0.651로정상군 (C57BL/6J_Nr) 의 0.288±0.017에비하여약 7.12 배유의한증가를나타내었다 (p<0.01). 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 4.46배유의 Figure. 2. The effect of Jeoreongchajeonja-tang extracts on organ weight of mice fed with high fat diet The liver, kidney, spleen weight of each group of mice was detected for 7 weeks. Normal; normal diet group, Control; High Fat Diet- Control group, HFD-GK; High Fat Diet-Positive Control group(garcinia cambogia), HFD-JCT: High Fat Diet-Jeoreongchajeonjatang administered group(extracts, 300mg/kg). The values are expressed as mean±sem(n=6). The significance were determined by Student t-test; +p < 0.05, ++p < 0.01 and +++p < (compared with ND), *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001(compared with HFD-control).

10 SW Jang et al. 17 하게낮았다 (p<0.05). 실험군 (HFD-JCT) 의 C/EBP-β mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 2.72 배유의하게감소 (p<0.05) 하였다 (Table 6). 3) UCP-2 mrna 유전자발현분석간의 UCP-2 mrna 유전자발현을분석한결과대조군 (HFD-CTL) 의유전자발현이 0.584±0.240로정상군 (C57BL/6J_Nr) 의 0.970±0.073에비하여약 39.7% 낮은결과를보였지만유의하지않았다. 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 79.7% 높았지만유의하지않았다. 실험군 (HFD-JCT) 의 UCP-2 mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 3.21 배유의하게증가하였다 (p<0.01) 하였다 (Table 6). 4) Adiponectin mrna 유전자발현분석간의 Adioponectin mrna 유전자발현을분석한결과대조군 (HFD-CTL) 의유전자발현이 0.840±0.249으로정상군 (C57BL/6J_Nr) 의 1.009±0.156 에비하여낮은결과를보였지만유의하지않았다. 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해높은결과를보였지만유의하지않았다. 실험군 (HFD-JCT) 의 Adioponectin mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 2.5배유의하게 (p<0.001) 높은결과를보였다 (Table 6). 5) Leptin mrna 유전자발현분석간의 Leptin mrna 유전자발현을분석한결과대 조군 (HFD-CTL) 의유전자발현이 2.737±0.761로정상군 (C57BL/6J_Nr) 의 1.137±0.228에비하여약 2.40 배유의한증가를나타내었다 (p<0.05). 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 2.24 배유의하게낮았다 (p<0.05). 실험군 (HFD-JCT) 의 Leptin mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 63.1% 유의하게감소 (p<0.05) 하였다 (Table 6). 6) SREBP1c/ADD1 mrna 유전자발현분석간의 SREBP1c/ADD1 mrna 유전자발현을분석한결과대조군 (HFD-CTL) 의유전자발현이 1.391±0.236 로정상군 (C57BL/6J_Nr) 의 0.097±0.010에비하여약 14.3배유의한증가를나타내었다 (p<0.001). 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 46.5% 유의하게낮았다 (p<0.05). 실험군 (HFD-JCT) 의 SREBP1c/ADD1 mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 37.6% 유의하게감소 (p<0.05) 하였다 (Table 6). 6. 병리조직학적분석 1) 간의병리조직학적분석고지방식이로유도된흰쥐모델에서시험물질에따른간조직검사 (H&E 염색, Oil Red O 염색 ) 를나타낸조직사진이다. 비만이유발된대조군 (HFD-CTL) 의간조직에서는지방이간세포질에축적되어지방구들이거대소포성 (macrovesicular) 으로변화되어현미경 Table 6. The Effect of Jeoreongchajeonja-tang extracts on the mrna Expressions in The Liver of Mice Fed with High Fat Diet Group Normal HFD-CTL HFD-GK_245 HFD-JCT AP2/FABP4 mrna 0.37± ±0.311 ## 0.30±0.018 ** 0.875±0.122 C/EBP-β mrna 0.288± ±0.651 ## 0.459±0.079 * 0.753±0.078 * UCP-2 mrna 0.970± ± ± ±0.256 ** Adiponectin mrna 1.009± ± ± ±0.184 *** Leptin mrna 1.137± ±0.761 # 1.221±0.204 * 1.009±0.416 * SREBP1c/ADD1 mrna 0.097± ±0.236 ### 0.744±0.195 * 0.867±0.111 * The mrna expressions in liver of mice fed with high fat diet was detected for 7 weeks. C57bl/6J-Nr; Normal; normal diet group, Control; High Fat Diet-Control group, HFD-GK; High Fat Diet-Positive Control group(garcinia cambogia), HFD-JCT: High Fat Diet-Jeoreongchajeonjatang administered group(extracts, 300mg/kg). The values are expressed as mean±sem(n=6). The significance were determined by Student t-test; # p < 0.05, ## p < 0.01 and ### p < (compared with ND), * p<0.05, ** p<0.01, and *** p<0.001(compared with HFD-control).

11 18 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model 상에 큰 지방구들이 보이며, 또한 H&E 염색과 Oil Red 2) 부고환 지방 세포의 병리조직학적 분석 O 염색시 회색 지방축적세포들이 넓게 분포하는 지방 고지방 식이로 유도된 흰 쥐 모델에서 부고환주 간이 나타난다. 정상군(C57BL/6J_Nr)과 비교하여, 고 변 지방조직 형태를 나타낸 조직 사진이다. 대조군 지방식이로 비만이 유도된 대조군(HFD_CTL)에서는 (HFD-CTL)은 광학 현미경 상에서 고지방식이 섭취로 인 회식지방축적세포들이 전체에 존재하고, 거대소포성 해 비만이 유발되면서 지방세포의 크기가 증가하였다. (macrovesicular) 지방증도 많이 존재하였다. 대조군 대조군(HFD-CTL)과 비교하여 양성대조군(HFD-GK)과 (HFD-CTL)과 비교하여 실험군(HFD-JCT)에서는 회식 실험군(HFD-JCT)에서는 부고환주변 지방조직 내 지 지방축적세포들과 거대소포성 (macrovesicular) 지방증 방세포 크기 증가가 억제되었다 (Figure 3B). 이 개선되었다 (Figure 3A). Figure 3A. The effect of Jeoreongchajeonja-tang extracts on histological profiles of liver in mice fed with high fat diet Figure 3B. The effect of Jeoreongchajeonja-tang extracts on histological profiles of epididymal adipose tissue in mice fed with high fat diet H&E and Oil red O staining of 5-mm paraffin-embedded liver tissue epididymal sections of each group of mice. Normal; normal diet group, Control; High Fat Diet-Control group, HFD-GK; High Fat Diet-Positive Control group(garcinia cambogia), HFD-JCT: High Fat Diet-Jeoreongchajeonjatang administered group (extracts, 300mg/kg).

12 SW Jang et al. 19 Figure 4. The effect of Jeoreongchajeonja-tang extracts on adipocyte area in mice fed with high fat diet The adipocyte area of each group of mice was detected for 7 weeks. Normal; normal diet group, Control; High Fat Diet-Control group, HFD-GK; High Fat Diet-Positive Control group(garcinia cambogia), HFD-JCT: High Fat Diet-Jeoreongchajeonjatang administered group(extracts, 300mg/kg). 3) 지방세포크기변화에미치는영향대조군 (HFD-CTL) 의지방세포크기는 μm로정상군 (C57BL/6J_Nr) 의 71.5 μm에비하여지방세포크기가 2.61 배유의하게증가였다 (p<0.001). 양성대조군 (HFD-GK) 의지방세포크기는 μm로대조군 (HFD-CTL) 에비해평균 7.3μm유의하게작았다 (p<0.001). 실험군 (HFD-JCT) 의지방세포크기는 μm로대조군 (HFD-CTL) 에비해평균 8.8μm가유의하게작았으며 (p<0.001), 양성대조군 (HFD-GK) 에비해서도평균크기가작은결과를보였다 (Figure 4). Ⅳ. 考察 현대의학에서는비만을체질량지수 (BMI) 에의해성인비만기준은 25kg/ m2이상으로정의하고, 복부비만은허리둘레로성인남자에서는 90cm, 여자에서는 85cm 이상으로정의한다. 비만의원인을크게원발 성원인, 이차성원인 2가지로분류하는데, 생활습관, 연령, 인종, 유전적요인, 장내미생물, 환경화학물질및독소등은원발성원인이며유전및선천성장애, 약물, 신경및내분비계질환, 정신질환등이이차성원인이다. 비만은제 2형당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 관상동맥질환, 대사증후군및뇌경색, 비알코올지방간질환, 통풍과같은합병증의발생율을높인다. 따라서비만치료의목표는체중감량을통해비만의합병증개선과예방이며, 치료목표는개개인의건강상태와조건에맞게현실적으로정해야한다. 치료전체중의 3~5% 를감량하더라도비만의동반질환및합병증을의미있게개선시킬수있다는보고가있다. 따라서개개인의상태에맞추어체중을줄이는것은비만의일차적치료목표가된다. 현대의학에서는비만의치료를행동치료, 식사치료, 운동치료를기본으로하고, 보조적인방법으로약물치료를병행한다. 현대의학에서약물요법의적응증은 BMI 30kg/ m2이상인경우, 비만관련합병증이있으면서식이, 운동,

13 20 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model 행동요법으로성공적으로개선되지않는 BMI 27kg/ m2이상의환자인경우에약물요법의대상이된다 5. 비만치료약들은현대의학에서크게두가지카테고리로분류한다. 첫째는식욕억제제이고둘째는위장관지방흡수억제제이다. 식욕억제제는시상하부의노르아드레날린, 도파민, 세로토닌수용체를대상으로작용한다. 위장관지방흡수억제제는선택적으로위장관에서지방의흡수를줄인다. 식욕억제제는배안쪽, 가쪽시상하부부분에작용하여노르아드레날린, 도파민의신경전달을증폭시키고, 도파민은감소시키는방식으로작용하며이의결과로포만감을증가시키고배고픔을줄이는효과를지닌다. 대표적으로 Phentermine/topiramate와 Lorcaserin이있다. Phentermine/topiramate는식욕억제제로아드레날린수용체에작용하며, 무작위이중맹검시험에서양성대조군에비해유의성있는체중감소효과가있었지만, 마비, 입마름, 변비, 불면, 산모에투여시선천성태아구개열등의심각한부작용이있었다. Lorcaserin은 5-HT2C 수용체작용물질로무작위이중맹검시험에서위약대조군에비해유의한체중감소를나타냈으나, 두통, 어지러움, 구역감등의부작용이있었다. 위장관지방흡수억제제에는대표적으로 Orlistat( 상품명 Xenical) 이있다. 이것은 lipase 억제제인 lipostatin의파생물로, 위와소장에서 lipase 의활성부위에공유결합하여 lipase 가지방을지방산으로가수분해하는것을막는다. Orlistat 은다중무작위이중맹검시험에서위약대조군에비해유의한체중감소효과를보였지만, 복용자의 10% 이하에서복부팽만, 변실금, 지방변, 증가된배변의부작용을보였다. 비만의확고한약물치료법이없기에현대의학에서는아직도파민, 노르아드레날린수용체작용제, 아편수용체억제제, glucagon-like peptide 1 수용체등을활용한새로운비만치료제가여전히개발및연구중에있다 6. 따라서, 유의한체중감소효과와동시에심각한부작용이없는개인별체질맞춤한의학비만약물치료제개발의필요성역시대두되는상황이다. 한의학에서는肥滿을肥, 肥胖, 肥人, 肉人, 肥 貴人등으로표현하며그原因에대하여 黃帝內徑 에서는過食肥甘膏粱厚味, 久臥, 久坐, 少勞, 素稟之體및外感濕邪및內傷七情등으로인한氣滯, 痰濁, 水濕, 瘀血등이肥滿을誘發한다고記錄하고있다. 비만의發生機轉을韓醫學에서는根本的으로장부의氣虛로보았으며, 運化機能의無力으로因하여이차적으로痰濕이發生하고이것이水液代謝를失調하여肥滿의原因이된다고보았다 18,19. 따라서, 韓醫學에서는肥滿의原因인痰飮을없애고氣血의循環을도와運化機能을도와주는藥物療法, 行動療法, 食餌療法, 針治療등이그治療法이된다 20. 電針刺戟과韓藥의竝合療法이肥滿治療에有意한效果를지닌다는점이밝혀졌다 四象醫學에서는肥滿에대하여特別히言及한部分은없으나, 東醫壽世保元 四端論 에서 肺以呼肝以納肝肺者呼吸氣液之門戶也. 脾以納腎以出腎脾者出納水穀之府庫也 라고하였으니, 少陽人의肥滿을出納水穀의問題로解釋할수있으며, 단순한體重의增加란側面보다全身的體內機能代謝調節의失調, 즉體質에따른臟腑의大小에의한差異에서오는病的不均衡常態로肥滿을理解해볼수있을것이다 24. 四象體質處方및藥材는肥滿을治療하는데에있어임상적으로널리사용되어왔다. 또한肥滿治療에사용할수있는다양한실험적근거를지닌다. 涼膈散火湯이 Gold thioglucose 로高脂肪食餌로誘發된肥滿白鼠에서체중증가억제, 간지질및체지방증가억제효과가있었다는보고가있고 10, 太陰調胃湯이비만쥐에서체지방을억제하고전지방세포인 3T3-L1의증식을억제한다고보고되었으며 25 少陽人肥滿方이비만유도생쥐모델에서체중감소, LDL-cholesterol, Triglyceride 감소에유의성을보였으며 16, 加味太陰調胃湯이부분비만일본인을대상으로 BMI 감소에유의한효과를나타냈다는보고도있다 11. 猪苓車前子湯은少陽人脾受寒表寒病亡陰

14 SW Jang et al. 21 證身熱頭痛泄瀉를치료하는처방 14 으로택사 ( 澤瀉 ) 적복령 ( 赤茯苓 ) 각 8g, 저령 ( 豬苓 ), 차전자 ( 車前子 ) 각 6g, 지모 ( 知母 ), 석고 ( 石膏 ) 강활 ( 羌活 ) 독활 ( 獨活 ) 형개 ( 荊芥 ) 방풍 ( 防風 ) 각 4g로構成되어있는데 (Table.1) 四象醫學적측면에서方劑의構成原理는강활 ( 羌活 ) 독활 ( 獨活 ) 형개 ( 荊芥 ) 방풍 ( 防風 ) 은脾局의陰氣를降陰하는약한정도의解表寒而降表陰을하고, 지모 ( 知母 ), 석고 ( 石膏 ) 를 1돈씩소량사용하여淸胃熱하며, 택사 ( 澤瀉 ) 적복령 ( 赤茯苓 ), 저령 ( 豬苓 ) 차전자 ( 車前子 ) 로腎局의陰氣를降陰하는利水而降表陰하여小便을통하게하는약으로해석할수있다 26. 실험적으로는, 猪苓車前子湯에들어간약재중방풍 ( 防風 ) 차전자 ( 車前子 ) 형개 ( 荊芥 ) 지모 ( 知母 ) 독활 ( 獨活 ) 은 Lipase inhibitor 인지방흡수억제제 Orlistat 과비교하여유사한수준의 Lipase 활성저해효과가입증되었다 27. 또한, 豬苓車前子湯은 100microgram/ml 의농도에서유의하게전지방세포의분화및증식을억제한다는보고가있다 17. 이처럼, 猪苓車前子湯은少陽人의肥滿處方으로서실험및임상에서두루사용되어왔음에도실질적으로猪苓車前子湯의항비만효과에대해규명한연구는없었다. 이에저자는猪苓車前子湯이고지방식이로비만을유도한마우스의체중변화, 식이효율, 혈청생화학검사 (Total cholesterol, triglyceride, Creatinine, AST, ALT, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol), 혈중호르몬단백질 (IGF-1, Leptin, Adiponectin), 장기및부위별지방중량의변화 ( 복부피하지방, 부고환, 신장, 창자, 간, 신장, 비장 ) 를측정하였다. 또, 간과부고환주변지방조직에서비만과관련된유전자발현 (AP2/FABP4 mrna, C/EBP-β mrna, UCP-2 mrna, Adiponectin mrna, Leptin mrna, SREBP1c/ADD1 mrna) 을분석하였고병리조직학적간과, 부고환, 지방세포크기를분석하였다. 이를통해猪苓車前子湯의항비만효과를확인하였다. 본연구에서는정상군 (C57BL/6J_Nr) 과고지방식이를투여한대조군 (HFD-CTL), 고지방식이투여후 Garcinia cambogia를투여한양성대조군 (HFD-GK), HFD에猪苓車前子湯 300mg/kg을투여한실험군 (HFD-JCT) 으로나누었으며각그룹당 6마리씩으로나누어 7주동안실험하였다. 체중변화에미치는영향에서는실험군 (HFD-JCT) 의체중이평균 8.1g 감소하면서고지방식이에의한체중증가유도를효율적으로억제할수있음을알수있었다 (Table 4). 일일평균식이섭취량과일일평균체중증가량을통해식이효율을보았을때, 실험군 (HFD-JCT) 의식이효율은 12.01±0.60% 로, 대조군 (HFD-CTL) 의 15.97±0.39% 에비해유의미한차이를보였다 (p<0.001). 양성대조군 (HFD-GK) 14.89±0.94% 에비해서도실험군 (HFD-JCT) 의식이효율은약 19.3% 낮은것을확인할수있었다 (Table 4). 이는식이섭취량에비해체중의증가가크지않다는것을의미한다. 실험군 (HFD-JCT) 에서식이섭취가위장관에서잘흡수되지않았거나실험군 (HFD-JCT) 의대사량이증가하였다는의미이다. 실질적으로猪苓車前子湯에의한체중증가의억제가다양한장기에서일어났는데, 실질장기의중량측정과병리조직학적 ( 현미경적 ) 측면에서이를확인하였다. 복부와부고환, 신장, 창자주변은내장지방이가장많이쌓이는부분으로, 이들의중량을측정하여서猪苓車前子湯의체지방감소에대한효과를확인하였다. 실험종료후실험군 (HFD-JCT) 이대조군 (HFD-CTL) 에비해복부피하지방, 부고환, 신장, 창자주변지방량모두감소하는것을확인할수있었다 (Figure 1). 또한, 간, 신장, 비장의장기무게의변화에서는실험군 (HFD-JCT) 의간무게 (liver weight) 는약 30.4% 감소하였으며대조군 (HFD-CTL) 에비해유의하였다. (p<0.001), 신장무게 (kidney weight) 는약 4.5%, 비장무게 (spleen weight) 약 22.2% 감소하였다. 하지만대조군 (HFD-CTL) 에비해유의하지는않았다 (Figure. 2). 간과부고환지방세포의병리조직학적분석에서, 정상군 (C57BL/6J_Nr) 에비해고지방식이섭취에의해비만이유발된대조군 (HFD_CTL) 은현미경상에서회식지방축적세포와거대소포성 (macrovesicular) 지방세포가전체적으로눈에띄게많이존재하였다. 반면,

15 22 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model 실험군 (HFD-JCT) 에서는상기세포들이현저하게줄어들었다 (Figure 3A). 부고환주변지방조직형태를관찰했을때도, 대조군 (HFD-CTL) 에비해실험군 (HFD- JCT) 군에서는부고환주변지방조직내지방세포의형태변화가적어, 정상군 (C57BL/6J_Nr) 과유사하였다 (Figure 3B). 실질적으로, 부고환주변지방조직의크기를측정하였을때에도실험군 (HFD-JCT) 의지방세포크기는 100.0μm로대조군 (HFD-CTL) 에비해평균 8.8 μm가유의하게작았다 (Figure 4). 따라서, 위의소견들을통해猪苓車前子湯이실질장기의중량을감소시켰고, 병리조직학적측면에서지방조직의크기를감소시켰음을입증하였다. 猪苓車前子湯은체지방의중량감소뿐만아니라혈청학적지표인 Liver Function test, Kidney Function test, 혈청 Cholesterol에서도개선효과도나타내었다. 혈청중 creatinine 의함량을분석한결과, 정상군 (C57 BL/6JJ_Nr) 은 0.23 mg/dl, 대조군 (HFD-CTL) 은 0.28 mg/dl, 양성대조군 (HFD-GK) 은 0.30 mg/dl, 실험군 (HFD-JCT) 은 0.27 mg/dl 이측정되었다 (Table 5). Creatinine은근육의 creatine phosphate 에서생성된대사산물로, 신장에서배설후세뇨관에서재흡수가거의이루어지지않고배설되기때문에혈중 creatinine 은신장기능을진단하는데중요한지표가된다. 검사결과대조군과실험군의혈중 creatinine 수준에차이가거의없었으므로猪苓車前子湯이신장의여과및재흡수, 배설작용에있어이상을일으키지않는다는것을의미한다. 간수치 (AST, ALT) 에있어서실험군 (HFD-JCT) 의혈중 AST 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해유의하지는않았으나 13.6% 감소하였고, ALT 는대조군 (HFD-CTL) 에비해 67.9% 유의미하게감소하였다 (p<0.001) (Table 5). 혈청 AST, ALT 는간세포의변성과괴사가진행되어 transaminase가혈중유리되어높아짐에따라증가하는것으로간조직손상의지표가되며, AST, ALT 효소의활성도는흰쥐에서고지방식이, 간염, 지방간, 간암에서간실질세포의장애로증가하는것으로보고되고있다 28. 따라서猪苓車前子湯은간독성이없으며, 오히려고지방식 이로인해유도될수있는비알코올성지방간을예방할수있는효과가기대된다. 혈중지질학적분석결과에서실험군 (HFD-JCT) 의총콜레스테롤 (T-cholesterol) 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해유의하게감소하는겻을확인했다 (p<0.001). 양성대조군 (HFD-GK) 에비해서도실험군 (HFD-JCT) 군의수치가약 9.6% 낮았다 (Table 5). 또한, 혈중중성지방 (Triglyceride) 량에서실험군 (HFD-JCT) 의중성지방 (Triglyceride) 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해유의하게감소 (p<0.001) 하였다 (Table 5). 중성지방 (Triglyceride) 은사람과동물의체지방을구성하는주요구성요소로, VLDL(very-low-density lipoprotein) 과 chylomicron 의주요구성성분이되고, 혈중에서는 lipoprotein lipase 에의해지방산과글리세롤로분해되어, lipoprotein에둘러쌓여 adipose fat 과 liver 에서양방향으로지방을수송한다. 콜레스테롤은세포막의구성성분이자중성지방 (triglyceride) 과함께대표적인인체내지질로서, 혈관의강화유지, 호르몬생산, 담즙생산에관여하지만수치가증가하는경우중성지방과함께동맥경화나순환기질환의주요원인이된다 29. 실험군 (HFD-JCT) 이대조군 (HFD-CTL) 에비해 HDL-cholesterol은약 8.4% 유의미하게높았으며 (p<0.01) (Table 5), LDLcholesterol은실험군 (HFD-JCT) 이대조군 (HFD-CTL) 에비해약 33.8% 유의미하게낮았다 (p<0.001) (Table 5). HDL 은대식세포로부터콜레스테롤을제거하고, 항산화, 혈전방지, 혈관내피세포기능유지를통해죽상경화증을방어한다고한다 30. 따라서, HDL 이높아지는식이요법을할수록심혈관계질환의위험성을낮춘다는보고가있으며 31, 반면, 혈중에순환하는 LDL 은대식세포에축적되어거품세포를유발시키고죽상경화반을형성하는데에일조한다 32. 혈중지질농도를감소시키는약재들을처치함으로서 LDL 이산화될위험성을감소시키고이를통해아세틸콜린에대한혈관운동성반응을촉진시킴으로서, 혈관내피세포를정상화시킬수있다 33. 따라서猪苓車前子湯이혈중 LDL 농도를낮춰주고 HDL 농도를증가시킴으로서, 비만의합병증인죽상동맥경화증, 심혈관질환의

16 SW Jang et al. 23 치료및예방에사용할수있는가능성을확인할수있었다. 猪苓車前子湯은이외에도비만관련다양한인자들에영향을주고있었는데, 우선, 인슐린유사생장인자 (Insulin-like growth factor, IGF) 는성장호르몬에의존한성장인자로, 혈액중의 IGF-1 는비만인경우내장지방에서의 Adiponectin 생산이감소하고높아진 insulin에의해 IGF-1 활성이높아진다 34. 혈중 IGF-1 의발현량을분석한결과실험군 (HFD-JCT) 은대조군 (HFD-CTL) 에비하여 IGF-1의발현량이약 24% 유의하게감소 (p<0.001) 하였고양성대조군 (HFD-GK) 의 IGF-1 수치를비교하였을때에도실험군 (HFD-JCT) 이약 7% 낮은결과를보였다 (Table 5). Leptin 은염색체 7q32에있는 Ob gene 의산물이며, adipocyte에의해주로분비되는단백질호르몬이다. Leptin 의생산과혈중농도는 BMI, 체내지방과강력한상관관계를지닌다 35. 에너지가과잉축적될경우 Leptin 이지방세포에서분비되기떄문에비만인의대부분 leptin 농도가증가되어있다. 본연구에서흰쥐의혈중 Leptin 의함량을분석한결과실험군 (HFD-JCT) 의 Leptin 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해약 22.6% 유의하게감소 (p<0.001) 하였고, 실험군 (HFD-JCT) 과양성대조군 (HFD-GK) 의 Leptin 수치를비교하였을때에는유의한차이가없었다 (Table 5). mrna level 에서 Leptin mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 63.1% 유의하게감소 (p<0.05) 하였다 (Table 6). Adiponectin은지방조직에서분비되는 cytokine 으로혈중유리지방산농도를감소시키고, 지질상태를개선시키고, 혈당조절에도움을주며, 당뇨환자에서염증을줄여준다 35. adiponectin 은비만시에는농도가감소하며, 비만쥐모델에서 adiponectin 의투여가비만으로인한인슐린저항성을개선시킨다는보고가있다 36. 본연구에서는흰쥐의혈중 Adiponectin 단백질량을분석한결과, 실험군 (HFD-JCT) 의 Adiponectin 수치는대조군 (HFD-CTL) 에비해약 27.9% 유의하게높았다 (p<0.01), (Table 5). 또한 mrna level 에서도 실험군 (HFD-JCT) 의 Adioponectin mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해 2.5배유의하게높았다 (p<0.001) (Table 6), 猪苓車前子湯은 Adioponectin mrna 와 Adiponectin 발현량을증가시킴으로서비만의합병증인인슐린저항성및제 2형당뇨병, 대사증후군에대한치료에사용할수있는가능성을확인할수있었다. 猪苓車前子湯이비만관련유전자발현에미치는영향을알아보기위해간의 AP2/FABP4 mrna, C/EBP-β mrna, UCP-2 mrna, SREBP1c/ADD1 mrna 유전자발현을분석하였다. 지방세포유전자조절부위에전사활성인자가활성화되면지방전구세포에서성숙한지방세포로의분화가이루어진다. 이러한지방세포분화를조절하는인자는 AP2/FABP4, C/EBPs, SREBPs mrna 등이있다 37. 실험군 (HFD-JCT) 에서대조군 (HFD-CTL) 에비해 AP2/FABP4 mrna 가약 37.7% 감소하였지만유의하지는않았다. 반면, 양성대조군 (HFD-GK) 은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 4.62 배유의하게낮았다 (p<0.01) (Table 6). C/EBP-β(CCAAT/enhancer-binding protein beta) mrna는 C/EBP-β 을발현하는 mrna이며, 번역된단백질은지방세포의분화초기단계를유도하는역할을한다. C/EBP-β를과하게발현하는경우지방생성자극과관계없이지방세포생성을촉진시킨다는보고가있다 38. 실험군 (HFD-JCT) 의 C/EBP-β mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 2.72배유의하게낮게나타났다 (p<0.05) (Table 6). 비만의초기분화와지방세포생성촉진신호를猪苓車前子湯이 mrna 수준에서감소시켜항비만효과가있음을알수있다. UCP-2 mrna는 mitochondrial uncoupling protein 2 를만드는 mrna인데 Mitochondiral uncoupling proteins(ucp) 는 Mitochondrial anion carrier proteins(macp) 중하나이며, ATP 를생산하는산화적인산화과정과는구별되는 proton leak을통해 nonshivering thermogenesis 에관여한다. 즉, proton 을미토콘드리아에서 ATP 대신열로발생시켜에너지소비를증가시키는단백질이다 39. 본실험에서실험군 (HFD-JCT) 의 UCP-2

17 24 Anti-obesity Effect of Jeoreongchajeonja-tang in a High-fat Diet-induced Obesity Mouse model mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 3.21 배유의하게증가하였다 (p<0.01) (Table 6). 따라서猪苓車前子湯이미토콘드리아에서열생산을증가시키고에너지소비를촉진시켜빠른에너지소비를유도함을알수있었다. SREBP-1 mrna 는지방의합성과수송에영향을주는유전자로, 비만환자가체중감량을하면 SREBP1c/ADD1 발현이감소한다 40. 본실험에서猪苓車前子湯투여군의 SREBP1c/ADD1 mrna 발현량은대조군 (HFD-CTL) 에비해약 37.6% 유의하게감소 (p<0.05) 하였다 (Table 6). 이상의결과를통해猪苓車前子湯이간및부고환지방세포에서의비만관련유전자발현에 mrna level 에서유의한영향을끼친다는사실을확인할수있었다. 이상의연구를통해猪苓車前子湯이체중을감소시키고식이효율을떨어뜨리며 (Table 4) 이는구체적으로조직학적검사에서猪苓車前子湯이복부, 간, 부고환, 지라의지방량을감소시켰고, (Figure 1) 병리조직검사에서는간과부고환에서지방세포의형태변화및크기증가를억제하였음을입증하였다. (Figure 3A, 3B, 4) 또한, 猪苓車前子湯이혈중총콜레스테롤, 중성지방, LDL-cholesterol을낮추고 HDL-cholesterol을높임을확인하였다 (Table 5). 이것은, 猪苓車前子湯이혈청단백질호르몬인 Leptin, IGF-1 Adiponentin 뿐만아니라 AP2/FABP4 mrna, C/EBP-β mrna, UCP-2 mrna, Leptin mrna, Adioponentin mrna, SREBP1c/ADD1 mrna 등 mrna level 에서작용한결과로추정된다 (Table 6). 猪苓車前子湯에들어간약재중방풍 ( 防風 ) 차전자 ( 車前子 ) 형개 ( 荊芥 ) 지모 ( 知母 ) 독활 ( 獨活 ) 은 Orlistat과유사한지방소화효소 (Lipase) 활성저해효과가입증되었고 27, 豬苓車前子湯은 100microgram/ml 의농도에서유의하게전지방세포의분화및증식을억제한다는보고가있다 17. 현대의학에서비만에사용하는약물중지방흡수억제제로분류된 Orlistat(Xenical) 도 Lipase inhibitor 로서작용한다 6. 豬苓車前子湯가위의연구들을보아 Orlistat과마찬가지로지방흡수 억제제의개념으로항비만효과가있는것인지에대해서는추가적인연구가필요하다. 본연구는猪苓車前子湯이실질적으로항비만효과가있는지, 또, 단백질, mrna level 에서어떻게작용하는지에대하여밝혀내었다. 하지만약의기전에대한연구는추가적으로필요하다. 저자는비만유도마우스에게猪苓車前子湯을투여하여비만억제단백질및비만관련유전자발현과관련된유의한데이터를얻었다. 추가적으로猪苓車前子湯이 Lipase 에어떤기전으로작용하는지, Orlistat(Xenical) 과같은지방흡수억제제와猪苓車前子湯의상호작용, 효과성및독성에대한비교연구및실험이추가적으로필요할것으로사료된다. Ⅴ. 結論 고지방식이로숫컷 C57bl/6 생쥐에비만을유도한후저령차전자탕 (JCT) 을 300mg/kg로투여한마우스에서체중변화, 식이효율, 혈청생화학적검사, 혈청 Leptin, IGF-1, adioponectin 검사, 장기및부위별지방중량측정, 간, 부고환지방세포유전자발현분석, 병리조직학적분석을통하여측정한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 실험군 (HFD-JCT) 은체중증가를유의하게억제하였다. 2. 실험군 (HFD-JCT) 은식이효율을유의하게억제하였다 (p<0.001). 3. 실험군 (HFD-JCT) 은대조군 (HFD-CTL) 과혈청 Creatinine 농도에유의한차이가없었다. 4. 실험군 (HFD-JCT) 은혈청 AST는감소하였으나유의미하지않았고, ALT 는유의미하게감소하였다 (p<0.001). 5. 실험군 (HFD-JCT) 은혈청중총콜레스테롤 (T- Choletserol) 이유의하게감소 (p<0.001) 하였으며, 중성지방 (Triglyceride) 도유의하게감소 (p<0.001)

18 SW Jang et al. 25 하였고, HDL-cholesterol은유의미하게높았고 (p<0.01), LDL-cholesterol 은유의하게낮았다 (p<0.001). 6. 실험군 (HFD-JCT) 은 IGF-1 수치가유의하게감소 (p<0.001) 하였다. 7. 실험군 (HFD-JCT) 은혈중 Leptin 이유의하게낮았고 (p<0.001) Adioponectin은유의하게높았다 (p<0.01). 8. 실험군 (HFD-JCT) 은복부피하지방, 부고환, 신장, 창자주변의지방조직의증량이유의하게감소하였다. 9. 실험군 (HFD-JCT) 은간무게, 신장무게, 비장무게가감소하였다. 간무게는유의하게감소하였다 (p<0.001). 10. 간의유전자발현검사결과실험군 (HFD-JCT) 은 AP2/FABP4 mrna 발현은낮았지만유의하지않았고, C/EBP-β mrna 발현은유의하게감소 (p<0.05) 하였고, UCP-2 mrna 발현은유의하게증가 (p<0.01) 하였으며, Adiponectin mrna 발현은유의하게증가 (p<0.001) 하였고, Leptin mrna 발현은유의하게감소 (p<0.05) 하였고, SREBPc/ADD1 mrna 는유의하게감소 (p<0.05) 하였다. 11. 병리조직분석결과실험군 (HFD-JCT) 은간의회식지방축적세포들과거대소포성 (mascrovesicular) 지방증이현저하게개선되었으며, 부고환주변지방조직내지방세포증가가억제되었고, 지방세포크기는유의하게작았다 (p<0.001). 이상의결과는저령차전자탕 (JCT) 이고지방사료로비만을유도한마우스의항비만작용에효과가있음을나타내며향후비만의예방과치료에저령차전자탕이유용하게활용될수있을것이라예상된다. Ⅵ. Acknwolegement 상기연구는과학기술정보통신부 ' 체질특성에따른대사성질환의치료약물및기기임상연구 ' ( 과제번호 : 2015M3A9B ) 의지원을받아수행되었음. Ⅶ. References 1. Bray GA. The Battle of the Bulge: A History of Obesity Research, Dorrance, Pittsburgh Guh DP, Zhang W, Bansback N, Amarsi Z, Birmingham CL, Anis AH. The of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic and meta-analysis. BMC Public Health 2009;9: Lenz M, Richter T, Muhlhauser I. The morbidity and mortality associated with and obesity in adulthood: a systematic review. Dtsch Arztebl Int 2009;106(40): Oh SW, Yoon YS, Shin SA. Effects of excess weight on cancer incidences depending on cancer sites and histologic findings among men: Korea National Health Insurance Corporation Study. J Clin Oncol 2005;23(21): Kang Jae hun, Kang Joon Goo, Kang Ji Hun et al. Korean Obesity Treatment Guideline 2014, Korean Soceity For The Study Of Obesity, (Korean) 6. Dennis L.Kasper, Anthony S.Fauci, Dan L.Longo et al. Harrison s Principles Of Internal Medicine 19 th edition McGraw-Hill Education Lee, Sung-Hyun, Lee, Jae-Sung, The Reductive Effects of Oriental Medicine on the Body Fat and Abdominal Obesity, The Society of Korean Medicine for Obesity Research. 2001:1(1):33-42.(Korean) 8. Moon Soo Jung, Review of Clinical Studies on Oriental Medicine Treatment for Obesity in the Korean Literature, Master Dissertation, Wonkwang University, 2010.(Korean)

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