<C3D6C1BE2DB4EBC7D1C7D1C0C7C7D020B9E6C1A6C7D0C8B8C1F620C1A63232B1C7C1A631C8A32E687770>

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1 대한한의학방제학회지제22권제1호 Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~192 pissn , eissn Official Journal of The Korean Medicine Society For The Herbal Formula Study Available at Original Article / 원저 강황추출물이 Diethylnitrosamine 과 CCl 4 로유발된흰쥐의간암과간손상에미치는영향 정태산 최창원 * 동신대학교한의과대학내과학교실 The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage Induced by Diethylnitrosamine (DENA) and CCl 4 in Rats Tae-san Jung Chang-won Choi * Department of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Dong-shin University ABSTRACT Objective : In order to investigate the effect of Curcumae Longae Rhizoma(CLR) extract on the hepatocellular carcinogenesis and acute liver damage induced by diethylnitrosamine(dena) and CCl 4 in rats. Methods : Experimental groups were subdivided into four; normal group (Nor), acute liver damage and hepatocellular cancer inducing control group (Con), and CLR extract 200 mg / kg /day (CAA) or 400 mg / kg /day (CAB) administered groups to Con. Thereafter the changes of the body weight, the liver weight and the weight of liver/100g body weight, total cholesterol, HDL cholesterol, triglyceride, the activities of AST, ALT, ALP, LDH, AFP, SOD, catalase were measured. And we observed by optical and electron microscopy. c 2014 The Korean Medicine Society For The Herbal Formula Study This paper is available at http//: which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 177

2 대한한의학 방제학회지 제22권 제1호 (2014년 6월) Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~192 Result : 1. The body weight was decreased in Con compared with Nor for 5 weeks, but increased in Con compared with Nor from 6 week to 9 week. During experimental period of total 9 weeks, CAA and CAB were increased compared with Con. 2. The liver weight was increased significantly (p<0.05) in Con compared with Nor. The weight of liver/100g body weight was increased significantly (p<0.05) in Con compared with Nor and decreased significantly (p<0.05) in CAB compared with Con. 3. The level of total cholesterol was increased in Con and CAA compared with Nor, but there was not statistically significant. The level of triglyceride was decreased in Con compared with Nor. But increased in CAA and CAB compared with Con. The level of HDL-cholesterol was significantly increased (p<0.05) in CAA and CAB compared with Con. 4. The activities of AST, ALT were increased in Con compared with Nor, but decreased in CAA compared with Con, significantly decreased (p<0.05) in CAB compared with Con. 5. The activities of ALP, LDH were increased in Con compared with Nor, but decreased in CAA and CAB compared with Con. 6. The activities of AFP was increased significantly (p<0.05) in Con compared with Nor, but decreased significantly (p<0.05) in CAA and CAB compared with Con. 7. The activities of SOD were increased in Con, CAA and CAB compared with Nor, but decreased in CAA and CAB compared with Con. The activities of Catalase was more increased in CAA and CAB compared than Con. 8. The results of light microscopical observation, a number of hepatocytes were damaged in Con compared with Nor and CAB. 9. According to the electron microscopical observation, irregular nuclear membrane, condensed nucleoplasm was observed in Con, the experimental group was observed in the nucleus of the well-preserved and evenly developed nucleoplasm. Conclusions : These results suggest that administration of CLR extract suppress or retard on the hepatocellular carcinogenesis and acute liver damage induced by DENA and CCl4 in rats. Keyword : Hepatocellular carcinogenesis, Acute liver damage, Diethylnitrosamine(DENA), CCl4, Curcumae Longae Rhizoma(CLR) Ⅰ. 서 히 이루어지고 있으나 뚜렷한 효과를 나타내는 론 1) 치료약제의 개발은 부족한 실정이다. 29) 간은 인체의 모든 대사 기능의 중심이 되며 체 간암은 세계적으로 가장 빈도가 높은 종양 중 내성 체외성 유독물질에 대한 해독작용을 하는 의 하나로 특히 아시아와 남부 아프리카에 많이 발생하며3), 국내에서는 2011년 현재 폐암에 이어 장기이기 때문에 간의 심한 손상은 인체기능의 치명적인 손상을 가져온다1). 간 손상의 원인으로 두 번째로 높은 사망률을 기록하고 있다4). 일반적 는 바이러스의 감염, 약물중독, 지속적인 음주, 혈 으로 간암의 위험 인자로는 간경화증과 같은 만 관장애, 대사장애 등이 있으며, 이로 인한 질환으 성 간질환을 들 수 있으며, 우리나라에서는 B형 로는 肝炎, 肝硬便症, 肝癌, 肝디스토마, 肝梅毒 및 C형 간염 바이러스, 알코올 등도 주요 위험인 자로 알려져 있다5). 2) 및 肝性昏睡 등이 있다. 이러한 간 손상을 치유 하기 위한 방법으로 천연물을 이용한 간 기능 보 현재 간암 치료는 외과적 절제술을 기본으로 호제 또는 간 질환의 치료제 개발의 연구가 활발 간 동맥 색전술, 국소치료법, 간 이식 등이 시행 * Corresponding author : Chang-won Choi, PhD. Professor, Department of Internal Medicine of Korean Medicine, Dong-shin University, , Jorye-dong, Suncheon-si, Jeollanam-do, , South Korea. Tel : medijun@paran.com Received : May 25, 2014 / Revised : June 16, 2014 / Accepted : June 17,

3 정태산외 1 인 : 강황추출물이흰쥐의간암과간손상에미치는영향 Jung et al., The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage 되고있으나우리나라간암환자의대다수가간기능이저하된간경변증을동반하고있어수술이가능한경우는많지않다 6). 또한현재시행하는치료법으로는암세포주에대한직접적인살상을목표로하고있기때문에세포독성효과는있지만대부분개체저항력을떨어뜨리는부작용이있어, 최근에는부작용이적은생약과복합처방이연구대상이되고있다 7). 최근한의학에서간암에대해진행되는실험적연구로는간암에대한병태모델이나간암세포주를대상으로하는단일약재 8-10), 한약처방 11-13), 약침액투여 14-16) 의유효성과항암효과에대한연구가이루어지고있으며, 임상증례보고 17-19) 등을통해간암에대한한의학적치료방법을연구하고있다. 강황 (Curcumae longae Rhizoma) 은생강과식물인강황 (Curcuma longa L.) 의根莖을건조한것으로性味는溫無毒辛苦하고肝, 脾經으로歸經하며破血行氣, 通經止痛등의效能으로心腹痞滿脹痛, 經閉, 癓瘕, 風濕肩臂疼痛, 跌撲腫痛등에활용된다 20,21). 이에대한연구로항산화효과 22), 항균효과 23) 등이究明되었고, 다양한암세포주를이용한실험 24-26) 에서항암효과가있다고증명되었으나실험동물에암을유발시킨후약물을경구투여하여관찰한연구모델은없었다. 이에저자는 diethylnitrosamine과 CCl 4 로간손상과간암을유발시킨후, 강황추출액의항암효과와간손상에미치는영향을究明하기위하여체중과간중량의변화, 혈청지질의변화, transaminase (AST, ALT) 의활성, alkaline phosphatase (ALP) 와 lactate dehydrogenase (LDH) 의활성, superoxide dismutase (SOD) 와 catalase의활성, 간조직의광학현미경관찰, 간세포의전자현미경관찰등을통해유의성있는결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 실험동물실험은동물실험윤리위원회의승인을얻어시 행하였으며, 동물관리규정을준수하였다. 체중 200±10 g 내외의 7주령흰쥐 (Sprague Dawley) 를샘타고 ( 오산, 한국 ) 로부터구입하였다. 실험동물은동신대학교한의과대학동물사육실에서일정한조건 ( 온도 : 21±2, 습도 : 50-60%, 12시간주기명 / 암 ) 하에서일반고형사료 ( 샘타코, 흰쥐용 ) 와물을충분히공급하면서 1주동안적응시킨후실험에사용하였다. 2) 약재및약물추출본실험에사용한강황 (Curcumae longae Rhizoma) 은중국산강황 (Curcuma longa L.) 을동신대학교부속한방병원에서 2012년 3월에구입한후정선하였으며, 약물추출은강황 40 g 을물 900 ml에넣고약탕기로 3시간동안가열한다음농축한후저온순환수조 (COOL ACE CA-1500) 에서 1 차동결한다음동결건조기 (Samwon, SFDSMO06, 한국 ) 로동결건조하여 5.5 g 의분말을얻었다. 2. 방법 1) 간손상및간암유발정상군을제외한모든실험동물은 diethylnitrosamine (DENA, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) 200 mg / kg을 0.9% 식염수 1 ml에용해하여 1주간격으로 2회복강투여하였다. DENA투여 1주후부터 carbon tetrachloride(ccl 4, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) 와 corn oil을 1:1로희석한약물 1 ml을 1주간격으로 3회복강투여하여간손상과간암을유발하였다. 2) 실험군설정및약물투여정상군은통상적인사료와물을공급하였으며, 대조군은간손상과간암이유발된후부터식염수 0.5 ml을실험기간동안매일구강투여하였다. 실험군은실험기간 (9주) 동안매일강황추출액건조분말을음용수에용해하여 200 mg / kg ( 이하 CAA군 ) 와 2배에해당하는 400 mg / kg ( 이하 CAB군 ) 을구강투여하였다. 179

4 대한한의학방제학회지제 22 권제 1 호 (2014 년 6 월 ) Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~ 관찰방법 1) 체중측정대조군과실험군의체중은 1주간격으로실험기간동안측정하였으며, 체중측정 12 시간전부터금식시켰다. 2) 간중량측정흰쥐의간중량측정을위하여실험기간인 9주후 urethane(0.75 mg / kg ) 을복강투여하여마취하였다. 흉강을열고심장채혈한다음간을적출하였고, 생리식염수로세척한다음수분을제거하고서 chemical balance(saturous, USA) 를이용하여측정하였다. 간의무게는실험동물체중 100 g 당무게로환산하였다. 3) Total cholesterol, HDL cholesterol, Triglyceride 함량측정혈액은시험관에넣어실온에서 30분간방치하여혈액을응고시킨다음 3,000 rpm 에서원심분리하여혈청을얻었다. Total cholesterol은 Allain 등의방법 27) 에따라 546 nm파장에서, HDL cholesterol 은 Warnick 와 Albers의방법 28) 에따라 546 nm파장에서, triglyceride는 McGowan 등의방법 29) 에따라 505 nm파장에서측정하였으며, 모든시약은 Kit (ELITECH, France) 를사용하였다. 4) 혈청 Transaminase 활성측정혈청중 aspartate aminotransferase(ast) 와 alanine aminotransferase (ALT) 의활성측정은 Reitman-Frankel 의방법 30) 에따라 kit 시약 ( 아산제약, 한국 ) 을사용하여측정하였다. AST와 ALT 기질액 1.0 ml을시험관에넣고 37 에서 5분간방치한다음혈청 0.2 ml을넣어잘혼합한후 37 에서 AST는 60분, ALT는 30분간반응시킨다음정색시액 1.0 ml을첨가하여잘혼합하여실온에서 20분간방치하여반응을종료시키고, 0.4 N NaOH 용액 10 ml을가하여잘혼합한다음실온에서약 10분간방치하였다가 505 nm에서흡광도 (photometer 5010, Robert Riele GmbH, Germany) 의변화를측정하였다. 5) Alkaline phosphatase(alp) 함량측정 ALP 활성도측정은 Reitman-Frankel 방법 30) 에의한 kit 시약 ( 아산제약, 한국 ) 을사용하여 405 nm에서측정하였다. 6) Lactate dehydrogenase(ldh) 함량측정 LDH 활성도측정은 Reitman-Frankel 방법 30) 에의한 kit 시약 ( 아산제약, 한국 ) 을사용하여 340 nm에서측정하였다. 7) 혈청 AFP 측정심장채혈하여획득한혈액 (10 μl ) 을증류수 40 μl에희석하였다. 혈액샘플은 AFP를측정하기전까지 -80 초저온냉동고에보관하였다. 그다음 AFP ELISA kit(sierra Resources International, Inc., Valrico, FL) 를이용하여완충액에희석된혈액샘플 10 μl에서혈청내 AFP 농도를측정하였으며, 제조사의실험방법에따라수행하였다. 8) Superoxide Dismutase (SOD) 활성도측정대조군과실험군흰쥐로부터혈청을수집하고, 이를원심분리한후얻은상층액을 SOD 활성을측정하기위한효소원으로이용하였다. 단백질정량은 Bio-Rad assay를이용하였으며, -70 의 deep freezer에보관하면서실험에이용하였다. SOD 활성도는 SOD assay kit(dojindo, Japan) 를이용하여 450nm에서흡광도를측정한후 SOD 활성도를계산하였다. 9) Catalase 활성도측정 Catalase 활성도측정은 Beers and Sizer의방법 31) 에준하여 50 mm 인산칼슘완충액 (ph 7.2) 에기질인 10 mm H 2O 2 와효소액을가하여최종반응액이 3.0 ml이되게한다음 25 에서 30 초간반응시키면서 240 nm파장에서소실되는 H 2O 2 의양을측정하였다. 효소활성도의단위는 15초간에 1 mg의단백이반응하여환원시킨 H 2O 2 를μm로나타내었다. 180

5 정태산외 1 인 : 강황추출물이흰쥐의간암과간손상에미치는영향 Jung et al., The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage 10) 광학현미경관찰흰쥐의간조직을적출하고 Bouin 용액을사용하여 24시간동안고정시킨다음, 30, 50, 70, 90, 95, 100Ⅰ, 100Ⅱ와같이알코올농도를상승시켜탈수한다음 xylene으로투명화과정을거친후 paraffin 으로포매하였고, 포매된조직을 microtome 을사용하여 5 μm 두께로절편하였다. 절편한조직을 slide glass 위에부착시키고 xylene으로 paraffin 을제거한다음 100%, 90%, 80% ethanol 과같이농도가낮아지는순으로 5분씩담구어함수과정을거치게하였다. Hematoxylin 과 Eosin으로이중염색을한다음탈수하였다. Canada balsam으로봉합한후카메라부착광학현미경 (Olympus BX51, Japan) 으로관찰한후사진을촬영하였다. Figure 1. The changes of body weight during 9 weeks. Nor, administered saline; Con, control group administered administered CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administered CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. (n=6) 11) 전자현미경관찰전자현미경관찰을위하여광학현미경시료와동일한부위의조직을절취하여전고정액속에서 1 mm3크기로세절한후 2.5 % glutaraldehyde (phosphate buffer, ph 7.4) 로 2시간동안전고정하였다. 전고정이끝난조직은동일완충액을사용 10분간격으로 3회세척한다음 1 % osmium tetroxide(oso 4) 로 2시간동안고정한다음동일완충액으로 3회세척하였다. 세척후시료들은상승농도순의에탄올로탈수하여 propylene oxide 로치환한다음 Epon-Araldite 혼합액으로포매하였고 60 오븐에서 30시간중합시켰다. 포매된조직들을 LKB-Ⅴ형 ultramicrotome을사용하여 1 μm두께로절편을제작하고 1 % toluidine blue 로 hot plate(60 ) 상에서염색하였다. 염색된시료를광학현미경으로관찰하여조직을확인한다음동일한부위에서 60 nm두께로초박절편을제작하여 silver grid에부착하였고, uranyle acetate 와 lead citrate로이중염색한다음 JEM 100 CX-Ⅱ 투과형전자현미경 (Jeol Ltd, Tokyo, Japan) 으로관찰하였다. 12) 통계분석실험에서얻은결과는평균 ± 표준편차로나타내 었으며, 통계분석은 Student's t-test 와 one-way ANOVA test를통하여 p-value 값이 0.05 미만일때통계적으로유의한차이가있는것으로판정하였다. Ⅲ. 결과 1. 체중의변화흰쥐의체중변화를측정한결과, 대조군의체중은정상군에비하여 5주까지는감소하였으나 6 주이후부터는정상군보다증가하기시작하였다. 실험군의체중은대조군에비하여모든실험기간동안증가하였다 (Fig. 1). 2. 간중량및체중 100g 당간중량의변화 1) 간중량간중량을측정한결과정상군 (11.0±0.32 g) 에비하여대조군 (14.18±0.45 g) 은유의성 ( # p<0.05) 있게증가하였고, CAA군 (13.91±0.49 g) 과 CAB군 (13.15±0.70 g) 은대조군에비해감소하였으나유의성은없었다 (Fig. 2A). 181

6 대한한의학방제학회지제 22 권제 1 호 (2014 년 6 월 ) Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~192 Figure 2A. The comparison of liver weight from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl 4 treatment; CAA, CLR extract 200 mg / kg /day administered group; CAB, CLR extract 400 mg / kg /day administered group during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with normal at # p <0.05. (n=6) Figure 3. The changes of cholesterol concentration from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6) Figure 2B. Comparison of liver weight per 100g body weight from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl 4 treatment; CAA, CLR extract 200 mg / kg /day administered group; CAB, CLR extract 400 mg / kg /day administered group during 9 after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with normal at # p<0.05 or control at * p<0.05. (n=6) 2) 체중 100g 당간중량흰쥐의체중 100g 당간의중량을측정한결과정상군 (2.22±0.05 g) 에비하여대조군 (2.85±0.09 g) 은유의성 ( # p<0.05) 있게증가하였으며, CAA군 (2.73±0.10 g) 과 CAB군 (2.41±0.07 g) 은대조군에비하여감소하였고, 특히 CAB군은유의성 ( * p <0.05) 있게감소하였다 (Fig. 2B). 3. 혈청지질함량의변화 1) 총콜레스테롤함량총콜레스테롤의함량을측정한결과정상군 Figure 4. The changes of triglyceride concentration from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6) (72±3.21 mg / dl ) 에비하여대조군 (79±3.87 mg / dl ) 과 CAA군 (80±4.06 mg / dl ) 에서약 10 % 증가하였으나, 통계적인유의성은없었으며, CAB군 (71±6.13 mg / dl ) 은대조군에비해낮게측정되었으나유의성은없었다 (Fig. 3). 2) Triglyceride의함량중성지방의함량을측정한결과정상군 (74±6.31 mg /dl) 에비하여대조군 (64±7.40 mg /dl) 이약 14% 감소하였으며, CAA군 (71±10.0mg/dL) 과 CAB군 (75±15.62 mg /dl) 은대조군보다증가하였으나통계적인유의성은없었다 (Fig. 4). 182

7 정태산외 1 인 : 강황추출물이흰쥐의간암과간손상에미치는영향 Jung et al., The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage Figure 5. The changes of HDL concentration from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with control at * p<0.05. (n=6) Figure 7. The changes of ALT activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. Significant differences were compared with normal/control at #p<0.05/*p<0.05. All values are mean ± S.E. (n=6) 있게증가하였으며, CAA군 (105±11.63 U/L) 과 CAB 군 (93±10.62 U/L) 은대조군에비하여감소하였고, 특히 CAB군은대조군에비하여유의성 (*p<0.05) 있게감소하였다 (Fig. 6). Figure 6. The changes of AST activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. Significant differences were compared with normal/control at #p<0.05/*p<0.05. All values are mean ± S.E. (n=6) 3) HDL-콜레스테롤함량 HDL-콜레스테롤함량을측정한결과정상군 (46±1.38 mg / dl ) 에비하여대조군 (42±1.53 mg / dl ) 에서는감소하였으나유의성은없었으며, CAA군 (57±4.55 mg / dl ) 과 CAB군 (51±3.17 mg / dl ) 은대조군에비하여유의성 (*p<0.05) 있게증가하였다 (Fig. 5). 4. 혈청 Transaminase 활성의변화 1) Aspartate aminotransferase(ast) 활성 AST의활성을측정한결과정상군 (80±5.46 U/L) 에비하여대조군 (163±26.50 U/L) 이유의성 (#p<0.05) 2) Alanine aminotransferase(alt) 활성 ALT의활성을측정한결과정상군 (25±1.38 U/L) 에비하여대조군 (46±2.56 U/L) 이유의성 (#p<0.05) 있게증가하였고, CAA군 (35±4.36 U/L) 과 CAB군 (29±1.0 U/L) 은대조군에비하여감소하였으며, 특히 CAB군은대조군에비하여유의성 (*p<0.05) 있게감소하였다 (Fig. 7). 5. Alkaline phosphatase(alp) 활성의변화 ALP의활성을측정한결과정상군 (383±14.0 U/L) 에비하여대조군 (493±52.13 U/L) 은증가하였고, CAA군 (436±36.72 U/L), CAB군 (435±24.28 U/L) 은대조군에비하여감소하였으나, 통계적인유의성은없었다 (Fig. 8). 6. Lactate dehydrogenase(ldh) 활성의변화 LDH 활성을측정한결과정상군 (463± mg / dl ) 에비하여대조군 (626± mg / dl ) 이약 35% 증가하였고, CAA군 (571± mg / dl ) 과 CAB군 (485±70.79 mg / dl ) 은대조군에비해감소하였으나유의성은없었다 (Fig. 9). 183

8 대한한의학방제학회지제 22 권제 1 호 (2014 년 6 월 ) Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~192 Figure 8. The changes of Alkaline phosphatase activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6) Figure 11. The change of SOD activities from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl 4 treatment; CAA, CLR extract 200 mg / kg /day administered group; CAB, CLR extract 400 mg / kg /day administered group during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6) 7. 혈청 Alpha fetoprotein (AFP) 활성의변화혈청 AFP의농도를측정한결과정상군 (5.67±0.29 ng/ ml ) 에비하여대조군 (17.1±0.96 ng/ ml ) 에서는약 99% 증가하여통계적으로유의성 (#p<0.05) 을나타냈다. CAA 군 (3.61±0.52 ng/ ml ) 과 CAB 군 (3.37±0.37 ng/ ml ) 또한대조군에비하여통계적으로유의성 (*p<0.05) 있게감소하였다 (Fig. 10). Figure 9. The changes of Lactate dehydrogenase activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6) 8. SOD와 Catalase의활성의변화 1) SOD의활성 SOD의활성을측정한결과정상군 (28±6.88 %) 에비하여대조군 (34±5.87 %) 은증가하였고, CAA 군 (29±7.37 %) 과 CAB군 (28±6.98 %) 은대조군보다는감소하였으나통계적인유의성은없었다 (Fig. 11). Figure 10. The changes of alpha fetoprotein from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated administrated CLR extract 200 mg / kg /day or CAB group administrated CLR extract 400 mg / kg /day during 9 weeks after DENA and CCl 4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with normal/ control at #p<0.05/*p<0.05. (n=6) 2) Catalase의활성 Catalase 활성을측정한결과정상군 (0.236±0.01 U/mg protein) 에비하여대조군 (0.230±0.00U/mg protein) 에서가장낮게나타났으며, CAA 군 (0.243±0.02 U/mg protein) 과 CAB군 (0.243±0.00 U/mL) 은대조군보다높은활성을보였으나통계적인유의성은없었다 (Fig. 12). 9. 간조직의변화정상군의간조직은타원형의중심정맥과함께일정한크기의세포핵을갖고있었으며세포질은 184

9 정태산 외 1인 : 강황추출물이 흰쥐의 간암과 간 손상에 미치는 영향 Jung et al., The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage Figure 12. The change of catalase activities from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl4 treatment; CAA, CLR extract 200 / /day administered group; CAB, CLR extract 400 / /day administered group during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6) Figure 14. Electron micrograph of hepatocytes from the 9 weeks normal group. A. Electron micrographs showing scattered rough endoplasmic reticulum(rer) and a number of mitochondria. B. A number of lipid droplets(l) are observed near the sinuoid Kupffer cell(kc). N, nucleus; RBC, red blood cell; M, mitochondria. Bar indicate 500 nm. CAA군에서는 대조군과 유사하게 조직 전반에 Figure 13. Histological sections of liver of rats in response to CLR extracts in the DENA and CCl4-induced liver injury. 걸쳐 지방방울들이 다수 관찰되었으며, 암세포의 A, Normal group; B, Control group administered saline during 9 weeks, Arrows indicate ipid droplets and arrow heads indicate giant nuclei.; C, CLR extract (200 / /day) administered group during 9 weeks, A number of cancer cells(cc) are observed in the right side,; D, CLR 타원형의 중심정맥을 중심으로 동굴모세혈관들이 집단이 관찰되기도 하였다(Fig. 13C). CAB군은 관찰되었고, 암세포로 변화하는 큰 핵을 갖는 간 세포는 거의 관찰되지 않았으며, 암세포 집단 또 한 거의 관찰되지 않았다(Fig. 13D). extract (400 / /day) administered group during 9 weeks. CV, central vein. Hematoxylin-Eosin stain. Original magnification 간세포의 미세구조변화 정상군 간세포의 미세구조를 관찰한 결과 핵막 거의 일정하게 eosin에 대한 염색성을 보였고, 동 이 뚜렷하고 핵질이 고르게 발달해 있었다. 과립 굴모세혈관에는 혈액이 충만되어 있었다(Fig. 13A). 세포질세망이 발달해 있었으며, 사립체는 둥근 모 대조군은 중심정맥 주변에 많은 지방방울들이 양이었다. 당원과립들이 세포질 전반에 걸쳐 있었 관찰되었으며, 조직 전반에 걸쳐 암세포로 진행 으며, 지방방울들은 동굴모세혈관 주변 세포질에 중인 커다란 핵을 갖는 간세포들이 다수 관찰되 서 다수 관찰되었다(Fig. 14A-B). 었다(Fig. 13B). 185

10 대한한의학 방제학회지 제22권 제1호 (2014년 6월) Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~192 Figure 16. Electron micrographs of hepatocytes from the CAA group. Figure 15. Electron micrograph of hepatocytes from the 9 weeks control group. A. Electron micrographs showing a lot of mitochondria(m) which contain electron lucent matrix. B. A white blood cell(wbc) and red blood cell(rbc) are observed in the sinusoid. L, lipid droplet; N, nucleus; P, polysome. Bar indicate 500 nm. A, The rough endnoplasmic reticulum(rer) and Golgi complex(go) are well developed, and forms aggregates of parallel. B. A lot of electron dense material are observed in the sinusoids. KC, Kupffer cell; L, lipid droplet; M, mitochondria; N, nucelus. RBC, red blood cell. Bar indicate 500 nm. 대조군 간세포의 미세구조를 관찰한 결과 핵의 자밀도는 대체로 높게 나타났다(Fig. 16A). 대부 크기가 세포질에 비하여 비교적 크게 관찰되었으 며, 핵막의 경계가 뚜렷하지 않고 불규칙하였다. 분의 간세포의 핵은 핵소체가 발달해 있었으며, 무수히 많은 사립체들이 관찰되었는데 cristae의 동굴모세혈관의 Kupffer 세포는 전자밀도가 매우 발달은 미약하였으며, 기질의 전자밀도는 낮게 관 높은 다양한 형태의 물질들을 내포하고 있는 것 찰되었다(Fig. 15A). 반면 세포질에서는 발달된 이 관찰되었다(Fig. 16B). 과립세포질세망과 당원과립의 집단들이 세포질 CAB군에서 미세구조는 간세포의 뚜렷한 핵막 곳곳에서 관찰되었고 세포질 전반에 걸쳐 소수의 과 발달된 핵질, 커다란 핵소체가 관찰되었다. 세 지방방울이 관찰되었다. 또한 동굴모세혈관에서는 포질 전반에 걸쳐 발달된 층판구조를 이루고 있는 과립세포질세망, 사립체들의 cristae, 다수의 용해 백혈구와 적혈구들이 관찰되었다(Fig. 15B). 실험군인 CAA군에서 미세구조를 관찰한 결과 소체들이 관찰되었다(Fig. 17A). 동굴모세혈관에 뚜렷한 핵막과 고른 핵질, 다수의 층판구조를 이 서는 림프구와 백혈구가 다수 관찰되었는데, 백혈 룬 과립세포질세망과 발달된 골지체가 관찰되었 구의 세포질에서는 특이적으로 많은 사립체들과 다. 사립체들은 세포질 전반에 걸쳐 다수 관찰되 소포들, 용해소체들이 관찰되었다.(Fig. 17B). 었는데 cristae가 발달하였으며, 사립체 기질의 전 186

11 정태산외 1 인 : 강황추출물이흰쥐의간암과간손상에미치는영향 Jung et al., The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage Figure 17. Electron micrograph of hepatocytes from the CAB group. A. The rough endnoplasmic reticulum(rer) are well developed, Arrows indicate lysosomes. B, A lot of lysosomes are observed in the peripheral cytoplasm(right upper portion). B. A lymphocyte(lym) and a white blood cell(wbc) are observed in the sinusoid. Arrows indicate lysosomes. L, lipid droplets; N, nucelus. Bar indicate 500 nm. Ⅳ. 고찰 암은뇌혈관질환, 심장질환과더불어우리나라의 3대사망원인중하나이다 4). 이중간암은 2009년현재갑상선암, 위암, 대장암, 폐암에이어다섯번째로발생률이높고 32), 2011년현재폐암에이어두번째로높은사망률을보이며, 2011년현재인구 10만명당남자는 32.8명, 여자는 10.9 명이간암으로사망하고있다 4). 간암은다른암에비해예후가불량한편인데, 이는종양생물학의특성상성장과침윤이빠르고, 대부분의간세포암이만성간염이나간경화증을동반하며간암이상당히진행된상태에서발견되어근치적치료가어렵기때문이다 33). 현재 간암치료는간절제술, 간동맥화학색전술, 국소치료법, 간이식수술등이시행되고있으며, 외과적절제술이기본으로시행되고있으나간암환자의약 80% 에서간기능이저하된간경변증을동반하고있어수술이가능한경우는많지않다 6). 또한장기생존및완치를기대할수있는간절제술의경우에도 5년내재발률이 55-80% 에이르는실정이므로비수술적인치료가점차대두되고있는실정이다 34). 간암은한의학적으로脇痛, 鼓脹, 蟲門, 積聚, 黃疸등의범주에속하며 2), 간암에대한변증으로는氣滯血瘀, 濕熱結毒, 肝氣鬱結, 肝膽濕熱, 肝脾兩虛, 精氣虧損, 肝陰不足, 肝腎陰虛등이있으며, 疏肝理氣, 活血化瘀, 淸熱利濕, 益氣健脾등의치법으로다양한처방을응용하고있으나이에대한체계적인연구는거의없는실정이다 35). 본실험에사용된강황 (Curcumae longae Rhizoma) 은活血祛瘀藥에속하며, 생강과식물인강황 (Curcuma longa L.) 의根莖을건조한것으로破血行氣, 通經止痛등의效能으로心腹痞滿脹痛, 經閉, 癓瘕, 風濕肩臂疼痛, 跌撲腫痛등을치료하고, 혈압강하 항균등의약리작용을가지고있는것으로알려져있다 20,21). 강황에대한연구로는항산화효과 22), 항균효 과 23) 등이究明되었고, 다양한암세포주를이용한 실험 24-26) 에서항암효과가있다고증명되었으나실험동물에암을유발시킨후약물을경구투여하여관찰한연구모델은없었다. 실험에사용된 DENA는그자체가암발생의개시인자및촉진인자의성질을가지고있고, 저농도의양을흰쥐에음용시키기만하여도암종으로진행되어암화과정의연속적인생화학적및병리학적연구를하는데유용하게사용되고있다 36). CCl 4 는 cytochrome p450에의하여 CCl 3 free radical 이생성되어세망내피계 (endoplasmic reticulum) 에서불포화지방산을공격하여지질과산화가일어나므로세포막과간효소에손상을일으키고, 미토콘드리아의작용이저하되어간세포괴사에이르게하여 37) 간의지방변성, 괴사, 섬유화를유발시켜간손상실험에광범위하게사용되고있으며, 187

12 대한한의학방제학회지제 22 권제 1 호 (2014 년 6 월 ) Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~192 또한 DENA와 CCl 4 를병용투여한실험들 38,39) 도다수진행되었다. 이에저자는강황이 DENA와 CCl 4 로유발된흰쥐의간암형성과간손상에미치는영향을확인하기위해간암과간손상을유발시킨후, 9주동안강황추출물을투여하여 200 mg / kg (CAA군) 과 400 mg / kg (CAB 군 ) 으로나누어투여한후체중과간중량의변화, 혈청지질의변화, transaminase (AST, ALT) 의활성, alkaline phosphatase (ALP) 와 lactate dehydrogenase (LDH) 의활성, superoxide dismutase (SOD) 와 catalase의활성, 간조직의광학현미경관찰, 간세포의전자현미경관찰을시행하였다. 일반적으로종양환자의경우현저한식욕부진과함께탈수증상이수반되며, 이로인한만성적인체중감소가초래되고 40), 간암환자의경우도절반이상에서영양불량및흡수장애로인한만성적인체중감소가발생한다 41). 체중측정결과대조군의체중은정상군에비하여 5주까지는감소하였으나 6주이후부터는정상군보다증가하기시작하였고, 실험군의체중은대조군에비하여모든실험기간동안증가하였다. 간암발생시간의무게및체중에대한간무게는체중과반비례하여증가하는경향이있는데 42), 간중량및체중 100 g 당간중량측정결과, 간중량은정상군에비해대조군, CAA군, CAB군모두증가하였지만대조군에비하여 CAA군, CAB군모두감소하였으며, 체중 100 g 당간중량변화에서는대조군에비해 CAB는통계적으로유의성있게감소하였다. 간암으로인해간실질장애가심하게되면혈청 cholesterol 농도는감소하는경향을보이는데 43), 본실험에서는총콜레스테롤함량의변화는유의성이없었다. 그러나 triglyceride 의함량은 CAA 군과 CAB군에서모두대조군에비해증가하였고, CAA군과 CAB군의 HDH-cholesterol 함량도대조군에비해통계적으로유의성있게증가하였다. 간세포의손상을검사하기위하여임상적으로흔히혈청내의 AST, ALT, ALP, LDH와같은효 소의활성도를검사하는데 44), 혈청내에서의 AST, ALT 활성치증가는간세포의장애정도와비교적상관성이높고, 간에서혈액으로유출되는다른효소에비해예민하게변동된다 30). ALP는간염, 간경변, 폐쇄성황달, 기타간담도계질환등이있을때증가하고 45), 당분해주효소인 LDH의활성도는종양조직에서는당분해활성도가정상조직에비해증가되므로증가하게된다 46). 본연구에서도 diethylnitrosamine (DENA) 와 CCl 4 로처리한대조군의 AST,ALT 활성도가정상군에비하여유의성있는상승을보여간독성이유발됨을알수있었고, CAA군과 CAB군에서 AST와 ALT의활성도가대조군에비해감소하였으며특히 CAB군은대조군에비하여통계적으로유의성있게감소하였다. ALP와 LDH 활성에서 CAA군과 CAB군모두정상군보다증가되었지만대조군에비해활성도가다소감소되어강황이간손상에따른효소활성을억제시킴을알수있었다. 혈청 AFP는출생후에는빠르게혈중에서사라져출생직후에검출되지않을정도로감소하다가간세포암등의병적상황이되면다시증가하게되므로임상적으로유용한종양표지자와선별검사의방법으로사용되고있다 47). 본실험에서는정상군에비해대조군이유의성있게증가하였으며, 대조군에비해실험군전체에서통계적으로유의성있는감소를보였다. 활성산소는산소대사과정이나환경적인요인에의해발생되는데, 자체반응성이매우강하여유전자돌연변이를발생시키거나종양억제유전자를불활성화시켜암유발인자로작용한다 48). SOD 는산소대사과정에서가장먼저생성되는활성산소를제거하는효소이며 49), Calalase 는체내에서지방의자동산화및유기물의산화로생기는 H 2O 2 를 H 2O와 O 2 로분해하여무독화시키는활성산소제거효소이다 50). SOD 및 Catalase 를측정함으로써체내활성산소와간암과의연관성을유추해볼수있는데, SOD의활성도를측정한결과정상군에비해대조군은증가하였고실험군모두대조군보다감소하였으나통계적으로유의성은없었 188

13 정태산외 1 인 : 강황추출물이흰쥐의간암과간손상에미치는영향 Jung et al., The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage 다. Catalase 의활성도를측정한결과대조군은정상군에비해감소하였으며, CAA군과 CAB군은정상군과대조군에비해증가하었다. 이는강황이체내활성산소를제거하여간세포의사멸을억제하는것으로사료되나통계적인유의성이없어활성산소에관련하여추가적인실험이필요하다고사료된다. 광학현미경을통해간조직의변화를관찰한결과정상군에서는타원형의중심정맥, 방사형의동굴모세혈관, 일정한 eosin에대한염색성을보였다. 반면대조군에서는조직전반에걸쳐커다란핵을갖는세포들과암세포의집단들이다수관찰되었으며, 중심정맥주변에많은지방방울을관찰할수있었다. CAA군은대조군과큰차이가없었으나, CAB군은타원형의중심정맥을중심으로동굴모세혈관들이관찰되었으며, 암세포로변화하는커다란핵을갖는세포와암세포집단은거의관찰되지않았다. 전자현미경관찰결과대조군의간세포에서는불규칙한핵막, 응축된핵질, cristae의발달이미약하고기질의밀도가낮은사립체등이관찰되었다. CAA군과 CAB군에서는간세포의뚜렷한핵막과고른핵질, 발달된 cristae, 기질의밀도가높은사립체, 발달된층판구조의과립세포질세망이관찰되었다. 이는강황이손상된간세포에세포보호효과가있으며간세포내의신생물형성을억제한것으로보인다. 이상의실험결과를요약하여보면실험군은대조군에비해간무게의변화, 혈청지질의변화, transaminase (AST, ALT) 의활성, α-fetoprotein (AFP) 의농도, 간조직의광학현미경관찰, 간세포의전자현미경관찰결과강황이간암의증식억제와면역효과가있다고유추해볼수있다. 그러나정확한직접투여량과투여기간에대한유의성은아직불명확하여이에대한검증이필요할것으로보이며, ALP와 LDH의활성, SOD와 catalase의활성, 체중변화에서유의성이명확하게나타나지않은점은더욱깊은연구가필요할것으로사료된다. Ⅴ. 결론강황추출물이 diethylnitrosamine과 CCl 4 로유발된흰쥐의간암형성과간손상에미치는영향을확인하기위해간암과간손상을유발시킨후, 9주동안강황추출물을투여하여 200 mg / kg (CAA군) 과 400 mg / kg (CAB군 ) 으로나누어투여한후각각의효과를조사한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 체중은대조군이정상군에비하여 5주까지는감소하였으나 6주이후부터는정상군보다증가하였고, 실험군의체중은대조군에비하여모든실험기간동안증가하였다. 2. 간의중량및체중 100g당간중량은정상군에비하여대조군과실험군모두증가하였고, 대조군에비해실험군은모두감소하였으며, 특히체중 100g당간중량에서는 CAB군이대조군에비해유의성있게감소하였다. 3. 혈청지질중 triglyceride 는대조군에비해실험군에서증가하였으나유의성은없었고, HDL- Cholesterol 의함량은유의성있게증가하였다. 4. Transaminase의활성은대조군에비해모든실험군에서감소하였으며특히 CAB군에서는유의성있게감소하였다. 5. ALP와 LDH 활성은대조군에비해모든실험군에서활성도가감소하였으나유의성은없었다. 6. AFP는정상군에비해대조군이유의성있게증가하였으며, 대조군에비해모든실험군에서유의성있는감소를보였다. 7. SOD의활성도를측정한결과정상군에비해대조군은증가하였고대조군에비해모든실험군에서감소하였으나유의성은없었다. Catalase 의활성도를측정한결과정상군에비해대조군은감소하였으며, 실험군은정상군과대조군에비해증가하였으나유의성은없었다. 8. 간조직을광학현미경으로관찰한결과대조군에서는조직전반에걸쳐커다란핵을갖는세포들과암세포의집단들이다수관찰되었으나, 189

14 대한한의학방제학회지제 22 권제 1 호 (2014 년 6 월 ) Herbal Formula Science(HFS) 2014;22(1):177~192 CAB군에서는거의관찰되지않았다. 9. 간세포를전자현미경으로관찰한결과대조군의불규칙한핵막, 응축된핵질에비해실험군에서는잘보존된세포핵과고르게발달된핵질이관찰되었다. 참고문헌 1. Ko KI, Ko WB, Kim JH, Kim HD, Park BL, Park YS, Park YC, Lm WB. Human physiology. Seoul:Simkudang. 1993: Joint Text Compilation Committee for Korean internal medicine(liver). Korean internal medicine (Liver). Seoul:Institute of Oriental Medicine. 2001: Editing Committee of the Harrison s Principle of Internal Medicine in The Korean Association of Internal Medicine. Harrison s Principle of Internal Medicine (16th). Seoul:MIP. 2006: Statistics Korea. Statics of the Causes of Death in 2011( index.board?bmode=read&aseq=260050) Song IH, Kim KS. Current status of liver disease in Korea : Hepatocellular carcinoma. Korean J Hepatol. 2009;15(6): Shimizu M, Takai K, Moriwaki H. Strategy and mechanism for the prevention of hepatocellular carcinoma: phosphorylated retinoid X receptor alpha is a critical target for hepatocellular carcinoma chemoprevention. Cancer Sci. 2009; 100(3): Park RK, Oh KR, Lee KG, Mun YJ, Kim JH, Woo WH. The Water Extract of Boswellia carterii induces apoptosis in human leukemia HL-60 cells. Yakhak hoeji. 2001; 45(2): Kim YT, Lee HJ, Kim GW, Shin HM. Induction of Apoptosis and Its Mechanism by Siegesbeckia Glabrescens in HepG2 cells. Korean J. Oriental Physiology & Pathology. 2005;19(3): Kim PJ, Yun HJ, Lee YT, Seo KS, Park SD. The effect of Somok on apoptosis of human liver cancer HerG2 cell. The korean journal of oriental medical prescription. 2005;13(2): Han SI, Choi SD, Park YK, Kim GS, Kang BK. A Study on Antitumor Effect and Mechanism of Cortex ulmi pumilae Water Extract on HepG2 Hepatoma cell. Korean J. Orient. Int. Med. 2000;2(2): Cheon MS, Chun JM, Yoon TS, Lee AY, Moon BC, Choo BK, Kim SH, Kim HK. Anti-carcinogenetic and Anti-metastatic Effects of Extract from Maekmoondong-tang in HepG2 cells. Korean J of herbology. 2009; 24(3): Lee JB, Heo RK, Seung KM, Mun G, Lee JD, Won JH. The Effect of Injinho-tang Extract on Hepatocellular Carcinogesis and Hepatic Cirrhosis Induced by Diethylnitrosamine and CCl4 in Rats. Journal of Pharmacopuncture. 2009;12(3): Yun HJ, Kim HS, Heo SK, Hwang SG, Park WH, Park SD. Effect of Yong-dam-sa-gantang on apoptosis in human hepatoma HepG2. The korean journal of oriental medical prescription. 2007;15(2): Lee GM, Jeon BH, Kim WS, Sung LG. The Effects of the Water Extract of Gagaminjinhotang on the liver Damage Induced by Bile Duct Ligation. Korean J. Oriental Medical Pathology. 1993;8(1): Sohn SH, Park HS. Effect of Orostachys Japhonicus Herbal-Acupuncture on Transferred Hepatic Cancer of Mouse Induced by Colon26- L5 Human Colon Cancer Cells. The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Medicine Society. 2006;23(6): Ryu MS, Kim SP, Kim JH, Ryu HS, Yoon YC, Shin JC. The Effect of Inchinohryungsan Pharmacopuncture on Hepatocellular Carcinoma Induced by Diethylnitrosamine(DEN) in Rats. 190

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