pissn 1229-1153 / eissn 2465-9223 J. Food Hyg. Saf. Vol. 33, No. 3, pp. 200~206 (2018) https://doi.org/10.13103/jfhs.2018.33.3.200 Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.kr 능이버섯과미강혼합추출물의 β-glucan 함량및항산화활성 심완섭 최선일 정태동 조봉연 최승현 한웅호 이진하 서유리 1 김혜빈 1 임기택 1 이옥환 * 강원대학교식품생명공학과, 1 강원대학교바이오시스템공학과 β-glucan Content and Antioxidant Activity of Mixed Extract from Sarcodon aspratus and Rice Bran Wan-Sup Sim, Sun-Il Choi, Tae-Dong Jung, Bong-Yeon Cho, Seung-Hyun Choi, Han Xionggao, Jin-Ha Lee, Yu-Ri Seo 1, Hye-Been Kim 1, Ki-Taek Lim 1, and Ok-Hwan Lee* Department of Food Science and Biotechnology and 1 Department of Biosystems Engineering, Kangwon National University, Chuncheon, Korea (Received March 7, 2018/Revised April 14, 2018/Accepted May 8, 2018) ABSTRACT - This study was to investigate the optimal condition of mixture ratio for development of functional food ingredient from Sarcodon aspratus and rice bran. First, o Brix was measured along with extraction time. Five kinds of mixtures of Sarcodon aspratus and rice bran (10:0, 7:3, 5:5, 3:7, 0:10) were extracted in 95 o C water over a one-hour period and the extraction yield was evaluated. We further evaluated β-glucan content, DPPH radical scavenging activity, ferric ion reducing antioxidant power (FRAP), total phenolic content and total flavonoids content. As a result, both Sarcodon aspratus and rice bran showed a constant o Brix after 45 minutes of extraction time. The content of β-glucan was highest in the Sarcodon aspratus and rice bran mixture with a ratio of 3:7. As the ratio of rice bran increased in all mixtures, the antioxidant capacity also increased. In conclusion, to create a functional food ingredient the optimal mixing ratio of Sarcodon aspratus to rice bran is 3:7. Key words : Sarcodon aspratus, Rice bran, β-glucan, Antioxidant capacity *Correspondence to: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea Tel: 82-33-250-6454, Fax: 82-33-259-5565 E-mail: loh99@kangwon.ac.kr 최근급속한경제성장과서구화된식생활로인해비만, 고지혈, 고콜레스테롤증, 당뇨, 고혈압, 동맥경화및암등다양한생활습관병이연쇄적으로발병하여여러합병증을유발하는것으로보고되고있다. 그로인해, 웰빙에대한소비자들의관심이높아지면서기호적기능뿐만아니라만성질환및성인병등을예방할수있는생리적기능성을지닌식품의선호도가증대되고있으며이에따라천연기능성소재를이용한식품개발연구가활발하게진행되고있다. 소재들마다우수한생리활성이각기다르므로이들을적절하게혼합함으로써상승효과를기대할수있으나동시에서로상쇄효과를나타낼수도있으므로혼합물의종류및혼합비율별로각각의생리활성을재확인할필요가있다. 능이버섯 (Sarcodon aspratus) 은민주름버섯목 (Aphyllophorales) 의굴뚝버섯과 (Telephoracea Sarcodon) 에속하는식용버섯으로그맛과향이뛰어나다 4,. 선행연구로밝혀진능이버섯의주요대사산물및유용성분으로는높은활성의 protease 6) 와향기성분으로 1-octen-3-ol benzenaldehyde 등이알려져있고 7), cyclopropyl-valyl 등의항산화물질 8), 유리당과아미노산등의영양성분등이보고되어있다 9). 또한버섯에함유되어있는대표적인다당류인 β-glucan 은면역활성체의기능, 항산화능, 생체조직재생과치유기능, 항생제, 항균, 항바이러스및대식세포를자극하여돌연변이세포를인식하고공격하는항종양효과가있다고보고되어있다 10,11,1. 미강 (Rice bran) 은벼도정시부산물로서발생되어지는것으로이는연간 60만톤의생산량으로추정된다 1. 미강은산패하기쉽고, 저장이어려워사료용이나농산부산물로이용되고있는실정이다 1. 그러나미강에는식이섬유, 비타민류, 미네랄류외에 γ-oryzanol, tocopherols, tocotrienols과같은 phenolic 성분등의항산화물질들이대량존재하기때문에기능성식품소재로서의이용이기대된다 15,16). 200
β-glucan Content and Antioxidant Activity of Mixed Extract from Sarcodon aspratus and Rice Bran 201 강원도철원지역은오대쌀의주요생산지로쌀부산물인미강을활용한고부가가치연구가매우절실한상황이다. 본연구에서는오대쌀미강과철원군특산물인능이버섯을혼합하여건강기능식품소재화를위한기초자료를제공하고자하였다. 따라서능이버섯과미강이혼합된추출물제조를위한최적혼합비율설정을위하여추출시간별 o Brix 측정실험을하였고추출수율을구하였다. 또한 β-glucan 함량과 DPPH radiacl 소거능, FRAP value, 총페놀함량및총플라보노이드함량의항산화실험을통해기능성식품으로서의가능성을확인하고자하였다. Materials and Methods 실험재료및시약본연구에사용한능이버섯과미강은 ( 주 ) 우창 (Cheorwon, Korea) 으로부터제공받았으며실험결과값의함량을명확히하기위하여이들을건조한뒤분쇄하여사용하였다. 분쇄된능이버섯을혼합무게 100 g을기준으로미강과 100%, 70%, 50%, 30%, 0% 의 5가지비율로혼합하여그순서대로 S-1, S-2, S-3, S-4, S-5로명명하였다. 본혼합물의추출물을제조하기위해, 각각의혼합물당 10배의물을첨가하여 95 o C에서 1시간추출후 filter paper (Whatman, No. 3, Maidstone, Kent, UK) 로여과한것을 2회반복하였다. 제조된추출물은회전식진공농축기 (Tokyo Rikakikai Co., Ltd, Tokyo, Japan) 를이용하여감압농축한뒤동결건조기 (Ilshinbiobase Co., Ltd, Gyeonggi, Korea) 를이용하여동결건조물로제조하여 20 o C에서보관하며사용하였다. β-glucan 분석은 Megazyme kit (Mixed-linkage β- glucan, McCleary method, Megazyme Co., Wicklow, Ireland) 를사용하였다. 항산화활성조사에사용된 L-ascorbic acid, TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine), ferric chloride tetrahydrate, Folin-Ciocalteu's phenol reagent, gallic acid, rutin 은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였으며, 그외분석용으로사용한시약류는분석용특급시약을사용하였다. o Brix 측정능이버섯과미강에함유된유용성분은수용성다당체성분으로최적추출조건설정은 Lin 등 17) 의방법을변형하여추출시간에대한 o Brix를평가하여나타내었다. 각각의능이버섯과미강무게의 10배의물을가하여 95 o C에서 2시간동안추출하면서 o Brix의변화를측정하였다. o Brix 측정은굴절당도계 (Hand refractometer, N-1E, 0~32%, ATAGO, Tokyo, Japan) 를사용하여상온 (25 o C) 에서측정한후 o Brix로나타내었다 18). β-glucan 함량분석 β-glucan 함량은 Shin 등 19) 의방법을일부변형하여측정하였다. 시료 50 g을 0.5 mm 크기로곱게분쇄하여 0.1 g을 tube에넣고툭툭쳐시료가바닥에모이게하였다. 50% ethanol 0.2 ml과 sodium phosphate buffer (4.0 ml, 20 mm, ph 6. 를첨가한후교반하였다. 그후 tube를항온수조에넣고 60초간 incubate 시킨후다시 100 o C에서 2분간더 incubate 시키고 50 o C에서 5분간 incubate 시킨뒤 lichenase (0.2 ml, 10 U) 를첨가후 50 o C에서 1시간반응시켰다. 그후 sodium acetate buffer (5.0 ml, 200 mm, ph 4.0) 를첨가후상온 (25 o C) 에서 5분간방치하고원심분리 (1,000 g, 10 min) 한뒤상등액만 0.1 ml 취하고이에 β-glucosidase (0.1 ml, 0.2 U), GOPOD reagent 3.0 ml 첨가후 50 o C에서 20분간반응시킨뒤 510 nm에서흡광도를측정한후시료의 β-glucan 함량은다음식에의해계산하였다. β glucan (%, w w) ΔA F --------- FV ----------- 1 -------- W 162 = -------- D 0.05 1000 100 180 ΔA Absorbance F 50 (μg of D-glucose) / Absorbance of 50 μg of D-glucose FV Final volume 0.05 Volume of sample analysed 1/1000 Conversion from μg to mg 100/W Factor to express β-glucan content as a percentage of sample weight 162/180 Factor to convert from free D-glucose to anhydro-d-glucose D Dilution factor DPPH radical 소거능측정 DPPH radical 소거능은 Lee 등 1 의방법을변형하여측정하였다. 시료 0.2 ml에 0.4 mm DPPH 용액 0.8 ml를첨가하여혼합한뒤암소에서 10분간반응시킨후 microplate reader를이용하여 517 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH radical 소거능 (%) = {1 [A experiment /A control ]} 100 A experiment = Absorbance of experimental group A control = Absorbance of control group FRAP 측정 FRAP은 Kim 등 20) 의방법을변형하여측정하였다. 300 mm sodium acetate buffer (ph 3.6), 10 mm TPTZ, 20 mm FeCl 6H 2 O를 10:1:1로혼합하여혼합용액 1.5 ml, 시료 50 μl, DW 150 ul를각각혼합하여 37 o C에서 4분간반응시킨후 microplate reader를이용하여 593 nm에서흡광도를측정하였다.
202 Wan-Sup Sim et al. 총페놀함량분석총페놀함량은 Kim 등 2 의방법을변형하여측정하였다. 시료 1mL에 10% Folin-Ciocalteu 시약과 2% Na 2 CO 3 시약을순서대로첨가한뒤암소에서 1시간동안반응시킨후 microplate reader를이용하여 750 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로 gallic acid를사용하였으며표준검량곡선 (y = 17.884x 0.0199, R 2 = 0.9997) 으로부터총페놀함량을계산하였다. 총플라보노이드함량분석총플라보노이드함량은 Chun 등 2 의방법을변형하여측정하였다. 시료 0.5 ml에 95% ethanol 1.5 ml을첨가한후 10% aluminum nitrate 0.1 ml, 1 M potassium acetate 0.1 ml와증류수 2.8 ml를혼합하여상온에서 30분간반응시킨후 microplate reader를이용하여 415 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로 rutin을사용하였으며표준검량곡선 (y = 1.709x 0.0021, R 2 = 으로부터시료의총플라보노이드함량을계산하였다. 통계처리 β-glucan 함량, DPPH radical 소거능, FRAP value, 총페놀함량및총플라보노이드함량값의통계처리는 SAS version 9.4 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA) 을이용하여분석하였다. 유의성분석은 one-way ANOVA 검정을실시하였으며 Duncan의다중범위검정법 (Duncan's multiple range test) 으로유의성은 p < 0.05 수준에서검정하였다. Results and Discussion 추출시간에따른 o Brix의변화능이버섯과미강의추출시간에따른 o Brix 함량변화를측정한결과는 Fig. 1과같다. 추출후 45분까지능이버섯과미강에서모두 o Brix 함량이증가하였지만, 45분경과부터 120분까지능이버섯은 2.8 o Brix, 미강은 0.6 o Brix의포화상태를유지하였다. 따라서미강의최적추출조건을연구한 Lin 등 17) 의결과와본연구의 o Brix 값이포화된시간에따라추출시간을확립하여 95 o C 열수조건에서 1 시간동안능이버섯과미강을추출하여추출물을제조한뒤실험에사용하였다. 추출수율측정능이버섯과미강의혼합비율에따른혼합추출물들의추출수율을측정한결과는 Table 1과같다. 추출수율의범위는 24.3%~35.3% 였으며, 100% 미강만함유되어있는 S-5 추출물을제외한나머지추출물에서모두 30% 가넘는비교적높은추출수율을획득하였다. 반면, S-5 추출물에서는 24.3% 의가장낮은추출수율을보였다. 이는 Woo Fig. 1. Changes of the o brix of Sarcodon aspratus and rice bran during extraction time. Table 1. Extraction yields of five mixture ratios of Sarcadon aspratus and rice bran Samples Extraction yields (%) S-1 33.1 S-2 34.5 S-3 35.3 S-4 30.7 S-5 24.3 Table 2. β-glucan content in five mixture ratios of Sarcodon aspratus and rice bran Samples β-glucan content (%, w/w) S-1 1.50 ± 0.07 bc6) S-2 1.46 ± 0.07 c S-3 1.53 ± 0.07 b S-4 1.73 ± 0.11 a S-5 1.51 ± 0.07 bc 6)Each value represents mean ± SD (n =. Means with different a-c letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. 등 2 이보고한 80% methanol을이용해제조한미강추출물의추출수율인 19.05% 와유사한값임을확인하였다. 또한 Kim 등 2 의연구에의하면추출수율은복합물질의혼합비, 용매-용질의혼합비, 추출시간등에따라영향을
β-glucan Content and Antioxidant Activity of Mixed Extract from Sarcodon aspratus and Rice Bran 203 받는다는 보고가 있어 본 혼합물들의 추출 수율은 각각의 혼합 비율에 따른 용매에 대한 용해도 차이에 기인된 것 으로 사료된다. β-glucan 함량 능이버섯과 미강의 비율에 따른 혼합물들의 β-glucan 함 량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. β-glucan은 곡류 및 버섯류의 세포벽을 구성하면서 단백질 혹은 기타 세포벽 성분과 결합하여 면역활성체, 항산화능, 항균 활성, 항바. β-glucan 이러스 등의 효과가 있는 다당류의 일종이다 이 버섯에 풍부하다는 기존의 보고 와 달리, 능이버섯이 100% 함유된 S-1 추출물의 1.50 ± 0.07% 보다 능이버섯이 30% 함유된 S-4 추출물에서 1.73 ± 0.11%의 유의적으로 가장 높은 β-glucan 함량 값을 확인하였다. Ballance 등 의 연구에 의하면 식물에서 모든 β-glucan을 추출하기 매 우 어렵고, 추출 및 정제된 β-glucan 내에 기타 성분들이 일부 혼입될 수 있다는 보고가 있어, β-glucan에 미강에서 추출된 성분들이 일부 혼입된 것으로 사료된다. 9,10,1 1 2 항산화 활성 측정 비율에 따른 능이버섯과 미강 혼합물들의 항산화 활성 을 측정하기 위해 DPPH radical 소거능과 FRAP을 측정 하였다. DPPH는 항산화 능력을 측정하는데 있어 대표적 Fig. 2. DPPH radical scavenging activity of five mixture ratios of Sarcodon aspratus and rice bran. Each value represents mean ± SD (n =. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. Ascorbic acid. a-h 6) 인 반응물질로 그 자체로 매우 안정한 자유 라디칼이며 DPPH radical 소거능은 hydroxy radical (-OH)을 갖는 페 놀성 화합물이나 플라보노이드를 가진 물질에서 수소 공 여를 통한 라디칼의 소거로 자색 화합물이 노란색으로 탈 색되는 원리를 이용하는 방법이다. FRAP은 Fe 가 Fe 로 환원되어 TPTZ와 결합하여 blue 계열의 색을 나타내 어 환원력을 흡광도 값으로 나타내는 방법이다. 비율에 따른 능이버섯과 미강 혼합물들의 DPPH radical 소거능 및 FRAP 활성을 확인한 결과는 각각 Fig. 2와 Fig. 3과 같다. DPPH radical 소거능 및 FRAP 활성 모두 혼합물 내 미강의 함유량이 높아질수록 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며, 미강이 100% 함유된 S-5 추출물의 경우 2.5, 5.0, 10.0 mg/ml 농도에서 45.03%~79.87%의 DPPH radical 소 거능과 0.17~0.62의 FRAP value로 혼합물 농도에 따른 유 의적인 증가를 확인하였다. 특히 DPPH radical 소거능의 경우, 10.0 mg/ml 농도의 모든 추출물에서 양성대조군으 로 사용한 Ascorbic acid의 0.05 mg/ml 농도와 유사한 효 과를 확인하였다. 이는 Lee 등 이 보고한 미강의 항산화 우수성에 대한 연구 결과와 유사한 것을 확인하였다. 26) 3+ 2+ 20) 1 항산화 성분 분석 비율에 따른 능이버섯과 미강 혼합물들의 항산화 성분 을 분석하기 위해 총 페놀 및 총 플라보노이드 분석을 실 시하였다. 폴리페놀계 물질들은 식물체에 특수한 색깔을 Fig. 3. FRAP activity of five mixture ratios of Sarcodon aspratus and rice bran. Each value represents mean ± SD (n =. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. Ascorbic acid. a-j 6)
204 Wan-Sup Sim et al. Fig. 4. Total phenolic contents of five mixture ratios of Sarcodon aspratus and rice bran. Each value represents mean ± SD (n =. a-cmeans with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. 한생리활성을가진다고보고되어있다 27). 총페놀함량은 gallic acid를표준물질로사용하여그함량을확인하였다 (Fig.. 총페놀함량은혼합물내미강의함량이높아질수록유의적으로증가하였으며, 미강의함량이 50%~100% 범위인 S-3, S-4, S-5 추출물에서 10.33 ± 0.24 mg GAE/g, 10.87 ± 0.33 mg GAE/g, 11.80 ± 0.30 mg GAE/g의총페놀함량을확인하였다. 총플라보노이드함량은 rutin을표준물질로사용하여그함량을확인하였다 (Fig.. 총플라보노이드함량또한혼합물내미강의함량이높아질수록유의적으로증가하였으며, 미강의함량이 50%~100% 범위인 S-3, S-4, S-5 추출물에서 8.61 ± 0.14 mg RE/g, 9.52 ± 0.06 mg RE/g, 16.26 ± 0.21 mg RE/g의총플라보노이드함량값을확인하였다. 이는 Chun 등 2 이보고한품종별미강의총페놀함량값과유사한것을확인하였다. 혼합물중미강이 70% 함유된 S-4 추출물에서베타글루칸함량이유의적으로가장높았지만, 항산화활성및항산화성분함량은 S-4 추출물보다미강이 100% 함유된 S-5 추출물에서가장높았다. 이는추출물에서능이버섯에함유되어있는유효성분보다미강에함유되어있는 γ-oryzanol, tocopherols, tocotrienols와같은 phenolic 성분등의항산화물질들이대량추출되었기때문이라사료된다. Acknowledgement 본연구는 2017 년도중소벤처기업부의기술개발사업지원에의한연구임 [No.C1013243-01-01]. 국문요약 Fig. 5. Total flavonoids contents of five mixture ratios of Sarcodon aspratus and rice bran. Each value represents mean ± SD (n =. Means with different letters on the same kind of bars are a-c significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. 부여하고산화환원반응에서기질로작용하며, 한분자내에 2개이상의 phenolic hydroxyl (-OH) 기를가진방향족화합물을가리키며플라보노이드와탄닌이주성분으로충치예방, 고혈압억제, 항에이즈, 항산화, 항암등의다양 본연구에서는능이버섯과미강이혼합된기능성식품소재개발을위해혼합비율의최적화에대한연구를실시하였다. 유용성분분석및항산화능평가에앞서소재별추출시간에따른 o Brix를측정함으로써 95 o C 열수조건에서 1시간추출법의최적의추출조건을확립하였고, 혼합비율별추출물을제조한후추출수율, β-glucan 함량, DPPH radical 소거능, FRAP value, 총페놀함량및총플라보노이드함량을측정하였다. 추출수율의범위는 24.3%~35.3% 였으며, 100% 미강이함유된 S-5 추출물을제외한나머지추출물에서는모두 30% 이상의높은추출수율을획득하였다. β-glucan 함량은능이버섯이 100% 함유된 S-1 추출물보다능이버섯이 30% 함유된 S-4 추출물에서 1.73 ± 0.11% 로유의적으로가장높은함량값을나타내었다. 혼합물들의항산화능을평가한 DPPH radical 소거능, FRAP value 측정, 총페놀및총플라보노이드성분함량결과혼합물내미강의함량이높아질수록그항산화력이우수하였다. 이는추출과정에서혼합물을구성하고있는능이버섯과미강의상호작용에의한결과라고
β-glucan Content and Antioxidant Activity of Mixed Extract from Sarcodon aspratus and Rice Bran 205 사료된다. 따라서본연구결과능이버섯과미강따라서 30% 이상의우수한추출수율, 가장높은 β-glucan 함량및우수한항산화력을바탕으로능이버섯과미강을활용한기능성식품소재개발을위한그들의혼합비는능이버섯과미강의 3:7의비율 (S- 로혼합하여추출하는것이바람직한것으로판단된다. References 1. Jang Y.S., Jeong J.M.: Effects of phyto-extract mixture on adiposity and serum lipid levels in obese mice induced by high fat diet. J Korean Soc Food Sci Nutr., 39, 1439-1445 (2010). 2. Kim J.W., Kim S.D., Youn K.S.: Antioxidant activity of Hwangki and Beni-Koji extracts and mixture. J Korean Soc Food Sci Nutr., 40, 1-6 (201. 3. Oh H.S., Kim J.H.: Physiological functionalities of hot water extract of Codonopsis lanceolata and some medicinal materials, and their mixtures. The Korean Society of Community Living Science., 18, 407-415 (2007). 4. Lee K.S., Kim J.B.: Effects of the Sarcodon aspratus on the high level of blood lipid and obesity induced by high fat-diet in rat. J. Life Sci., 19, 1265-1270 (2009). 5. 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