(P)122.100-Y(C12N 5/16) 특허심판원 제심 7 부결 심판번호 2008당3671 사건의표시특허등록제733012 호발명 복제된개과동물및이의생산 방법 의권리범위확인( 소극적) 청구인재단법인수암생명공학연구원 경기용인시처인구원삼면사암리 1024-39 대리인변리사박진철 피청구인재단법인서울대학교산학협력재단 서울강남구역삼1동823-1 풍림빌딩703 호( 법무법인한별) 서울관악구봉천7동산4의 2번지 대리인변리사권영모, 박금낭 서울중구남대문로2가118 한진빌딩본관 18층 C.P.O.BOX 8735( 법무법인광장) 대리인변리사유민오 서울서초구양재동 275-7 트러스트타워 19 층( 제일광장특 허법률사무소 ) - 1 -
주 문 1. 확인대상발명의설명서및도면에기재된 ' 개과동물의복제생산방법' 은특허제 733012 호발명의권리범위에속하지아니한다. 2. 심판비용은피청구인의부담으로한다. 주문과같다. 청구의취지 이 유 1. 기초사실 가. 이건특허발명의등록경위및특허청구범위 어 특허등록제733012 호발명( 이하 이건특허발명 이라한다) 은 2005. 7. 26. 출원되 2007. 6. 21. 등록된것으로심판이청구된특허청구범위는아래와같다. 청구항 1. (a) 개과동물의성숙난자로부터핵을제거하는단계; (b) 개과동물의 조직으로부터체세포를분리하여공여핵세포를제조하는단계; (c) 상기 (a) 단계의 탈핵난자에 (b) 단계의공여핵세포를미세주입하고전압이 3.0 3.5kv/cm인조건으 로전기융합시키는단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서융합된난자를활성화시키는단계 를포함하는개과동물의핵이식란제조방법( 이하 이건제1 항발명 이라하고, 나머 지항도같은방식으로부른다 ). 청구항 2. 제1 항에있어서, 상기 (a) 단계의개과동물의성숙난자는생체내로부터회 수된것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. - 2 -
청구항 3. 제2 항에있어서, 상기생체내로부터회수는개과동물의배란일로부터 48 72 시간에수행하는것임을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 4. 제1 항에있어서, 상기 (b) 단계에서상기체세포는개과동물의난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아줄기세포, 배아생식세포, 태아세포, 태좌세포및배아세포로이루어진그룹중에서선택된어느하나인것을특 징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 5. 제1 항에있어서, 상기 (b) 단계에서체세포는섬유아세포또는난구세포인 것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 6. 제1 항에있어서, 상기 (c) 단계에서전기융합은직류전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로 10~30μs동안 1~3회수행하는것을특징으로하는개과동물의핵이식란 제조방법. 청구항 7. 제1 항에있어서, 상기 (d) 단계에서활성화시키는단계는칼슘이오노포어 및 DMAP(6-dimethylaminopurine) 를융합된난자에동시에처리하거나단계적으로처 리하는것을특징으로개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 8. 제7 항에있어서, 상기칼슘이오노포어 5 10μ M을 37~39 에서 3 5분 동안처리한다음 DMAP(6-dimethylaminopurine) 1.5mM~2.5mM을 37 39 에서 4 5 시간동안처리하는것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 9. 제1 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및너구리로이루어진그룹중에서선택되는것임을특징으로하는개과동물의핵이 식란제조방법. 청구항 10. 제1 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대및여우로이루어진그룹중 - 3 -
에서선택되는것임을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 11. 제1항내지제10 항중어느한항의방법에의해제조된핵이식란. 청구항 12. 제11 항에있어서, 기탁번호 KCTC 10831BP 인핵이식란. 청구항 13. 제11항또는제12항의핵이식란을대리모의난관에이식하여산자를출 생하는단계를포함하는복제된개과동물의생산방법. 청구항 14. 제13 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥 이및너구리로이루어진그룹중에서선택되는것임을특징으로하는복제된개과동 물의생산방법. 청구항 15. 제13 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대및여우로이루어진그룹 중에서선택되는것임을특징으로하는복제된개과동물의생산방법. 나. 확인대상발명의요지 청구인은심판청구시제출한확인대상발명의설명서및도면을 2009. 4. 6. 자로보 정하였다. 상기보정된확인대상발명은개과동물의복제생산방법에관한것으로별지 1 에기재된바와같다. 2. 이해관계 이건심판의청구인은피청구인의전용실시권자인건외 주식회사알앤엘바이오 로 부터특허침해금지청구등에관한소송( 서울중앙지방법원사건번호: 2008가합84750 호) 을받은사실이있음을갑제4 호증( 소장사본) 으로부터확인할수있으므로, 이건심 판청구는이해관계인에의한적법한청구로인정된다. 3. 당사자의주장 - 4 -
가. (1) 청구인의주장 확인대상발명은이건특허발명과비교하여과제해결을위한기술적구성을전혀 달리하는발명이므로, 확인대상발명은이건특허발명의권리범위에속하지아니한다. (2) 개의핵이식란제조방법에서핵이식란의융합율은전압조건만이유일한변수가 아니고다양한변수가영향을미치는것이므로이건특허발명과전압조건만을달리하 여높은융합율을나타내는것은실시불가능하다고주장하는것은이치에맞지않다. 나. (1) 피청구인의주장 확인대상발명의전압조건으로는청구인이주장하는바와같은높은융합효율을 달성할수없으므로, 확인대상발명은구성및효과가서로모순된것이어서실시불가 능한발명이다. (2) 확인대상발명의전압조건은이건제1항발명의전압조건의권리범위에포함되 는것이므로확인대상발명은이건특허발명의권리범위에속한다. 4. 판단 가. 보정된확인대상발명의적법여부 2009. 4. 6. 자로보정된확인대상발명은청구인이심판청구시제출한확인대상발명 의설명서및도면에기재된내용이논문형식으로되어있어이를이건특허발명과 대비하기쉽도록명확하게한것에불과하여그요지가변경된것이아니므로적법한 보정이라하겠다. 따라서, 이하에서는 2009. 4. 6. 자보정된확인대상발명을대상으로판단한다. 나. 확인대상발명이실시불가능한지여부 (1) 판단기준 - 5 -
확인대상발명이심판청구인의심판청구당시제조 판매해온물품이아니라하더라 도심판청구인으로서는장래실시하고자하는확인대상발명이이사건특허발명의권 리범위에속하는지여부의확인심판을청구할이익이있는바( 대법원 2000. 4. 11. 선 고 97후3241 판결등참조), 확인대상발명의실시가불가능하거나전혀실시할가능성 이없지않는이상원고는이해관계인으로서장래실시하고자하는확인대상발명이이 사건특허발명의권리범위에속하는지여부의소극적권리범위확인심판을청구할이익 이있다( 특허법원 2008. 10. 23. 선고 2008허1548 판결참조). 위와같은법리에따르면, 소극적권리범위확인심판에서는심판청구인이실시하고있 거나장래실시할예정인발명도확인대상발명이될수있고, 확인대상발명이실시가 불가능하다는등의특단의사정이없는한, 심판대상은심판청구인이특정한확인대상 발명이므로, 아래에서는이건심판의확인대상발명이실시가불가능한지에관하여살 핀다. (2) 판단 확인대상발명의 1.75 kv/cm의전압조건에서핵이식란의세포융합을수행하여 77.4%, 80.4%, 79.2% 및 80.9% 의융합율을달성하였다( 갑제3호증의표 1, 3 참조) 라고그효과를주장하고있는것에대하여, 피청구인은이건특허발명의명세서( 갑 제2 호증) [ 표 7] 의기재에서는 1.75 ~ 1.9 kv/cm의전압조건에서핵이식란의융합 율은 33.3% 였고, 을제6호증의실험성적증명서에는 1.75 kv/cm에서 15 usec 동안 2 회파장을주어융합한결과 37.9% 의융합률을달성된정도에불과하여, 확인대상발 명에의한이러한융합율은 1.75 kv/cm의전압조건에서는결코달성할수없는것이 므로확인대상발명은구성및효과가서로모순된것이어서실시불가능한것이라고 주장한다. - 6 -
이러한주장에대하여살피면, 확인대상발명이논문(2008, Mol. Reprod. Dev., Wiley-liss, inc; 갑제3 호증참조) 으로받아들여져발행된점, 청구인은이건제1항 발명의개과동물의핵이식란의제조방법은전기융합단계에서의전압조건만을한정하 고있으나, 개의핵이식란을제조하는일련의과정에서전압조건만이융합율을좌우하 는유일한조건이라할수없는점, 확인대상발명에서는전압조건에아울러후활성화 단계의조건을더추가하고있으나, 을제6호증의실험증명서에서 1.75 kv/cm에서 15 usec 동안 2 회파장을주어융합하여전압조건에만맞추어실험한점등을고려하면, 확인대상발명이실시불가능한것이라는피청구인의주장을뒷받침할수있는증거가 불충분하여확인대상발명이실시불가능하다고단정할수없다. 가사, 피청구인의주장처럼확인대상발명이 33.3% 또는 37.9% 의융합율정도만나 타낸다하더라도그효과가열악한것에불과할뿐확인대상발명이실시불가능한발 명이라고는할수없다. 따라서, 확인대상발명이실시불가능한발명이라고하는피청구인의주장은이유없 다. 나아가, 피청구인은확인대상발명의전압조건에서는핵이식란의융합효율이열악하 므로실제로는이건특허발명의전압범위에서실시할것이라고주장하나, 청구인이심 판청구서, 2009. 4. 17. 자기술설명회등에서지속적으로확인대상발명을실시하고있 다고주장하고있고, 확인대상발명에대하여심결이확정된다고하더라도그기판력은 확인대상발명에만미치는것이지확인대상발명의전압범위가달라지는경우에까지그 기판력이미치지는않으므로이에대한피청구인의주장은이유없다. 다. 확인대상발명이이건특허발명의권리범위에속하는지여부 (1) 판단기준 - 7 -
특허발명의특허청구범위의청구항이복수의구성요소로되어있는경우에는그 각구성요소가유기적으로결합된전체로서의기술사상이보호되는것이지각구성요 소가독립하여보호되는것이아니므로, 특허발명과대비되는확인대상발명이특허발명 의청구항에기재된필수적구성요소들중의일부만을갖추고있고나머지구성요소가 결여된경우에는원칙적으로그확인대상발명은특허발명의권리범위에속하지아니한 다할것이고( 대법원 2001. 6. 15. 선고 2000후617 판결, 2000. 11. 14. 선고 98후 2351 판결참조), 특허발명의청구항이일정한범위의수치로한정한것을구성요소의 하나로하고있는경우에는그범위밖의수치가균등한구성요소에해당한다는등의 특별한사정이없는한특허발명의청구항에서한정한범위밖의수치를구성요소로 하는확인대상발명은원칙적으로특허발명의권리범위에속하지아니한다할것이다( 대 법원 2001. 8. 21. 선고 88후2372, 2389 판결참조). (2) 이건제1항발명과확인대상발명의대비 ( 가) 목적대비 이건제1항발명은체세포핵이식기술을이용한개과동물의핵이식란생산 방법을제공하는데그목적이있고, 확인대상발명도체세포핵이식기술을이용하여 개의핵이식란을제조하는방법에관한것이므로, 양발명은그목적에차이가없음을 알수있다. ( 나) 구성및효과대비 이건제1항발명의기술구성을확인대상발명과대비하기위하여구성요소별로 나누어보면, 1 (a) 개과동물의성숙난자로부터핵을제거하는단계; (b) 개과동물 의조직으로부터체세포를분리하여공여핵세포를제조하는단계( 이하 구성요소 1 이라한다); 2 (c) 상기 (a) 단계의탈핵난자에 (b) 단계의공여핵세포를미세주입 - 8 -
하고전압이 3.0 3.5kv/cm 인조건으로전기융합시키는단계; 및 (d) 상기 (c) 단계 에서융합된난자를활성화시키는단계를포함하는( 이하 구성요소 2 이라한다) 개과 동물의핵이식란제조방법으로구분할수있다. 구성요소 1은확인대상발명의 난자공여견으로부터난자를회수하여탈핵난자의제 조및공여핵세포의제조단계 에대응되며, 대응되는양구성은모두개과동물의성숙 난자로부터핵을제거하여탈핵난자를제조하는한편, 별도로공여핵세포를제조하는 단계를포함하고있는점에서차이가없다. 구성요소 2는확인대상발명의 상기탈핵난자에상기공여핵세포를주입하고, 1.75 kv/cm에서 15 usec 동안 2번의 DC 파장을주어융합하고, 활성화하는단계; 및상기 융합후 2 시간후에융합된난자를후활성화시키는단계 라는구성에대응되며, 대응되 는양구성은모두탈핵난자에공여핵세포를주입하고전기적자극을주어융합시키는 전기융합단계와융합된난자를활성화시키는단계를포함하고있는점에서는차이가 없고, 다만, 전기융합단계의전압이구성요소 2는 3.0 ~ 3.5 kv/cm이고확인대상발 명은 1.75 kv/cm이므로구성요소 2의전압조건이확인대상발명의전압조건보다 1. 7 내지 2 배정도높은점에서차이가있다. 한편, 이건특허발명의명세서( 이하 명세서 라한다) 의종래기술란에 체세포핵이 식기술은생식과정에서일반적으로이루어지는감수분열및반수염색체보유생식세 포를경유하지않고도자손을탄생시킬수있는기술로서성체가가진배수체보유체 세포를핵이제거된난자에이식하여수정란을생산하고상기수정란을생체내로이 식하여새로운개체를발생시키는방법이다. 일반적으로체세포핵이식기술에서체세 포공여핵을이식할수핵난자(recipient oocyte) 는인위적으로시험관내(in vitro) 에서 배양하여 2 차감수분열중기까지도달하도록성숙시켜사용한다. 그다음체세포핵이 - 9 -
식에따른염색체이상발생을방지하기위하여체세포를이식하기전에상기성숙난 자의핵을제거하고상기탈핵난자의주란강또는세포질내에체세포를주입한다. 그 후상기탈핵난자와주란강또는세포질에주입된체세포를전기적자극을통하여물 리적으로융합시키고전기자극또는화학물질에의하여활성화시킨후대리모에이식 하여산자를탄생시킨다. ( 명세서, 제2 면) 라는기재와, 체세포핵이식을통한동물복제 기술은영국로슬린연구소의윌멋(Wilmut) 박사에의해 6세된암컷양에서채취한 유선세포를핵이제거된난자에이식하여핵이식란을생산한후생체내이식을통하 여체세포복제동물인돌리를탄생시킴으로써최초로성공하였다. 이후소, 마우스, 염 소, 돼지및토끼등에서체세포핵이식방법에의한복제된산자생산이보고되었다 (WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577). ( 명세서, 제2 면) 라는기재및 이에본발명자들은체세포핵이식방법에의한복제된 개과동물의생산방법을연구하던중전기융합조건, 핵이식란활성화조건및대리모 이식조건을최적화하여최초로체세포핵이식방법에의해복제된개과동물을생산 함으로써본발명을완성하였다. ( 명세서, 제3 면) 라는기재에서볼수있듯이, 탈핵난 자및공여핵세포의제조단계, 상기공여핵세포을탈핵난자에미세주입하는단계및 융합단계, 융합된난자의활성화단계를포함하는핵이식란제조방법에서탈핵난자와 공여핵세포의융합에전기적자극을사용하는것을종래기술란에기재하면서이러한 체세포핵이식기술을사용한선행예들을제시하고{ 이러한사항은을제5 호증(1997. 3. 6. 국제공개되고국내에서 2008. 1. 3. 자로등록된등록특허공보제793220 호) 에서 도확인된다 }, 이건특허발명은그러한체세포핵이식기술에서전기융합조건을최적 화하는것이이건특허발명의하나의과제임을밝히고있다. 그리고이건제1항발명에서전기융합단계의조건을일정한전압범위로한정하고 - 10 -
있고, 명세서에서그러한전압범위에대하여 상기에서공여핵세포의미세주입이완 료된탈핵난자는세포조작기를이용하여전기적으로공여핵세포와융합시킨다. 전 기적융합에서전류는교류또는직류일수있으며, 바람직하게는전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로수행할수있으며보다바람직하게는직류전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로 10 30μs동안 1 3 회수행할수있다. 가장바람직하게는, 직류전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로 20μs동안 2 회수행할수있다. ( 명세서, 제5 면) 라고기재하고있 음을볼때, 이건제1항발명은전기융합단계의전압의범위를 3.0 ~ 3.5 kv/cm으로 한정한것에그기술적의의가있다고볼수있다. 또한, 이건제1 항발명의전압조건에대하여, 이건특허발명의명세서에서 상기에 서전압이 3.0kV/cm 미만이거나또는 3.5kV/cm을초과하는경우에는매우낮은융합 율을보인다. 상기전기적융합시의전압범위는지금까지알려진일반적인전기적융 합시의전압범위(1.7 2.0kV/cm) 보다높은특징이있다. ( 명세서, 제5 면) 라고기재되 어있듯이, 피청구인스스로확인대상발명의전기융합단계의전압 1.75 kv/cm를포함 하고있는전압 1.7 2.0 kv/cm는지금까지알려진일반적인전기융합시의전압범 위이고이건특허발명은그전압범위가이보다높은것에특징이있다고밝히면서일 반적인전압범위를제외하고그보다전압범위가높은전압 3.0 3.5 kv/cm를이건 제1 항발명에서한정하여권리화하고있음을볼수있다. 따라서, 위 (1) 항의판단기준에비추어종합하여살피면, 구성요소 2의전압범위와 확인대상발명의전압에차이가있고, 이건제1항발명은그전압범위를한정한것에 기술적의의가있는점, 이건특허발명의명세서에서확인대상발명의전압을포함하고 있는일정한전압범위를지금까지알려진일반적인전기융합시의전압범위라고밝히면 서이건제1항발명에서는그러한일정한전압범위를제외하고그보다높은전압범 - 11 -
위를기재하여권리화하고있은점등에비추어볼때, 확인대상발명의전압조건과구 성요소 2의전압조건이균등관계에있다고도할수없다. ( 다) 정리 그렇다면, 확인대상발명은이건제1항발명과대비하여전기융합단계의전압 조건이상이하고그러한전압조건이균등관계에있다고도할수없으므로이건제1항 발명의권리범위에속하지아니한다. (3) 이건제2항내지제15항발명과확인대상발명의대비 확인대상발명이독립항인이건제1 항발명에속하지아니하는이상, 그종속항 발명인이건제2항내지제10 항발명과, 이건제1항발명의구성요소를그대로포함 하고있는이건제11항내지제15항발명은구체적으로대비할필요도없이그권리 범위에속하지아니하는것이다. (4) 소결 따라서, 확인대상발명은이건특허발명의권리범위에속하지아니한다. 5. 결론 이상살핀바와같이확인대상발명은이건특허발명의권리범위에속하지아니하고, 심판비용은피청구인의부담으로하기로하여주문과같이심결한다. 2009. 5. 29. - 12 -
19983330 심판장 심판관 신진균 19985703 주심심판관 이호조 19985092 심판관 이유형 - 13 -
별지 1. 확인대상발명의설명서및도면 특허발명과대비될수있는설명서및필요한도면 1. 확인대상발명의명칭융합과활성화처리간격축소에의한복제개생산방법 2. 확인대상발명의상세한설명 (1) 확인대상발명의과제해결수단 확인대상발명은체세포핵이식시융합과활성화처리간격축소에의한복제개생 산방법에관한것이다. 보다구체적으로, 확인대상발명은난자공여견으로부터난자를회수하여탈핵난자의 제조및공여핵세포의제조단계: 상기탈핵난자에상기공여핵세포를주입하고, 1.75 kv/cm에서 15 usec 동안 2번의 DC 파장을주어융합하고, 활성화하는단계; 및상기 융합후 2 시간후에융합된난자를후활성화시키는단계; 로이루어지는개의핵이식 란제조방법및이에의해제조된개의핵이식란에관한것이다. 또한, 확인대상발명은상기핵이식란을대리모의난관에이식하여산자를출생하는단 계를포함하는복제개의생산방법에관한것이다. 이에확인대상발명에서는후술하는실시예를참고하면다음과같은방법으로융합과 활성화사이간격이복제효율에미치는영향을실험을통하여입증하였다. 먼저, 잡종견의난자를회수하고, 수컷혹은암컷성견골든리트리버의공여핵세포 를준비한뒤, 체세포핵이식기술을이용하여융합된난자를얻었다. 상기융합은챔버 에서 1.5 kv/cm 의전기적자극을 15usec 동안 2 번주어융합하였고, 화학적으로활성 화시킨후, 다시후활성화시키는단계를거쳐복제개의핵이식란( 복제배아) 을얻었 다. 후활성화에있어 2시간간격처리군의 12개난자와 4시간간격처리군의 14개의난 자의염색체상을조사하였다. 4시간처리군에비하여 2시간처리군에서응축된중기상 염색체상이유의적으로더많이관찰되었다 (P<0.05). 또한, 수컷과암컷의공여핵세포로체세포핵이식기술에의하여제조한각각 151 개, 225개의재구성된난자를 9마리와 14 마리의동기화된대리모에이식하였다. 2시간 그리고 4시간처리군각각의 376개와 288개재구성된난자를각각 23마리와 16마리의 대리모에이식하였다. 수컷 (2마리의대리모가 3 마리를분만) 그리고암컷 (1마리의 대리모가 1 마리를분만) 의공여세포모두건강한강아지를분만하였다 (P>0.05). 임 신율과건강한산자생산율은 4시간처리군에비하여 2 시간처리군 ( 각각 13.0% 및 1.1 %) 에서유의적으로높게관찰되었다 (P<0.05). 총 3마리의대리모가분만단계까 - 14 -
지임신이진행되었고, 4 마리의강아지가태어났다. 따라서, 확인대상발명은, 난자공여견으로부터난자를회수하여탈핵난자의제조및공여핵세포의제조단계 : 상 기탈핵난자에상기공여핵세포를주입하고, 1.75 kv/cm에서 15 usec 동안 2번의 DC 파장을주어융합하고, 활성화하는단계; 및상기융합후 2시간후에융합된난자를 후활성화시키는단계로이루어지는개의핵이식란제조방법에관한것이다. 또한, 확인대상발명은상기방법으로제조된개의핵이식란에관한것이다. 또한, 확인대상발명은상기핵이식란을대리모의난관에이식하여산자를출생하는단 계를포함하는복제개의생산방법에관한것이다. (2) 확인대상발명의실시를위한구체적인내용 이하, 실시예를통하여확인대상발명을보다구체적으로설명한다. 가. 실험방법 실험1은암컷과수컷의핵공여섬유아세포가체세포핵이식후임신율에미치는영 향을알아보았다. 총, 체세포핵이식기술에의하여제조된 151개와 255개의재구성된 난자를각각 9, 14 마리의자연적동기화된대리모에이식되었다. 실험2는융합과활성화사이의간격이체세포핵이식후난자에미치는영향에대하여 알아보았다. 무작위로선발된재구성된배아를융합후 2시간 4 시간째에고정하였다. 10 ug/ml 의 bisbenzimide에염색체를염색하고 glycerol 과 PBS (1:1) 로된용액을 이용하여슬라이드위에올렸다. 이샘플들은인버티드현미경과콘포칼현미경 (Eclipse C1si: Nikon Corp) 을이용하여관찰하였다. 실험3은체세포핵이식후이식한배아에서융합과활성화사이의간격이임신에미치 는영향을알아보았다. 총 376개와 288개의재조합된난자가각각 2시간 4 시간째활 성화되었고융합후 23마리와 16 마리의자연적동기화된대리모에이식하였다. 나. 실험과정 (i) 동물의준비 총 151 마리의잡종암견 (1-7 세: 몸무게 20-25kg) 중난자공여공여견 (N=112) 및대리모 (N=39) 가사용되었다. 모든시설과과정은수암생명공학연구원의실험동물 윤리위원회기준을의거하였다. 모든실험과수술과정은수암생명공학연구원에서출간 된실험동물관리및사용에관한지침에따라서수행되었다. (ii) 질도말및혈청프로게스테론농도 매일암견의질팽창과분비물을관찰하였다. 질도말샘플은 Diff-Quik염색 (International Reagents Crop., Kobe, Japan) 후현미경하에서관찰되었으며, Concannon and DiGregorio (1986) 방법에의한방법에의해분류되었다. 혈액샘플 - 15 -
(2ml) 은경정맥을통해매일회수되었고, 혈청은 3000rpm에서 20분동안원심분리하여 회수하였다. 혈청내프로게스테론농도는 DSL-3900 Active Progesterone Coated-Tube Radioimmunoassy kit (Diagnostic System Laboratories, Inc., Webster, TX) 에의하 여분석되었다. 이 kit 는토끼항프로게스테론면역글로블린을항체로가지고있다. (iii) 배란기예측 배란시점은 Hase 등 (2000) 에등에의한방법을통해측정되었다. 초기프로게 스테론농도가 4ng/ml 또는그이상이되면배란일로판단하였다. 질도말을해보면배 란기에표면세포는일반적으로상피세포와동일하거나 (iv) 개복및난자회수 전처리 90 % 수준이다. (0.05 mg/kg atropine sulfate and 0.025 mg/kg acepromazine maleate) 된 동물은 5mg/kg 케타민을사용하여마취하였고, 이소플로란으로마취를유지하였다. 난관은배란 72 시간후중앙개복을통해노출되었다. 난관나팔관말단의입구를찾아서 6 gauge bulbed-needle 을도관으로사용하였고, 이 도관은수술적연결을통해위치되었다. 자궁난관접합부바로위의난관의기저부는 지압을통해식별하였다. 난관의내강은 24 gauge 피하바늘을통해도관되었다 (Angiocath TMPlus; Becton Dickinson Korea, Ltd., Seoul, Korea). 약 10ml의회수액 (HEPES가첨가된 기와피하바늘을통해관류되었다. 회수액은난관내강과 TCM199; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) 이주사 bulbed-needle을통하여멸 균플라스틱페트리디쉬에수거되었다. 두개의난관을관류후각난관외막을절개하 여난소를꺼내황체개수를육안으로세어보았다. 마지막으로개복부위를두겹으로봉합하였다. 절개선을따라수술접착제를처리하였 다. 수술후암견은수의사에의하여표준관리방침에의하여관리되었다. (v) 공여핵세포의준비 공여핵세포는개피부생검을통해섬유아세포로부터얻었다. 생검은 2연령수컷과 6 년령암컷골든리트리버로부터채취하였다. 조직샘플의표 면은면도하였고수차례세정되었다. PBS (Life Technologies, Rockville, MD) 로두 차례세정후조직은 100mm 배양접시에서수술용칼을이용하여갈려진후 0.1% (w/v) 과트립신과 1mM EDTA가첨가된 DMEM (Life Technologies) 을사용하여 1 2시간 동안처리하였다. 트립신처리된세포는 300 g 에서 10분동안원심분리하여한차례세 정하였고 100mm 프라스틱배양접시에뿌려졌다. 뿌려진세포는DMEM에10 % (v/v) FBS (Life Technologies), 1mM sodium pyruvate, 1mM (v/v) non-essential amino acid (Life Technologies), 그리고 10ug/ml penicillin-streptomycin이첨가된배지에 5% CO 2, 38 에서 6 8 일동안배양하였다. 바닥에붙지않은세포를제거하고, 배양접시 에붙어자라는세포들은배양접시에찰때까지배양하였다. 세포들은 5 7일간격으로 - 16 -
5 분간트립신 (0.1% trypsin, 0.02% EDTA) 을처리하여계대배양하였다. 2계대배양 후세포는동결배양액에동결하여 -196 의액체질소에보관하였다. 동결배지는 8 0 % (v/v) DMEM, 10 % (v/v) DMSO 그리고 10 % (v/v) FBS 로구성된다. 체세포핵이식 전세포를녹여서 80% 정도자랄때까지 3 4 일간배양하고배양액에 0.5% 의 FBS를 첨가하여세포기아상태로배양한다. 각세포는 30 초간트립신처리하여회수한다. (vi) 체세포핵이식 (SCNT) 1 TCM-199에 10 % (v/v) FBS가첨가된배지에 0.1 % (w/v) hyaluronidase 를처 리하여피펫팅하여난자로부터난구세포를제거하였다. 현미경 (TE2000-E; Nikon Corp., Tokyo, Japan) 을이용하여난자를탈핵하였다. 탈핵후, 난자는 5분간 5ug/ml의 bisbenzimide로염색하여 DNA 유뮤여부를확인하였 다. DNA 가남아있는난자는폐기하였다. 날카로운피펫을이용하여트립신처리된표 면이둥근형태를지닌섬유아세포를골라탈핵된난자의위란강으로옮겼다. 2 상기탈핵된난자(couplets) 를 0.26M mannitol, 0.5mM HEPES 그리고 0.1MgSO4로구 성된융합배지에 4분간침지시킨후융합배지와함께두개의전기노드로구성된챔버 에옮겨놓는다. 다음으로, TX Electro-Cell manuipulator 2001 (BTX Inc., San Diego, CA) 을이용하여 1.75 kv/cm에서 15 usec 동안 2번의 DC 파장을주어융합한다. 전기 적자극후재구성된난자는 10% FBS가첨가된 TCM-199배지에서실험군에따라리프로 그래밍된다. 모든융합된난자는 10uM calcium ionophore (Sigma) 가포함된배양액에 서 3 4 분간배양하여화학적활성화시킨다. 배아들은 TCM-199 세정배지로 5분간세정한후 msof에 1.9 mm 6-dimethylaminopurine이포함된배양액에 4 시간배양하여후활성화(post-activation) 를시킨다. (vii) 배아 ( 핵이식란 ) 이식 복제된배아( 핵이식란) 는활성화후 4시간이내에수술적방법으로자연적으로 동기화된내리모의난관에이식하였다. 수술은위에서기술한같은방법으로수행하였 다. 배아들은 Sovereign Ton Cat 카테터 (Sherwood Medical, St. Louis, MO) 에최소한 의배양액과함께로딩하고난관의 2/3 부분이지점에조심스레옮겨준다. 대리모당 이식배아수는 9 21 개사이이고, 평균 16.75 개였다. (viii) 임신진단 이식후약 Ltd., Tokyo, Japan) 30일이후대리모는3.5MHz curved transducer (SSD-900; ALOKA Co., 휴대용실시간초음파기계를이용하여태아의크기와형태를검 사하였다. 배아또는태아의심박수또한조사하였다. 임신이확인된후에는분만시 까지매 7 일간격으로초음파를사용하여관찰하였다. (ix) Genotyping 을위한 DNA 추출과극소위성분석 - 17 -
유전적동일함을확인하기위하여공여핵섬유아세포, 공여견, 복제견그리고대 리모에서 Lee 등 (2005) 과 Park (2006) 등이게재한방법을이용하여분석이이루어졌 다. 다음의 10 개의마커가선택되어사용했다: PEZ1, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ12, PEZ20, FHC2010, FHC2054 그리고 FHC2079. 다. 실험결과 공여세포영향 표1 에서는체세포복제성공율에있어서수컷, 암컷공여세포의영향을보여준다. 공 여핵세포의성별은개의체세포복제에큰영향이없었다. 수컷과암컷공여세포모두 임신이이루어졌다. 수컷과암컷각각의공여세포를사용하여재조합된난자를이식한 대리모중 30일째임신율은각각 22.2% 와 14.3 % 이였고, 분만단계까지임신이진행 된것은각각 22.2% 와 7.1 % 였다. 수컷과암컷공여세포간의유의차는없었다. [ 표 1] 암컷과수컷공여세포가임신율과강아지분만에미치는영향 재조합난자핵의리모델링 응축된염색체 ( 도 1 A, B) 혹은중기상을띄는염색체상 ( 도 1 C) 을지닌난자비율 은융합후 4 시간째 (14.3% 와 7.1 %) 에비하여 2 시간째 (50% 와 50 %) 에서유의 적으로높았다. 융합후 4 시간째는대부분의배아가 (64.3%) 분산된염색체상을나 타냈다 ( 도1 D-F). 길어진혹은분산된염색체를지닌배아의비율은융합과활성화 사이의간격이길었을때증가하였다 ( 표2, P<0.05). [ 표 2] 개난자의체세포핵이식의리모델링에서융합과활성화간격의시간이미치는영향 활성화시간이임신율에미치는영향 - 18 -
융합후활성화사이의간격에따른비임신대리모대비임신대리모비율에큰차이 가있음을확인하였다 ( 표3, P<0.05). 이식후 30일째초음파를이용한임신진단결 과 4 시간처리군에서는임신이확인되지않았으나, 2시간처리군에서 4마리가의대리 모가임신되었음을확인하였다. 4마리의임신된대리모중 1 마리는유산을하였고, 나 머지 3마리의대리모에서 4 마리의강아지를분만하였다. 평균임신기간은 59일이였 다. 4마리의복제강아지중 1마리는심장판막기형으로생후 1 일째폐사하였다. 도 2는 25, 22 그리고 19 주의세마리의복제견모습이다. 극소위성분석결과강아지들은 각각의체세포와유전학적으로동일하였다 ( 표 4a, b). [ 표 3] 융합과활성화사이의간격이임신율에미치는효과 [ 표 4a] 수컷공여세포로부터생산된 3마리복제강아지의극소위성분석 [ 표 4b] 암컷공여세포로부터생산된복제강아지의극소위성분석 - 19 -
3. 확인대상발명의도면의간단한설명 도 1 은융합후개복제핵이식란의핵모양을나타낸것이다. ( 단, A-C: 융합후 2시 간째모양. A, B: 응축염색체중기같은연장된염색체. D-F: 융합후 4시간째에관찰 된분산된염색체모양. 기준선, 10 um) 도 2는체세포복제에의해생산된 3 마리의복제견을나타낸것이다. ((A) 생후 25 주, (B) 생후 22 주, (C) 생후 19 주) 4. 도면 [ 도 1] [ 도 2] - 20 -