별지제 14 호서식 자체연구개발과제최종보고서 단위과제명생물제제평가기술개발연구과제번호 10201생물안308 연구과제명면역글로불린제제의 B형간염표면항체가시험법개선 책임자 소속 혈액제제검정팀 성명 반상자 책임자 반상자 10% 연구자 서지숙 10% 연구자 연구자 이유경 10% 연구자 박상미 10% 및참여율 연구자 신인수 20% 연구자 이완희 10% 연구자 김정환 10% 연구자 김오정 20% 연 구 결 과 활용계획 필요성 및 목표 방법 및 결과 기대성과 면역글로불린제제의 B형간염표면항원항체가역가시험인미세입자고착효소면역검사 (MEIA) 법에대한검정시약의짧은유효기간, 동시처리검체수량의제한등의단점을해결할수있는시험법개선필요에따라적합한 ELISA Kit 선정을통한 ELISA법확립및 MEIA 법과의비교분석및제조사등과의공동연구를통한역가시험결과비교및상관관계분석에의한사람면역글로불린제제에대한 B형간염표면항원항체가시험법개선국내외에서시판되어사용되고있는 ELISA Kit 후보중스크리닝을통하여적합한 Kit를선정한다. 국가표준품을이용하여직선성, 특이성등을고려한시험법을확립한다. 동일한국가표준품및검체를사용하여 MEIA법및 ELISA법을각각수행한결과를비교하고시험타당성을확인한다. 제조사와의공동연구를통한확립된시험법검증. 예비실험 1728 data 및본실험 4312 data의통계분석실시 정확성 (accuracy) 은희석표준품의회수율 >96% 정밀성 (precision) 및반복성 (repeatability) 은예비실험에서평균 ~5% 이하본실험전체에서 ~10% 로확인 특이성과검출한계는음성혈장과의통계분석에서사용된최저농도인 <10 IU로결정 정량한계는표준곡선분석에서 10~150 IU/L로직선성은 R 2 >0.998 완건성 (Robustness) 는 matrix effect등을평가했을때회수율 100.1% B 형간염표면항원항체가시험개선을통한사람면역글 로불린제제의품질관리향상 시험법개선에따른 SOP 제정 연구개발비 ( 천원 ) 책정액 80,000 천원사용액 80,000 천원 발표 ( 게재 ) 계획연보 학술지명 APR 학술대회명생물공학회 비고보안성유 ( ) 무 ( ) 위와같이자체연구개발과제최종보고서를제출합니다. 2010 년 12 월일 과장성명 : 반상자 ( 서명혹은인 ) 식품의약품안전평가원장귀하
편집순서 1 : 겉표지 ( 뒷면 ) ( 측면 ) ( 앞면 ) 과 최종보고서 제 과제번호 명 면역글로불린제제의 B 형간염표면항체가시험법개선 주의 ( 주의내용기재 ) ( 글 14 point 고딕체 ) 2 0 1 0 Improvement of Assay for Human Immunoglobulin of Antibody Response to Hepatitis B Virus Surface Antigen 식품의약품안전평가원 2010. 12. 국가검정센터 혈액제제검정팀
주의내용 주 의 1. 이보고서는식품의약품안전평가원에서시행한자체연구개발과제의 최종보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시식품의약품안전평가원에서 시행한자체연구개발과제의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다. 4. 이보고서내용을신문, 방송, 참고문헌, 세미나등에인용시에는 해당주관부서또는연구책임자와사전에상의하여주시기바랍 니다.
편집순서 2 : 보고서요약문 요약문 연구과제명중심단어 면역글로불린제제의 B형간염표면항체가시험법개선 B형간염표면항원항체가, 면역글로불린, 효소면역측정법, 역가 연구기간 2010 년 1 월 1 일 ~ 2010년 12 월 31 일면역글로불린제제의 B형간염표면항원항체가역가시험인미세입자고착효소면역검사 (MEIA) 법에대한검정시약의짧은유효기간, 동시처리검체수량의제한등의단점을해결할수있는시험법개선필요에따라적합한 ELISA Kit 선정을통한 ELISA법확립및 MEIA 법과의비교분석및제조사등과의공동연구를통한역가시험결과비교및상관관계분석에의한사람면역글로불린제제에대한 B형간염표면항원항체가시험법개선을위한연구가수행되었다. 국내외에서시판되어사용되고있는 ELISA Kit 후보중스크리닝을통하여적합한 Kit를선정하기위한제조사등과의총 4개실험실의국가표준품및 WHO 국제표준품을이용한예비실험이수행되었고, 총 1728개 data의통계분석을통해정확성 ( 회수율 >96%) 및정밀성 (CV 평균 5%) 이확인된 Enzygnost 키트를선정하였으며, 희석용액으로키트에포함된음성혈장혹은사람혈청알부민 5% 가사용가능함을밝혔다. 예비실험을통해확립된표준시험방법을통해 4개실험실에서동일한국가표준품및검체를사용하여 MEIA법및 ELISA법을각각수행한결과를비교하고시험타당성을확인한본실험에서총 4312개의 data의통계분석을통하여정밀성 (precision) 및반복성 (repeatability) 평가를위한실험실간, 일간평균 CV는약 10% 로확인되었다. 특이성과검출한계는음성대조액대비최저농도표준액의흡광도통계분석에서 10 IU/L 이하로결정되었으며, 정량한계는 10~150 IU/L로확인되었다. 표준곡선의직선성은본실험과예비실험을포함한모든결과에서 R 2 >0.998로우수하였으며, 완건성 (Robustness) 는 matrix effect등을평가하기위하여사용된 3 개군 ( 사람면역글로불린, 말토즈첨가사람면역글로불린 ph4.2 및 B형간염사람면역글로불린 ) 그리고희석용액인 5% 사람혈청알부민을이용하였을때회수율이 100.1% 로조사되었다. 동연구결과 22 개의검체에대한조사에서 IMx 및 AxSYM 장비를이용한 MEIA 결과와 ELISA 키트의결과는상관성을나타내었다. 따라서 ELISA 키트를이용한국가검정이현행국가검정시험법인 MEIA법을대체가능한것으로판단되었다. 특히 4개실험실과일간변이결과또한 CV ~10% 이하로조사되었으며, 면역글로불린및말토즈첨가사람면역글로불린의기준 (>0.19 IU/50 mg 면역글로불린 ) 을 5배이상상회하는범위에서변이가관찰되었다. 현재제조사의자사기준에근거한표준시험방법과연구사업에서사용한표준시험방법은통계적으로유의한차이를보이지않았으나표준곡선의범위와검체희석배수를조정하여표준곡선의중간점으로검체흡광도를조정한본시험법이보다신뢰도높은결과값을제시할것으로판단되어동표준시험방법의제정할예정이다. 이로써본연구를통하여 B형간염표면항원항체가시험법을확립하였고관련면역글로불린제제의품질관리향상에기여할것으로판단된다.
편집순서 3 : 영문요약서 Summary Title of Project Keywords Improvement of Assay for Human Immunoglobulin of Antibody Response to Hepatitis B Virus Surface Antigen Anti-HBsAg, Immunoglobulin, ELISA, potency Project Period 2010. 01. 01 ~ 2010. 12. 31. Comparison of 5 assay methods for anti-hbsag is performed to improve potency assay of human immunogloguling (HuIgG) preparation. Current assay method based on microparticle enzyme immuno assay (MEIA) with IMx (Abott) has some disadvantage including discontinuation of related reagent and limited sample number for one assay. Therefore, to overcome these issues, the purpose of this study was to establish ELISA method for anti-hbsag comparing with current MEIA methods. First of all, three commercial ELISA kits were compared with co-laboratory studies including manufacturers and KFDA (total 1728 data) using national standard (NS) of and international standard (IS) of anti-hbsag. Resulted similar reproducibility (average CV=5%, recovery>96%) of each kits however, Enzygnost(Abott) was selected as an optimal kit which showed the most stable precision (CV=4.1%) when the negative serum was applied as diluent for sample and standard. Even though, negative serum and 5% human serum albumin (HSA) showed compatible reproducibility, negative serum gave better precision (CV=4.1% vs 7.1%) and lower background (data not shown). Using optimal ELISA kit, the validation were performed including intra- and inter-day assay, inter-laboratory assay data and inter-method comparison with 22 representative HuIgG preparations (total 4312). The samples consists of 9 lot of maltose added HuIgG, 3 lot of HuIgG, 5 lot of Anti HBV HuIgG and 5 NS spiked samples (total 22 samples). As a result intra day precision was 4.6±2.0% and inter day precision was 7.7±5.3 for ELISA (N=180 for 5 days), 3.7±1.9 for AxSym (N=10 for 5 days) and 1.6±0.8 for IMx(N=6 for 2 days). With the result of NS 10 IU spiked samples (4 representative samples and 1 blank), the mean recovery% was 100.1±12.55% (N=752). The statistical analysis showed the detection limit of ELISA was below 10 IU/L and the range was 5~150 IU/L. The linearity of dose response curve with NS were good (R 2 >0.998) and robustness was proved based on the spiking assay with representative samples (100.1%) which showed no matrix effect. Therefore, the ELISA assay was validated and showed co-relation to MEIA including two automated instruments; IMx and AxSYM. As a conclusion the ELISA assay could replace current assay method, MEIA resulted from 22 sample comparison assays for 5 day-to-day data with 4 laboratories. We will provide standard operating procedure of anti-hbsag assay with the ELISA as a validated assay which was expected to improve the quality control of related preparations.
편집순서 4 : 목차 목 차 Ⅰ. 연구개발과제연구결과 제 1 장연구개발과제의개요 1 제 2 장연구개발과제의국내 외연구개발현황 3 제 3 장연구개발과제의연구수행내용및결과 4 제 4 장연구개발과제의연구결과고찰및결론 43 제 5 장연구개발과제의목표달성도및관련분야에의기여도 44 제 6 장연구개발과제의연구개발결과활용계획 45 제 7 장참고문헌 46 제 8 장첨부서류 47
편집순서 5 : 연구개발과제연구결과 연구개발과제연구결과 제 1 장연구개발과제의개요 면역글로불린제제의 B형간염표면항원항체가역가시험인미세입자고착효소면역검사 (MEIA) 법에대한검정시약의짧은유효기간, 동시처리검체수량의제한등의단점을해결할수있는시험법개선 제 1 절연구개발과제의목표 사람면역글로불린제제에대한 B 형간염표면항원항체가시험법개선 제 2 절연구개발과제의필요성 B형간염표면항체 (Hepatitis B surface antibody) 검사는 B형간염예방접종후, 수술전혹은건강검진목적으로대부분의검사실에서가장많이의뢰되는검사종목중의하나이다. 수동혈구응집법에이어진보된검사법으로효소면역측정법 (enzyme immunoassay, EIA) 의도입후많은기관에서정량측정이가능해졌다. B형간염표면항원 (Hepatitis B surface antigen, HBsAg) 검사는정량분석이가능하며가능하며 B형간염바이러스의방어항체수치가 10 miu/ml로제시되어양성기준이명확하다. 정량적면역측정법중안정성이높다고알려진미세입자효소면역검사법 (microparticle enzyme immunoassay, MEIA), 전기화학발광면역검사법 (electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA), 화학발광면역검사법 (chemiluminescence assay, CLIA) 이보편화되어사용되고있다. 임상적사용외에혈액제제인사람면역글로불린제제등에도 B형간염표면항원검사가유럽약전등에서역가시험으로채택되어사용되고있다. 사람면역글로불린제제는혈장분획을제조할목적으로채장된개별혈장을가지고냉에탄올분획공정및불활화열처리공정을거쳐제조된생물학적제제로서저및무감마글로불린혈증등의적응증을가지고있다. 또한특수혈장유래사람면역글로불린중 B 형간염사람면역글로불린제제는혈장분획제제를제조할목적으로채장된 B형간염혈장 (Anti-HBs Plasma) 를용해한후위와동일한공정을거쳐제조된제제로서, 성인및신생아의 B형간염치료및예방의목적등으로사용되고있다. 우리나라의각제제별 - 1 -
연간국가검정접수건은 2009 년에전자의경우 129 건, 후자의경우 22건접수되어혈액제제의연간접수건수인 600여건에서상당수를차지하고있다. 각국의공정서에수재된사람면역글로불린제제의역가시험을살펴보면, 유럽약전 (EP) 의경우효소면역측정법을이용한 B형간염표면항원항체가 ( 이하 Anti-HBsAg) 항목을채택하고있으며, 우리나라의경우일반혈장유래사람면역글로불린의경우역가시험항목을홍역항체가시험으로설정하고있으나, 최근 Anti-HBsAg 시험을추가하였다. 한편 B형간염사람면역글로불린제제의경우 Ant-HBsAg시험항목을채택하고있다. 현재 B형간염사람면역글로불린제제의국가검정수행시역가시험방법으로미세입자고착효소면역검사 (MEIA) 법을사용하고있으나, 보유하고있는장비의검정시약단종및짧은유효기간, 동시처리검체수량의제한등의문제점이있어해당시험법의개선이필요하다. 관련시험법개발동향을살펴보면, 언급된시험법외에 ELISA Kit 및화학발광면역법 (Chemiluminescence assay) 등이개발되어상업적으로널리판매되고있다. 이중 ELISA Kit법의경우많은수의검체를동시에처리할수있고시험법또한간편하여국제적으로도많이이용되고있는시험방법이다. 또한, WHO 및각국규제기관등에서표준화된시험법을통한품질관리의필요성을인식하고있으므로, 본연구의목적은 ELISA 법을확립한후기존의 MEIA법과비교분석하여 ELISA 법으로시험법을개선하고자하며, 제조사와의공동연구를통하여확립된시험법을상호검증하고, 나아가이러한결과를토대로역가시험표준화를통한품질관리능력향상하고국제적인추세에부응하고자한다. - 2 -
제 2 장연구개발과제의국내 외연구개발현황 2008 년도에식품의약품안전청혈액제제팀에서면역글로불린제제역가시험법개선에관한연구가수행되었으며, 이를토대로생물학적제제기준및시험방법에서말토즈처리사람면역글로불린 ph4.25 및사람면역글로불린의역가시험항목중 Anti-HBs항목을추가함. 유럽약전 (EP) 에서사람면역글로불린제제의역가시험법으로 Anti-HBs시험항목을채택하고있음. - 3 -
제3장연구개발과제의연구수행내용및결과 3.1. 실험방법 전체실험은 ELISA Kit 선정및시험법확립을위한예비실험과공동연구를통한시험법간 (ELISA vs MEIA) 및실험실간상관관계를조사하고시험법을검증하기위한검체를이용한본시험으로진행되었다 (Scheme. 1). - 4 -
Scheme 1. Scheme to establish ELISA assay method for Anti-HBsAg in immunoglobulin preparations. - 5 -
3.1.1 ELISA Kit 선정시험우선 ELISA Kit 선정을위한예비실험에서는국가표준품의국제표준품에대한회수율과실험에사용되는음성혈장희석액과 5% 사람혈청알부민 ( 이하 5% HSA) 을비교하고, 3종류의 ELISA 키트인 Enzygnost, Murex, Monolisa 의재현성을확인하기위한시험이실시되었다. 국가표준품 ( 식약청, 95.45 IU/vial) 을표준곡선으로, 국제표준품 (WHO, 100 IU/vial) 을검체로하여 4개의실험실 ( 식약청, 적십자, 녹십자, SK 케미칼 ) 에서동일한 4 희석배수표준액에대해실험실당 Enzygnost 키트의경우음성혈장과 5% 사람혈청알부민 (HSA, ( 주 ) 녹십자 ) 을희석액으로각희석액당 3회씩총 6회, 그외키트는 5% HSA으로 6회씩반복한결과를분석하였다. 총분석횟수는국가 / 국제표준품 4개의희석농도당 3개웰씩 6회씩 3개의키트에적용하여실험실당 512 회를 4개실험실에수행하므로써총 1728 회의분석이수행되었다 (Scheme. 2) - 6 -
Scheme 2. Research scheme for establishment and selection of optimal ELISA kit for Anti-HBsAg - 7 -
3.1.1.1 Kit 선정시험을위한 ELISA를이용한 Anti-HBsAg 측정법 ELISA 시험방법은각키트제조사의시험방법을이용한표준시험방법을제정하여각실험실이공통적으로적용하였다 (SOPs). 요약하면, 세키트모두일정량의 HBsAg이코팅된플레이트를이용하였다. 각각의국가표준품및국제표준품은 1 ml 초순수로희석한다. 이후희석액 ( 키트에포함된음성혈장혹은 5% 사람혈청알부민 ) 을이용하여 1000, 2000, 4000 및 10000 배희석한다. 키트에포함된 HBsAg-HRP conjugate을 25 μl 씩웰에넣는다. 즉시각희석표준액 100 μl를 3개의웰에넣는다. 이때키트에포함된양성대조액과음성대조액각각을 3개의웰에 100 μl씩넣는다. 60분간 37 oc에서반응한다. 반응후키트내세척액을이용하여 5회세척한다. 세척액을제거하고즉시 TMB 와 H2O2가포함된발색시약을웰당 100 μl씩넣고상온에서 30분간발색한다. 반응정지액인 1N H2SO4시액을 100 μl씩첨가한후즉시 450 nm에서비교파장 650 nm로흡광도를측정한다. 국제표준품을표준곡선으로하여각희석배수의국가표준품의농도를측정한다. 3.1.2 공동시험을통한시험법검증시험시험법검증을위한본실험은 Kit 선정용예비실험과동일하게 4개의실험실에서실시되는 semi-blind test (B형간염사람면역글로불린은 ml당 200 IU 이상이고나머지검체는 0.19 IU 이상인관계로두제제군은희석배수가달라이를희석배수구간으로사전공지함 ) 로총 22개의검체에대해예비실험과동일한방식으로수행하였다. 이때 ELISA Kit는예비실험에서선정한최적조건인 Enzygnost 만을사용하고 2개실험실에서는추가로자동화장비인 MEIA 원리를응용한 AxSYM과 IMx의결과를산출하여자동화장비데이터와 4개실험실의한 ELISA 키트결과를비교분석하였다. ELISA를사용한실험은 4개의실험실에서 5일동안 22개검체군 (Table. 1) 3회씩반복한결과를얻었다. 이결과를이용하여일내, 일간, 실험실간통계적유의성이분석되었다. 자동화장비인 AxSYM과 IMx를사용한결과는각각의실험실결과를토대로 AxSYM은 1일 1회씩 5 일간실시되었으며, IMx는 1일 3회반복하여얻어진 22개검체에대한결과를토대로세가지측정법을비교할때사용되었다 (Scheme. 3). - 8 -
Scheme. 3. Research scheme for co-laboratory analysis of Anti-HBsAg with various methods - 9 -
3.1.2.1 Anti-HBsAg 측정법 ELISA 측정법은위 3.1.1.1 방법을준용하였다. 단국가표준품을표준품으로사용하였으며, 농도는 25 IU/L에서 150 IU/L 범위에서 4 희석배수로음성혈장을희석액으로사용하였다. 각검체는 IMx에서판정된결과를근거로흡광도가 0.5~1.5 범위에포함되도록희석되었다 (Table. 1) 각검체는 3 단계의희석배수 ( 예 1/20, 1/30, 1/40) 씩적용되었으며 4 실험실에각검체번호별희석배수가배포되어공동시험에적용되었다. IMx 와 AxSYM의경우 IMx는제조사시험방법을준용한국가검정 SOP가적용되었고, AxSYM의경우마찬가지로장비제조사시험방법을준용한녹십자사의자사 SOP가적용되었다. 3.1.2.2 검체의선정본실험에사용된검체는각각녹십자와에스케이케미컬양사에서무상공급받은검체를사용하였다. 역가시험으로 Anti-HBsAg이설정된사람면역글로불린제제 (HuIgG) 가적용되었으며, 각각 3 lot의제품을사용하였다. 세부적으로말토즈첨가사람면역글로불린의경우녹십자제품은원료가국내와수입으로나누어져있어녹십자에서 6 lot의제품이제공되었고, 사람면역글로불린제제와 B형간염사람면역글로불린제제는녹십자만에제품이있어각각 3 lot가사용되었다. 근주용 B형간염사람면역글로불린의경우제품생산량이적어 2 lot가적용되었다. 에스케이케미칼에서는국내혈장을원료로한말토즈첨가사람면역글로불린 3 lot가제공되었다. 이렇게총 17 lot의제품외에각제제군의한 lot에 10 IU의국가표준품 (NS) 이첨가된검체가 metrix 효과에의한완건성측정을위해준비되었고희석액중하나인사람혈청알부민에 10 IU가첨가된검체가별도로준비되어총 22개검체가준비되었다 (Table. 1). - 10 -
Table. 1. Sample information for ELISA of Anti-HBsAg as a co-laboratory assay. 번호 검체종류 희석배수 1 말토즈첨가 HuIgG lot 1( 수입혈장 ) 20 30 40 2 말토즈첨가 HuIgG lot 1( 국내혈장 ) 20 30 40 3 HuIgG lot 1 40 50 60 4 정주용 B형 HuIgG lot 1 4000 5000 6000 5 말토즈첨가 HuIgG lot 2( 국내혈장 ) 20 30 40 6 근주용 B형 HuIgG lot 1 4000 5000 6000 7 1% BSA in PBS + 10 IU of NS 100 200 300 8 말토즈첨가 HuIgG lot 2( 수입혈장 ) 20 30 40 9 말토즈첨가 HuIgG lot 3( 국내혈장 ) 20 30 40 10 HuIgG lot 2 40 50 60 11 정주용 B형 HuIgG lot 2 4000 5000 6000 12 말토즈첨가 HuIgG lot 4( 국내혈장 ) 20 30 40 13 근주용 B형 HuIgG lot 2 4000 5000 6000 14 말토즈첨가 HuIgG lot 1( 수입혈장 )+10 IU of NS 100 200 300 15 말토즈첨가 HuIgG lot 3( 수입혈장 ) 20 30 40 16 말토즈첨가 HuIgG lot 5( 국내혈장 ) 20 30 40 17 HuIgG lot 3 40 50 60 18 정주용 B형 HuIgG lot 3 4000 5000 6000 19 HuIgG lot 1 + 10 IU of NS 100 200 300 20 말토즈첨가 HuIgG lot 6( 국내혈장 ) 20 30 40 21 말토즈첨가 HuIgG lot 1( 국내혈장 ) + 10 IU of NS 100 200 300 22 정주용 B형 HuIgG lot 1 + 10 IU of NS 4000 5000 6000-11 -
3.2 통계분석 모든통계분석은 SAS (Version 9.1.3, SAS Institute, Cary, North Carolina, USA) 을이용하고그룹간의유의성검정은유의수준 5% 하에서양측검정 (two-sided) 을원칙으로한다. 실험중에발생한오류와같이명백한이상치는분석에서제외하고결측치는보정없이분석되었다. 세부적으로흡광도의산술및기하평균, 표준편차, CV, 신뢰구간등을요인수준에따라제시되었다. 자료가정규성을만족하는경우, two sample t-test 또는 ANOVA test 를실시하고, 그렇지않은경우비모수검정인 Wilcoxon rank-sum test 또는 Kruskal-Wallis test 를실시하였다. 비교그룹의수가 3개이상인경우 ANOVA test 또는 Kruskal-Wallis test 를실시하는데검정결과가유의한경우, 두개그룹을짝지어모든조합에서 two sample t-test 또는 Wilcoxon rank-sum test를실시하고 Bonferroni 방법으로 p값을보정하였다. 상대적으로분석횟수가많아 p< 0.01 을통계적으로유의한결과로판단하였다. 3.3 ELISA Kit 선정을위한예비실험결과 역가의기술통계량을키트별, 실험실별, 용액별로 Table 3.1 에제시하였다. Enzygnost 키트의음성혈장희석액의경우녹십자를제외한실험실의 CV값은 10% 미만으로작은반면 5% HSA의경우에는 CV값이상대적으로더크다. 이를통해음성혈장희석액의재현성이 5% HSA 희석액보다더높음을알수있다. 또한 Enzygnost 키트의 CV 평균은음성혈장희석액이 3.94% 로 5% HSA 희석액의 CV평균인 6.76% 보다작았고, 다른 키트의 CV 평균 (Monolisa 7.78%, Murex 5.98%) 보다정밀한값을나타내었다 (Table. 2). 본실험에서사용할키트로재현성이높은 Enzygnost 가선정되었다. 또한국가표준품과국제표준품으로도출한표준곡선의직선성을평가하기위해 R2를비교한결과거의모든표준곡선이 1에가까운 R2를나타내좋은직진성을보였다. 국가표준품의평균은 0.9982, 국제표준품의평균은 0.9967 로국가표준품의 R2값이약간더크게나타났으나전반적으로직선성이우수한것으로평가되어검체의 Anti-HBsAg을측정하는데두표준품모두적합하다고판단되었다. 국제표준품을표준곡선으로하여국가표준품의회수율을표시역가에대비한결과음성혈장을사용한경우 103.3±11.7% 그리고 5%HSA 를사용한경우 96.4±19.2% 의회수율을보였다 (Table. 3). - 12 -
Table. 2. Comparison of statistical analysis of three ELISA kits for Anti-HBsAg with 4 co-laboratory tests (N>9) Lab E Mo Mu Solution Type 음성 혈장 5% HSA 5% HSA 5% HSA Lab Mean (IU/vial) SD CV(%) GM GCV(%) A 93.93 2.22 2.36 93.91 2.39 B 95.12 2.22 2.33 95.09 2.38 C 106.73 6.51 6.10 106.55 6.46 D 90.99 4.53 4.98 90.89 5.22 A 88.52 4.96 5.60 88.40 5.75 B 88.49 7.03 7.94 88.25 8.18 C 105.58 6.65 6.29 105.38 6.85 D 88.32 6.35 7.19 88.11 7.63 A 79.87 2.86 3.58 79.82 3.68 B 91.98 3.80 4.13 91.90 4.25 C 78.63 14.76 18.77 77.11 23.68 D 89.82 4.16 4.63 89.72 4.79 A 94.96 7.12 7.50 94.70 7.91 B 97.34 4.34 4.46 97.25 4.57 C 105.42 5.28 5.01 105.30 5.10 D 99.63 6.90 6.93 99.41 7.09 Where GM: Geometric Mean, GCV: Geometric Coefficient of Variation, E: Enzygnost kit, Mo: Monolisa kit, Mu: Murex kit. The participated laboratories are (A)~(D). - 13 -
Table. 3. Recovery of National Standard calculated from dose response curve of International Standard of Anti-HBsAg. 희석액 N 회수율 (%) SD (%) 음성혈장 48 103.3 11.7 5% HSA 48 96.4 19.2 Where, N=assay number, SD=standard deviation and HSA=human serum albumin - 14 -
음성혈장희석액과 5% HSA 희석액간차이유무를검정하기위해 Shapiro-Wilk test 를통해반응값의정규성을검정한결과, 정규성을만족하지않으므로 (p<0.0001) 비모수검정인 Wilcoxon rank-sum test 를실시하여두용액간에차이가있는지검정하였다. 분석결과 4개실험실에걸쳐모두음성혈장이 5% HSA보다높은역가를보였으나, 적십자, 녹십자, 식약청은두용액간에는 p value가 0.05 이상이었으며, SK의경우에는 p value가 0.046 으로나타났다. 실험실구분없이통합한결과두용액간의차이를나타내는 p value는 0.03 이었다. 비록 5% HSA를희석용액으로사용했을경우정밀도가낮아지는결과를보였으나, 회수율에서큰차이가없고통계적으로유의한수준의차이를보이지않았기때문에 (p=0.03) 희석용액으로 5% 알부민도사용가능한것으로판단되었다. - 15 -
Table. 4. Comparison effect of dilution solution types on Anti-HBsAg ELISA assay based on statistical analysis of co-laboratory results. Mean CV lab 희석용액 N SD (IU/L) (%) 음성혈장 12 93.5 3.2 3.4 A 5% HSA 12 93.4 10.4 11.1 p value 0.47 B C D Total 음성혈장 12 92.4 7.6 8.2 5% HSA 12 81.5 16.7 20.5 음성혈장 12 99.3 18.8 19.0 5% HSA 12 97.2 19.3 19.8 음성혈장 12 91.5 4.8 5.3 5% HSA 12 79.3 17.5 22.0 음성혈장 48 94.2 10.7 11.3 5% HSA 48 87.9 17.5 20.0 0.05 0.84 0.06 0.03 The participated laboratories are (A)~(D). - 16 -
5% HSA 희석액에대한키트간비교분석한결과 (Table. 5), 녹십자외다른세실험실에서모두유의한차이를보였으나다중비교를통해 SK케미칼, 녹십자, 식약청의자료는 Enzygnost 키트와다른키트간에는유의한차이가없는것으로나타났다. 적십자의경우에는 Monolisa 키트가다른두키트와차이를보였다. 적십자와녹십자에서 Enzygnost 키트가가장높은역가를보였고, SK케미칼과식약청에서는 Murex 키트가가장높은역가를보였다. 모든실험실을통합하여키트간의차이를검정한결과, Monolisa 를제외한두 kit는통계적으로유의한차이를나타내지않았다. 그러나, 희석등과정에서실수가파악된몇건의편차를제외하고대체적으로세 kit간통계적유의한차이를보이지않았으므로 kit간차이는크지않다고판단하였다. - 17 -
Table. 5. Comparison of statistical analysis for three ELISA kits of Anti-HBsAg test. Lab Kit N Mean Bonferroni method (p-value**) SD (IU/L) E vs. Mo E vs. Mu Mo vs. Mu E 12 93.3 10.4 A Mo 24 81.2 8.0 0.000 1.000 0.044 Mu 24 83.7 22.2 E 12 81.5 16.7 B Mo 24 86.7 10.6 0.918 0.127 0.084 Mu 24 90.5 13.5 E 12 97.2 19.3 C Mo 24 83.8 32.9 0.161 1.000 0.234 Mu 24 96.3 17.2 E 12 79.3 17.5 D Mo 24 83.9 11.3 1.000 0.099 0.044 Mu 24 86.8 24.4 E 48 87.9 17.5 Total Mo 96 83.9 18.4 0.030 0.416 0.000 M u 96 89.3 20.1 Where E: Enzygnost kit, Mo: Monolisa kit, Mu: Murex kit. The participated laboratories are (A)~(D). - 18 -
각 kit별국가표준품의회수율을조사한결과전체적으로가장높은희석배수인 10,000 배희석에서정밀도와회수율이낮아지는결과를보였다 (Figure. 1). 이것은높은희석배수에따른실험오차가커지는것이원인으로분석되었고실제한실험실에서는희석실수에의한편차가커진것이결과분석을위한점검회의에서지적되었다 (Table. 2). 그럼에도불구하고통계분석에의한가장낮은농도의표준액 (10 IU/L) 에서도음성대조액인음성혈장의흡광도와대비하여통계적으로매우유의한분석결과 (p<0.0001) 를나타내어최소 10 IU/L의측정하한농도를나타내었다 (Table. 6). - 19 -
Figure. 1. Comparison recovery of Anti-HBsAg National Standard (NS) to International Standard (IS) dose response curve of three ELISA kits. Red dot line represents the theoretical 100% recovery of NS (95.45 IU/mL). X axis shows dilution factor and Y axis represents Anti-HBsAg concentration (IU/L). N=18 to each kits. - 20 -
Table. 6. Statistical analysis for the detection limit of ELISA assay for Anti-HBsAg. (N=20) t df Sig. Mean Difference 95% Confidence (2-tailed) (A 450 ) Lower Upper 10 IU/L 17.678 17.000.18761.1652.2100 음성혈장 6.519 17.000.06300.0426.0834-21 -
위측정하한농도에도불구하고검체적용을통한공동연구에서는이런단점을보완하고임상검체와달리관련제제의검정기준이최소 190 IU/L인점을감안하여표준곡선의범위를 25~150 IU/L로조정하였고 10,000 배의희석배수에서시험재현성이낮아짐을고려하여최대희석배수를 6,000 배로제한하도록관련표준시험방법서를개정하여공동연구를통한검체적용시험에사용하였다 (Table. 1). - 22 -
3.4 시험법간 일간 실험실간검증 3.4.1 일내재현성 각실험실별 1 일 1 회씩 5 일간의 ELISA 결과를분석하여각검체별일내재현성을평가 하기위해 CV% 가조사되었다 (Figure. 2). 각검체는각실험실별로 45 개의흡광도를 측정하였고그재현성평가지표로일내 CV% 가제시되었다. 전체평균 CV% 는 4.6 ± 2.0% 였으며, 실험실별로약간의정밀도차이가있었으나전반적으로 CV% 는 10% 를넘지않았다. 각실험실별 CV% 는 A가 5.8 ± 2.0%, B는 5.6 ± 2.1%, C의경우 4.3 ± 1.5% 그리고 D실험실은 2.8 ± 0.9% 로나타났다. 또한, 표준곡선의직선성은키트선정을위한예비실험때와마찬가지로 R 2 가모두 0.998 이상으로우수하였다. - 23 -
Figure. 2. Comparison of intra-day precision of Anti-HBsAg test using ELISA (Enzygnost) with 22 samples. Where A~D are participated labs, green square: lab A, blue triangle: lab B, red diamond: lab C and yellow circle: lab D, N=45 for each sample - 24 -
3.4.2 일간재현성각실험실에서측정된 B형간염표면항원항체가의일간차이가있는지에대해측정법별, 검체별로일간 CV% 가조사되었다. 전반적으로안정된정밀도를보였으며 ( 평균 CV%=4.3 ± 3.1), ELISA (CV% = 7.7 ± 5.3) 의경우전반적으로 MEIA법을사용한자동화장비인 AxSYM (CV% = 3.7 ± 1.9) 이나 IMx (CV% = 1.6 ± 0.8) 보다약간높은 CV% 를나타냈다. 단, ELISA의경우 1일 1회씩 4개실험실에서 5일간실시된각검체별로 180 회검사가실시된반면, 자동화장비는보유한실험실이각각한실험실인관계로한실험실에서만시험되었고 AxSYM은 1일 2회씩 5일간 IMx는기기시약단종으로 1일 3회씩 2일간실시된결과가제시되었다 (Figure. 3). - 25 -
Figure. 3. Comparison of inter-day (for 5 days) precision of Anti-HBsAg test using ELISA (Enzygnost) and MEIA (AxSYM, IMx) with 22 samples. Where N=180 for ELISA (5 days), N=10 for AxSYM (5 days) and N=6 for IMx (2 days) to each sample, light blue diamond for ELISA, blue square for AxSYM and red circle for IMx. - 26 -
3.4.3. 정확성정확성검증을위해검체군중 1 lot씩을선정하여 10 IU의국가표준품 (National Standard, NS) 가첨가되었고희석액으로사용되는 5% 사람혈청알부민에도동일한양의국가표준품이첨가되어회수율이조사되었다 (Table. 7). ELISA와 MEIA를이용한총 752 회시험에서전체적으로 100.1 ± 12.6% 의회수율을보였으며, 검체종류별회수율차이는통계적으로유의한변이를보이지않았다. 따라서본 ELISA 시험법은일내-일간정밀성, 정확성및표준곡선의직선성을보였을뿐만아니라기존의시험법인자동화장비를이용한 MEIA와동등한정도의정밀성과정확성을나타냈다. - 27 -
Table. 7. Spiking test result of Anti-HBsAg assay with 4 representative lot from each sample groups and one blank solution. - 28 -
3.5 공동연구를통한검체군별시험법간 Lot 간 실험실간검증 3.5.1. 말토즈첨가사람면역글로불린제제 ( 원료-수입혈장 ) 성능이검증된 ELISA kit와 MEIA 시험법을수입혈장을원료로제조된말토즈첨가사람면역글로불린제제 3 lots에적용하여그결과가실험실간에분석되었다 (Figure. 4). 전체적으로각 lot간약간의차이는있었으나 ELISA를이용한 4개실험실간의차이는통계적으로유의하지않았으며 (CV% = 6.4%, 최소값 1.6%, 최대값 13.0%), 네실험실의 ELISA 결과평균값과 MEIA 방법각각의결과값또한일치하였다 (CV% = 2.9% 최소값 0.6%, 최대값 6.0%) (Table. 8). 또한모든결과값은최소해당제제의우리청기준인 0.19 IU/50 mg HuIgG에 5배이상수준이었다. - 29 -
Figure. 4. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lots of maltose added HuIgG from imported plasma source. Where N=180 for ELISA, N=10 for AxSYM and N=6 for IMx, inside light blue rectangle for ELISA (4 participated labs), light blue diamond is the 1 st lot, blue square is the 2 nd lot and blue triangle is the 3 rd lot. - 30 -
Table. 8. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lots of maltose added HuIgG from imported plasma source. - 31 -
3.5.2. 말토즈첨가사람면역글로불린제제 ( 원료-국내혈장, 제조사 A 및 B) 성능이검증된 ELISA kit와 MEIA 시험법을국내혈장을원료로 A 제조사 (Figure. 5) 및 B 제조사 (Figure. 6) 에서생산된말토즈첨가사람면역글로불린제제각각 3 lot에적용하여그결과가실험실간에분석되었다. 전체적으로각 lot간약간의차이는있었으나 ELISA를이용한 4개실험실간의차이는통계적으로유의하지않았으며, 제조사 A의경우 CV는 4.8% 이었으며 (Table. 9), 제조사 B의경우 CV% 는 6.8%(Table. 10) 로조사되었다. 네실험실의 ELISA 결과평균값과 MEIA 방법각각의결과값또한일치하였다 (A 제조사 CV=1.9%, B 제조사 CV=4.3%) (Table. 9 및 Table. 10). 또한모든결과값은최소해당제제의우리청기준인 0.19 IU/50 mg HuIgG에 5배이상수준이었다. - 32 -
Figure. 5. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lot of maltose added HuIgG from national plasma source produced by A manufacturer. Where N=180 for ELISA, N=10 for AxSYM and N=6 for IMx, inside light red rectangle for ELISA (4 participated labs), light blue diamond is the 1 st lot, blue square is the 2 nd lot and black triangle is the 3 rd lot. - 33 -
Table. 9. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lot of maltose added HuIgG from national plasma source produced by A manufacturer. - 34 -
Figure. 6. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lots of maltose added HuIgG from national plasma source produced by B manufacturer. Where N=180 for ELISA, N=10 for AxSYM and N=6 for IMx, inside light red rectangle for ELISA (4 participated labs), black circle is the 1 st lot, red diamond is the 2 nd lot and green triangle for the 3 rd lot. - 35 -
Table. 10. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lots of maltose added HuIgG from national plasma source produced by B manufacturer. - 36 -
3.5.3. 사람면역글로불린제제 성능이검증된 ELISA kit와 MEIA 시험법을사람면역글로불린제제각각 3 lot에적용하여그결과가실험실간에분석되었다. 전체적으로각 lot간약간의차이는있었으나 ELISA를이용한 4개실험실간의차이는통계적으로유의하지않았으며, ELISA 실험실간 CV는 7.3% 이었으며 (Table. 11), 네실험실의 ELISA 결과평균값과 MEIA 방법각각의결과값또한일치하였다 (CV = 3.1%) (Figure. 7, Table. 11). 또한모든결과값은최소해당제제의우리청기준인 0.19 IU/50 mg HuIgG에 5배이상수준이었다. - 37 -
Figure. 7. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lots of HuIgG. Where N=180 for ELISA, N=10 for AxSYM and N=6 for IMx, inside light red rectangle for ELISA (4 participated labs), light blue is the 1 st lot 1, blue square is the 2 nd lot and blue triangle for the 3 rd lot. - 38 -
Table. 11. Comparison of Anti-HBsAg assays with 3 different lots of HuIgG. - 39 -
3.5.4. B형간염사람면역글로불린제제성능이검증된 ELISA kit와 MEIA 시험법을정주용및근주용 B형간염사람면역글로불린제제각각 3 lot 및 2 lot에적용하였고, 그결과가실험실간에분석되었다 (Figure. 8). 전체적으로각 lot간약간의차이는있었으나근주용과정주용간의통계적유의한차이는없었다. ELISA를이용한 4개실험실간의차이또한통계적으로유의하지않았으며, 제조사 A의경우 CV는 10.1% 이었으며 (Table. 12), 네실험실의 ELISA 결과평균값과 MEIA 방법각각의결과값또한일치하였다 (CV = 4.4%) (Table. 12). 또한모든결과값은해당제제의우리청기준인 200 IU/mL 이상이었다. - 40 -
Figure. 8. Comparison of Anti-HBsAg assays with 5 different lots of Anti-HBV HuIgG. Where N=180 for ELISA, N=10 for AxSYM and N=6 for IMx, inside light red rectangle for ELISA (4 participated labs), light blue diamond is the first lot (intra muscle inj. preparation), blue square is the second lot (im inj. preparation), blue triangle is the first lot of iv inj prep., black circle is the second lot and red diamond is the third lot of the preparation. - 41 -
Table. 12. Comparison of Anti-HBsAg assays with 5 different lots of Anti-HBV HuIgG. - 42 -
제4장연구개발과제의연구결과고찰및결론 ELISA kit 선정및시험법검증 - 네개실험실에서국가 / 국제표준품을이용한검증실시 ( 총1728 회 ). - 통계분석을통해정확성 ( 국가표준품회수율 : 96 ~ 103%) 및정밀성 (CV = 4.1%) 를확인한 kit를최적조건으로선정 선정된 ELISA kit 의확립및기존의 M EIA 법과의비교 - 시험법확립등을위하여 22개사람면역글로불린제제를기반으로검체군선정분석 ( 총 4312 회 ) - ELISA 시험법확립을위한검증실시 : 정밀성-일간및실험실간 CV < 10%, 완건성및정확성-검체에국가표준품을 spiking 하여회수율비교 (100.1%) 및측정하한농도 <10 IU/L 및측정범위 10-150 IU/L 그리고직선성 (R 2 > 0.998) 입증 - ELISA와 MEIA (AxSYM 및 IMx) 의시험상관분석 (22개검체군별각시험법별변이인 CV는 1.9 ~ 4.4%) - 43 -
제 5 장연구개발과제의목표달성도및관련분야에의기여도 B 형간염표면항원항체가시험개선을통한사람면역글로불린제제의품질관리향 상목표달성 - 44 -
제 6 장연구개발과제의연구개발결과활용계획 제 1 절활용성과 과제명면역글로불린제제의 B 형간염표면항체가시험법개선 과제책임자 반상자 / 혈액제제검정팀 / 미생물학 제 2 절활용계획 ( 가 ) 정책활용 - 생물학적제제기준및시험방법중사람면역글로불린제제, 말토즈첨가사람면역글로불린제제및 B형간염사람면역글로불린의역가시험국가검정 SOP 마련 - 관련제제품질관리개선에활용 ( 나 ) 언론홍보및대국민교육 언론홍보및대국민교육내용등을간략히기술함 ( 다 ) 연구논문 번호논문제목저자명저널명국내 / 국외 SCI 여부 ( 라 ) 학술발표 번호발표제목발표자학회명 국내 / 국제 ( 마 ) 지식재산권 번호출원 / 등록 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국 IPC 분류 ( 바 ) 타연구 / 차기연구에활용 타연구및차기연구에활용될예를구체적으로기술함 ( 사 ) 기타 임상시험, 관련 DB 구축, 워크숍또는심포지엄개최등의경우를구체적으로기술함 - 45 -
제 7 장참고문헌 1. 유수진, 오혜전, 신보문 : 세가지검사시약에따른 Anti-HBs 검사의정성및정량적비교분석, 대한진단검사의학회지, 2006, 26(6), 431-5 2. D. Huzly, T. Schenk, W. Jilg, and D. Neumann-Haefelin, Comparison of Nine Commercially Available Assays for Quantification of Antibody Response to Hepatitis B Virus Surface Antigen, J Clin Microb, 2008, 46(4), 1298 1306. 3. Barker, L. F., D. Lorenz, S. C. Rastogi, J. S. Finlayson, and E. B. Seligmann. 1977. Study of a proposed international reference preparation for antihepatitis B immunoglobulin. WHO Expert Committee on Biological Standardization technical report series. World Health Organization, Geneva, Switzerland. 4. Galanti, L. M., C. Cornu, P. L. Masson, A. R. Robert, D. Becheanu, M. E. Lamy, and C. L. Cambiaso. Assay of anti-hbs antibodies using a recombinant antigen and latex particle counting: comparison with five commercial tests. J. Virol. Methods, 1991, 32:221 231. 5. Heijtink, R. A., P. M. Schneeberger, B. Postma, and W. Crombach. Anti-HBs levels after hepatitis B immunisation depend on test reagents: routinely determined 10 and 100 IU/l seroprotection levels unreliable. Vaccine, 2002, 20, 2899-2905. 6. 생물학적제제기준및시험방법 ( 식품의약품안전청고시제2008-16 호, 2008.08) 7. 식품의약품안전평가원 SOP - 46 -
제8장첨부서류 첨부 1. 용역연구결과보고서 - 실험실 A 첨부 2. 용역연구결과보고서 - 실험실 B 첨부 3. 용역연구결과보고서 - 실험실 C 첨부 4. 용역연구결과보고서 - 실험실 D - 47 -
첨부 1. 용역연구결과보고서 - 실험실 A - 48 -
첨부 2. 용역연구결과보고서 - 실험실 B - 49 -
첨부 3. 용역연구결과보고서 - 실험실 C - 50 -
첨부 4. 용역연구결과보고서 - 실험실 D - 51 -