대한진단검사의학회지제 27 권제 5 호 2007 Korean J Lab Med 2007;27:355-9 DOI /kjlm 원저 진단면역학 효소면역측정법과화학발광면역측정법을이용한 B 형간염표면항원검사의비교 허희진 1 채석래 1 차영주

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종환 경
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1 대한진단검사의학회지제 27 권제 5 호 2007 Korean J Lab Med 2007;27:355-9 DOI /kjlm 원저 진단면역학 효소면역측정법과화학발광면역측정법을이용한 B 형간염표면항원검사의비교 허희진 1 채석래 1 차영주 2 동국대학교의과대학진단검사의학교실 1, 중앙대학교의과대학진단검사의학교실 2 Comparison Study with Enzyme Immunoassay and Chemiluminescence Immunoassay for Hepatitis B Virus Surface Antigen Detection Hee Jin Huh, M.D. 1, Seok-Lae Chae, M.D. 1, and Young Joo Cha, M.D. 2 Departments of Laboratory Medicine, College of Medicine, Dongguk University 1, Gyeonggi Province and College of Medicine, Chung-Ang University 2, Seoul, Korea Background : The serological detection of the surface antigen (HBsAg) of hepatitis B virus (HBV) is the basis of detection of HBV infections in blood donors and patients with hepatitis. The aim of this study was to compare the performance of HBsAg enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and HBsAg chemiluminescence immunoassay used in Korea. Methods : We compared seven assays: Architect i 2000 (Abbott Laboratories, USA), Elecsys 2010 immunoanalyzer (Roche Diagnostics, Germany), Advia Centaur (Bayer Healthcare, USA), Murex HBsAg version 3 (Abbott Laboratories, USA), Enzygnost HBsAg 5.0 (DADE Behring, Germany), LG HBsAg ELISA (LG, Korea), and Genedia HBsAg ELISA 3.0 (Greencross Medical Science, Korea). We evaluated the sensitivity of each assay by testing serially diluted WHO HBsAg reference material, two seroconversion panels, and recombinant HBsAg with three mutations in the a determinant. Results : The lowest HBsAg level detected by each assay using WHO reference material was variable from 0.05 (Murex and Advia) to 0.2 IU/mL. When testing 21 seroconversion panels, the total number of positive samples was 15 by Murex and 14 by Architect. Murex, LG, and Architect detected all of the 3 mutant samples tested. Conclusions : Analytical sensitivity and mutant detecting ability among HBsAg commercial assays were variable and not related to the analytical methods, but related to the manufacturer s reagents. We suggest that each laboratory should select an HBsAg assay based on analytical performance, test throughput, and the applicability of full automation. (Korean J Lab Med 2007;27:355-9) Key Words : Hepatitis B surface antigens, Chemiluminescence immunoassay, Enzyme-linked immunosorbent assay 서 론 B 형간염만연지역인국내에서성인의약 5% 가 B 형간염만성 접 수 : 2007년 2월 21일 접수번호 : KJLM2020 수정본접수 : 2007년 6월 19일 게재승인일 : 2007년 6월 23일 교신저자 : 차영주 우 서울시동작구흑석동 중앙대학교의과대학진단검사의학과 전화 : , Fax: chayoung@cau.ac.kr 보균자로알려져있고 [1], B형간염은만성간질환의주요원인을차지하고있다. 국외에서도과거에비해수혈등으로인한감염이감소하고있지만, 여전히수혈을통한전파가보고되고있는실정으로, 간염의만성보균자가많은국내에서는특히 B형간염의정확한진단은중요하다 [2]. 표면항원은 B형간염감염후 2-8주에혈청에서처음발견되고보균자로진행시계속남아있어 B형간염면역측정법의기본이되는검사로, 과거보다검사법들의검출민감도가증가하였지만, 위음성결과들이보고되고있으므로정확하고민감한방법으로 B 355

2 356 허희진 채석래 차영주 형간염진단이나헌혈자검사를시행하는것이필수적이다. B형간염표면항원검사에서위음성을보일수있는원인으로는 B형간염보균자의혈중에검사법의검출한계보다낮은농도로표면항원이존재하거나 [3], 바이러스의특정부위변이로인한돌연변이가검사시약의항체와반응하지않는경우 [4] 등을들수있다. 또한, 표면항원의생성감소와상관있는유전자부위의돌연변이도위음성의원인으로보고되고있다 [5]. 국내에서시행된한연구에서만성 B형간염환자의 46.5% 가 S 유전자의 major hydrophilic region의돌연변이를갖고있는것으로보고된바있다 [6]. B형간염만연지역에서는돌연변이빈도가높으므로, 국내에서는 B형간염바이러스유전자돌연변이들이검사에서위음성을초래하여문제가될수있다. B형간염표면항원검사로는효소결합면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 미세입자효소면역측정법 (microparticle enzyme immunoassay), 방사면역검사법 (radioimmunoassay, RIA) 등이사용되고있고, 민감도가높고자동화가가능한검사법인화학발광면역측정법 (Chemiluminescence immunoassay) 이개발되어사용되고있다. 현재많이이용되고있는효소면역측정법을이용한시약들과화학발광면역측정법을이용한장비는분석능력, 검사비용, 검사시간등에차이가있어검사실실정에맞는방법으로 B형간염표면항원검사를시행하기위해서는시약, 장비별분석능력을비교해볼필요가있다. 상기와같이우리나라는 B형간염양성률및돌연변이빈도가높으므로가능한한돌연변이유무에상관없이민감한시약을사용하는것이안전하기때문에, 저자들은국내에서이용되고있는화학발광면역측정법을이용한자동화장비들과효소면역측정법을이용한시약들의민감도와돌연변이검출정도를비교하여 B형간염표면항원검사에대한분석능력을평가하고자하였다. 재료및방법 1. 평가장비와시약국내에서이용되는화학발광면역측정법을이용한 B형간염표면항원검사중 Architect i 2000 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA; 이하 Architect), Elecsys 2010 immunoanalyzer (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany; 이하 Elecsys), Advia Centaur (Bayer Healthcare LLC, Diagnostics Division, NY, USA; 이하 Advia) 를평가하였고각각의 B형간염표면항원검사시약을사용하였다. Architect은미세입자에결합된단클론항체인 anti-hbs가 B형간염표면항원에반응하여검사되는 chemiluminescent microparticle immunoassay를원리로하고있고측정범위는 IU/mL이고 0.05 IU/mL 이상을양성으로판정한다. Elecsys는 electrochemiluminescence immunoassay를원리로하고전극에전류를가하는순간화학발광 이유도되고이신호를검출기로측정하여보정을통해구해진기준치 (cutoff value) 와검체에서측정한신호를이용해계산된지수값 (index value) 으로결과를판정하며 1.0 이상인경우양성으로판정하고검출한계는 0.04 IU/mL이다. Advia는화학발광면역측정법을원리로하고있고지수값이 1.0 이상인경우양성으로판정한다. Microplate 법을이용하는 ELISA 시약으로는 Murex HBsAg version 3 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA; 이하 Murex), Enzygnost HBsAg 5.0 (DADE Behring, Marburg, Germany; 이하 Enzygnost), LG HBsAg ELISA (LG생명과학, 서울, 대한민국 ; 이하 LG), 제네디아에취비에스에이지엘리자 3.0 ( 녹십자상아, 서울, 대한민국 ; 이하제네디아 ) 을평가하였다. ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 와 ELISA washer (Tecan, Groedig, Austria) 를이용해검사하였다. Enzygnost의검출한계는 0.05 IU/mL이고제네디아의검출한계는 0.08 IU/mL이다. 2. 평가방법 B형간염표면항원검사의각시약별평가를위해서민감도와돌연변이검출정도를비교하였다. 모든검사는두번연속측정하여두번다양성일때양성으로판정하였고, 두번측정한결과에차이가있을때는한번더측정하여세번의결과중두번이상양성일때양성으로판정하였다. Architect의 BBI PHM- 935B 246일검체결과는각각양성과음성을보여세번째측정한결과양성으로최종양성으로판정하였고, 그외는모두두번측정한결과가일치하였다. 1) 민감도평가민감도평가는 World Health Organization (WHO) 표준물질 (HBsAg subtype adw2, genotype A reference panel, 2nd International Standard 2004, code 03/262, 33 IU/mL, National Institute for Biological Standards and Controls, South Mimms, UK) 을이용하여시행하였다. WHO 표준물질을 B형간염표면항원과 B형간염표면항체음성인혈청과계대희석하여 3.3, 0.33, 0.2, 0.1, 0.75, 0.05, 0.025, 그리고 IU/mL의최종농도로제조한후각각의장비와시약으로측정하였다. 두종류의상품화된역가반전패널을이용하여진단민감도를측정하였다 : Hepatitis B seroconversion panel PHM935B (Boston Biomedica Inc. (BBI), West Bridgewater, MA); Hepatitis seroconversion panel Catalog No. HBV (Zepto- Metrix Corporation, New York, USA). 역가반전패널 BBI PHM935B는최초검체채취일을 0일로하여 128일, 135일, 151 일, 165일 175일, 189일, 203일, 217일, 231일, 246일, 262일, 273 일에채취한혈청으로구성되어있어, 간염표면항원이양성에서음성으로역전되기시작하는민감도를예측할수있다. Zepto-

3 B 형간염표면항원검사의비교 357 Metrix HBV 11000는최초검체채취일을 0일로하여 0일, 3일, 12일, 14일, 19일, 21일, 26일, 29일, 33일에채취한혈청으로구성되어있어, 간염표면항원이양성을보이기시작하는민감도를예측할수있다. 2) 돌연변이검출평가 3종의 a 결정기돌연변이로구성된 B형간염표면항원재조합검체를각각의장비와시약으로측정하였다. 각각의재조합표면항원돌연변이는 129번아미노산인 glutamine이 histidine으로치환, 133번아미노산인 methionine이 leucine으로치환, 또는 145 번아미노산인 glycine이 arginine으로치환되어생성된것으로 Coleman에의해제공된것이다 [4]. 결 각각의시약들로 WHO 표준물질계대희석검체를검사한결과 Murex와 Advia B형간염표면항원시약의최소검출농도는 0.05 IU/mL로가장낮았다. Architect, Elecsys와 LG의 B형간염표면항원시약은 IU/mL의최소검출농도를보였고, Enzygost와제네디아시약은 0.2 IU/mL의최소검출농도를보였다 (Table 1). Murex B형간염표면항원시약은 BBI PHM935B 246일까지양성이고 ZeptoMetrix HBV 일부터양성으로역가반전패널검체 21개중 15검체가양성이었고, Architect B형간염표면항원시약은 BBI PHM935B 246일까지양성이고 ZeptoMetrix HBV 일부터양성으로 14검체양성이었다. 그외시약들은 10검체에서 13검체까지다양한양성정도를보였다 (Table 1). Murex와 LG 그리고 Architect의 B형간염표면항원시약은재조합 B형간염표면항원돌연변이 3종을모두검출하였고, 다른시약들은 3종중 2종만을검출하였고모두 145번아미노산인 glycine이 arginine으로치환되어생성된돌연변이를검출하지못하였다 (Table 1). 과 고찰 B형간염의진단에있어표면항원의존재를정확히검사하는것은환자의진단뿐만아니라, 증상이없는보균자들을선별하여감염을막는데에도중요하다. 간염의진단을위해이용되는여러 B형간염표자자중 anti-hbc만양성인경우는낮은농도의 B 형간염 DNA를가지는보균자나간염바이러스돌연변이를갖는간염환자에서보고되고있다 [7, 8]. 그러므로, B형간염감염빈도가낮은지역에서는 anti-hbc 결과로보균자의가능성을예측할수있지만, B형간염의만연지역인국내에서 anti-hbc 검사로보균자를예측하는것은불가능하다. 이런문제를보완하기위해일부국가에서는 B형간염 DNA를검출하는 nucleic acid amplification technique을수혈전선별검사로시행하고있지만국내에서는아직시행되고있지않아, 수혈을위한선별검사는표면항원검사에만의존하고있다. 이와같이국내에서의보균자진단은표면항원양성정도에만의존하고있는경우가많아국내에서이용되는시약들의표면항원검사시약민감도를평가할필요가있다. 면역크로마토그래피법 B형간염표면항원검사의민감도와자동화측정시스템간의일치율을환자검체를이용해비교한보고가있지만, 표준물질을이용해시약의민감도를평가하고비교한국내보고는없다 [9-11]. 비록역가반전패널이검사민감도를정확히반영하지는못하지만검사의전반적인수행능력 (performance) 을예측할수있기때문에저자들은표준물질과역가반전패널을이용해 B형간염표면항원검출시약들의민감도를비교해보았다. 본연구결과에서 B형간염바이러스감염후 B형간염표면항원을검출하는시점은 19-26일까지시약간에 7일간의차이가있었고, B형간염표면항원양성에서음성으로전환되는기간이 일까지로시약간에 43일간의차이를보였다. WHO 표준물질을이용한민감도평가에서 Elecsys와 Architect은시약회사에서제시된검출한계와본연구의결과가거의일치하였지만, Enzygnost와제네디아의최소검출농도는 0.2 IU/mL로서제시된검출한계와차이가있었다. B형간염표면항원검출민감도는시약마다달랐으므로검사실에서검사법의민감도차이를인지하고검사실자체민감 Table 1. Overview of the results obtained with chemiluminescence enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay Assay Architect Elecsys Advia Murex Enzygnost LG Genedia Lowest HBsAg level detected in serial dilution of WHO standard (IU/mL) Positive detection rate (%) of two seroconversion 66% 57% 57% 71% 52% 62% 48% panel (n=21) (14/21) (12/21) (12/21) (15/21) (11/21) (13/21) (10/21) HBsAg positive to negative conversion day on BBI PHM935B HBsAg negative to positive conversion day on ZeptoMetrix HBV No. of positive samples of recombinant HBsAg mutant samples (n=3)

4 358 허희진 채석래 차영주 도를설정하는것이중요할것으로사료된다. 돌연변이검출정도의비교를위해이용된 3종류의재조합검체모두를검출해낸시약은 Architect, Murex와 LG였으며, 나머지시약들은가장흔한돌연변이로알려진 145번아미노산인 glycine이 arginine으로치환되어생성된돌연변이를검출하지못하였다 [12]. 본연구가다양한재조합돌연변이로검사를시행하지못해모든변이형에대한검출력을종합적으로판단할수는없지만, 최근다른연구에서도이돌연변이를 Elecsys와 Advia 등이검출하지못함을보고하였고, 각기다른항체를사용하고있는면역검사법에서일부의항체로는 B형간염표면항원 a 결정기변이가검출되지않을수있다고설명하고있다 [13]. 한국인의 B형간염바이러스의거의대부분은유전자형 C이고 [14-16], 유전자형 C는높은 S 유전자돌연변이와상관이높다 [17]. 일본에서유전자형 C의 B형간염바이러스 S 유전자 major hydrophilic region의돌연변이빈도는 24% 인반면 [18], 국내빈도는 46.5% 로같은유전자 C형임에도국내가더높은것으로보고되고있다 [6]. 간염바이러스의돌연변이빈도는만성감염환자가많은곳에서높고, 미성숙한면역반응을보이는신생아의수직감염환자군에서높고, 특히 B형간염만연지역에서감염의예방을위해예방접종을시행하는지역에서는 vaccine escape mutant 가증가할가능성이높다 [19]. 돌연변이의검출은시약마다차이가있어무증상보균자에서 B형간염 DNA검사양성이면서표면항원음성인원인은돌연변이를일으킨바이러스들을상품화된진단시약이검출하지못하기때문인것으로보고되고있다 [20]. 또돌연변이를검출할수있는시약이라하더라도민감도에따라돌연변이바이러스의표면항원농도가낮을때는음성결과를보일수있다 [21]. 이러한원인으로실제 B형간염표면항원양성이나검사상음성으로판정된혈액이수혈된예가보고되고있다 [22]. 그러므로우리나라와같이돌연변이빈도가능성이높은지역에서는다양한변이바이러스들을검출할수있는진단시약을쓰는것이바람직하다고생각된다. B형간염표면항원을포획하는항체가단클론항체인지다클론항체인지에따라돌연변이검출정도에차이가있어단클론항체인경우돌연변이검출정도가낮고, 다클론항체인경우돌연변이검출률은높지만특이도는낮은단점이있다 [19, 23]. 저자들의연구에이용된시약중단클론항체로구성된시약은 Elecsys, Murex, 제네디아, LG, Advia이고다클론항체로구성된시약은 Architect, Enzygnost였다. 이번연구에서단클론항체시약과다클론항체시약의돌연변이검출차이는보이지않았다. 본연구에서는화학발광면역측정법을이용한자동화장비와 Microplate법을이용하는 ELISA 키트의 B형간염표면항원검출민감도와돌연변이검출능력은효소결합면역측정법, 화학발광면역측정법등검사방법간의차이보다는제조사의시약별로차이가있음을보여주었다. 하지만본연구는 B형간염표면항원검사의민감도에만국한하여비교하였고특이도에대한비교평가를수행하지못하였기때문에이결과만으로시약간의우열을평가하기 에는무리가있다. 특히 B형간염만성지역인국내에는낮은농도의 B형간염표면항원을가지고있는건강보균자수가적지않으며, B형간염표면항원농도가낮은영역일수록시약에따라특이도의차이도상당히있으리라예상되기때문에검사실에서의시약선정시세심한주의가필요하다. 검사실에서는 B형간염의진단시 B형간염표면항원검사에만의존하기보다는 HBV-DNA 검사등다른표지자를이용한보완적해석이필요하며, B형간염표면항원진단시약의차이점과검사속도, 자동화가능성등의장비성능을고려하여각검사실의필요에따라적절한시약을선택해야할것이다. 요약배경 : B형간염표면항원검사는 B형간염환자진단및무증상인의선별검사를위한가장기본이된다. 저자들은국내에서이용되는효소면역측정법과화학발광면역측정법을적용한표면항원검사장비와시약들을비교하였다. 방법 : Architect i 2000 (Abbott Laboratories, USA), Elecsys 2010 immunoanalyzer (Roche Diagnostics, Germany), Advia Centaur (Bayer Healthcare LLC, USA), Murex HBs- Ag version 3 (Abbott Laboratories), Enzygnost HBsAg 5.0 (DADE Behring, Germany), LG HBsAg ELISA (LG생명과학, 대한민국 ) 와제네디아에취비에스에이지엘리자 3.0 ( 녹십자상아, 대한민국 ) 의 7종류시약들을비교하였다. 민감도를평가하기위해두종류의역가반전패널, WHO 표준물질의계대희석혈청과 3종류의 a 결정기돌연변이로구성된 B형간염표면항원재조합물질을사용하였다. 결과 : Murex와 Advia B형간염표면항원시약의 WHO 표준물질을이용한최소검출농도는 0.05 IU/mL, 그외시약의농도는 IU/mL에서 0.2 IU/mL로다양했다. 역가반전패널검체 21검체중 Murex B형간염표면항원시약은 15검체에서양성이었고 Architect B형간염표면항원시약은 14검체, 그외시약들은 10검체에서 13검체까지다양한양성정도를보였다. Murex 와 LG 그리고 Architect의 B형간염표면항원시약은재조합 B형간염표면항원돌연변이 3종을검출하였다. 결론 : B형간염표면항원검사시약마다민감도및돌연변이검출정도에차이를보였으며, 이는효소면역측정법, 화학발광면역측정법등방법간의차이라기보다는제조사의시약에따른차이였다. 검사시약의선정시시약의분석적성능및장비의검사수행능력분석에기초해서적절한시약선택이중요할것으로생각된다. 참고문헌 1. Lee DH, Kim JH, Nam JJ, Kim HR, Shin HR. Epidemiological find-

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<333820B1E8C0BAC8F12D42C7FC20B0A3BFB0C7D7BFF820B9D720C7D7C3BC20B0CBBBE7B8A62E687770> Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 14, No. 7 pp. 3419-3424, 2013 http://dx.doi.org/10.5762/kais.2013.14.7.3419 B 형간염항원및항체검사를위한화학발광면역검사법 (CIA) 과면역크로마토그래피법 (ICA) 의비교분석 김혜정