화장품피부감작성동물대체시험법 ( 유세포분석을이용한국소림프절시험, LLNA:BrdU-FCM) 가이드라인 2018. 8. 독성평가연구부특수독성과
지침서 ᆞ 안내서제 ᆞ 개정점검표 명칭 화장품피부감작성동물대체시험법 ( 유세포분석을이용한국소림프절시험, LLNA:BrdU-FCM) 가이드라인 ( 민원인안내서 ) 아래에해당하는사항에체크하여주시기바랍니다. 이미등록된지침서ㆍ안내서중동일ㆍ유사한내용의 지침서ㆍ안내서가있습니까? 예 아니오 등록대상 여부 상기질문에 예 라고답하신경우기존의지침서ㆍ안내서의개정을우선적 으로고려하시기바랍니다. 그럼에도불구하고동지침서ㆍ안내서의제정이 필요한경우그사유를아래에기재해주시기바랍니다. ( 사유 : ) 법령 ( 법ㆍ시행령ㆍ시행규칙 ) 또는 행정규칙 ( 고시ㆍ훈령ㆍ예규 ) 의내용을단순편집또는 나열한것입니까? 단순한사실을대외적으로알리는공고의내용입니까? 1 년이내한시적적용또는일회성지시ㆍ명령에해당하는내용입니까? 외국규정을번역하거나설명하는내용입니까? 신규직원교육을위해법령또는행정규칙을알기쉽게정리한자료입니까? 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 상기사항중어느하나라도 예 에해당되는경우에지침서ㆍ안내서등록대상이아닙니다. 지침서ㆍ안내서제ㆍ개정절차를적용하실필요는없습니다. 지침서ㆍ안내서 구분 내부적으로행정사무의통일을기하기위하여반복적으로행정사무의세부기준이나절차를제시하는것입니까? ( 공무원용 ) 대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것입니까? ( 민원인용 ) 예 ( 지침서 ) 아니오 예 ( 안내서 ) 아니오 기타확인 사항 상위법령을일탈하여새로운규제를신설ㆍ강화하거나민원인을구속하는내용이있습니까? 예 아니오 상기질문에 예 라고답하신경우상위법령일탈내용을삭제하시고지침서ㆍ 안내서제ㆍ개정절차를진행하시기바랍니다. 상기사항에대하여확인하였음. 2018 년 8 월 29 일 담당자확인 ( 부서장 ) 고경육 박기숙
이안내서는화장품피부감작성동물대체시험법 ( 유세포분석을이용한 국소림프절시험, LLNA:BrdU-FCM) 가이드라인에대하여알기쉽게설명 하거나식품의약품안전처의입장을기술한것입니다. 본안내서는대외적으로법적효력을가지는것이아니므로본문의기술방식 ( 하여야한다 등 ) 에도불구하고민원인여러분께서반드시준수하셔야하는사항이아님을알려드립니다. 또한, 본안내서는 2018 년 8월현재의과학적ㆍ기술적사실및유효한법규를토대로작성되었으므로이후최신개정법규내용및구체적인사실관계등에따라달리적용될수있음을알려드립니다. 민원인안내서 란대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게 풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것 ( 식품의약품안전처지침서등의관리에관한규정제 2 조 ) 본안내서에대한의견이나문의사항이있을경우식품의약품안전평가원독성평가연구부특수독성과에문의하시기바랍니다. 전화번호 : 043-719-5152, 5155 팩스번호 : 043-719-5150
제 개정이력
목 차. 개요 6. 시험원리 6. 제한점및고려사항 7. 시험방법 7. 판정기준 12. 시험결과및보고 12 - 별첨 1 : 번역본 (OECD TG 442B 서론, 부속서 1B) - 별첨 2 : 원문 (OECD TG 442B Introduction, Appendix 1B) - 5 -
화장품피부감작성동물대체시험법 유세포분석을이용한국소림프절시험 가이드라인 개요 본시험법은피부감작성의독성발현경로 중네번째 핵심단계 인 세포의활성화와증식을평가하는방법으로서 기준에 따라시험물질의피부감작성을평가하는유세포분석을이용한국소림프절시험 이다 본시험법은 시험지침 의최근개정을 반영한것이다 본시험법은기존방사성동위원소를사용하는국소림프절시험법을대체하기위한방법으로피부감작성반응중유도기 에나타나는반응을측정하는시험법이다 림프절단일세포의증식수준을티미딘 유사체인 를이용하여유세포분석기로측정하여감작능을평가하는것이다 은다른 시험법과마찬가지로기니픽시험 대비사용 되는동물의수를줄일수있으며 면역보조제사용이불필요하여동물의고통을줄일수있는장점이있다 또한 와달리방사성동위원소를사용하지않고피부감작성을확인할수있기때문에작업시방사성노출이나방사성폐기물처리문제가없다 시험원리 감작성시험물질은도포부위림프절내에림프구증식을유도하며 림프구의증식은투여용량및도포된알레르기유발항원의감작능에비례한다 림프구의증식정도는 증식세포의 에결합하는티미딘의유사체인 양을측정하여결정한다 의결합은플루오레세인이소티오시안산 으로표지된 1) UN GHS : United Nations Globally Harmonized System of classification and labelling of chemicals 2) LLNA: BrdU-FCM : Local Lymph Node Assay: Bromodeoxyuridine-Flow Cytometry 3) 2018 년 6 월 25 일에개정됨 - 6 -
특이적항체를사용하여유세포분석기를통해 양성세포수를정량화한다 제한점및고려사항 시험을수행하기전에본시험법이시험물질에적절한시험법인지와시험물질처리농도 선택을위하여구조 물리화학적성질 생체내또는생체외독성시험결과 구조적으로유사한화학물질의독성시험자료등시험물질에대한모든자료를고려해야한다 특정금속물질 일부계면활성제와같이위양성결과를나타내는피부자극제 불용성 시험물질등의 시험법적용은제한점이존재하기때문에이러한물질들은기니픽을이용한시험 으로평가해야한다 또한시험물질이잠재적교란원인으로서작용하는작용기를포함하는경우 기니픽을이용한시험이필요할수있다 본시험법의검증연구에있어서 결과와비교시중감작성인 메르캅토벤조티아 졸 과약감작성인메틸메타크릴레이트 는위음성결과를나타내었음을참고한다 규제목적으로혼합물에대해평가할경우본시험법이적절한지를검토해야한다 시험방법 시험준비및투여용액의준비 실험동물은임신과출산경험이없는 주령의암컷마우스를사용한다 검증연구에 사용된 마우스 가선호종으로여겨지나 종도사용 될수있다 최소 일이상순화시키며 순화기간동안매일일반증상을관찰한다 마우스종선택 사육조건등의상세한사항은별첨 의부속서 항을참조한다 고체시험물질은실험동물에도포하기전에적절한용매 부형제를선정해야하며 액체시험물질은원물질혹은도포전에희석하여처리한다 의료기기와같이불용성 시험물질인경우적절한용매 부형제를사용하여추출과정을거치도록해야하며 시험물질에 - 7 -
대한안정성자료가확보되지않은경우시험당일에제조하도록한다 신뢰성확인 양성대조군을사용하여본시험에대한수행능력을점검해야한다 양성대조군은부형제 대조군에비해감작지수 가 이상증가할것으로기대하는농도에서 양성반응을야기해야하며 과도한피부자극또는전신독성을나타내지않고 의과도한반응을유발하지않는농도를선택한다 양성대조물질로는아세톤 올리브오일 에희석한 와 을사용하는것이권장되나상황 에따라정확한판정을위해다른양성대조물질을사용할수있다 매시험마다양성대조군 을포함할것을권장하나 한달에최소한번이상유세포분석을정기적으로수행하거 나 배경시험자료 를통해양성대조군의재현성있는결과들이도출되고있음을증명할수있다면주기적시험도가능하다 별첨 부속서 항참조 시험방법의변경 인원 재료및시약 마우스의공급처등 이있을경우반드시해당시험에양성대조군을포함시켜야한다 동물수및투여용량설정 투여용량군당최소 마리의마우스를사용하고 시험물질의농도는최소 단계이며 동시에처리된부형제대조군 양성대조군을포함하도록한다 시험물질의농도는대개적절한 개의연속되는농도를선정한다 예 등 시험물질과관련된모든독성학적 구조적 물리화학적정보를고려하여전신 독성이나과도한국소피부자극을피할수있는최고농도를선택하며 이와같은정보가없을경우예비시험을수행한다 예비시험 예비시험은전신독성이나과도한국소피부자극을유발하는농도에대한정보가없을때 본시험에서사용할최대투여용량을선택하기위하여실시한다 시험되는최대투여용량은액체시험물질의경우 농도이며 고체또는부유액의 경우는적용가능한최대농도이다 물질도포는시험 일차에이루어지며 양쪽 귀의뒷면에골고루물질을 씩도포하고 빈케이지에두었다가물질이모두흡수되면깔짚이있는케이지로다시옮겨준다 - 8 -
예비시험은 본시험과동일한조건하에서수행되지만 림프절증식을 평가하지않으며투여용량군당한마리혹은두마리의마우스를사용하도록권장한 다 전신독성또는도포부위의국소자극등임상증상을매일관찰하며 측정일중 어느하루라도홍반점수 이거나귀두께 이면과도한국소자극을나타내는것 으로간주한다 본시험에서의최고투여용량은예비시험에서사용된농도들중전신독성이나과도한국소피부자극을유발하는농도보다낮은농도를선택한다 표 예비시험에있어서관찰및측정항목 표 홍반증상에따른부여점수 관찰및측정항목체중임상증상홍반귀두께측정 측정시기시험 일차와 일차매일매일 양쪽귀 시험 일차 관찰및측정항목 홍반이없음 매우가벼운정도의홍반 거의인지하기어려움 명확히나타나는홍반 중등도이상의홍반 딱지가생성되어홍반수준을결정하기어려운심각한홍반 빨개짐 점수 본시험수행 가 동물실험 실험동물은시험전최소 일이상순화후 주령이되면아래와같이군분리를실시하며 이상징후가있는개체를제외하고군당 마리이상을사용한다 용액주사및물질도포를하지않은공시료군 물질도포없이 용액만을주사하는무처치군 부형제를도포하고 용액을주사하는부형제대조군 양성대조물질을도포하고 용액을주사하는양성대조군 - 9 -
시험물질을도포하고 용액을주사하는시험군 시험물질농도별 음성대조군은부형제대조군으로하고 양성대조군은 에용해시킨 를 사용한다 시험군은예비시험을통해결정된 단계농도로구성하고 각농도별 마리 이상의동물을사용한다 일정별시험수행내용은아래에서설명하는바와같다 각개체별로도포부위에서의국소자극 전신독성등모든일반증상을매일관찰한다 표 본시험에서의일정별처치내용 수행일자 수행내용 개별마우스에표식 시험물질 용매 부형제 양성대조물질을 양쪽귀의뒷면에 μ 씩도포 시험첫째날과같이시험물질도포 표 본시험에있어서관찰및측정항목 관찰및측정항목 측정시기 시험물질을도포하지않음 체중 시험 일차와 일차 용액 을마우스당 씩복강투여 마우스안락사 림프절적출 일반증상홍반귀두께측정 매일매일 양쪽귀 시험 일차 나 림프절적출및림프절단일세포부유액준비 유세포분석기를이용하여 양성림프절단일세포비율 을결정하기위해서는 위에서설명한 가지마우스군으로부터림프절적출을수행한다 플레이트에단 일세포분리망 을넣고 냉장상태로보존된 를분주하여적 출한양쪽이개림프절을넣고 시약스푼으로밀면서으깨어하얀이개림프절막만남을때까지세포를분리한다 과단일세포분리망에냉장상태로보존된 를추가하여남아있는세포를모아 튜브에옮겨총 의단일세포부유액을만 든다 부유액의세포수를측정하여유세포분석을위한최적의조건인 개의세 포를준비한다 단일세포부유액 은시중에판매하고일관성있는결과를생산하는 - 10 -
항 항체키트 를사용하여준비하며 이키트에서제 공하는완충액을첨가하고 를처리하여세척한다음 결합항 항체를첨가한후 한번더세척한다음 용액을첨가한다 다. BrdU 양성림프절단일세포비율 (%) 측정 공시료를이용하여세포가존재하지않는 구역 오른쪽위 을설정 그림 무처치시료를이용하여 양성세포 가전체세포의약 가되는 구역설정 그림 구역의백분율은 개의림프절단일세포에서 표지된항 항체양성림프절단일세포의비율을나타낸다 그림 1. BrdU 양성세포 (Q2) 의백분율을산출하기위한유세포분석기의설정 공시료 무처치군시료 부형제대조군시료 시험물질또는양성대조군시료 라 양성세포 의계수 부형제대조군처리군 그림 시험물질처리군및양성대조군처리군 그림 에대한 유세포분석을수행한다 분위 분석및통계결과 를통해각처리군에대한 구역백분율을구한다 - 11 -
마 감작지수 및 산출 부형제대조군의 양성림프절단일세포의수는채취한마우스림프절단일세포의 수와 개의림프절단일세포 유세포분석기를이용하여산출 의 양성값의 비율을곱하여산출한다 시험물질처리군의 양성인림프절단일세포의수는앞서설명된방법과동일하게산출한다 각각의 값은시험물질처리군내개체당 양성의림프절단일세포의수를부형제대조군처리군내 양성의림프절단일세포의평균으로나눈값이다 각시험물질군의평균 는개별 을바탕으로산출한다 감작지수 (SI) = 시험물질군의노출된마우스당 BrdU 양성단일림프절세포수 부형제대조군의 BrdU 양성평균림프절세포수 는감작지수 가 을나타내는시험물질의농도 이며 그값을구하는공식은부속서 부록 항을참조한다 판정기준 유세포분석을이용한피부감작시험법의판정기준은아래와같다 감작지수 판정 피부감작성 비감작성 시험결과및보고 시험결과보고서에는시험데이터 시험보고서 시험물질 대조군 부형제 사용된마우스 신뢰성점검 결과및토의에대한내용을포함하도록한다 - 12 -
별첨 번역본 서론 부속서 또는유세포분석을이용한국소림프절시험 서론 피부감작성물질이란 의화학물질의분류및표시에관한국제조화시스템 에정의된바와같이반복적피부접촉후알레르기반응을유도하는물질을일컫는다 피부감작에관여하는주요한생물학적현상에대해일반적인동의가있다 피부감작과관련 된화학적 생물학적기전을설명하는독성발현경로 의형식 으로설명될수있다 는분자수준의초기단계에서중간단계를거쳐유해효과 즉알레르 기성접촉성피부염을일으키는과정으로이루어진다 는유기화학물질등의 차아민 라 이신 및티올 시스테인 과반응하는화학물질에중점을둔다 이와관련하여 분자수준의초기 단계 첫번째핵심단계 는피부단백질의친핵성중심에전자친화성물질들이공유결합하는것이다 첫번째핵심단계 는 펩타이드반응을이용한피부감작성시험법 을사용한다 의두번째핵심단계는각질세 포에서발생하며 염증반응뿐만아니라항산화 전자친화성반응요소 의존성경로 와같이특정한세포신 호전달경로관련유전자발현의변화를측정하며 생체외 루시퍼라아제시험법 또는 을사용한다 세번째핵심단계는수지상세포 의활성을평가하는것으로서 일반적으로특정세포표면표지자 케모카 인 싸이토카인의발현을평가하며 에설명된바와같이생체외인체세포주활성화 시험법 생체외 세포주활성화시험법 또는 유전자시험법 을사용한다 네번째핵심단계는 세포의증식을평가하며 마우스를이용한생체내 국소림프절시험 을사용한다 마우스를이용하여피부감작성을판별하기위한첫번째시험지침 인국소림프절시험 은 년에채택되었고이후개정되었다 검증연구에대한연구내용및전문가검토는발표된바있다 시험법에서림프구증식을측정하는데방사성동위원소인 티미딘 이나방사성요오드 가사 - 13 -
용되므로방사능의획득 사용또는폐기가문제가되는지역에서는 의적용이제한된다 본시험법은 를변형시킨비방사성시험법이며 림프구증식을측정하기위해 또는유세포분석을이용하여비방사성물질인 을사용한다 법을이용한국소림프절시험법 부록서 유세포분석을이용한국소림프절시험법 부록서 와마찬가지로 와 은피부감작성의유도단계와 관련되며 용량 반응평가에적합한정량적데이터를제공한다 또한 에방사성을표지하지 않고피부감작성을판별할수있기때문에방사능물질에대한작업시노출이나폐기물처리에 문제가없다 결과적으로피부감작물질을판별하는데기니픽의사용 을줄이고마우스의사용을증가시키게된다 본시험법은마우스를사용하여화학물질의피부감작성을평가하고자마련하였다 은 기니픽시험 특히기니픽최대화시험과 시험으로이루어진다 와변형된비방사성시험법인 그리고 모두 의기니픽시험에비해동물의수와고통을줄이는장점이있다 참고문헌 1) UN, 2017. Globally Harmonised Sysem of Classification and Labelling of Chemicals (GHS) Seventh revised edition. United Nations, New York. Available at: https://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev07/07files_e0.html 2) OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168. Available at: http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2012) 10/PART1&docLanguage=En 3) OECD (2015), In Chemico Skin Sensitisation, Test Guideline No. 442C, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 4) OECD (2015), In Vitro Skin Sensitisation, Test Guideline No. 442D, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 5) OECD (2017), In Vitro Skin Sensitisation, Test Guideline No. 442E, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 6) OECD (2010), The Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals - 14 -
No. 429, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines 7) OECD (2010), Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 8) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002. 9) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997. 10) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33. 11) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitizing potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59. 12) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] 13) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273. 14) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286. 15) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257. 16) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] - 15 -
17) OECD (2010). OECD Guidelines for Chemical Testing No. 442A.Skin sensitization: Local Lymph Node assay: DA. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 18) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] - 16 -
부록 용어정의 정확도 시험결과와허용된참고치의일치정도 시험수행에대한평가척도이고상관성 의한측면이다 정확하게맞춘시험결과의비율을의미하는 일치성 과 정확도 는같은의미로쓰임 독성발현경로 분자수준의시작단계를거쳐체내유해반응 까지표적화학물질또는유사한화학물질그룹으로부터일어나는일련의현상 기준시험물질 시험물질의비교기준으로사용되는물질 기준물질은다음의특성을가져야한다 일관성있고신뢰할수있는공급원 시험되는물질과구조적 기능적유사성 알려진물리 화학적특성 알려진효과입증자료 원하는 반응의범위내알려진효력 위음성 양성물질이음성으로판정되는것 위양성 음성물질이양성으로판정되는것 유해성 물질이생명체 생태계또는특정인구집단에노출될때 유해영향을야기할 가능성이있는물질또는상황 의본질적특성 실험실간재현성 다른실험실에서동일한시험절차와시험물질로 시험을수행하였을떄양적또는질적으로유사한결과를생산할수있는지측정하는것으로서 시험법이실험실간전수될수있는지여부를나타내는것 실험실내재현성 동일한실험실에서자격을갖춘사람이다른 시점에서특별한실험절차로같은결과를생산할수있는정도 혼합물질 서로반응하지않는 가지이상의물질로구성된혼합물또는용액 단일성분물질 정량적인구성으로정의되며 하나의주요성분이 적어도 이상인물질 다성분물질 두가지이상의주요성분의양이 및 인물질 다성분물질은생산과정의산물이다 혼합물과다성분물질의차이는 혼합물은두가지이상의물질을화학반응없이섞어서얻고 다성분물질은화학반응의산물임 이상치 집단에서무작위로채취한샘플이다른수치와상당히다른값을보이는것 - 17 -
유사시험법평가기준 검증된시험방법을기반으로기전적 기능적으로 유사하게제시된시험방법의비교가능성을평가하는기준 다음사항을포함함 필수적시험방법구성요소 검증된시험방법의허용가능한수행검증을위해사용된화학물질들중에서선택된최소한의기준물질리스트 검증된시험방법에서얻은내용을기반으로정확성과신뢰도의비교수준 이는제시된시험방법이기준화학물질의미니멈리스트를이용해평가했을때증명되어야함 숙련도물질 표준화된시험방법의기술적인능력을증명하기 위해실험실에서사용되는수행기준에포함된기준물질 이물질의선택기준은일반적으로반응범위를대표한다는것과시중에서구할수있는것 그리고고품질의유용한시험자료가있는것 신뢰성보증 시험수행과독립된개인이실험실시험기준 장비 기록보관 절차의준수에대한관련절차를평가하는것 참고물질 관심의대상이되는종 이나참고할수있는 또는 시험계 에서의반응이이미알려져있고 검증과정에서선택 되어이용된시험물질 이물질들은시험법이사용될것으로예상되는시험물질종류를대표해야 하며 시험물질이일으킬것으로예상되는반응의모든범위 강 약 음성 를나타내야한다 검증절차의 단계 시험법및시험목적에따라다른참고물질목록이필요할수도있음 상관성 시험과관심효과의관련성및시험이특정목적에의미있고유용한지에대한설명 상관성은시험이얼마나관심생물학적효과를정확하게측정하고예측하는지나타내며 상관성은시험법의정확도 일치성 를내포함 신뢰도 동일한시험방법에따라반복시행하였을때동일실험실과다른실험실에서 시험결과를재현할수있는정도 신뢰도는실험실내 실험실간재현성 과 실험실내반복성 으로평가됨 재현성 동일한방법으로동일한물질을시험하였을때나온결과의일치 수신자조작특성 분석 예측모형에대하여최적의판정기준값 을설정하기위한분석 판정기준값을사용한예측모형을통해 시험물질이양성혹은음성으로분류될수있다 판정기준값의모든편차는민감도 및특이도 의변화에따라반대반향으로변하는결과로이어질것이다 분석은대개진단시험에대한최적의판정기준값을구하는데사용함 알려지지않은물질이거나가변적인구조를가지며 복잡한반응물이거나생물학적인재료 - 18 -
민감도 시험법으로모든양성 활성화학물질이정확하게분류되는비율 민감도는 시험법의범주결정에대한정확도의척도이며시험법의상관성을평가하는중요고려사항 피부감작성 면역학적과정으로감수성있는사람이화학적항원에국소적으로 노출되었을때나타나며 화학적항원은접촉성감작성 을발병시킬수있는 피부면역반응을촉발함 특이도 시험법으로모든음성 비활성화학물질이정확하게분류되는비율 특이도는 시험법의범주결정에대한정확도의척도이며시험법의상관성을평가하는중요고려사항 자극지수 시험물질의피부감작가능성을평가하기위해산출된값 부형제대조군과시험물질처리군의증식정도의비율 물질 생산과정을통해얻어지거나또는자연상태로얻어진화학원소들 과 이들로이루어진구성물질 생산품의안정성을유지시키는데필요한첨가제와생산과정에서유래하는불순물을포함하지만 해당물질의안정성이나조성의변화에영향을주지않고분리될수있는용매는제외함 시험물질 시험의대상이된물질을말함 - 19 -
부속서 1B : 생체내피부감작성동물대체시험법 ( 유세포분석을이용한국소 림프절시험 ; LLNA:BrdU-FCM) 초기고려사항및제한점 은검증되었고 국제적으로전문평가를받은이후 피부감작성및비감작성 시험물질을 판별하는유용한시험법으로권고되고있으나일부제한점이존재한다 검증연구는유사하거나변형된 피부감작성시험법을평가하기위한유사시험법평가기준 에따라수행되었다 은피부감작성시험물질을식별하기위한변형된비방사성국소림프절시험이며 몇가지제한점을가지고있다 이는생체내시험법이필요한것으로간주될때의모든경우에 있어방사성 혹은기니픽시험 을 으로반드시대체하여 사용해야한다는의미는아니다 다만 이시험법은동등한장점을갖고있으며음성및양성결과에대한추가적인확인이요구되지않을때단독의대체시험법으로사용할수있다 시험을수행하고자하는실험실은시험을시작하기전에시험물질에대하여모든정보를고려 해야한다 이와같은정보에는시험물질의물질명및화학적구조 물리화학적성질 시험물질 에대한모든생체외및생체내독성시험결과 시험물질과구조적으로관련된물질의독성시험 결과등이포함된다 또한평가하고자하는시험물질에대하여 이적절한방법 인지 특정유형의시험물질인경우 사용이부적합할수도있음 항참조 를고찰해야하며 투여용량설정에있어서이러한정보들을참고해야한다 은생체내방법이므로 알레르기성접촉감작활성을평가하는데동물사용이배제될수없다 따라서동물을사용하는시험법대신적절한 및 시험법의적용과이러한방법들을사용한접근법도고려해야한다 은 다른 시험법과마찬가지로 기니픽시험 과비교시사용되는동물의수를줄일 수있다 또한 시험법은 과달리과도한피부감작을유도하지않 기때문에알레르기성접촉감작성을평가하기위해동물이사용되지만실제적으로동물의고통을경감할수있는시험법이다 또한기니픽최대화시험에서는면역보조제를사용해야하지만 에서는이러한면역보조제가필요하지않다 따라서 의경우동물의고통을줄일수있다 이처럼 과비교시 시험은장점을지니고있지만 시험법사용에있어서 제한점이존재하여 의사용이불가피할수있다 예 특정금속물질 일부계면활성제와 같이위양성결과를나타내는특정피부자극제 불용성시험물질 또한잠재적교란원인물질로서작용한다고판단되는작용기를포함하는물질이나물질그룹인경우 예 기니픽시험 이필요할수있다 기존 시험법이가지고있는제한점은 - 20 -
시험법도가지고있는것으로여겨진다 이러한제한점이외에 의정확도에영향을줄수있는특성을포함하지않는 시험물질인경우 을적용할수있다 검증연구에따르면 은 결과와비교시 유사시험법평가기준의 개참고물질중 개를정확하게 식별하였다 변형시험법들에서예측하는데한계를나타내는 개의중감작성물질 메르캅토벤조티아졸 와 개의약감작성물질메틸메타크릴레이트 의경우 에서도위음성의예측결과를나타냈다 그러나감작지수 값을설정하고시험법의예측력을계산하는데동일한데이터세트가사용되었기때문에해당결과는실제예측력보다과대예측되었을수도있다 규제목적으로혼합물에대한시험자료를도출하기위해본시험법을사용하는경우 시 험을수행하기전에본시험법이그러한혼합물의평가에적절한결과를생산할수있을 지와만일그렇다면그이유가무엇인지를고려해야한다 그러나이같은고려사항은혼합물의시험에대한규제적요건이이미존재하는경우에는필요하지않다 부록 에각용어에대한정의가제시되어있다 시험원리 의기본원리는감작성시험물질이도포부위의림프절내림프구의증식을 유도한다는것이다 림프구증식은투여용량및도포된알레르기유발항원의감작능에비례하여 나타나며 감작성의정량적측정값을구하는데있어간단한방법이될수있다 림프구의증식은 각시험군에서의평균림프구증식을부형제처리대조군 의 평균림프구증식과비교하여측정한다 부형제처리대조군의평균증식에대한시험처리군의 평균증식의비율을감작지수 로정의하며 잠재적피부감작성물질로판정이되어시험물질에대한추가적인시험을이용하여평가하기전 지수가 이되어야한다 본시험법은이개림프절내증식하는세포의수를계수하기위해 양을측정한다 는티미딘 의유사체로서 증식하는세포의 에결합한다 의결합은 유세포분석을이용하여측정할수있는데 이유세포분석은플루오레세인이소티오시안산 으로표지된 특이적항체가사용된다 유세포분석은 림프절단일세포의수를분석하는데널리사용되고있는유세포분석기를사용하여살아있는 양성세포의수를정량화한다 시험방법 동물종선택 실험동물로는마우스를사용한다 에대한검증연구는 종에대해서 - 21 -
광범위하게수행되었기때문에 가선호종으로여겨진다 종또한 에사용될수있다 종반응은 종반응과높은상관성을나타내며 종의반응보다좀더민감하다 그러나각각의마우스종에있어서 분석후 민감도를최대화할수있도록하기위해다른 판정기준치 를적용해야할수도있다 어린성체의암컷으로서임신과출산경험이없는 마우스를사용한다 본시험에사용되는마우스는 주령이여야하며 마우스의체중편차는 최소로하되 평균체중의 를초과해서는안된다 대체적으로다른종이나수컷을사용할수 있으나 시험법과종이나성별에의한차이가없다는것을증명할충분한데이터가있어야한다 사육조건 마우스는개별사육에대한충분한과학적근거가제시되지않는다면집을지을수있는적절한깔짚이있는단단한케이지 에서그룹사육 을해야한다 사육실의온도는 로유지되어야한다 상대습도는사육실청소시를제외하고최소한 가되어야하고 를넘지않아야하며 의범위에있어야한다 조명은 시간간격으로낮과밤을설정하여조절한다 사료는일반적인마우스사료를사용하며사료와물을자유롭게공급한다 실험동물준비 마우스는무작위로선발하고상처나지않게개체식별 예 제모 한다 또한 시험물질처리전최소 일간순화한다 시험물질처리전모든마우스에대한피부병변유무를 검사한다 모든검사동안 과 과같은윤리적인방법으로마우스를다룬다 투여용액의준비 고체시험물질은마우스에도포하기전 적절한용매 부형제에용해또는현탁시켜야하며 필요하다면 마우스한쪽귀에시험물질을도포하기전에그용액을희석해야한다 액체시험물 질은원물질또는도포전에희석하여도포한다 의료기기에서일반적으로알려진불용성물질 들 은마우스한쪽귀에물질을도포하기전에추출가능한모든성분이추출될수있도록적 절한용매를사용하여가혹조건으로추출하여해야한다 시험물질은보관이가능하다는것을증명할만한안정성자료가없다면시험당일에조제해야한다 신뢰도확인 양성대조군 은반응강도가잘알려진감작성물질을이용하여적절하고재현성있는반응을보여줌으로써본시험이적절하게수행되었는지확인하기위하여사용한다 실험실의시험수행능력을확인하고실험실내및실험실간재현성과비교가능성을평가하기 위하여적절한양성대조군을포함하여실험할것을권고한다 일부규제당국에서는각각의시험마다 - 22 -
양성대조군을요구할수있기때문에 을수행하기전에관계당국과상의할것을권장한다 매실험마다양성대조군의사용을주기적양성대조군사용으로인해야기될수있는추가적인 동물실험을피하기위해권장한다 양성대조군은음성대조군대비자극지수가 을초과할것으로 예측되는노출수준에서 양성반응을나타내어야한다 양성대조군의용량은 과도한피부자극또는전신독성을나타내지않고유도반응은재현성있게나타나지만과도한 반응 을유발하지않는농도를선택해야한다 선호되는양성물질은아세톤 올리브오일 에희석한 와 이지만상황에따라적절한타당성이제시되고 위의조건에부합한다면다른양성대조물질을사용할수있다 시험마다양성대조군을포함할것을권장하지만 을정기적으로수행하고 있고 즉 을한달에최소한번이상수행 양성대조군의재현성있고정확 한결과를얻기위해양성대조군의데이터베이스를확립한실험실이라면양성대조물질에대 한주기적시험 예 개월미만간격 도가능하다 적절한기간내 즉 년미만 에최소 회의양성대조군에대한독립적인시험에서일관되게양성결과를생성함으로써 에대한숙련도를증명할수있다 에대한시험방법적변경 예 훈련받은인원 시험에사용하는재료및 시약 장비 마우스의공급처등의변경 이있을경우반드시해당시험에양성대조군을포함시켜야 한다 그리고이같은변경은항상시험보고서에기록을남겨야한다 양성대조군결과의일관성 있는기록을위해신규배경시험자료확립의필요성을결정함에있어서이러한변경이이전에확립된배경시험자료의적절성에어떠한영향을미치는지를고려해야한다 시험자는양성대조군에대한주기적인시험을결정할때 매시험마다양성대조군을사용하지 않고수행된시험에서도출된음성시험결과에대한적절성과수용가능성에대한영향들을 고려해야한다 예를들어 주기적인양성대조군의시험을할때위음성결과가나왔다면 양성 결과가나온마지막양성대조군시험과위음성결과가나온양성대조군시험사이에수행된 음성판정시험물질의결과에대해서는신뢰할수없다 매실험마다양성대조군을포함할것인가 양성대조군에대한주기적인시험을수행할것인가를결정할때에는이러한시험결과들을주의 깊게고려해야한다 배경시험자료를통해양성대조군에사용되는마우스의수를줄일수있는점이과학적으로입증되었을때 매번사용되는양성대조군의마우스수를줄일수있다 양성대조물질은일관된반응을유발한다고알려진부형제 예 아세톤 올리브오일 를사용하여시험을수행해야하지만 규제상황에따라비표준부형제 임상적 화학적으로관련 있는제형 를이용한실험이요구될수있다 만약양성대조물질을시험물질과다른부형제에녹여시험을수행하였다면양성대조군에대한부형제대조군을별도로시험에포함시켜야한다 특정한화학물질그룹이나반응범위를갖는시험물질을평가할경우 기준물질 - 23 -
은본시험법이이런종류의시험물질의피부감작능을평가하는데적절하다는것을증명하기위해필요할수도있다 적절한기준물질은다음과같은특성을가져야한다 시험물질의그룹과구조적기능적으로유사성을지닐것물리적 화학적특성이알려져있을것 에대한시험자료가있을것 다른동물종이나인체시험자료가있을것 시험절차 동물의수및투여용량 투여용량군당최소 마리의마우스를사용하며 최소 개의농도로설정된시험물질 부형제로이루어진부형제대조군 양성대조군 실험실규정을근거로하여 항에서언급된 것을고려하여동시도포또는최근시험결과값사용 을준비한다 특히간헐적으로양성대조군을 시험한경우 양성대조군의복수의투여용량을고려하도록한다 시험물질로처리를하지않은경우를제외하고 대조군마우스는처리군마우스와동일한방식으로취급및처리해야한다 투여용량및부형제선택은참고문헌 번와 번에제시된권고사항을기반으로한다 개의투여용량의경우 대개적절하게연속되는농도에서선정한다 예 등 시험에사용될연속농도를선정하는데충분한과학적근거가 뒷받침되어야한다 개의연속적인농도를선정함에있어서 가능하다면시험물질과관련된 기존의모든독성학적정보 예 급성독성및피부자극 구조적 물리화학적정보 또는구조적으로 관련된시험물질 들을고려해야한다 이는전신독성또는과도한국소피부자극을피하면서도 최고농도로노출을최대화하기위함이다 이와같은정보가없을경우에는예비시험 이요구된다 항참조 시험물질을도포하는데적절한용액 부유액을조제해야하며 용해도를최대화하는것에 중점을두어가장높은농도를얻을수있는부형제를선정해야한다 본시험법의부형제로 권장하는것은아세톤 올리브오일 디메틸포름아미드 메틸에틸케톤 프로필렌글리콜 디메틸설폭사이드 이지만 충분한과학적근거가뒷받침된다면다른 부형제들도사용할수있다 어떤경우추가대조군으로서시험물질이시판되는형태와같은제제또는임상적으로적합한용매를사용해야할경우도있다 친수성물질인경우 적절한용해제 예 를사용하여시험물질용액이피부를젖게하고 도포하는즉시용액이흘러넘치지않도록특별한주의를기울여야한다 전체가수용성인부형제는피해야한다 - 24 -
개별마우스의림프절채취를통해마우스간의변동성평가와시험군과부형제대조군간의 차이에대한통계적비교가가능하다 절 또한 개별마우스에대한데이터가수집될때 양성대조군에사용되는마우스수를줄일수있는지에대한가능성을평가할수있다 이와더불어 일부국가의규제당국에서는각각의마우스데이터를수집하도록요구하고있다 마우스데이터를합하는방식으로수집하여시험물질결과들을도출하는경우 향후에또다른 규제당국이요구에따라개별마우스데이터를생산해야할수도있기때문에이러한중복시험을피하기위해개별마우스데이터를정기적으로수집하는일이동물복지차원에서필요하다 예비시험 시험시최고농도를결정하기위한정보가없다면 항참조 예비시험을수행하여 에서시험할적정투여용량을정해야한다 예비시험은전신독성 항참조 이나과도한국소피부자극 항참조 을유발하는농도에대한정보가없을때 본시험에서사용할최대투여용량을선택하기위하여실시한다 액체시험물질의경우 시험되는최대투여용량은 농도이며 고체또는부유액의경우는가능한최대농도이다 예비시험은 본시험과동일한조건하에서수행되지만 림프절증식을 평가하지않으며투여용량군당적은수의마우스를사용한다 투여용량군당한마리혹은 두마리의마우스를사용하도록권장한다 모든마우스는전신독성또는도포부위의국소자극등 모든일반증상을매일관찰한다 체중은시험전과종료전 일차 에측정한다 각마우스의 양쪽귀의홍반을관찰하고 표 에따라점수화한다 귀두께는두께측정기 예 디지털마이크로미터혹은피콕다이얼두께측정기 를사용하여 일차 도포전 일차 첫번째도포약 시간후 및 일차에측정한다 또한 일차에는마우스를인도적으로희생시킨후귀부위를적출하여 무게를측정한다 측정일중어느하루라도홍반점수 이거나귀두께 이면과도한 국소자극을나타내는것으로간주한다 본시험에서의최고투여용량은 예비시험에서사용된농도들 항참조 중전신독성이나과도한국소피부자극을유발하는농도보다낮은농도를선택한다 표 홍반증상에따른부여점수 관찰홍반이없음 매우가벼운정도의홍반 거의인지하기어려움 명확히나타나는홍반중등도이상의홍반 딱지가생성되어홍반수준을결정하기어려운심각한홍반 빨개짐 점수 - 25 -
에서는자극을판정하기위해귀두께 가 증가와함께용매 부형제대조군과 비교시시험물질처리군의귀두께가통계적으로유의한증가를나타내는지의여부를확인해야 한다 그러나귀두께가 보다적을때에는통계적으로유의한증가가나타날수있더라도 특별하게과도한자극과관련되지는않는다 통합평가의일환으로사용할경우다음의임상결과는전신독성 을나타낼수있으며 본 에사용할최대투여용량을나타낼수있다 신경계기능변화 예 입모 운동실조 떨림 경련 행동변화 예 공격성 털손질행동의변화 활동수준의현저한변화 호흡양상변화 예 호흡곤란 헐떡임 수포음과같이호흡의빈도및강도의변화 음수섭취량 변화 또한무기력또는무반응증상 경미한또는일시적인통증과괴로움이상의모든임상 증상 또는 일차부터 일차까지체중감소가 를초과하는것및치사율은평가에고려되어야한다 빈사상태의마우스또는심한통증과고통을보이는마우스는안락사시킨다 본시험일정 시험일정은다음과같다 일차 각마우스의체중및모든임상적관찰사항을개별적으로확인하고기록한다 시험물질의 적정희석액 부형제 또는양성대조군 항에서고려된사항으로실험실규정에따라동시도포또는최근시험결과값사용 을각귓등에 씩도포한다 일차및 일차 일차에수행했던적용방법대로다시도포한다 일차 아무런처치를하지않는다 일차 용액 쥐한마리당 을복강내에투여한다 일차 각마우스의체중과모든임상적관찰사항을기록한다 를투여하고약 시간후 마우스를안락사시킨다 각마우스로부터이개림프절 을적출하고 각마우스별로인산완충용액 에처리한다 림프절의확인및해부에관한모식도와자세한사항은참고문헌 에서확인할수있다 본시험에서국소피부반응을좀더관찰하기위하여귀홍반의점수또는귀두께측정 두께측정기를사용하거나해부시귀를적출하여무게측정 과같은추가적인매개변수가시험프로토콜에포함될수있다 - 26 -
세포부유액의준비 각마우스에서얻어진양쪽림프절을적출한후림프절단일세포 의단일 세포부유액은 메쉬스테인리스스틸거즈또는다른방법 예 나일론메쉬위에 서일회용플라스틱막자를사용하여림프절을분쇄 을이용하여준비한다 본시험법에서림 프절단일세포부유액을준비하는과정은중요하므로모든실험자는사전에이러한기술을숙 지해야한다 또한부형제대조군마우스의림프절은작기때문에작업에신중을기하여감작지 수값에대한모든인위적영향을피하도록한다 림프절단일세포는적정용량 예 의 차가운 를추가하고 필요한경우림프절단일세포부유액은희석할수있다 예 로희 석 림프절단일세포의수는계수해야하고 다음단계에서 림프절단일세포가필요하다 세포증식측정 양성림프구의측정 시중에판매되는키트 예 검증연구에서는 사용 를사용한후 유세포분석을통해 양성림프구의수를계수한다 다른항 항체 키트가일관성있는결과를나타낸다면이러한키트도사용할수있다 간략히말해서 림프절 단일세포부유액 을원심분리하여 로한번세척한후재현탁한다 세포는키트에서제공하는완충액을추가하고 를처리한다 세척후에 결합항 항체를추가하고 한번더세척후 용액을추가한다 살아있는 발현세포 세포 내 양성세포의수는유세포분석기로측정한다 관찰 임상적관찰 각마우스별로 도포부위의국소자극혹은전신독성등모든임상적증상을최소하루에 한번주의깊게관찰해야한다 모든관찰사항은각마우스별로체계적으로기록하도록한 다 모니터링계획은전신독성 과도한국소피부자극또는안락사가필요한피부부식등을보이는마우스들을신속하게식별할수있도록기준을포함해야한다 체중 항에서언급한바와같이 시험을시작할때와계획에따라안락사시킬때각마우스의체중을측정해야한다 - 27 -
결과의계산 각처리군 에대한결과는감작지수 평균으로나타낸다 의감작지수는시험군이나양성대조군의마우스당 양성림프절단일세포의수를부형제대조군의마우스당 양성림프절단일세포의평균수로나누어구한다 부형제대조군에대한감작지수의평균은 이된다 양성림프절단일세포의수는다음과같이정의한다 별첨 항참조 양성림프절단일세포의수 양성세포의 의 림프절단일세포의수 판정기준은 의결과를양성으로간주한다 다만 경계값 이양 성인지의여부를결정할때에는용량 반응관계 통계적유의성및용매 부형제와양성대조군반응의일관성또한사용될수있다 도출된결과를명확히할필요가있을경우 알려진피부감작성물질과시험물질이구조적 연관이있는지의여부와같은시험물질의다양한속성및관찰된용량반응관계의본질을고려해야한다 이외기타고려사항에대해서는추후자세히논의하도록한다 각마우스처리농도별데이터를수집함으로써 데이터내용량 반응간관계가존재하는지 존재한다면그정도는어떠한지에대해통계적분석이가능하다 모든통계적평가에는 용량 반응관계에대한평가는물론이고 시험군간의적절한보정비교를할수있다 예 시험물질의 투여군대비용매 부형제대조군간의짝비교 통계분석은선형회귀나용량 반응경향평가를위한 짝비교를위한 등이포함될수있다 적절한통계분석법을선택할때연구자는편차의가능한불균등및데이터변형이나비모수 통계분석이필요할수있는문제에대해인지해야한다 모든경우에 연구자는특정데이터포인트 이상치 라고도함 의유무에관계없이 계산및통계적분석을수행해야할수있다 데이터및보고 데이터 데이터는표형식으로요약하여나타내며 각마우스에대한 양성림프절단일세포의수 마우스당 양성림프절단일세포의그룹평균수나이와연계된오차들 예 동시용매 부형제대조군대비각투여군에대한평균감작지수 를제시하도록한다 시험보고서 시험보고서에는다음의정보를포함해야한다 4) 유세포분석의 '4 분위통계 (Quadrant Statistics)' 로부터수집된퍼센트데이터 (Q2 지역 %) - 28 -
시험물질 출처 제품번호 사용기한날짜 정보가존재하는경우 시험물질의안정성 알려져있는경우 단일성분물질 물리적외형 수용성및부가적으로관련된물리화학적특성 이나 명 번호 나 코드 구조식 순도 적절하고실제적으로 개연성이높은화학물질명과같은화학적식별정보등 다성분물질 및혼합물 정확한화학구조과분자구조를알수없는물질 및혼합물 위에서설명된 화학적식별에의한특성 구성성분의비율과성분의물리화학적특성 대조군 식별데이터 예 가능한경우 번호 출처 순도 알려진불순물 제품번호 물리적성질및물리화학적성질 예 휘발성 안정성 용해도 용매 부형제 식별데이터 순도 농도 해당되는경우 사용용량 부형제선정의타당성실험동물 마우스나 마우스의공급출처마우스의미생물상태 알려진경우 마우스의수와주령 마우스의출처 사육조건 식이정보등 시험조건 키트에대한출처 제품번호 제조업체의품질보증 품질관리데이터 항체민감도 특이성및검출한계 시험물질의준비와도포에관한세부사항 투여용량선정에대한타당성 수행된경우 예비시험에대한결과포함 사용된부형제와시험물질농도 도포된시험물질의총량 사료와음용수품질에관한세부사항 식이유형 공급원 음용수원등 처리및샘플링스케줄에관한세부사항 독성측정방법 양성혹은음성판정기준 프로토콜편차에대한세부사항및편차가연구설계와결과에어떻게영향을주었는지에 대한설명 - 29 -
신뢰도확인 최신신뢰도확인결과요약 여기에는시험물질에대한정보 농도 양성대조군 부형제대조군 사용된기준시험물질 해당되는경우 이포함된다 시험연구실에대한 양성대조군과동시에수행된양성대조군및부형제대조군데이터 동시수행된양성대조군이포함되지않은경우 가장최근의주기적양성대조군에대한 수행일자및보고서와양성대조군이동시수행되지않은경우그정당한근거를밝히기 위해해당실험실의 양성대조군데이터에대한세부사항이담긴보고서 결과 도포를시작할때와예정에따라인도적으로안락사시킬때마우스별체중및각처리군의평균과관련된오차 예 가능한경우 각마우스의도포부위의피부자극을포함한독성징후및발병시기와경과 양성림프절단일세포의수와각처리군내마우스별각각의 값을담은표 각처리군의마우스별 양성림프절단일세포의수에대한평균및관련된오차 예 과각처리군에대한이상치분석결과 계산결과및시험물질및대조군모두에서마우스간변동성을설명할수있는변동성에 대한적절한측정값 용량 반응관계 통계분석 해당되는경우 결과토의 시험물질이피부감작성물질로판정되어야하는지에대한결론과함께통계분석 용량 반응 분석 결과에대한간단한결과해석 참고문헌 (1) OECD (2018), Local Lymph Node Assay: 5-bromo-2-deoxyuridine-flow cytometry method (LLNA: BrdU-FCM) Validation Study Report, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 283, ENV/JM/MONO(2018)43, OECD, Paris. (2) OECD (2018), Summary of the Peer Review of the Validation Study for LLNA: BrdU-FCM Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No.284, ENV/JM/MONO(2018)44, OECD, Paris. (3) Yang H, Na J, Jang WH, Jung MS, Jeon JY, Heo Y, Yeo KW, Jo JH, Lim KM, Bae SJ. (2015), Appraisal of within- and between-laboratory reproducibility of non-radioisotopic local lymph node assay using flow cytometry, LLNA: BrdU-FCM: Comparison of OECD TG429 performance standard and statistical evaluation. Toxicology Letters 234: 172-179. (4) Ahn IY, Kim TS, Jung ES, Yi JS, Jang WH, Jung KM, Park MY, Jung MS, Jeon EY, Yeo - 30 -
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부록서 부록 유세포분석기를이용한 양성의림프절단일세포측정 이방법은 이주관한검증연구에사용된 의프로토콜에기반을둔다 실험실에서 을수행할때이프로토콜사용을권장한다 측정전준비사항 표지된 를측정하기전에아래의시료들이준비되어야한다 공시료군 용액주사및물질도포를전혀하지않은마우스의림프절단일세포무처치시료군 물질도포없이 용액만을주사한마우스의림프절단일세포부형제대조군처리군 부형제대조군을도포하고 용액을주사한마우스의 림프절단일세포 시험물질처리군 최소 개의농도 시험물질로도포하고 용액을주사한 마우스의림프절단일세포 양성대조군처리군 양성대조군을도포하고 용액을주사한마우스의림프절 단일세포 유세포분석기결과분석 시험전또는정해진주기에따라적절한장치 예 을사용할경우는 이용또는 을사용할경우는 이용 를사용하여유세포분석기를교정해야한다 그래프 축 과 축 모두선형적 로있어야한다 그래프에서그중심에살아있는림프절단일세포들이모여있는구역을설정한다 적어도 개의세포수를갖는구역을설정한다 그래프 축 은선형적 축 은로그 로설정한다 그림 시험수행시작시점에서비염색시료 단독염색시료 단독염색시료 염색시료 를사용하여보정값을설정한다 이때설정된보정값은추후에도사용할수있다 - 34 -
아래의단계에따라 구역설정하기 공시료를이용하여세포가존재하지않는 구역 오른쪽위 을설정한다 그림 무처치시료를이용하여 양성세포 가전체세포의약 가되는 구역을설정한다 그림 구역의백분율은 개의림프절단일세포에서 표지된항 항체양성림프절단일세포의비율을나타낸다 그림 양성세포 의백분율을산출하기위한유세포분석기의설정 공시료 무처치군시료 부형제대조군시료 시험물질또는양성대조군시료 양성세포 의계수 부형제대조군처리군 그림 시험물질처리군및양성대조군처리군 그림 에대한유세포분석을수행한다 분위 통계 를통해각처리군에대한 구역백분율을구한다 및 산출 부형제대조군처리군의 양성인림프절단일세포의수는채취한마우스림프절단일세포의 - 35 -
수와 개의림프절단일세포 유세포분석기를이용하여산출 의 양성값의비율을곱하여 산출한다 시험물질처리군의 양성인림프절단일세포의수는앞서설명된방법과동일하게 산출한다 각각의 값은시험물질처리군내개체당 양성의림프절단일세포의수를 부형제대조군처리군내 양성의림프절단일세포의평균으로나눈값이다 각시험물질군의평균 는개별 을바탕으로산출된다 감작지수 (SI) = 시험물질군의노출된마우스당 BrdU 양성단일림프절세포수 부형제대조군의 BrdU 양성평균림프절세포수 양성결과의경우 값 즉 감작지수 을나타내는예측농도 는아래에서제시된방정식을사용하여선형회귀방법을통해산출한다 농도 파라미터 기울기 와 절편 는선형최소자승법을통해도출될수있다 그밖에다른측정방법들 선형보간법또는외삽법 을이용하여 값을산출할수있다 - 36 -
별첨 원문 서론 부속서 - 37 -
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화장품피부감작성동물대체시험법 유세포분석을이용한국소림프절시험 가이드라인 민원인안내서 발 행 일 발 행 인 편집위원장 편집위원 년 월 식품의약품안전평가원장이선희독성평가연구부장정자영 박기숙 김태성 김주환 이정선 고경육 김지영 김학 홍미혜 윤미옥 윤경은 도움주신분 문 의 처 주 소 허용 정태천 정미숙 임경민 정승호 식품의약품안전평가원 특수독성과 충청북도청주시흥덕구오송읍오송생명 로 오송보건의료행정타운식품의약품안전처식품의약품안전평가원 - 60 -