국내외신수요창출을위한고품질흑마늘및바이오푸드의상품화 (Commercialization of high quality black garlic and biofoods to create new market for domestic and export) 경상대학교 농림축산식품부

발간등록번호 11-1543000-000148-01 국내외신수요창출을위한고품질흑마늘및바이오푸드의상품화 (Commercialization of high quality black garlic and biofoods to create new market for domestic and export) 경상대학교 농림축산식품부

국내외신수요창출을위한고품질흑마늘및바이오푸드의상품화 (Commercialization of high quality black garlic and biofoods to create new market for domestic and export) 경상대학교 농림축산식품부

제출문 농림축산식품부장관귀하 이보고서를 국내외신수요창출을위한고품질흑마늘및바이오푸드의상품화 과제 ( 제 1 세부과제 흑마늘및개똥쑥혼합물의생리활성규명 제 1 협동과제 개발바이오제품의품질특성및생리활성평가 제 2 협동과제 흑마늘과쑥혼합면역증진용음료의테스트마케팅 ) 의최종보고서로제출합니다. 2013 년 7 월 29 일 주관연구기관명 : 경상대학교주관연구책임자 : 성낙주협동연구기관명 : ( 재 ) 남해마늘연구소협동연구책임자 : 신정혜협동연구기관명 : 남해보물섬마늘영농조합법인협동연구책임자 : 류홍건 - 1 -

요약문 Ⅰ. 국내외신수요창출을위한고품질흑마늘및바이오푸드의상 품화 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 현대인의식품섭취성향은식품가공산업의발달로다양화되고, 바쁜일상생활로편의주의식품에대한선호도가높고자연식품보다는가공식품에대한의존도가증가되고있는데, 정제된간편식의애용은고지혈증, 심장질환, 암, 당뇨병및고혈압성질환등과같은만성질환의발생증가로사회문제로까지대두되고있다. 인체는산화촉진물질과억제물질이균형을이루고있으나, 산화적스트레스강도가클경우생체의균형이상실되어충분한방어기능을기대하기어려우므로생체내산화작용을효율적으로예방하기위해서는지속적인항산화물질의섭취가필요하다. 인체의생명유지를위한호기성에너지대사에는반드시산소가관여하는데, 호흡과정에유입된산소의일부가활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 으로전환되어조직세포가산화적스트레스를유발하게된다. 즉, 산화적스트레스의직접적인원인이되는활성산소종은불안정하고반응성이높아생체내여러가지물질과쉽게반응하여체내조직을공격하므로써비가역적인손상을유발하게되며, 활성질소종은염증반응시대식세포호중구및다른면역세포의면역반응으로생산되는데이때활성산소종도함께생성된다. 이러한염증반응은매우복잡하므로이러한과정중에다량의 nitric oxide나 cytokine등이생성된다. 따라서식물체의유용성분은이러한물질의생성을억제시킴으로써인체내에서항체생성촉진, 체내생화학적수치의정상화등으로질병이나외부자극에대한방어활성을증가시켜만성질환의예방과치료에대한면역기능을안정화시키게된다. 따라서인체가섭취하는식품은건강과직결되므로식품을통하여항산화, 면역, 체력증진등의긍정적인효과를얻기위하여우리나라뿐만아니라전세계적으로건강증진을위한생리활성물질탐색과기능성식품개발에관한연구로식물체에대한연구가오래전부터수행되어오고있다. 특히생약및식용식물은우리주변에서쉽게찾을수있으며, 안전한천연물질이므로여러질병의예방이나치료에유용자원으로서의그가치를찾고자하는시도가많이이루어지고있다. 즉, 여러가지생리적효능이있는식물류로부터그기능성성분을추출하여건강기능향상에도움이되는다양한가공품의개발이시도되고있는데, 최근에는이러한생리조절기능을부여한기능성제품의개발이확대되고있으며, 단일식물소재보다는여러가지 - 2 -

식물의추출물을혼합한제품을개발함으로써추출혼합물에의한기능성의극대화를꾀하고있다. 마늘에관한연구는오래전부터상당히수행되어져왔으나, 마늘로부터기능성을얻기위하여다량섭취는매우어렵다. 따라서마늘의기능성을유지하면서섭취량을상승시킬수있는방안으로홍마늘이나흑마늘이개발되었으며, 이를원료로한제품이생산되고있다. 특히흑마늘은다양한제조공정에의해여러유형의제품으로생산되고있으며, 그생리활성또한여러연구자들에의해유용하다는것이밝혀져있다. 하지만현재까지흑마늘에함유되어있는각종유용물질의분석및분리에대한연구는의외로적다. 심지어이미개발된각종흑마늘제품중품질의지표로활용될수있는물질에대한정보도전무한실정이다. 또한흑마늘은장기간의열처리로인하여탄화를유발하거나이로인한위해성물질의생성, 탄맛및탄화향등이잔류할수있어안전성과품질의고급화가요구되므로전처리법, 숙성시간및온도조건을조절함으로기존의흑마늘에비해당도가높고탄맛이나탄화향이적은고품질흑마늘의생산공정의개발이필요하다. 현재인구의고령화, 노동력부족등으로인하여마늘을비롯한주요농산업이점차위축되고있다. 따라서마늘산업의육성을위해서는산업화를통한고부가가치창출의돌파구마련이절실히요구되고있으며, 특히마늘은우리의주요양념채소류로서국제적인경쟁력강화가요구되고있는작물이므로마늘을이용한바이오푸드개발연구가더욱절실하다. 더욱이마늘과쑥은과거로부터다양한생리활성이인정되어민간요법으로활용되어온안전성이입증된식품으로이를활용한건강증진용식품은소비자에게접근이용이하며, 전세계적으로섭취되고있으므로해외시장개척에도유리한소재인바, 이를잘활용할경우국내외시장을타겟으로하는바이오푸드를개발이가능하리라판단된다. 따라서본연구에서는흑마늘을주원료로하고, 개똥쑥및천연식물류를첨가함으로써기능성이강화된고품질의바이오푸드를개발함에있어항산화와면역증진기능성을중심으로생리활성을평가하였다. 이를근거로하여추출물의최적추출조건및조성물의혼합비율을설정하였다. 나아가개발제품의 in vivo 및 in vitro 실험으로생리활성을규명하였다. 즉, 동물실험을통해기능적효능을분석함으로서최종제품의생리활성과안전성확보를위한신뢰성있는기초자료를확보하였다. 또한개발된제품들의품질을과학적으로규명하여기업의기술력향상과상품화를통해국내외시장개척을위한홍보자료로활용코져하였다. - 3 -

Ⅲ. 연구개발내용및범위 흑마늘및개똥쑥혼합물의생리활성규명 개똥쑥의이화학적성분, 생리활성측정및유효물질의분리 - 개똥쑥의부위별영양성분비교, 생리활성측정및페놀화합물의분리 분석 흑마늘및개똥쑥추출물의추출조건별생리활성스크리닝 - 흑마늘및개똥쑥을대상으로온도, 시간및에탄올농도비를달리한조건으로추출하여항산화활성및유효물질함량분석 남해산시판흑마늘의생리활성비교분석 - 남해산마늘을이용한시판흑마늘중유효성분함량및생리활성의비교분석 강제운동부하시흑마늘과개똥쑥추출물의 in vivo상생리활성및적정섭취량분석 - 강제운동부하에의한산화적스트레스에서흑마늘과개똥쑥추출물의급이가간기능지표효소활성, 지질과산화물함량, 체내지질성분변화및항산화계에미치는영향분석 흑마늘복합조성물제조를위한천연식물류의검색 - 문헌조사를통한천연식물류의스크리닝 동물실험을통한흑마늘, 개똥쑥및천연식물복합조성물음료의생리활성효능검증및적정섭취량설정 - 흑마늘과개똥쑥추출물을베이스로한개발제품에대해 in vivo에서체내지질성분변화및항산화계에미치는영향을분석하여적정섭취량산출 - 개발된흑마늘복합물의 in vitro에서유효성분의함량및항산화활성분석 - 흑마늘복합물을급이한후강제운동시킨흰쥐의간기능지표효소활성, 지질과산화물함량, 체내지질성분변화및항산화계에미치는영향분석 개발바이오제품의품질특성및생리활성평가 흑마늘과개똥쑥추출물의영양성분및유용물질분석 - 타품종쑥과개똥쑥의생리활성비교 - Pilot 규모에서흑마늘과개똥쑥의최적추출조건설정 흑마늘및개똥쑥열수추출물의생리활성규명 - 항산화, 요산, 항당뇨, 항고혈압에대한활성실험 - 면역활성측정 개발바이오제품의품질특성규명 - 제품의유리당, 유기산및페놀화합물의함량분석 면역증진음료개발을위한복합조성물개발및바이오식품의품질특성규명 - 복합조성물개발을위한천연식물류의생리활성검색 - 개발된복합조성물의항산화활성및생리활성분석 - 4 -

- 복합조성물함유음료및타블렛개발을위한유효농도설정 - 개발된복합조성물의항산화, 요산, 항당뇨, 항고혈압및면역에대한활성 - 개발된복합조성물함유음료및타블렛의품질특성규명 - 제품의유리당, 유기산및페놀화합물의분석 - 항산화, 요산, 항당뇨, 항고혈압및면역에대한활성실험 흑마늘과개똥쑥함유시제품의제조배합비설정 개발시제품의영양성분과관련된특성분석 - 유리당및유기산의분석 개발시제품의생리활성및면역활성검증 흑마늘과쑥혼합면역증진용음료의테스트마케팅 고품질흑마늘의제조조건설정및산업화 - 고품질흑마늘생산조건의최적화및이에기초한대량생산공정확립 - 개발기술에기반한상품화추진및지적재산권확보 흑마늘과쑥혼합면역증진용음료의테스트마케팅 - 성공적인시장진입을위한테스트마케팅용제품생산및소비자선호도조사 - 선호도조사를반영한최종상품화조건확정 - 대량생산공정확립및상품화 - 개발음료의상품화를위한포장디자인개발 흑마늘쑥, 및천연식물류추출물을함유한면역증진용제품의상품화 - 흑마늘, 쑥및천연식물추출물함유시제품의소비자선호도조사 - 개발시제품의유통기간설정및상품화추진 - 대량생산공정확립 - 개발음료의상품화를위한포장디자인개발 - 5 -

Ⅳ. 연구개발결과 흑마늘및개똥쑥혼합물의생리활성규명 개똥쑥의이화학적성분, 생리활성및유효물질의분리개똥쑥 (Artemisia annua L.) 의잎과줄기의영양성분및생리활성을측정하였으며, 수분, 조지방및조단백질함량은잎에서높았으며, 총페놀과플라보노이드함량은잎이줄기에비해약 2배정도높았다. DPPH라디칼소거능, 환원력과 tyrosinase 저해활성이잎에서줄기에비해높았으며, α-glucosidase저해활성은줄기에서활성이높았다. 인체유방암세포인 MCF-7, MDA-MB-231, 인체자궁경부상피암세포 (HeLa) 및위암세포 (AGS) 에대한증식억제활성도잎추출물에서유의적으로높았다. HPLC를이용하여페놀화합물을분석한결과, phenolic acid 및 catechin류는줄기에비해잎추출물에서월등히높게정량되었으며, flavonol류는잎에서만동정되었다. 개똥쑥추출물의항산화및암세포증식억제활성은페놀화합물에대한의존도가높아개똥쑥추출물의생리활성이섬유소, 페놀및플라보노이드함량에의존적이라는결론과함께미지의활성물질이관여하는것으로추정하였다. 흑마늘및개똥쑥추출물의추출조건별생리활성스크리닝반응표면분석에의해흑마늘추출물의생리활성을최적화할수있는추출조건을설정하고자중심합성계획 ( 온도 : 50~90 시간 : 3~15시간 : 용매의에탄올농도비 : 0~100%) 에따라 15가지조건으로실험하였다. 흑마늘추출물의총페놀, 플라보노이드및 thiosulfinate 함량과항산화활성은 J 조건 (90, 9시간, 50% 의에탄올농도비 ) 에서가장높았음. 반응표면분석결과흑마늘추출물은평균적으로 89.68, 9.79시간및 55.72% 에탄올농도비에서최적화될것으로예상되었다. 개똥쑥추출물의항산화활성및그유효물질의함량을최적화할수있는추출조건을확립코져반응표면분석법에의한중심합성계획에따라 15가지의추출조건 ( 온도 : 50~90, 시간 : 3~15시간, 에탄올농도 : 0~100%) 에서실험하였다. 개똥쑥추출물의 DPPH, ABTS 라디칼소거활성및환원력은 J 조건 (90, 9시간, 50% 의에탄올농도 ) 에서가장높았으며, NO 라디칼소거활성은 H 조건 (80, 12시간, 75% 의에탄올농도 ) 에서가장높았다. 총페놀화합물및플라보노이드함량은 J 조건에서가장많았고, 개똥쑥의최적추출조건은평균 89.37, 8.55시간및에탄올농도는 56.77% 였다. 남해산시판흑마늘의생리활성비교분석시판되는남해산흑마늘 4개사제품 (A, B, C 및 D) 을이용하여항산화활성, 아질산염소거및 nitrosodimethylamine(ndma) 생성억제활성을비교하였다. 마늘의유효성분및항산화활성이생마늘보다흑마늘에서높았으며, 아질산염소거활성과 NDMA 생성억제활성은항산 - 6 -

화활성과비슷한경향이었다. 흑마늘제품간에는대차를보이지않았으며, 전반적으로 A 와 B 사제품이유사한경향이었다. 흑마늘의 NDMA 생성억제활성이항산화활성과유사한패턴 을보여흑마늘이생체내암발생의억제에도영향을줄것으로예상되었다. 강제운동부하시흑마늘과개똥쑥추출물을급이시킨흰쥐의생리활성및적정섭취량분석생리활성이증강된흑마늘음료개발을위하여흑마늘 (BG), 개똥쑥 (GS) 추출물및 2종의혼합물 (MBS-Ⅰ, 흑마늘추출물 7 brix: 개똥쑥추출물 0.7 brix=93:7; MBS-Ⅱ, 흑마늘추출물 14 brix: 개똥쑥추출물 1.4 brix=93:7, v/v) 을트레드밀에의해강제운동시킨실험쥐에게급이하여 4주간사육하였다. AST 및 ALP 활성은대조군에비하여실험식이급이군에서유의적으로감소하였다. 혈청의중성지방및총콜레스테롤함량은흑마늘과개똥쑥의혼합물급이군에서유의적으로감소하였으나혈청과간조직의지질함량은 MBS-Ⅰ군과 MBS-Ⅱ군간에유의차가없었다. 지질과산화물함량은대조군에비하여모든시료급이군에서유의적으로감소되었으며, 혈청에서는 MBS-Ⅰ군, 간조직에서는 MBS-Ⅱ군에서가장낮았다. 간조직의 catalase 활성은대조군에비해 GS군과혼합물급이군에서 1.8~2.3배증가, SOD 및 GSH-px 활성은대조군에비해시료급이군에서각각 1.3~1.5배, 1.2~1.7배정도증가하였다. 혼합물급이군이흑마늘이나개똥쑥의단독급이군에비해활성이높았으며, 이들혼합물이체내산화적스트레스완화에효과적일것으로판단되었다. 흑마늘과개똥쑥추출혼합물중효과적인 MBS-Ⅰ을선정하여섭취량을달리하여동일조건에서급이한결과 AST, ALT 활성, 혈액및간조직의항산화활성은 MBS-400군이대조군이나여타실험군에비해그효과가유의적인차이로우수하였다. 체내지질개선의측면에서는 MBS-200군및 MBS-400군이유사한경향을보였다. Catalase, SOD 및 GSH-px 등의항산화효소활성도 MBS-400군이여타실험군에비해유의적으로상승되어, 산화적스트레스시 MBS- Ⅰ의효과적인적정섭취량은성인체중 60 kg을기준으로계산하면 200~400 ml/day인것으로추정된다. 흑마늘과개똥쑥추출물을베이스로한개발제품의 in vivo 생리활성평가흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 을베이스로하여개발된제품의생리활성을비교한결과, 산화적스트레스에대해개발제품을 300 ml/day 급이하였을때식이효율은대조군과유의차가없었으며, 장기의중량에도유의차를보이지않았다. 혈중지질성분중총지질과총콜레스테롤함량은대조군에비해유의적으로감소되었으나, 그외지질성분이나간조직의지질개선에는대조군과유의차를보이지않았다. 혈액및간조직의항산화활성, 지질과산화물함량, 간조직중항산화효소의활성은개발제품급이군이대조군에비해유의적으로감소되었다. - 7 -

흑마늘복합조성물음료제조를위한천연식물류의선정흑마늘복합조성물음료를제조하기위하여항산화및면역활성측면에서기연구된천연식물류를문헌조사로스크리닝한결과, 총 82건의연구보고와 100여종의천연식물류가스크리닝되었으며, 이중여러연구자들을통해사용빈도및활성이우수한식물류로인지된 11종을선정하였다. 선정된 11종의천연식물류는구기자, 황금, 오가피, 감국, 산약, 작약, 단삼, 뽕잎, 생강, 상황버섯및옥수수수염이었다. 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 in vitro 생리활성의평가흑마늘추출물과 5종의천연식물류추출물의혼합 ( 흑마늘복합물 ), 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의혼합에의한생리활성을비교한결과시료의농도가높을수록유효물질의함량이높고항산화활성이증가되어흑마늘복합물을 1일 1회이상섭취할경우체내생리활성향상에도움이될것으로추정되었다. 또한흑마늘복합물에개똥쑥을첨가한경우항산화활성이유의적으로증가되었으나, 흑마늘복합물의농도에따른유의차는보이지않았다. 강제운동부하에의한흑마늘복합물의 in vivo 생리활성평가흑마늘추출물과천연식물류 5종의복합물 (BM1, BM2) 을이용하여강제운동시킨흰쥐에게 5주간급이하여체내지질성분변화및항산화계에미치는영향을측정하였다. 간헐적인운동부하에의해산화적스트레스가작았기때문에운동부하의유무에따른산화적스트레스의발생차이는크지않았다. 흑마늘복합물의급이로인한간기능지표효소활성의변화에는유의차를보이지않았다. 시료의농도가높은 BM2 급이군에서 BM1급이군에비해체내총지질, 중성지방및 LDL-콜레스테롤수치가유의적으로감소되었으며, 간조직의항산화효소활성이유의적으로증가되었다. 따라서본연구가간헐적인운동에의한운동강도가낮은것을고려해본다면, 흑마늘복합물개발음료는운동뿐만아니라현대인의일상생활속의스트레스방어에도도움이될것으로예상되며, 흑마늘음료의 1일 3회섭취도가능한것으로평가되었다. 품종별쑥의생리활성비교개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥열수추출물을제조한다음항산화및항암활성을비교분석한결과 5종의쑥추출물중총페놀함량은인진쑥에서유의적으로가장높았으며, 다음으로개똥쑥, 약쑥및강화약쑥순이었다. 플라보노이드함량도인진쑥이가장높았다. 추출물의농도를달리하여항산화능을측정한결과, NO 라디칼소거능은 200 μg/ml 농도에서약쑥, 강화약쑥및개똥쑥이약 50% 이상의활성을나타내었으며, 이들시료간에유의차는없었다. FRAP법에의한항산화능은인진쑥에서높게나타났으며, β-carotene 존재하에서의항산화능또한인진쑥이 100 μg/ml 농도에서 50% 이상의높은활성을보였다. 400 μg/ml 농도에서인체자궁경부상피암세포인 HeLa의증식억제활성은인진쑥이 80% 이상으로활성이높았고, 유방암세포인 MCF-7의대해서는강화약쑥이 80% 이상의증식억제활성을보였다. 이상의결 - 8 -

과, 쑥추출물은높은항산화활성과암세포증식억제활성을나타내었으며, 특히항산화활성 은 ascorbic acid 이상의높은활성을나타내어천연기능성식품소재로써활용가치가높다 고판단된다. Pilot 규모에서흑마늘과개똥쑥의최적추출조건흑마늘과개똥쑥을반응표면분석법에따른중심합성계획에의하여 110~130 와 2~4시간범위의 11가지조건 (A~K) 에서각각열수추출하여총페놀, 플라보노이드함량및항산화활성이최대화되는추출조건을모니터링하였다. 항산화활성의정도에따라흑마늘추출조건 3종 (13 0, 4시간 ; 120, 3시간 ; 130, 3시간 ) 과개똥쑥의최적추출조건 1종 (120, 3시간 ) 을선정하였다. 흑마늘추출물에대한개똥쑥추출물의혼합비율을 1:0.5, 1:1, 1:1.5 및 1:2(w/w) 로조절하여총페놀, 플라보노이드함량및항산화활성을측정한결과, 120, 3시간에서추출된흑마늘추출물과개똥쑥추출물을혼합한시료에서그활성이우수하였으며, 최적의혼합비율은흑마늘과개똥쑥추출물에서 1:1.5(w/w) 인것으로판단되었다. 흑마늘과개똥쑥추출혼합조성물의생리활성및면역활성검증흑마늘과개똥쑥의제품개발을위한최적의혼합비율을알아보고자흑마늘과개똥쑥의비율을달리한혼합물의항산화활성, nitric oxide 라디칼소거능및 α-glucosidase 저해활성을실험한결과 nitric oxide 라디칼소거능과 α-glucosidase 저해활성을제외한모든실험에서흑마늘과개똥쑥을 99.3 : 0.7의비율로혼합하였을때항산화활성이가장우수하였다. 흑마늘과개똥쑥혼합물의생리활성을분석한결과혼합물의농도가높아질수록, 개똥쑥의혼합비율이증가시킴에따라항산화활성도유의적으로증가하였는데이는개똥쑥의높은항산화력과흑마늘의갈변물질에의한상승효과로해석된다. 흰쥐의비장세포증식을통하여면역세포증식효과를측정한결과품종별쑥추출물중개똥쑥이가장우수하였으며, 흑마늘과혼합할때개똥쑥추출물의첨가비율이높아질수록활성도더증가하였다. 생리활성에대한연구와관능평가결과를종합하여흑마늘과개똥쑥추출물의최적혼합비율은 99.3:0.7비로하여농도에따른 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와같은 cytokine의생성량을시험한결과대조군에비해유의적으로높은수준의 cytokine이생성됨을확인할수있었다. 흑마늘과개똥쑥함유시제품의최적배합비흑마늘과개똥쑥추출물의혼합비율설정에따라관능평가를통하여식품첨가물을최소화하면서음료의기호도를향상시키는최적조건을시험하였다. 흑마늘추출물은 7 brix 농도를 90.2%, 쑥추출물은 0.7 brix 농도를 6.8%, 배추출농축액은시판되는 60 brix 제품을 2%, 결정과당을 1% 혼합하여음료시제품을제조하였다. - 9 -

개발시제품의영양성분분석설정배합비에따라음료시제품을제조하였으며, 고형분함량의기준은 8% 이상으로하였는데, 개발된음료중총페놀화합물은플라보노이드함량에비해약 3.7배정도높은함량으로정량되었다. 유리당함량은 fructose가 14.76 mg/ml로가장높았고, 유기산은 citric acid가 82.2 mg/100 g 으로가장높은함량이었으며, 유기산은총 7종이 12 mg/100 g 이상이었다. 개발시제품의생리활성및면역활성분석 DPPH와 ABTS 라디칼소거활성및환원력, FRAP법에의한항산화활성, Fe +2 chelating 활성을측정하였으며, 10% 희석액에서 DPPH 라디칼소거활성은 51.7%, 환원력은 2.6이었으며, 6~10% 희석액에서 ABTS 라디칼소거활성은 95%, Fe +2 chelating 활성은 41.8~43.7% 범위였다. 아질산염소거활성은 10% 농도의시료가 63.8% 였고, 농도증가와더불어활성도증가하였다. α-glucosidase 저해활성도비슷한경향이었으나, 최고활성은 28.3% 였으며, xanthine oxidase 저해활성은 63.8% 였다. Raw 264.7 세포를이용한면역활성평가의적정농도를설정하고자 CCK-8 assay를실시한결과 20% 농도까지는세포독성을나타내지않았음을확인하였으며, 시제품은 Raw 264.7 세포에서 NO 생성량이시료의농도가높을수록유의적으로감소하여 20% 희석액에서 20 μm 이하였다. 면역반응의대표적인 cytokine인 IL-1β와 TNF-α는시료의농도가높을수록생성량이유의적으로증가하였다. 흑마늘복합물제조를위한천연식물의생리활성및면역활성검증문헌조사를통해선별된 11종의천연식물 ( 구기자, 황금, 오가피, 감국, 산약, 작약, 단삼, 뽕잎, 생강, 상황버섯및옥수수수염 ) 를대상으로항산화및대식세포를이용한면역활성을측정한결과총페놀및플라보노이드함량은상황버섯이가장높았다. DPPH와 ABTS 라디칼소거활성에서 EC 50 값은단삼이 100 μg/ml 이하였으며, 환원력은상황버섯이가장높았고, Fe +2 킬레이팅활성은뽕잎이가장높았다. 추출물의세포독성은 LPS 처리후세포생존율이오가피를제외한모든시료에서 50 μ g/ml처리시 80% 이상이었으며, LPS의처리후 NO 생성량은대조구에비해 12배증가되었으며, 황금은 100 μg/ml 첨가시 NO 생성을 72% 정도감소시켰다. 황금, 상황버섯, 단삼, 뽕잎, 작약이항산화와면역활성이높아항산화및면역증강용기능성음료제조를위한부재료로써선별가치가있는것으로판단되었다. 흑마늘복합물제조를위한천연식물 5 종의혼합조건별생리활성검증 천연식물류 5 종혼합물의제조시혼합조건별 (MHE-1, 각시료를추출하여동량으로혼합 ; MHE-2, 추출수율에따른배합비로혼합하여추출 ) 생리활성을비교한결과유효물질인총페 - 10 -

놀화합물및플라보노이드함량이 MHE-2에서유의적으로많았다. 시료의농도를달리한조건에서항산화활성을측정한결과 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성은 25~250 μg/ml농도범위에서 MHE-2의활성이유의적으로높았으며, 500~1000 μg/ml농도범위에서는시료간의유의차가없었다. Superoxide anion 라디칼소거및 Fe +2 킬레이팅활성은 25 μg/ml 농도에서활성이나타나지않았으며, Fe +2 킬레이팅활성의경우라디칼소거활성과다소상이한경향이었다. 환원력 25~50 μg/ml농도범위에서시료간의유의차가없었으나그이상의농도에서는 MHE-2 의활성이유의적으로높아천연식물류 5종혼합물의제조시 MHE-2의추출방법이적절하리라판단되어흑마늘복합물의제조에활용하였다. 상황버섯, 황금, 단삼, 뽕잎및작약을각각추출하여동량씩혼합하였을때 (MHE-1) 와추출물의수율을고려하여동일한수율을가지도록원재료를혼합한후동시추출하였을때 (MHE-2) 항산화활성은시료간에차이를나타내었으나, 면역활성과관련된제인자들을분석한결과에서는추출방법의차이에따른활성의차이는없었다. 그러나, 두시료모두 LPS만처리한대조군에비해더효과적으로농도의존적인면역활성을보여이들추출물이면역활성증강에기여할것으로기대된다. 고품질흑마늘생산조건의최적화및이에기초한대량생산공정확립마늘의제조공정을온도변화에따라 4단계로나누어각단계마다시료를채취하고이화학적성분의변화를비교한결과흑마늘의조직감은숙성이진행됨에따라수분함량의감소와더불어증가하였고, ph도점차산성화되었다. 숙성중당도, 총당및환원당등의탄수화물의함량은증가하였고, 최종숙성 4단계에서유효성분의함량이가장높은통마늘로제조한흑마늘에서총페놀화합물은약 4.6배, total pyruvate 및 thiosulfinate의함량은각각 2.2배및 25.1배가증가하였다. 개발기술에기반한상품화추진및지적재산권확보흑마늘의제조방법및이에따라생산된흑마늘을이용한고농축액의제조조건을최적화하여특허출원하였다. 특허기술은가온과냉각을반복하여제조된흑마늘을원료로하고열수추출물및그잔사를동결건조한분말을활용해저점도, 고영양, 고농축액을만들기위하여열수추출물을농축시킨농축액과잔사분말을혼합해제품을완성하여소비자가원하는농도로조절하여섭취할수있도록하는제조방법이다. 참여기업에서는이기술을활용하여고농축액제품인 신의 를출시하여판매중에있다. 성공적인시장진입을위한테스트마케팅용제품생산및소비자선호도조사연구결과에기반하여흑마늘과쑥을혼합한음료를개발한제품명을 오천년애 로선정하였다. 선호도조사를실시한결과응답자의 78% 가맛에대해긍정적인반응을보였으며, 부정적인반응은 22%, 또한기존의흑마늘음료에비해첨가된쑥의향미성분으로인해마늘냄 - 11 -

새는현저히감소되었다. 제품출시후의시장성에대한예측을분석한결과 47.6% 가구매계획이있으며음료로써만족한다는응답을하였으며, 24.4% 는매우좋다고응답해 오천년애 흑마늘음료가출시되면기존의흑마늘음료보다선호도가더높을것으로예견된다. 선호도조사를반영한최종상품화조건설정흑마늘에쑥을농도별로첨가하여맛과향미에대해관능평가를실시한결과쑥추출물을 1% 이상첨가한제품은쑥의향이너무강하여기호도가감소되었다. 따라서쑥추출물을 0.7% 미만으로첨가한제품의관능평가결과를근거로하여흑마늘추출물, 쑥추출물, 배추출농축액, 결정과당의농도를 90.2:6.8:2:1로선정하고기존의흑마늘에제형의고급화를추구하기위해병음료로개발하고자하였다. 대량생산공정확립및상품화 소비자선호도조사결과에기초하여개발제품의시장성을확인후, 대량생산을위한제조 공정을확립하고상품화를위한제품포장디자인을개발하였다. 개발음료의상품화를위한포장디자인개발 흑마늘과쑥을혼합한음료의포장은기존생산라인에적합한디자인으로확정하였다. 흑마늘, 쑥및천연식물추출물함유음료및타블렛의테스트마케팅용제품제작 2차년도에개발된흑마늘음료오천년애는 1세부과제및 1협동과제의연구결과를종합하여흑마늘, 쑥, 천연식물류를혼합추출한최적배합비율을확정하여면역증진용흑마늘음료오천년애프리미엄을제조하였다. 흑마늘액상제품은물류비가높고부피가커보관이불편한단점을개선하기위하여흑마늘액상추출물을분말화하여타블렛형태로의공정을확립하고시제품화하였으며제품명은 오천년애파워 로정하였다. 개발시제품의유통기간및상품화추진 흑마늘음료인 오천년애프리미엄 제품의물성을시험한결과제조일로부터 1 년의유통기 간을정하였다. 제품개발 2 종상품화 기술개발및소비자선호도조사결과에기초하여 오천년애프리미엄 과 오천년애파워 제품의대량생산을위한제조공정을확립하고상품화를위한제품포장디자인을확정하였다. - 12 -

수출을위한해외시장분석국내건강식품시장현황및면역제품의비율, 주요원료에대한조사를실시하였으며, 미국, 일본, 중국을대상으로건기식생산현황과면역제품을시장조사하였다. 해외시장을공략하기위해서는타블렛제품이적합할것으로판단되어본과제를통해개발한 오천년애파워 를중심으로시장을개척할예정이다. - 13 -

Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 1) 연구성과 (1) 지적재산권확보 본과제를통하여흑마늘을이용한고농축액제조방법에관한특허 1건출원됨. 이를근거로하여제조된흑마늘고농축액과쑥을혼합한면역증강용음료및항산화효능을갖는기능성음료제조에대한특허 1건이등록되었으며, 1건이출원되었음. 흑마늘및저점도흑마늘고농축액제조방법 (10-2011-0030967, 출원, 2011) 의특허내용 흑마늘제조방법및흑마늘고농축액제조방법에관한것으로서보다구체적으로는가온및냉각조건을반복실시하여숙성시킨후후숙성을함으로써별도의가수 ( 加水 ) 과정없이도조직감이우수하고유효성분이다량함유된흑마늘을제조할수있는방법이며이러한방법에의해제조된흑마늘을이용하여진액을추출하고진액추출과정에서남은흑마늘잔사물을분쇄하여진액에첨가함으로써섬유소나불용성영양성분등과같은영양성분이풍부하면서도탄맛이나쓴맛을최소화할수있는흑마늘고농축액을제조하는방법에관한것임. 또한, 쑥, 헛개나무, 느릅나무, 시무나무, 상백피, 상지, 오가피, 산수유, 구기자, 감초및대추등과같은천연재료중적어도하나와흑마늘을이용하여천연재료성분이첨가된흑마늘진액을제조하고, 이과정에서남은흑마늘잔사물을건조하여분쇄한초미립분쇄물을흑마늘진액에첨가하여소정농도로농축시킴으로써, 항산화화합물함량이보다증가하고라디칼소거활성이우수하여항산화성이보다향상된흑마늘고농축액제조방법을제공하고자함. 흑마늘고농축액제조시천연재료를첨가하여농축함으로써, 항산화활성발현물질인페놀화합물함유량이보다많아지고라디칼소거활성이보다우수하여전체적으로항산화활성이매우향상된흑마늘고농축액을제조하므로써바이오푸드개발에활용할것임. 흑마늘과개똥쑥을이용한면역증강용음료의제조방법 (10-1028155, 특허등록, 2011) 의특허내용 면역증강에높은효과를나타내는흑마늘과개똥쑥을주재료로한음료의개발에관한것으로, 더욱상세하게는편리하게음용할수있도록흑마늘과개똥쑥의자극적인맛과향을개선하여기호성을향상시킨음료와그제조방법이며, 나아가프로폴리스분말, 홍삼추출물, 상황버섯추출물, 사과농축액, 배농축액, 자일리톨, 효소스테비아분말중에서하나이상선택된첨가제가더포함되는것을특징으로하는면역증강용음료조성물의제공방법에대한것임. 흑마늘추출액 (7brix) 과개똥쑥추출액 (0.7brix) 의혼합비율별시료의흰쥐비장세포에대한면역증강활성을분석한결과에기초하여최종혼합비율을설정하고, 효능이유지되는수준에서첨가물을통해관능특성을개선한음료의개발조건을제시한특허로, 음료개발을위한레시피로활용가능함. - 14 -

항산화효능을가진흑마늘과쑥혼합음료의제조방법 (10-2012-0027252, 출원, 2012) 의특허내용 항산화효능을가진흑마늘과쑥혼합음료의제조방법에관한것으로서, 관능적특성및생체내항산화효능이최대화되는비율을제공함과더불어쑥의쓴맛을제거할수있도록전처리공정을거치는것을특징으로하는항산화효능을가진흑마늘과쑥혼합음료의제조방법에관한것임. 본발명은상기와같은문제점을해결하기위하여고안된것으로써, 흑마늘과쑥은단독추출음료만으로도항산화효능이있으나이들의추출조건에따라그활성에차이가있으므로, 최적의추출조건을제공함과동시에이들을혼합함에있어관능적특성및생체내효능이최대화되는비율을제공하여생체내에서시너지효과를지니는항산화효능을가진흑마늘과쑥혼합음료의제조방법을제공하는데있음. 또한, 쑥의추출물을음료로제조하였을때, 관능적효능이좋도록쑥의쓴맛을제거하기위한전처리공정을제공하는데있으며, 항산화효능을가진흑마늘과쑥혼합음료의제조방법은흑마늘과쑥의최적추출조건을제공함과동시에이들을혼합함에있어관능적특성및생체내항산화효능이최대화되는비율을제공하며, 또한, 쑥의추출물을음료로제조하였을때, 관능적효능이좋도록쑥의쓴맛을제거할수있는방법을제공하므로써향후흑마늘바이오푸드제조에활용예정임. (2) 연구논문 국내연구논문 9편출간, 학회발표 10건이완료됨. 개똥쑥의영양적특성및생리활성 (2011, 한국식품영양과학회지 ) 개똥쑥 (Artemisia annua L.) 의개똥쑥잎과줄기의영양성분및생리활성을다양한측면에서분석한연구결과로개똥쑥을이용한제품개발에기초자료로활용할것임. 개똥쑥의항산화및항암활성과기능성물질의탐색 (2011, 한국식품영양과학회지 ) 개똥쑥의항산화활성및항암활성측정과유효성분으로페놀화합물을분석한연구결과 로개똥쑥첨가제품에대한과학적인근거자료로활용할것임. 시판흑마늘의항산화및 Nitrosodimethylamine의생성억제 (2012, 농업생명과학연구 ) 시판되는남해산흑마늘제품에대해항산화활성, 아질산염소거및 N-nitrosodimethylamine (NDMA) 생성억제활성을비교한연구결과임. 남해산흑마늘제품의인지도향상을위한홍보용자료로활용할것임. 반응표면분석을이용한흑마늘과개똥쑥혼합음료개발을위한추출조건의최적화 (2012, 농 업생명과학연구 ) - 15 -

흑마늘과개똥쑥을반응표면분석법에따른중심합성계획에의하여고온 (110~130 ) 에서 2~4시간범위의 11가지조건 (A~K) 에서각각열수추출하여유효성분및항산화활성을측정한연구임. 흑마늘과개똥쑥을이용한제품개발을위한제조공정에활용할것임. 국내산품종별쑥의생리활성 (2012, 한국생명과학회지 ) 섬애약쑥, 인진쑥, 약쑥, 강화사자발쑥및개똥쑥열수추출물을대상으로항산화및항암활성을비교분석하였음. 개똥쑥과타쑥의활용비교와개똥쑥을이용한제품에대한인지도및제품의활성에대한과학적인근거자료로활용할것임. 반응표면분석을이용한흑마늘의항산화활성최적화를위한추출조건확립 (2012, 한국식품저장유통학회지 ) 반응표면분석에의해흑마늘추출물의생리활성을최적화할수있는추출조건을설정하고자중심합성계획 ( 온도 : 50~90 시간 : 3~15시간 ; 용매의에탄올농도비 : 0~100%) 에따라 15가지조건으로실험하였음. 흑마늘추출물의유효성분극대화를위한에탄올추출과정으로제품개발을위한제조공정에활용할것임. 반응표면분석에의한개똥쑥의항산화활성을위한최적추출조건확립 (2013, 농업생명과학연구 ) 개똥쑥추출물의항산화활성및그유효물질의함량을최적화할수있는추출조건을확립코져반응표면분석법에의한중심합성계획에따라 15가지의추출조건 ( 온도 : 50~90, 시간 : 3~15시간, 에탄올농도 : 0~100%) 에서실험하였음. 개똥쑥추출물의유효성분극대화를위한에탄올추출과정으로제품개발을위한제조공정에활용할것임. 흑마늘및개똥쑥추출물의급이가강제운동시흰쥐의체내지질성분및간조직의항산화효소활성에미치는영향 (2013, 한국식품영양과학회지 ) 생리활성이증강된흑마늘음료개발을위하여흑마늘 (BG), 개똥쑥 (GS) 추출물및 2종의혼합물 (MBS-Ⅰ, 흑마늘추출물 7 brix: 개똥쑥추출물 0.7 brix=93:7; MBS-Ⅱ, 흑마늘추출물 14 brix: 개똥쑥추출물 1.4 brix=93:7, v/v) 을트레드밀에의해강제운동시킨실험쥐에게급이하여 4주간사육한후, 체내지질변화, 항산화계에미치는영향을분석하였음. 개발음료를이용한 in vivo 실험결과로개발제품의홍보및인지도향상을위한과학적근거자료로활용할것임. - 16 -

항산화및면역활성증강을위한생약재의탐색 (2013, 생명과학회지 ) 문헌조사를통해선별된 11종의생약재 ( 구기자, 황금, 오가피, 감국, 산약, 작약, 단삼, 뽕잎, 생강, 상황버섯및옥수수수염 ) 를대상으로항산화및대식세포를이용한면역활성을측정한연구결과임. 흑마늘음료의기능성향상을위하여첨가되는부재료로활용하고, 개발제품의생리활성향상에대한과학적인근거자료로활용가능함. (3) 학술발표 Physicochemical properties and biological activity of gaeddongssuk (Artemisia annua L.) 2010-10-21, 한국생명과학회 Antioxidant and acticancer activities of gaeddongssuk (Artemisia annua L.) 2010-10-27, 한국식품영양과학회 Immune cell activities from Artemisia of five species 2011-11-01, 한국식품영양과학회 Optimization of high temperature water extraction conditions for antioxidant properties of black garlic and gaeddongssuk composite by response surface methodology 2011-06-09, 한국식품과학회 Optimization of the extraction condition for antioxidative components of gaeddongssuk (Artemisia annua L.) by response surface methodology 2011-11-01, 한국식품영양과학회 Optimization of ethanol extraction conditions for high-functionality of black garlic by response surface methodology 2011-11-01, 한국식품영양과학회 Effect for supplementation of black garlic and gaeddongssuk (Artemisia annua L.) composites on the hepatic lipid profiles and antioxidative defense system 2012-11-02, 한국식품영양과학회 Supplementation effect of black garlic and gaeddongssuk (Artemisia annua L.) on blood components in rats run on treadmill 2012-11-02, 한국식품영양과학회 The effect of black garlic extract on lipid metabolism in immobilization stressed rats 2012-11-02, 한국식품영양과학회 Effects of black garlic and mugwort extract on the restraint stress in rats 2012-11-02, 한국식품영양과학회 - 17 -

2) 성과활용계획 3건의특허기술을참여기업이직접활용하여실시함으로서고품질의흑마늘제품을생산하고, 마케팅하는데활용하고자함. 참여기업의대량생산체계를바탕으로제품의산업화를통한국내건강기능식품시장의진출과해외수출을위한제품생산이가능할것으로예상됨. 흑마늘에생리활성이우수한천연식물류를첨가하여항산화및면역활성이증강된제품을개발하여향후기능성식품으로서의보다심도있는연구를통하여제품개발기술의업그레이드화에도기여할수있음. - 18 -

SUMMARY This study was conducted by research project Commercialization of high quality black garlic and biofoods to create new market for domestic and export. (1) The nutritional properties, antioxidant and anticancer activities from leaves and stems of Gaeddongssuk (Artemisia annua L.) were investigated. And phenolic compounds from A. annua were identified through quantitative analysis by HPLC. Contents of moisture, crude lipid and crude protein were significantly higher in the leaves. Contents of total phenols and flavonoids of leaves were about 2 times higher than those of stems. Antioxidant activity was significantly increased in a does-dependent manner, water and ethanol extracts of leaves were stronger than those of stems. Especially, DPPH radical scavenging activity, reducing power and tyrosinase inhibition activity were significantly higher in leaves extracts than stems extracts of Gaeddongssuk. (2) In MTT assay by human breast adenocarcinoma cell line MCF-7 and MDA-MB-231, ethanol extracts of leaves showed the highest anticancer activity, the rates of growth inhibition were 76.26% and 52.59% on MCF-7 and MDA-MB-231 cells, at the concentration of 250 μg/ml, respectively. Growth inhibition activity of leaves extracts on HeLa and AGS cells was higher than that of stems extracts. Especially, growth inhibition activity of ethanol extract made from leaves were 61.07% and 57.24% on HeLa and AGS cells, at the concentration of 500 μg/ml, respectively, which were the highest of all extracts. Phenolic acid and catechin contents of A. annua extracts were higher in leaves than stems. Flavonol was identified only in leaves. Biological activities of extracts from Gaeddongssuk were dependent on the fiber, phenolic and flavonoid content. (3) For establish the extraction conditions for the optimization of the biological activities of black garlic and Gaeddongssuk (Artemisia annua L.) using the response surface methodology (RSM). The extraction conditions were based on the central composite design, with 15 kinds of variations in the extraction temperature (50-90 ), extraction time (3-15 hrs), and ethanol concentration (0-100%). (4) In black garlic, the total phenol, flavonoids, thiosulfinate contents, and anti-oxidant activity of black garlic extract were significantly higher at the J condition (90 for 9 hrs with a - 19 -

50% ethanol concentration). In this condition, the biological activities such as DPPH radical scavenging (66.10%), ABTS radical scavenging activity (75.02%), and reducing power by of FRAP (375.4 μm/ml) were excellent. Overall, the extraction conditions for the optimized biological activities of black garlic via RSM were expected to be at 89.68 for 9.79 hrs with a 55.72% ethanol concentration. The actual values were 96.4-114.8% of the predicted values. (5) In Gaeddongssuk, reducing power by FRAP, DPPH and ABTS radical scavenging activities of Gaeddongssuk extract were significantly higher at J condition (90 for 9 hr with 50% ethanol concentration). On the other hand, NO radical scavenging activity was significantly higher at H condition (80 for 12 hr with 75% ethanol concentration). Total phenol and flavonoids contents were the highest in the extract of J condition, followed by H condition. Overall, we expected that the extraction conditions for optimized antioxidative activities of Gaeddongssuk extract by RSM were at 89.37 for 8.55 hr with 56.77% ethanol concentration. And the actual values were 89.88 115.54% of the predicted. (6) Black garlic and Gaeddongssuk (Artemisia annua L.) were extracted using central composite design by response surface methodology (RSM) in 11 conditions (A K) with 110 130 and 2 4 hr, and then each extracts were monitored for the total phenol, flavonoid contents and antioxidant activities. The optimum extraction conditions for black garlic and Gaeddongssuk are selected 3 conditions (130, 4 hr; 120, 3 hr; 130, 3 hr) and 1 condition (120, 3 hr), respectively. They were mixed according to the following ratio; 1:0.5, 1:1, 1:1.5 and 1:2 (black garlic: Gaeddongssuk extract, w/w), and then these composites were tested to the total phenol, flavonoid contents and antioxidant activities. Antioxidant activities of black garlic and Gaeddongssuk extracts by 120, 3 hr condition were higher. And the optimal mixture ratio of black garlic and Gaeddongssuk was 1:1.5 (w/w). (7) Four kinds of marketing black garlics (A, B, C and D products) from Namhae were analysed the antioxidant, nitrite scavenging activities and inhibition of N-nitrosodimethylamine (NDMA) formation. Total pyruvate and thiosulfate contents were higher in the black garlics than fresh garlic, and their contents were the highest in B product. Total phenol and flavonoids contents in the water and 80% ethanol extracts from black garlics were higher in water than ethanol extract, and all black garlics were higher than fresh garlic. And these contents of A product were somewhat higher compared to - 20 -

the others. Antioxidant activities, such as DPPH, ABTs, hydroxyl and nitric oxide radical scavenging showed stronger in water than ethanol extracts. And their activities in all products of black garlic were higher than the extracts of fresh garlic, and their activities of A and B products were similar to each other. In ph 2.5, nitrite scavenging activity and inhibition of NDMA formation were stronger in the black garlics than fresh garlic, and A product was the highest. Moreover, inhibition of NDMA formation from black garlic showed similar trends compared to the antioxidant activities. Therefore, we expect that the black garlic will contribute to the inhibition of carcinogenesis in vivo. (8) Antioxidant and cancer cell growth inhibition activity of hot water extract from 5 different varieties of artemisia (A. Argyi H., A. iwayomogi Kitamura, A. Princeps Var Orien talis HARA, A. princeps Pampanini and A. annua L.) in Korea were studied. Total phenol and flavonoid contents were the highest in A. iwayomogi Kitamura followed by A. Argyi H. DPPH radical scavenging activity was the highest in A. Argyi H. at 50 μg/ml concentration, NO radical scavenging activity was more than 50% in A. Princeps Var Orien talis HARA, A. princeps Pampanini, and A. annua L. at 200 μg/ml concentration. FRAP was higher in A. Argyi H. and A. iwayomogi Kitamura. Antioxidant activity in the β -carotene linoleic acid system was also higher in A. Argyi H. and A. iwayomogi Kitamura by 60.50% and 56.90% at 100 μg/ml concentration, respectively. In cancer cell growth inhibition activities at 400 μg/ml concentration, A. iwayomogi Kitamura showed higher than 80% on HeLa cell. A. princeps Pampanini and A. Argyi H. extract had growth inhibition activities higher than 80% on MCF cell. The antioxidant and anticancer activities in various artemisia are a promising source of functional food ingredients. (9) To develop functional products based on black garlic, a black garlic extract (BG) of 7 brix, a Gaeddongssuk extract (GS) of 0.7 brix and two types of mixtures (MBS-Ⅰ; black garlic 7 brix: Gaeddongssuk 0.7 brix, MBS-Ⅱ; black garlic 14 brix: Gaeddongssuk 1.4 brix, 93:7, v/v) were supplemented to rats training on a treadmill for 4 weeks. Body weight from the training did not decrease during the experimental period. Serum albumin content significantly increased in the groups fed an experimental diet compared to the control. The BUN content significantly decreased in BG and MBS-Ⅱ groups compared to the control. AST and ALP activities significantly decreased in the groups fed an experimental diet compared to the control. Serum triglyceride and total cholesterol levels in MBS-Ⅰ and MBS-Ⅱ groups significantly decreased compared to the control. Lipid levels of the serum and liver tissue were not significantly different between the MBS-Ⅰ and MBS-Ⅱ groups. - 21 -

The contents of lipid peroxide in the serum and liver tissue were significantly reduced in the groups fed all extracts compared to the control, the serum and liver lipid contents were the lowest in the MBS-Ⅰ and MBS-Ⅱ groups, respectively. Activity of hepatic catalase in the GS and MBS groups increased by 1.8~2.3 times compared to the control. SOD and GSH-px activities significantly increased from treatment with the extracts by 1.3~1.5 times and 1.2~1.7 times, respectively. (10) These results indicate that a mixture of BG and GS extracts has higher biological activity than a single supplementation of BG or GS extract. Therefore, the addition of Gaeddongssuk to black garlic (MBS-Ⅰ and MBS-Ⅱ) is effective as a defense material against oxidative stress. MBS-Ⅰ may be especially effective for its biological activities. (11) To development of bio-product based on black garlic, medicinal plants were screened by the literature search. And then selected over 100 kinds of materials. More frequent use of 11 kinds of samples were selected. Eleven medicinal plant materials were tested for antioxidant capacity and inhibitory activity on lipopolysaccharide (LPS) induced nitric oxide (NO) production in the RAW264.7 cells. Yields from hot water extracts of the materials were the highest in the Lycii fructus by 52.10%, Phellinus linteus was the lowest by 5.7% and yields of another were 14.50~42.47%. Total phenol and flavonoids contents were the highest in the Phellinus linteus. EC 50 value of Salvia miltiorrhiza was lower than 100 μ g/ml, but the values of Phellinus linteus, Scutellaria baicalensis and Paeonia lactiflora were 100~200 μg/ml in the DPPH and ABTS radical scavenging activities. EC 50 values of all extracts in the superoxide anion radical scavenging activity were higher than 300μg/mL. Phellinus linteus for the reducing power was shown the highest activity. Fe +2 chelating activity was the highest in the Morus alba extract. Cell viability by MTT against the LPS induced RAW264.7 cell showed above 80% at the 50 μg/ml, and above 77% at the 100 μ g/ml concentration, except for Acanthopanax sessiliflorum. NO production in the LPS induced RAW264.7 cell was 12 fold increased compared to the control. Its NO production level was 6.86~26.18 μm for all extracts, especially 100 μg/ml of Scutellaria baicalensis extract decreased 72% of NO production than the control. These results suggest that Scutellaria baicalensis, Phellinus linteus, Salvia miltiorrhiza, Morus alba and Paeonia lactiflora are potential candidates of functional material because of their potent antioxidant and anti-inflammatory activities. - 22 -

(12) Selected 5 kinds of medicinal plants were mixed under two condition. After 5 kinds of medicinal plants were extracted and dried, individually, and then each of the mixture (1:1:1:1:1) were tested biological activity (MHE-1). On the other hand, the mixture to same extraction yields from each of raw material was tested biological activity (MHE-2). Above samples were analysed on the nutritional components, antioxidant and immune activity. The result was more effective in MHE-2 sample. (13) Free sugar was detected 3 kinds, contents of fructose and glucose in Phellinus linteus was the highest. MHE-1 and MHE-2 were similar content. Organic acid was determined 11 kinds, Morus alba was the highest, followed Paeonia lactiflora. The content of MHE-1 was higher than MHE-2. In the biological activities of mixture(mhe-1, MHE-2), xanthin oxidase inhibitory activity was increased significantly to the does-dependent manner, activity of two mixture is similar. α-glucosidase inhibitory activity was higher MHE-2 than MHE-1, in the 500~5000 µg/ml concentration. Total phenol and flavonoids contents were significantly higher than MHE-2. Antioxidant activity was significantly increased to the its concentration, and MHE-2 was significantly higher than MHE-1. (14) Cell viability by MTT against the LPS induced RAW 264.7 cell showed above 80% at the 50 μg/ml, and above 77% at the 100 μg/ml concentration of all except, Acanthopanax sessiliflorum. NO production in the LPS induced RAW 264.7 cell was 12 fold increased compared to the control. Its NO production level was 6.86~26.18 μm for all extracts, especially 100 μg/ml of Scutellaria baicalensis extract decreased 72% of NO production than the control. These results suggest that Scutellaria baicalensis, Phellinus linteus, Salvia miltiorrhiza, Morus alba and Paeonia lactiflora are potential candidates of functional material because of their potent antioxidant and anti-inflammatory activities. (15) In immune activity of the mixture, cell viability by MTT was 84~91% in the 100 µg/ml concentration, was less than 50% in the 10000 µg/ml concentration. NO production in the LPS induced RAW264.7 cell was over than 10 fold increased compared to the control. But two mixture (MHE-1, MHE-2) was decreased to 50% of NO production in the 500 µg/ml concentration. In the two mixture, PGE 2 level was similar. TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6 level were decreased by mixture adding. These results suggest that medicinal plant and their mixture were expected to effective in the prevention of inflammatory diseases. Therefore bio-products from black garlic composite were expected to improve. - 23 -

(16) To develop of bio-product, black garlic and MHE-2 were mixed, intake amount for 1 day on adult was decided. To decide of optimal intake amount on 1 day, bio-product based on the black garlic composite of different volume were tested by in vivo animal experiment on treadmill running exercise. AST, ALT activities were decreased in groups fed bio-products. The lipid peroxide content in the serum and liver tissue was significantly decreased in the groups fed bio-products. Hepatic catalase, SOD and GSH-px activities significantly increased from treatment with 3 times intake amounts on 1 day the bio-products. The bio-product is effective as a functional products against oxidative stress from exercise or daily life. (17) Manufacture condition of high-concentration extract from black garlic was optimized, and patented. Ochunnunae as drinks was developed. And composed to black garlic, mugwort and medicinal plants containing black garlic drink product was named Ochunnunae premium and Ochunnunae gold. After design of the products, commercialization was prompted. Ochunnunae power as tablet products was established packaging design to promote the commercialization. - 24 -

CONTENTS Chapter 1. Introduction of the research project 29 Chapter 2. Status of technology development in domestic and abroad 31 Chapter 3. Results of research project 32 Section 1. Biological activity of black garlic and Gaeddongssuk mixture 32 1. Objective and results of research 32 2. Materials and methods 35 3. Results and discussion 45 1) Biological activity and component analysis from Gaeddongssuk 45 2) Biological activity screening by extraction condition in black garlic 60 3) Biological activity screening by extraction condition in Gaeddongssuk 69 4) Biological activity marketing black garlics from Namhae 75 5) In vivo biological activity of black garlic and Gaeddongssuk mixture on running exercise 82 6) Optimal intake analysis of black garlic and Gaeddongssuk mixture on running exercise 93 7) In vivo biological activity of bio-products from black garlic and Gaeddongssuk mixture 99 8) Screening of medicinal plants for black garlic composite drinks 105 9) In vitro biological activity of black garlic composite and Gaeddongssuk mixture 117 10) In vivo biological activity of black garlic composite on interval running exercise 122 Section 2. Biological activity and quality characteristics of bio-product 130 1. Objective and results of research 130 2. Materials and methods 132 3. Results and discussion 139 1) Antioxidant activity of various mugwort extracts 139 2) Extraction condition optimization from biological activity screen of black garlic extract by various condition 144 3) Screening of optimal extraction condition from Gaeddongssuk hot water extract 150 4) Antioxidant activity by mixing ratio in black garlic and Gaeddongssuk mixture 156 5) Physicochemical property of bio-product 166 6) Antioxidant activity of bio-product 169-25 -

7) Biological activity of bio-product 174 8) Immune activity of bio-product 177 9) Biological activity in eleven kinds of medicinal plants 180 10) Nutritional properties of five kinds of medicinal plants and its mixture 191 11) Biological activity by mixture condition in five kinds of medicinal plants 193 12) Anti-inflammation in the RAW 264.7 cells by mixture condition in five kinds of medicinal plants 198 Section 3. Test marketing drinks for enhanced immune activity from black garlic and mugwort mixture 204 1. Objective and results of research 204 2. Materials and methods 206 3. Results and discussion 209 1) Optimization of high quality black garlic processing condition and establish of mass production process 209 2) Low-viscosity and high-concentration black garlic extract processing condition establishmen 216 3) Quality properties of low-viscosity and high-concentration black garlic extract processed by this project 217 4) Test marketing drinks for enhanced immune activity from black garlic and mugwort mixture 218 5) Bio-product commercialization for enhanced immune activity composed with black garlic, mugwort and medicinal plants 229 6) Analysis of international markets for bio-product export 243 Chapter 4. Accomplished degree and contribution in related fields 266 Chapter 5. Results of the study and application plan 272 Section 1. Necessity of additional research and improvement 272 Section 2. Application in other fields and post-effects 273 Section 3. Research achievement 274 Chapter 6. International science and technology information gathered in the process of study 277 Chapter 7. Research facilities and equipment plan status 277 Chapter 8. References 277-26 -

목 차 제 1 장연구개발과제의개요 29 제 2 장국내외기술개발현황 31 제 3 장연구개발수행내용및결과 32 제 1 절흑마늘및개똥쑥혼합물의생리활성규명 32 1. 연구개발의목표및주요결과 32 2. 재료및방법 35 3. 결과및고찰 45 1) 개똥쑥의생리활성분석및유효물질의구명 45 2) 흑마늘의추출조건별생리활성스크리닝 60 3) 개똥쑥의추출조건별생리활성스크리닝 69 4) 남해산시판흑마늘의생리활성비교 75 5) 강제운동부하시흑마늘과개똥쑥추출혼합물의 in vivo 생리활성 82 6) 강제운동부하시흑마늘과개똥쑥추출혼합물의적정섭취량분석 93 7) 흑마늘과개똥쑥혼합에의한개발제품의 in vivo 생리활성 99 8) 흑마늘복합조성물음료제조를위한천연식물류의선정 105 9) 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 in vitro 생리활성의평가 117 10) 간헐적운동부하에의한흑마늘복합물의 in vivo 생리활성평가 122 제 2 절개발바이오제품의품질특성및생리활성평가 130 1. 연구개발의목표및주요결과 130 2. 재료및방법 132 3. 결과및고찰 139 1) 개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥추출물의항산화활성 139 2) 다양한조건에서제조된흑마늘추출물의생리활성스크리닝을통한추출조건의최적화 144 3) 개똥쑥고온열수추출물의최적추출조건의스크리닝 150 4) 혼합비율을달리한흑마늘및개똥쑥혼합물의항산화활성 156 5) 개발제품의이화학적특성분석 166 6) 개발제품의항산화활성규명 169-27 -

7) 개발제품의생리활성규명 174 8) 개발제품의면역활성규명 177 9) 흑마늘과천연식물류복합물제조를위해선정된천연식물류의생리활성평가 180 10) 선정된천연식물류 5종및혼합물의영양성분분석 191 11) 선정된천연식물류 5종의혼합조건에따른생리활성비교 193 12) 선정된천연식물류 5종의혼합조건에따른 RAW 264.7 대식세포에대한염증활성측정 198 제 3 절흑마늘과쑥혼합면역증진용음료의테스트마케팅 204 1. 연구개발의목표및주요결과 204 2. 재료및방법 206 3. 결과및고찰 209 1) 고품질흑마늘의제조조건의최적화및이에기초한대량생산공정확립 209 2) 저점도고농축흑마늘진액의제조조건설정 216 3) 본연구를통하여개발된저점도고농축흑마늘진액의품질특성 217 4) 흑마늘과쑥혼합면역증진음료의테스트마케팅 218 5) 흑마늘, 쑥및천연식물추출물을함유한면역증진용제품의상품화 229 6) 개발제품의수출을위한해외시장분석 243 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 266 제 5 장연구개발성과및성과활용계획 272 제 1 절연구개발결과의활용방안 272 제 2 절기대성과 273 제 3 절연구성과 274 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 277 제 7 장연구시설 장비현황 277 제 8 장참고문헌 277-28 -

제 1 장연구개발과제의개요 마늘은우리나라국민의 90.7% 가 1일 1회이상섭취하여백미다음으로섭취빈도가높은식품이며, 일일섭취량은 6.5 g에달하는주요향신조미채소임 (2005년도국민건강영양조사, 보건복지부 한국보건산업진흥원 ). 2005년전국의마늘생산량은 31,800 ha에서 375천톤으로재배농가수는전체농가의 39.7% 를차지하고있으며, 2001년기준국내채소류중재배면적은 4위이며생산액은 5,382억원으로전체농산물생산액중 8위를차지하는주요농산채소임. 남해군의마늘산업은군전체농업생산액의 36% 를차지하고 2010년현재 6,400여호농가가참여하고있는주요산업으로 2009년의생산량은 18,090톤으로 2008년대비 2,171톤정도가감소하여지역의주요농산업의육성및고부가가치창출을통한지역산업안정화가요구되고있음. 마늘은식품으로서의가치뿐만아니라안전성이이미확보되어있으며다양한약리적효능이잘알려져있어건강지향적인현대인의성향과대체의학과자가치료에대한관심이증대되고있는사회적인경향에부합하는기능성식품임. 마늘중에함유되어있는주요황화합물인 alliin, diallyl disulfide, S-allyl-L-cysteine 등은강력한살균작용, 정장작용, 피로회복, 이뇨작용, 말초혈행개선, 항동맥경화, 항고혈압, 항산화작용, 항노화, 면역기능조절및항암등다양한생리활성을발현하며, 비황화합물인 spirostanol 형의 saponin, fructan, F-4 등의기능성발현물질은생마늘, 열수및용매추출, 가열처리등다양한형태와방법으로가공이가능하므로마늘은식품소재산업, 의약산업등에활용가능하고타산업과도융합이가능한우수한기능성식품임. 흑마늘은마늘을일정온도와습도하에서숙성시킴에따라마늘의자체성분에의하여갈변반응이진행됨으로서제조되는가공식품으로서생마늘섭취시거부요인이되는강한향과매운맛이감소되고당도와산미가증가하며, 적절한물성을가지게됨. 흑마늘로가공되면서생성되는갈변물질에의한항산화, 항고지혈증및항암효능등의활성이증가되고, 섭취가용이해짐에따라파우치및환등으로 3차가공되어건강기능성식품으로최근인기가높아지고있음. 본과제에서흑마늘과함께바이오식품개발에활용할쑥은기후나토양에잘적응하는광역성식물로전세계적으로널리분포하고있으며, 지구북반구에약 200~300여종이있고, 쑥이라는이름은어디서나쑥쑥자라는놀라운생명력때문에붙여진이름이며, 뛰어난약효때문에의초 ( 醫草 ) 라고도함. 한방에서주로이용하는쑥으로참쑥 (Artemisia mongolica), 약쑥 (Artemisia vulgaricus), 인진쑥 (Artemisia capillaries) 및개똥쑥 (Artemisia annua) 등을들수있으며, 쑥은동일속의쑥이라할지라도생육환경에따라그특성및약효가매우다른데, 민간요법에서는쑥의전초를말려진정제, 경련, 마비, 전신강직등의치료에사용되어왔으며한방에서는지혈, 한 - 29 -

습, 이담등의효과가있어서복통, 토혈, 만성간염, 식욕부진및만성위장염등에이용하였고, 이외에도피부병, 호흡기및신경계질환등의치료에도이용되어왔음. 건강에대한관심증대, 평균수명의연장, 생활수준의향상과더불어현대인은건강장수를기원하게되었고, 이러한차원에서이미발생된질병의치료보다는질병의예방에더집중하게되었는데약물보다는천연식품의섭취를통하여건강을증진시키고자함. 각종질병에대해인체는자기방어를위한기본기작을가지고있으므로외부요인으로부터자신을방어할수있는능력을강화시키는것만으로도건강증진을도모할수있음. 이러한측면에서볼때외부로부터유입된유해물질을제거및방어하는항산화작용을제 1차기작으로볼수있고, 생체의면역기능증진은인체방어를위한제 2차기작으로여겨짐. 현재까지밝혀진바에의하면산화적스트레스는발암, 심장병, 류마티스성관절염, 신경퇴화성질병, 파킨슨병, 감염, 노화, 고혈압, 알러지등의질환발생과유관한것으로보고되어있음. 여러연구결과 superoxide (O - 2 ), H 2 O 2, OH 등의활성산소의유도체들로이들은반응성이강하여궤양이나발암등의원인이될뿐만아니라생체내모든분자들을무차별공격하여암을비롯한난치질환을유발하며, 생성된위치에서, 또는이동하면서주요세포구성물질인지질, 단백질, DNA 나아가전사인자등을파괴함. 면역기능증진식품은저하된인체의면역기능을증진시키는데기여하는식품을의미하고, 정상면역기능을증진시키는경우도포함되고있는데, 최근사스나신종인플루엔자등대규모유행질병으로인하여면역기능증진식품에대한관심은더욱증대되고있으며, 고령화로인한면역력저하인구의급증과함께면역력저하로잠복기에있던질병들의발병위험도가함께높아지므로면역기능증진에대한관심과필요성은더증폭되고있음. 건강기능식품개발과관련하여소비자와기업의공통적인관심사는면역기능증진, 비만조절, 관절건강등이지목되고있으나, 흑마늘을이용하여이들질환에대한효능과관련한연구는전무함. 현재남해군을중심으로마늘산업을육성하기위한다양한노력과군전체지역을광역친환경단지로육성하기위한사업이추진되고있어고품질원료마늘의확보가용이하고감염성질환의유행으로면역활성증진식품에대한수요가증가하고있으므로기업의국내외경쟁력을강화하고신수요를창출할수있는기술및제품의개발이요구되고있음. 흑마늘의경우탄맛이나혹은잔존한자극취로인해흑마늘및그가공품시장의지속적인성장을저해하고있는바, 유해성물질의생성여부에대한규명및이를최소화시킬수있는새로운가공방법의개발이시급한실정임. - 30 -

제 2 장국내외기술개발현황 1970년이후마늘과관련된국내연구보고는총 815건으로많으나, 흑마늘과관련한연구는본연구자들에의한연구결과외에는거의없다. 본연구과제의수행에앞서선행연구결과중흑마늘과관련하여흑마늘의제조과정중주요성분의변화를비교하고열수추출물을제조하여항산화활성을비교분석한결과공정의진행과더불어갈변물질의생성량이증가하였고항산화활성도증가하였으며, 생마늘및찐마늘과주요영양성분의비교에서흑마늘은수분함량이낮고당의함량이높았으며 fructose가주요유리당이었고, 마늘특유의성분인 total pyruvate 및 total thiosulfinate의함량도흑마늘이가장높았다. 생마늘, 찐마늘및흑마늘의열수및에탄올추출물의농도별시료에서항산화활성은흑마늘의항산화활성이생마늘및찐마늘에비하여더우수하였음을확인한바있다. 또한열처리공정에의하여제조되는마늘가공품의품질특성에대한기초자료를확보하고자통마늘을 60, 70, 80 및 90 에서저장하면서저장기간에따른갈변도, 색및주요성분의변화와항산화활성의변화를비교분석한결과, 고지방식이에 3% 의마늘분말혼합급이는지질개선효과가있었는데, 흑마늘의경우혈중총지질의함량을유의적으로감소시키는등지질개선효과가있었다는보고를한바있다. 개똥쑥에관한연구로서는이화학적인성분, 생리활성에관한선행연구결과가있다. 쑥 (Artemisia montana pampan) 은우리나라전역에걸쳐자생하는번식력이강한다년생식물로서분류학상으로엉거시과 (Aruduaceae) 에속하고, 약 2,000여종이되며, 쑥의주요성분으로는 alkaloid류, 비타민류, 정유류 ( 精油類 ), 무기질등이알려져있으며, 쑥의효과로서항균, 항염, 혈액응고, 자궁수축, 기관지확장, 해열작용등이기록되어있고민간요법및한약재로이용되어왔으며, 혈중 LDL-콜레스테롤을감소시키는효과가있음도보고되어있다. 쑥은국내에서인진쑥, 참쑥에대한연구보고가많아참쑥 (Artemisia vulgaris) 의페놀류화합물인 flavonoid가분리동정되었고, 이러한 flavonoid들은효소적또는비효소적으로지질과산화를효과적으로억제하며비타민 E보다높은항산화효과를나타냄이밝혀져있다. 개똥쑥은주성분인 artemisinin이말라리아치료효과가있다는보고외에국내에서연구된결과는거의전무한실정이며, 본연구진은마늘과접목하여기능성을강화할수있는식품으로쑥을선정하였다. - 31 -

제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절흑마늘및개똥쑥혼합물의생리활성규명 ( 제 1 세부과제 ) 1. 연구개발의목표및주요결과 1) 세부과제목표 흑마늘을주원료로하고, 개똥쑥및천연식물류를첨가함으로서기능성을강화한바이오푸드를개발코져항산화와면역증진기능성을중심으로생리활성을평가하여추출물의최적추출조건및조성물의혼합비율을설정함. 흑마늘과개똥쑥혼합추출물음료의면역기능을강화하기위하여천연식물류추출물을혼합하여복합조성물을제조하고 invitro 상에서항산화활성을측정함으로써복합조성물에대한기능성규명의기초자료를확보함. 개발제품의 invitro 및 invivo 상에서생리활성을규명하고, 동물실험을통한효능의분석및적정섭취량을분석함으로써최종제품의생리활성과안전성확보를위한신뢰성있는기초자료를얻고자함. 2) 주요내용 개똥쑥 (Artemisia annua L.) 의이화학적성분을분석함으로써영양적기능성을확인하고, 생리활성에관한기초연구로서부위별및용매별생리활성에관하여 in vitro에서항산화활성, tyrosinase와 α-glucosidase 저해활성및암세포증식억제활성을통해측정하였음. - 개똥쑥의수분, 조지방및조단백질함량은잎에서높았으나회분, 조섬유및무기물함량은줄기에서유의적으로높았음. 총페놀과플라보노이드함량은잎이줄기에비해약 2배정도높았으며, 라디칼소거능, 환원력및 tyrosinase 저해활성은모든농도에서잎이줄기에비해유의적으로높았으나, α- glucosidase 저해활성은줄기추출물에서활성이더높았음. 인체암세포주 (MCF-7, HeLa 및 AGS) 에대한증식억제활성은잎추출물에서유의적으로활성이높았음. - 개똥쑥의생리활성과관련한유효물질로추정되는페놀화합물을 HPLC로분석 동정한결과 phenolic acid 및 catechin류는줄기에비해잎에서월등히높았으며, flavonoid류는잎에서만동정되었으며, rutin 및 kaempferol은잎의에탄올추출물에서만동정되었음. 개똥쑥물및에탄올추출물의생리활성분석결과에기초하여물과에탄올혼합비를달리한조건에서제조된흑마늘과개똥쑥추출물의생리활성을비교함으로써흑마늘을주원료로한생리활성기능이강화된바이오푸드개발의최적추출조건및조성물의혼합비율을설정하고자함. - 흑마늘을에탄올비율, 추출온도및시간을달리한조건에서추출하여반응표면분석법 - 32 -

(RSM) 을통해생리활성을평가한결과, 최적추출조건은 55.72% 의에탄올농도로 89.6 8 에서 9.79시간추출한경우생리활성이극대화될것으로판단됨. - 개똥쑥의에탄올비율, 추출온도및시간을달리한조건에서추출하여생리활성을반응표면분석법 (RSM) 으로평가한결과, 53.70% 의에탄올농도에서 89.68 에서 8.46시간동안추출한경우생리활성이극대화될것으로예상되었음. 이상의연구결과를통하여아직까지연구가미흡한개똥쑥의부위별활성과성분에대한데이터확보를통하여잎부위의이용도를높일것을제안하며, 제 2협동과제를통한산업화및차년도연구를위한최적의추출및상품제조조건을제시함. 1차년도연구결과를바탕으로트레드밀을이용한강제운동에의해산화적스트레스를유발한흰쥐에서흑마늘과개똥쑥추출혼합물의 in vivo 생리활성을알아보고, 적정섭취량및이를이용한개발제품의활성을분석하였음. 흑마늘의기능성을증대시키고자개똥쑥을첨가하는연구로서기본물질이되는흑마늘의시판제품에대한생리활성을알아보고자남해산마늘을이용하여제조된흑마늘을대상으로생리활성을비교분석함으로써향후개발제품의기능성을일정하게유지시키고자함. - 시판남해산흑마늘 (4제품; A, B, C 및 D) 을이용하여항산화및아질산염소거활성을비교한결과마늘중 total pyruvate 및 thiosulfate 함량은 B제품에서가장높은함량이었음. - 시판흑마늘의항산화활성으로 DPPH, ABTS, hydroxyl 및 nitric oxide 라디칼소거활성을비교한결과 A와 B제품간의항산화활성은비슷한패턴이었음. 트레드밀을이용하여흰쥐를강제운동으로산화적스트레스를유발시켜흑마늘과개똥쑥의추출혼합물을흰쥐에급이시킨후 in vivo에서생리활성의변화를관찰함. 식이조건으로는흑마늘과개똥쑥혼합물 2종 [MBS-Ⅰ; 흑마늘 7 brix+ 개똥쑥 0.7 brix (93:7, v/v), MBS-Ⅱ; 흑마늘 14 brix+ 개똥쑥 1.4 brix (93:7, v/v)] 을사용하였음. 흑마늘추출물 7 brix(bs) 및개똥쑥추출물 0.7 brix(gs) 로총 4군으로구성하였음. - 대조군에비하여흑마늘, 개똥쑥및혼합물급이군에서전반적으로체내지질저하효과가관찰되었는데, 특히, BS군및 GS군보다 MBS군의효과가두드러지게나타났음. 간기능이상유무를나타내는지표로사용되는 AST 및 ALT 활성, 신장기능이상유무를나타내는지표인 ALP의활성과혈중요소질소를측정한결과에서는대조군과실험군간에유의차가없거나오히려실험군이더낮은경향을보였음. - 혈청과간조직의 DPPH 라디칼소거에의한항산화활성, 간조직의항산화효소활성을측정한결과대조군에비해실험군에서유의적으로활성이높았으며, 지질과산화물의함량도이에비례적으로감소되는결과를보였음. 특히 MBS-Ⅱ군이유의적으로항산화활성및항산화효소의활성이높았음. 흑마늘과개똥쑥추출혼합물중효과적인 MBS-Ⅰ을선정하여섭취량을달리하여동일조건에서급이한결과 AST, ALT 활성과혈액및간조직의항산화활성은 MBS-400군이대조 - 33 -

군이나여타실험군에비해그효과가유의적인차이로우수하였음. 체내지질개선의측면에서는 MBS-200군및 MBS-400군이유사한경향을보였음. - Catalase, SOD 및 GSH-Px 등의항산화효소활성도 MBS-400군이여타실험군에비해유의적으로상승되어, 산화적스트레스시 MBS-Ⅰ의효과적인적정섭취량은성인체중 60 kg을기준으로할때 200~400 ml/ 일인것으로추정됨. 흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 을베이스로하여개발된제품의생리활성을비교한결과, 산화적스트레스에대해개발제품을 300 ml/ 일급이하였을때식이효율은대조군과유의차가없었으며, 장기의중량에도유의차를보이지않았음. 혈중지질성분중총지질과총콜레스테롤함량은대조군에비해유의적으로감소시켰으나, 그외지질성분이나간조직의지질개선에는대조군과유의차를보이지않았음. 혈액및간조직의항산화활성, 지질과산화물함량, 간조직중항산화효소의활성은개발제품급이군이대조군에비해유의적으로감소되었음. 흑마늘과개똥쑥추출물의혼합물및개발제품을바탕으로하여기능성이높은활성물질을보완함으로써개발제품의시너지효과를얻고자흑마늘을베이스로한음료개발의자료를탐색함. 수종의천연식물류를첨가하므로써흑마늘음료의맛과향등의기호성증진뿐만아니라항산화및면역활성증대가가능하다고판단됨. 이를위하여문헌조사를통하여생리활성이높은식물류를탐색한결과총 82건의연구보고로부터 100여종의천연식물류를스크리닝하였음. 그중항산화및면역활성테스트에사용빈도수가높은식물류를 11종 ( 구기자, 황금, 오가피, 감국, 산약, 작약, 단삼, 뽕잎, 생강, 상황버섯및옥수수수염 ) 선정하였음. 흑마늘추출물과 5종의천연식물류추출물의혼합 ( 흑마늘복합물 ), 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의혼합에의한생리활성을분석한결과시료의농도가높고개똥쑥이첨가된시료구에서항산화활성이우수하였음. 상기의흑마늘에천연식물류를첨가한복합물의항산화활성및면역증진음료로써의가능성을알아보기위하여강제적인운동부하를간헐적으로수행시킨흰쥐에게급이함으로써체내지질성분의변화및항산화효소활성을분석하였음. 흑마늘복합물은성인기준 1일 1회복용량 (BM1) 과 3회복용량 (BM2) 으로구분하여흰쥐에게급이하였으며, BM2급이군에서지질개선및항산화효소활성이우수하였는데, 간헐적인운동에의한운동강도가낮은것을고려해본다면, 흑마늘복합물개발음료는운동뿐만아니라현대인의일상생활속의스트레스방어에도도움이될것으로예상되며, 흑마늘음료의 1일 3회섭취도가능한것으로평가되었음. - 34 -

2. 재료및방법 1) 실험재료및시료의제조 (1) 실험재료본실험에사용한개똥쑥 (Artemisia annua L.) 은 2009년 7월경경상남도하동군에서재배한것을채취하였으며, 이물질을제거하고그늘에서 15~20일간자연건조한후잎과줄기로구분하여실험에사용하였다 (Fig. 1). 건조된개똥쑥잎과줄기는증류수및 80% 에탄올을가하여 6 0 수욕상에서 12시간씩 2회반복추출한후회전식진공증발농축기로완전건고시켰다. 흑마늘은남해보물섬마늘영농조합법인 ( 제 2협동기관 ) 으로부터제공받았다. (2) 시판흑마늘의생리활성측정용시료의제조경남남해군에서재배된마늘을원료로사용하여남해군에소재한흑마늘가공업체 4곳 (A, B, C 및 D) 에서제조된것을제공받았으며, 남해산생마늘을대조로하여비교분석하였다. 흑마늘과생마늘은껍질을제거한후물및 80% 에탄올로실온에서 12시간씩 3회반복추출한후회전식진공증발기로완전건고시켜실험에사용하였다. (3) 중심합성계획에의한흑마늘과개똥쑥추출물의제조흑마늘은껍질을제거하였으며, 개똥쑥은잎과줄기를 1:3(w/w) 의비율로혼합하여총 20 g 을물과에탄올의혼합비율을달리한용매 200 ml를사용하여추출온도와시간을달리하여 Table 1과같은조건에서추출하였다. Table 1. Central composite design for optimization of ethanol extraction using a response surface methodology Exp No. Temperature ( ) Time (hr) Concentration of ethanol (%) 1 60-1 6-1 25-1 2 60-1 6-1 75 +1 3 60-1 12 +1 25-1 4 60-1 12 +1 75 +1 5 80 +1 6-1 25-1 6 80 +1 6-1 75 +1 7 80 +1 12 +1 25-1 8 80 +1 12 +1 75 +1 9 50-2 9 0 50 0 10 90 +2 9 0 50 0 11 70 0 3-2 50 0 12 70 0 15 +2 50 0 13 70 0 9 0 0-2 14 70 0 9 0 100 +2 15 70 0 9 0 50 0 16 70 0 9 0 50 0 17 70 0 9 0 50 0-35 -

(4) 흑마늘과개똥쑥혼합물의제조흑마늘과개똥쑥의고온열수추출시최적조건은 120 에서 3 시간이었으며, 이조건에서흑마늘과개똥쑥을각각추출하여혼합비율을조절하여생리활성을분석한결과 ( 제1 협동기관 ), 최적의혼합비율로제조된시료를제 1협동기관으로부터제공받았다. 흑마늘복합물과개똥쑥의혼합에따른생리활성변화를알아보기위하여상기의흑마늘복합물 (BM1, BM2) 에개똥쑥추출물 (1년차과제결과에따라 in vitro 생리활성이우수한열수추출물을사용 ) 을각각 0.4% 농도로첨가하여 BM1G, BM2G를제조하였다. WholeplantofA.annua. Dried leavesofa.annua. Dried stemsofa.annua. Fig. 1. Photograph of A. annua. 2) 영양성분분석 (1) 일반성분분석개똥쑥잎과줄기의수분함량은 105 상압가열건조법, 회분은 550 직접회화법, 조지방은 soxhlet 추출법, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법, 조섬유는 AOAC법에따라정량하였다. (2) 무기물정량무기물의분석은분해용플라스크에시료 2 g을취하여진한황산과진한질산을각각 10 ml씩차례로가한다음 hot plate상에서무색으로변할때까지분해하여 100 ml로정용 여과한후 Inductively Coupled Plasma(ICP, Optima 3300DV, Perkin-Elmer Co., NY, USA) 로분석하였다. 3) Total pyruvate 및 thiosulfate의정량분쇄한마늘시료 0.5 g에 10% trichloroacetic acid 5 ml를가하여실온에서 1시간반응시켜여과한여액 1 ml에동량의 0.0125% dinitriphenylhydrazine 을첨가하여 37 에서 10분간반응시켰다. 여기에 0.6 N NaOH용액 5 ml를가하여 420 nm에서흡광도를측정하였으며, sodium pyruvate (Sigma Co., St Louis, MO, USA) 를사용하여얻은표준검량곡선으로부터산출하였다. Thiosulfate는분쇄한마늘 0.1 g에 2 mm의 cysteine이함유된 ph 7.5의 50 mm HEPES [N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethane sulfonic acid] 용액 0.5 ml, 50 mm HEPES를차례로 - 36 -

첨가하여총반응액의부피를 5 ml로한다음 27 에서 10분간반응시켰다. 이를 1 ml 취하여 0.4 mm DTNB[5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)] 용액 1 ml를가하여잘혼합한다음다시 27 에서 10분간반응시켜 412 nm에서흡광도를측정하였다. L-cysteine(Sigma Co., St Louis, MO, USA) 을표준물질로하여작성된표준검량선에따라 thiosulfate 함량을계산하였다. 4) 항산화활성측정 (1) 방향족화합물및갈색도측정시료중의방향족화합물의함량은 280 nm, 갈색도는 420 nm에서분광광도계로각각측정하여흡광도값으로나타내었다. (2) 총페놀및플라보노이드함량측정총페놀함량은시료추출물 1 ml에 Foline-Ciocalteau 시약및 10% Na 2 CO 3 용액을각각 1 ml씩차례로가하여실온에서 1시간반응시킨후 700 nm에서흡광도를측정하였다. 총플라보노이드는시료추출물 1 ml에 10% aluminum nitrate 및 1 M potassium acetate 0.1 ml, ethanol 4.3 ml를차례로가하여혼합하고실온에서 40분간반응시킨다음 415 nm에서흡광도를측정하였다. 개똥쑥추출물의총페놀및플라보노이드함량은표준물질로각각 caffeic acid 및 quercetin(sigma-aldrich Co.) 을이용한검량선에의해계산하였다. (3) 라디칼소거활성측정 DPPH 라디칼소거활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 에대한전자공여활성으로나타내었다. 즉, 일정농도의시료추출물과 DPPH 용액 (5 mg/100 ml methanol) 을동량으로혼합한다음실온에서 20분간반응시킨후 525 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거능은시료첨가구와무첨가구의흡광도비로나타내었다. ABTS[2,2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)] 라디칼소거활성은 7 mm의 ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mm이되도록용해시킨다음암실에서 12~16시간동안반응시킨후 415 nm에서흡광도가 1.5 가되도록증류수로조정한 ABTS 용액 3 ml에추출물 1 ml를가하여실온에서 10분간반응시켜 415 nm에서흡광도를측정하였다. NO(nitric oxide) 라디칼소거활성은추출물 0.5 ml에 5 mm sodium nitroprusside 용액 0.5 ml 및 20 mm phosphate 완충용액 2 ml를혼합한후 2 5 의수욕상에서 150분간반응시켰다. 여기에 griess reagent [2% sulfanilamide- 4% H 3 PO 4 : 0.2% naphthylethylenediamide = 1:1(v/v)] 0.5 ml를가하여 542 nm에서흡광도를측정하였다. 라디칼소거활성은시료무첨가구에대한시료첨가구의흡광도비로계산하였다. Hydroxyl 라디칼소거활성은 1 mm FeSO 4 /EDTA 용액 0.2 ml, 10 mm 2-deoxyribose 0.2 ml, 시료추출물 0.2 ml, 0.1 M phosphate buffer(ph 7.4) 1.2 ml 및 10 mm H 2 O 2 0.2 ml를차례로가하여 37 에서 1시간반응시킨후 2.8% TCA 용액을가하여반응을정지시키고 95 의수욕상에서 10분간가열하여 532 nm에서흡광도를측정하였다. (4) 아질산염소거활성측정아질산염소거활성은 1 mm의 NaNO 2 용액 1 ml에시료추출액 1 ml를가한후 0.2 M - 37 -

citrate buffer (ph 2.5) 을가하여반응용액의총부피를 10 ml로하였다. 이용액을 37 에서 1시간반응시킨다음 1 ml를취하여 2% 초산용액 3 ml 및 Griess 시약 (1% sulfanilic acid: 1% naphthylamine= 1:1) 0.4 ml를가하여 15분간실온에서반응시켜 520 nm에서흡광도를측정하였다. 아질산염소거활성은시료무첨가구의활성에대한백분율 (%) 로계산하였다. (5) 환원력측정시료추출물, 200 mm의 phosphate buffer(ph 6.6) 및 1% potassium ferricyanide 용액을동량씩혼합하여 50 의수욕상에서 20분간반응시킨후 10% TCA 용액 1 ml를가하여반응을정지시키고, 5,000 rpm에서 5분간원심분리하였다. 상징액을 1 ml 취하여증류수및 0.1% ferric chloride 용액을동량으로혼합한후 700 nm에서흡광도를측정하였다. (6) FRAP법에의한항산화활성측정 FRAP(ferric reducing antioxidant power) 법에의한항산화활성은 300 mm acetate buffer (ph 3.6), 40 mm HCl에용해한 10 mm TPTZ 용액및 20 mm FeCl 3 6H 2 O를각각 10:1:1(v/v/v) 의비율로혼합하여 37 의수욕상에서가온한것을 FRAP 기질액으로사용하였다. 시료액 40 μ L, FRAP 기질액 100 μl 및증류수 40 μl를차례로혼합하여 37 에서 4분간반응시켜 593 nm에서흡광도를측정하였으며, FeSO 4 7H 2 O에의한표준검량선으로부터계산하였다. (7) Fe 2+ 킬레이팅활성측정 Fe 2+ 킬레이팅활성은시료추출물 0.2 ml, methanol 0.8 ml, 2 mm FeCl 2 4H 2 O 용액 0.05 ml 및 5 mm ferrozine 용액 0.2 ml를혼합하여실온에서 10분간반응시킨후 562 nm에서흡광도를측정하였다. 추출물의 Fe 2+ 킬레이팅활성은시료무첨가구에대한시료첨가구의흡광도비로나타내었다. 5) Tyrosinase 저해활성측정 Tyrosinase 저해활성은 0.2 M phosphate 완충용액 (ph 6.5) 2.3 ml에 2 mm L-tyrosine 용액 0.4 ml, 시료추출물 0.2 ml 및 tyrosinase(220 unit/ml, Sigma Co.) 0.1 ml를차례로혼합한후 37 o C에서 30분간반응시켜 470 nm에서흡광도 (S OD ) 를측정하고효소액을첨가하지않은실험구의흡광도 (B OD ) 값을뺀값에서무첨가구의흡광도 (C OD ) 에대한저해활성을계산하였다. 6) α-glucosidase 저해활성측정 α-glucosidase 활성저해활성은 2.5 mm ρ-nitrophenyl α-d-glucopyranoside를 0.1 M potassium phosphate buffer(ph 6.8) 에첨가하여반응기질로하고 α-glucosidase와시료추출물을차례로가한후효소액을첨가하여 37 에서 20분간반응시킨후, 0.1 M NaOH 100 μl로반응을정지시켰다. 이때반응생성물인 ρ-nitrophenol을 405 nm에서분광광도계로측정하여 α-glucosidase 활성의저해정도로나타내었다. - 38 -

7) 암세포증식억제활성측정인체암세포에대한시료추출물의증식억제활성은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol)- 2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 방법에따라수행하였으며, 인간암세포주로유방암세포 (MCF-7), 자궁경부상피암세포 (HeLa) 및위암세포 (AGS) 를한국세포주은행 (KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) 에서분양받았다. 10% FBS, penicillin(100 units/ml), streptomycin(50 μg/ml) 를첨가한 RPMI-1640 배지로 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 즉, 세포배양용 96 well plate에세포수를 5 10 4 cells/ml로 100 μl씩분주하여 37, 5% CO 2 incubator에서 24시간동안배양한후, 시료추출물을배지에 62.5, 125, 250 및 500 μg/ml농도로조절하여 100 μl씩접종하였다. 이를 24시간배양한다음 5 mg/ml의 MTT 용액을 10 μl씩첨가하여 4시간동안 37 에서배양하였다. 이때생존하는세포와 MTT와의반응으로생성된 formazan 결정을 dimethyl sulfoxide(dmso) 100 μl에녹여 plate shaker (MX2, FINEPCR, Seoul, Korea) 에서 30분간반응시킨후 ELISA reader로 540 nm에서흡광도를측정하였으며, 시료무첨가구에대한시료첨가구의흡광도비 (%) 로계산하였다. 8) HPLC에의한페놀화합물의분석개똥쑥의물및 80% 에탄올추출물의페놀화합물은 phenolic acid, flavonol 및 catechin류로구분하여 Table 2와같은조건하에서 HPLC에의해표준물질 (Sigma-Aldrich Co.) 을사용하머무름시간의비교로동정한후표준검량선으로부터정량하였다. Table 2. Analytical conditions of HPLC for phenolic acid, flavonol and catechin in A. annua extracts Instrument Detector Items Phenolic acid and flavonol Catechin Agilent 1200 series (Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia) UV-DAD detector (Agilent 1200 series, Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia) Wavelength 270 nm 270 nm Column Mobile phase XTerra TM RP C8 (4.6 250 mm, 5 μm, Waters Co., Milford, MA, USA), 30 A: 0.5% glacial acetic acid, B: methanol 0~10 min : B(15%) 10~20 min : B(15-20%), 20~30 min : B(30-40%), 40~50 min : B(40-60%), 50~55 min : B(60-80%), 55~60 min : B(80-100%) Flow rate 1 ml/min 1 ml/min Injection volume 20 μl 20 μl Agilent 1200 series (Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia) UV-DAD detector (Agilent 1200 series, Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia) TSKgel ODS-100Z (4.6 250 mm, 5 μm, Tosoh Co., Tokyo, Japan), 40 A: 0.5% glacial acetic acid, B: acetonitrile 0~10 min : B(15%) 10~20 min : B(15-20%), 20~25 min : B(20-60%), 25~30 min : B(60-100%) - 39 -

9) 강제운동부하시흑마늘과개똥쑥추출혼합물의 in vivo 생리활성측정 (1) 실험동물의사육및식이조성실험동물은평균체중이 90~110 g인 Sprague-Dawley계 3주령수컷흰쥐를 ( 주 ) 샘타코 (Osan, Korea) 로부터분양받아온도 (22±2 ), 습도 (50±5%) 및명암주기 (12시간, 07:00~19:00) 가자동설정된동물사육실 (DJ1-252-2, Daejong Instrument Industry Co. Ltd., Seoul, Korea) 에서기본식이 (normal diet, AIN-93G) 로 1주간예비사육하여난괴법에의해각군의체중이비슷하도록각그룹당 5~7마리씩나누어 4주간실험사육하였다. 1차적으로흑마늘과개똥쑥의혼합비율에따른활성을알아보고자흑마늘과개똥쑥혼합물 2종 [MBS-Ⅰ; 흑마늘 7 brix+ 개똥쑥 0.7 brix (93:7, v/v), MBS-Ⅱ; 흑마늘 14 brix+ 개똥쑥 1.4 brix (93:7, v/v)] 을사용하였으며, 흑마늘 7 brix(bs) 및개똥쑥 0.7 brix(gs) 와비교하였고, 대조군 (Control) 은시료대신물을급이하였다 (Table 3). Table 3. Diet composition by mixture of black garlic and gaeddongssuk Sample code Composition Control Water BG Black garlic 7 brix GS Gaeddongssuk 0.7 brix MBS-Ⅰ Black garlic (7 brix) 93 : Gaeddongssuk (0.7 brix) 7 MBS-Ⅱ Black garlic (14 brix) 93 : Gaeddongssuk (1.4 brix) 7 2차실험에서는 1차실험의결과, 선정된혼합물의효과적인적정섭취비율을얻기위하여흑마늘과개똥쑥혼합물 (MBS-Ⅰ) 을성인체중 60 kg에대한섭취량으로계산할때 1일 100 ml 섭취군 (MBS-100), 200 ml 섭취군 (MBS-200) 및 400 ml 섭취군 (MBS-400) 으로구분하였다 (Table 4). 시료는매일일정시간에경구투여하였으며, 사육기간동안물과식이는일정량씩공급하여자유급이하도록하였다. 시료는 1일 1회경구투여하였다. Table 4. Diet composition of animal experiment for establishment administration concentration of black garlic and Gaeddongssuk mixture(mbs-Ⅰ) Sample code Control MBS-100 MBS-200 MBS-400 Composition Water Supplementation of 100 ml/day based on adult 60 kg body weight Supplementation of 200 ml/day based on adult 60 kg body weight Supplementation of 400 ml/day based on adult 60 kg body weight - 40 -

3 차실험에서는 1 차및 2 차의실험결과를바탕으로흑마늘과개똥쑥혼합물 (MBS-Ⅰ) 이음 료로써이용하기적절하도록배추출농축액, 결정과당등을배합하여개발제품을제조하여, 이를상기의실험과정과동일한조건에서분석하였다 (Table 5). Table 5. Diet composition for in vivo activity of developed product(mbs-p) from MBS-Ⅰ Sample code Control MBS-p Water Composition 300 ml/day based on adult 60 kg body weight (2) 유산소성강제운동의실시산화적스트레스유발을위한운동프로그램은주 5회일정한시간 ( 오전 10시 ) 에소동물용트레드밀을이용하여유산소성운동부하훈련을 4주간실시하였다. 운동을시작한첫 1주는적응시기로 15 m/min의속도로실시하였으며, 2주째에는주행속도와시간및경사각도를증가시켰으며, 최종적으로 3~4주째에는 15 의경사도에서 25 m/min의속도로 30분씩주 5회실시하였다. 25 m/min의운동강도는 Sprague-Dawley계흰쥐에있어최대산소섭취량의약 70% 에해당하는운동강도로알려져있다 (Dudley GA et al, 1982). 10) 강제운동부하시흑마늘복합물의 in vivo 생리활성측정 (1) 실험동물의사육및식이조성평균체중이 90~100 g의 Sprague-Dawley계 3주령수컷흰쥐를 ( 주 ) 샘타코 (Osan, Korea) 로부터분양받아상기와동일한조건에서사육하여 1주간적응시킨후난괴법에따라각군에 8마리씩 4군으로비운동군 (Control), 운동대조군 (Ex-con), 운동 +BM1 급이군 (Ex-BM1), 운동 +BM2 급이군 (Ex-BM2) 으로구분하였다 (Table 6). Table 6. Experimental groups for in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas Sample code Control Ex-con Ex-BM1 Ex-BM2 Experimental groups Non exercised group with normal diet administration Exercised group by interval training with normal diet administration Exercised group with BM1 supplementation Exercised group and BM2 supplementation (2) 간헐적운동부하조건 간헐적운동부하는 2 일간격으로일정한시간 ( 오전 10 시 ) 에소동물용트레드밀 (Pro-jog - 41 -

EJ36GLE, Korea Hi-Tech, Siheung, Korea) 로 5주간실시하였으며, 운동을시작한 1주에는경사도없이 15 m/min의속도로주행을실시하였으며, 2~5주동안 15 의경사도에서 20 m/min의속도로 1회 20분씩규칙적으로실시하였다. (3) 체중변화, 식이섭취량및식이효율의측정실험사육기간동안식이는매일오후 5시에급여하였고다음날오전 10시경에잔량을조사하여 1일식이섭취량을계산하였으며, 물은수도수를매일신선하게공급하였다. 체중은 1주일에 1회일정시간에측정하였다. 실험사육 4주간의총식이섭취량 (g) 을총실험일수 (day) 로나누어 1일평균식이섭취량을산출하였으며, 식이효율 (food efficiency ratio, FER) 은동일기간내의체중증가량을총식이섭취량으로나누어계산하였다. (4) 실험동물의처리실험최종일에 16시간절식시킨후에테르로가볍게마취하여심장채혈법으로혈액을얻었으며, 약 30분간빙수중에정치한후 3,000 rpm에서 15분간원심분리 (Mega 17R, HANIL, Korea) 하여혈청을얻었다. 간장, 신장, 심장, 지라, 고환및폐등의장기조직은채혈직후적출하여생리식염수로혈액을충분히씻은다음흡수지로물기를제거하고중량을측정하였다. 간조직은지질분석및항산화효소활성측정을위하여적출한직후액체질소로급냉동시킨후 70 에보관하였다. (5) 혈액성분분석혈중당함량, 총단백질, 알부민함량의측정은 Asan kit시약으로각각측정하였다. Globulin 함량은총단백질함량에서알부민함량을뺀값으로계산하였다. 혈중요소질소 (BUN, blood urea nitrogen) 활성도는시판 AM kit(asan, Korea) 시약으로각각측정하였다. (6) 간기능지표효소활성측정간기능측정을위한혈중지표로써혈중 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 및 ALP(alkaline phosphatase) 활성도는시판 AM kit (Asan, Korea) 시약으로각각측정하였다. (7) 혈액지질성분분석혈중총지질 (total lipid) 함량은혈청 20 μl에 phospho-vanillin 시약을첨가하여 37 에서 15분간반응시킨후시료무첨가구를대조로하여 540 nm에서흡광도를측정하여표준검량선에의해산출하였다. 중성지방 (triglyceride), 총콜레스테롤 (total cholesterol) 및 HDL-C(high density lipoprotein cholesterol) 함량은시판 AM kit 시약 (Asan, Korea) 을사용하여각각측정하였다. LDL-C(low density lipoprotein cholesterol) 함량은혈청 total cholesterol-(hdl-c + triglyceride/5) 의계산식에의해산출하였고, VLDL-C(very low density lipoprotein cholesterol) 함량은혈청 total cholesterol-(hdl-c + LDL-C) 의계산식을사용하였다. (8) 간장중의지질성분분석간장중의지질함량은간조직 0.5 g을취하여 chloroform과 methanol 혼합액 (2:1, v/v) 을가하여 Poter-Elvehjem tissue grinder(daihan WOS01010, Korea) 로마쇄하여지질성분을추출 - 42 -

하였다. 이를여과한후일정량을취하여건고시킨다음총지질, 총콜레스테롤및중성지방함량분석을위한시료로사용하였으며, 상기의 kit시약으로분석하였다. (9) 혈청및간조직의항산화활성측정혈청의항산화활성은혈청 100μL에 tris-hcl buffer(100 mm, ph 7.4) 1 ml를가하여혼합한다음 0.5 mm DPPH 용액을가한후 37 의암실에서 15분동안반응시켰다. 여기에 chloroform 2 ml를가하여 3,000 rpm에서 10분간원심분리시켜하층부의 chloroform을취하여 517 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 이때항산화활성은시료첨가구와무첨가구의흡광도비로나타내었다. 간조직의항산화활성은간조직 1 g을 1.5% KCl 용액으로 10% 균질액을제조한후이를 100 μl 취하여상기와동일한방법에따라측정하였다. (10) 혈청및간조직의지질과산화물함량측정혈청중지질과산화물함량은혈청 100 μl에 1/12 N 황산용액과 10% phosphotungstic acid 를혼합하고 4,000 rpm에서 10분간원심분리시킨다음침전물에증류수및 thiobarbituric acid(tba) 시약을각각 1 ml씩가하여 95 수욕상에서 1시간동안반응시킨후생성된지질과산화물을 butanol에이행시켜 532 nm에서흡광도를측정하였다. 간조직의지질과산화물함량은간조직 1 g에 1.5% KCl 용액을가하여 10% 균질액으로만든다음, 이를 0.5 ml를취하여 3 ml의 1% phosphoric acid 및 1 ml의 0.6% TBA를넣어잘혼합하였다. 이것을 95 수욕상에서 45분간반응시킨후 butanol를가하여발색물질을추출한다음흡광도 (OD 535-520 ) 를측정하였다. 지질과산화물함량은 1,1,3,3-tetraethoxypropane(TEP) 을이용하여작성한검량선으로부터산출하였다. (11) 간조직의항산화효소원제조간조직중항산화효소활성을측정하기위한전처리과정으로액체질소로급냉동된간조직 2 g은 ice bath상에서 0.25 M sucrose와 0.5 nm EDTA를포함하는 50 mm 인산완충용액 (ph 7.4) 10 ml를가하여 Poter-Elvehjem tissue grinder로마쇄한후 10%(w/v) 균질액을만들어 centrifuge(mega 17R, Hanil Science Industrial Co., Ltd., Inchun, Korea) 및 ultracentrifuge (Optima TM XL-100K, Beckman, Fullerton, CA, USA) 를이용하여효소원 (mitochondria, cytosol 및 microsome 분획 ) 을분리하였다. 분리한 mitochondria와 microsome 분획물은 catalase 활성측정, SOD(superoxide dismutase) 및 glutathione peroxidase(gsh-px) 의활성은 cytosol 분획물로측정하였다. (12) 항산화효소활성측정 Catalase 활성은 0.1 ml의간효소원, 기질인 10.5 mm H 2 O 2 0.1 ml및 50 mm potassium phosphate buffer(ph 7.0) 2.89 ml를혼합하여총부피가 3 ml가되도록하였다. 이를 25 의수욕상에서 5분동안반응시켰으며, 240 nm에서 H 2 O 2 의흡광도변화로효소활성을측정하였고, 효소활성은 1분간 1 μm H 2 O 2 를분해시키는데요구되는효소량 (μmol/min/mg protein) 으로나타내었다. SOD 활성은추출한시료액 0.05 ml에 Tris-HCl buffer(50 mm Tris+10 mm EDTA, ph 8.6) - 43 -

1.4 ml와 15 mm pyrogallol 0.05 ml를첨가하여 25 에서 10분동안반응시킨후 0.05 ml의 1 N HCl을첨가하여반응을정지시킨다음반응용액중산화된 pyrogallol의양을 420 nm에서흡광도를측정하였다. SOD 유사활성은효소원을넣지않고반응시킨 15 mm pyrogallol 용액의자동산화를 50% 억제하는효소활성 (U/min/mg protein) 으로나타내었다. GSH-px 활성은 1 mm EDTA를함유한 100 mm phosphate buffer(ph 7.0) 2.5 ml에 3 mm GSH, 20 mm NaN 3, GSSH reductase 0.72 U, NADPH 0.45 mm과조효소용액 0.04 ml를넣어 37 에서 5분간반응시킨후 0.45 mm H 2 O 2 를가하여 340 nm에서 1 분동안감소하는흡광도를측정하였으며, 비효소적반응은상기의조건에서 0.45 mm H 2 O 2 를가하지않고반응시켜흡광도를측정하였다. 효소의활성도는비효소적반응에의해변화되는흡광도를감한값으로계산하였다. 11) 통계처리반복실험하여얻은결과는 SPSS 12.0 package를사용하여분산분석하였으며, 결과는평균 ± 표준편차로나타내었다. 각시료의분석결과에대한유의성검정은분산분석을한후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를실시하였다. - 44 -

3. 결과및고찰 1) 개똥쑥의생리활성분석및유효물질의규명 (1) 개똥쑥의영양성분개똥쑥잎과줄기의영양성분을분석한결과는 Table 7과같다. 수분, 조지방및조단백질함량은잎에서, 회분과조섬유는줄기에서유의적으로높은함량이었다. 조단백질은잎이줄기에비해약 2배정도높았다. 개똥쑥을꽃, 잎, 줄기및뿌리로구분하여일반성분을분석한보고 (Brisibe EA et al, 2009) 에서수분, 회분및조단백질함량은잎에서가장높았으며, 특히조지방은잎이줄기에비해약 3.2배정도높아본실험결과와비슷한경향이었으나, 회분함량은줄기에비해잎에서약 3 배정도높게측정되어본실험과는다소상반된경향이었다. Lee와 Park(2001) 은참쑥과강화약쑥에서회분함량이 9.4~11.8%, 조지방은 4.3~6.2%, 조단백질은 14.2~16.4%, 조섬유는 13.7~19.9% 로쑥의일반적인영양성분중조섬유의함량이대체로높은비율을차지하는것으로보고하여본실험과도일치하였다. 또한 Brisibe EA et al(2009) 은개똥쑥의부위별섬유소함량을분석한결과줄기및뿌리는잎과꽃보다섬유소함량이높으며, 특히소화성섬유소의비율이높아가축의사료로써이용가치가있는것으로보고한바있다. Table 7. Nutritional composition of A. annua (%, dry basis) Used part Moisture Ash Crude lipid Crude protein Crude fiber Leaves 12.53±0.59 *1) 11.23±0.13 11.23±0.22 * 9.36±0.12 * 23.31±1.49 Stems 10.27±0.13 13.31±0.18 * 6.80±0.63 4.71±0.13 30.18±1.16 * 1) Each value represents mean±sd, n=3 * This superscripts are significantly different among the different sample by Student t-test at p<0.05. (2) 무기물개똥쑥잎과줄기의무기물함량은 Table 8과같으며, 잎에서 9종, 줄기에서 6종의무기물이검출되었다. 무기물총량은잎이 4,476.21 mg%, 줄기는 5,235.09 mg% 로줄기가잎에비해약 1.2배정도높았는데, 이같은데이터는칼륨이잎 (2,910.38 mg%) 에비해줄기 (4,274.30 mg%) 에서약 1.5배정도높게정량된결과때문이라판단된다. 그외모든무기물은모두잎에서높은함량을보였으며, 영양학적으로중요시되는칼슘은잎과줄기에서각각 588.44 mg%, 390.24 mg% 로무기물총량의 13.15% 및 7.45% 를차지하였다. 개똥쑥중 12종의무기물을분석한보고에서잎이줄기보다무기물함량이높았으며 (Brisibe EA et al, 2009), 이는본실험과다소상이한결과로가장많은비율을차지한칼륨의함량이 - 45 -

본실험결과줄기에서상당히높게정량되었기때문인것으로사료된다. Table 8. Mineral contents of A. annua Mineral Leaves Stems Contents (mg%) (%) 1) Contents (mg%) (%) K 2,910.38±52.59 2) 65.02 4,274.30±131.42 81.65 Ca 588.44±10.36 13.15 390.24±7.66 7.45 Mg 241.71±6.52 5.40 104.08±3.66 1.99 Na 83.14±3.53 1.86 51.77±2.81 0.99 Fe 95.47±1.48 2.13 ND 3) Mn 0.39±0.12 0.01 ND Al 107.10±2.77 2.39 ND P 447.44±5.55 9.99 413.17±4.59 7.89 Se 2.14±2.22 0.05 1.53±1.51 0.03 Total 4,476.21±85.14 5,235.09±151.65 * 1) Ratio to the total mineral contents 2) Each value represents mean±sd, n=3 3) ND: not detected * This superscripts are significantly different among the different sample by Student t-test at p<0.05. (3) 방향족화합물함량및갈색도개똥쑥을물및에탄올로추출하였을때, 추출수율은잎이각각 7.94% 와 15.00%, 줄기는 23.01% 와 27.69% 로줄기에서높았으며, 물보다에탄올추출시수율이더높았다. 개똥쑥잎과줄기추출물의방향족화합물함량 (at 280 nm) 및갈색도 (at 420 nm) 를측정한결과는 Fig. 2와같다. 각추출물을 500 μg/ml농도로하여 280 nm에서흡광도를측정한결과, 잎에탄올추출물이 1.17로가장높았으며, 그외추출물에서는 0.37~0.54의범위였다. 420 nm에서도이와유사한경향으로잎에탄올추출물에서 2.13으로가장높았으며, 그외추출물에서는 1.00 이하의흡광도값이었다. 본실험에서잎에탄올추출물의흡광도값이유의적으로높았으며줄기에탄올추출물에서가장낮아항산화능도이와같은경향일것으로예상되나, 쑥과솔잎의열수및 70% 아세톤추출물은 280 nm에서갈색도와전자공여능의관계가역상관관계인것으로보고된바있으므로 (Kang YH et al, 1995) 시료중의방향족화합물의함량이나갈색도가항산화능과일치하지는않을것으로생각된다. - 46 -

Fig. 2. Aromatic compounds index and browning intensity of A. annua extracts. Each value represents mean±sd, n=3. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (4) 총페놀및플라보노이드함량개똥쑥잎과줄기추출물의총페놀및플라보노이드함량을측정한결과는 Fig. 3과같다. 총페놀함량은잎의물및에탄올추출물에서각각 88.19 mg/g과 99.98 mg/g이었으며, 줄기에서는각각 45.03 mg/g, 41.44 mg/g으로줄기에비해잎에서약 2배정도높은함량이었다. 플라보노이드함량은총페놀함량과유사한경향으로잎의에탄올추출물에서 51.86 mg/g으로가장높았으며, 줄기에탄올추출물에서는 18.55 mg/g이었다. 개똥쑥의총페놀및플라보노이드함량은잎의경우에탄올추출물이유의적으로높았으나, 줄기는물추출물에서다소높았다. 120 100 C D Water ex. Ethanol ex. mg/g, dried extracts 80 60 40 20 B A C D B A 0 Leaves Stems Leaves Stems Phenols Flavonoids Fig. 3. Phenols and flavonoids contents of A. annua extracts. A-D Means with different superscript in the same item are significantly different at p<0.05. - 47 -

Choi SR et al(2008) 은사철쑥의잎, 종실및줄기에서총페놀함량을측정한결과, 잎 > 종실 > 줄기의순으로많았으며, 개똥쑥의부위별총페놀함량은꽃대에서가장높았고뿌리에서가장낮았으나, 잎은줄기에비해약 2.7배높은함량을보여 (Brisibe EA et al, 2009) 본실험결과와유사한경향이었다. (5) 라디칼소거능개똥쑥추출물을 125, 250, 500, 1,000 및 2,000 μg/ml의농도에서 DPPH 라디칼소거능을측정한결과는 Table 9와같다. 반응액에첨가된시료의농도가증가됨에따라소거능은유의적으로상승하였다. 잎의물추출물 (LW) 및에탄올추출물 (LE) 은줄기추출물 (SW, SE) 에비해모든농도에서높은소거능을보였으며, 잎추출물은 250 μg/ml 농도에서 60% 이상이었고, 줄기추출물은 1,000 μg/ml 농도에서 50% 이상의소거능을보였다. 특히, 개똥쑥잎에탄올추출물 (LE) 의 IC 50 값은 147.15 μg/ml로 DPPH 라디칼소거능이가장높았으며줄기에탄올추출물이 776.92 μg/ml로소거능이가장낮았다. Table 9. DPPH radical scavenging activity of A. annua extracts (%) Sample code 1) Concentration (μg/ml) 125 250 500 1,000 2,000 IC 50 values (μg/ml) LW 44.00±2.45 ac2) 63.03±1.64 bc 86.28±0.70 cb 88.81±0.53 dc 92.52±1.95 ed 170.91±4.27 LE 45.68±0.73 ac 69.98±1.88 bd 87.77±1.71 cb 87.71±1.99 cc 87.41±2.53 cc 147.15±2.23 SW 22.70±1.92 ab 22.65±3.72 aa 44.08±5.18 ba 60.13±0.92 cb 74.59±2.31 da 585.98±10.97 SE 19.39±3.06 aa 25.92±0.79 bb 41.77±2.55 ca 57.13±1.17 da 77.78±1.37 eb 776.92±12.95 1) LW: water extract from leaves of A. annua, LE: ethanol extract from leaves of A. annua, SW: water extract from stems of A. annua, SE: ethanol extract from stems of A. annua 2) Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. Choi SR et al(2008) 은사철쑥잎, 종실및줄기추출물의 DPPH 라디칼소거능을비교한결과잎추출물이종실및줄기추출물보다높은소거능을보였는데, 잎추출물에서페놀함량이높았기때문이라고추정한바있다. 이러한결과는약쑥의용매별분획물중페놀및플라보노이드함량이높았던 ethyl acetate 분획물이여타분획물에비해항산화능및지질과산화억제능이높았다는보고 (Hong JH et al, 2007) 와도잘일치한결과였다. 또한쑥의물및에탄올추출물의전자공여능이에탄올추출물에서더우수하였다는보고 (Park CS et al, 2002) 는본실험 - 48 -

과도잘일치한결과였다. 개똥쑥추출물의 ABTS 라디칼소거활성측정결과는 Table 10과같다. ABTS 라디칼소거활성은첨가된시료의농도가증가됨에따라유의적으로상승하였다. 개똥쑥잎의물추출물 (LW) 및에탄올추출물 (LE) 은개똥쑥줄기의물추출물 (SW) 및에탄올추출물 (SE) 에비해모든농도에서유의적으로높은소거활성을나타내었으며, 2,000 μg/ml 농도에서는 LW, LE 및 SW 간에유의차를보이지않아활성이유사한것으로보였다. 반면에, IC 50 값을비교할경우잎에탄올추출물 (LE) 은줄기물추출물 (SW) 에비해약 66.8% 정도로라디칼소거활성이높았다. NO 라디칼소거활성은 Table 11에나타낸바와같이추출물의첨가농도에따라증가하는경향이었으나, 줄기물추출물 (SW) 은 125 μg/ml농도에서 LW 및 LE에비해유의차를보이지않았으며, 250~500 μg/ml 농도에서는유의적으로높은소거활성을보였다. 또한 1,000~2,000 μg/ml농도에서는 LE와활성이유사하였다. Choi YM et al(2006) 은여러종류의쑥으로부터 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성을측정한결과총페놀및플라보노이드함량이많은시료에서소거활성이높았다고보고하였다. ABTS 라디칼소거활성은 DPPH 라디칼소거활성과상관성이높으며그유효물질이페놀화합물에연유된다는보고 (Choi YM et al, 2003) 로볼때, 본실험결과의라디칼소거활성도총페놀및플라보노이드함량에의존적일것으로판단된다. 또한서로다른라디칼을이용한항산화활성의측정에서소거활성의차이는시료의산화환원및라디칼의화학구조적차이에의한것으로알려져있는데 (Gardner PT et al, 1998), 개똥쑥추출물의 NO 라디칼소거활성은 ABTS 라디칼소거활성과유사한기작에의해서일어나며, 활성의차이는반응기질의조건이나라디칼의종류에기인하는것으로생각된다. Table 10. ABTS radical scavenging activity of A. annua extracts (%) Sample code 1) Concentration (μg/ml) 125 250 500 1,000 2,000 IC 50 values (μg/ml) LW 36.32±2.59 ac2) 55.69±1.71 bc 83.83±1.91 cc 96.83±1.18 dd 97.71±1.06 db 224.41±1.73 LE 38.20±2.60 ac 64.62±0.79 bd 84.44±1.22 cc 92.72±1.13 dc 95.97±1.91 eb 179.25±3.49 SW 25.33±1.62 ab 30.12±1.31 bb 47.84±1.59 cb 66.28±1.80 db 96.30±1.76 eb 540.61±10.55 SE 16.60±2.50 aa 25.83±3.51 ba 32.91±1.96 ca 50.91±0.53 da 74.02±3.80 ea 974.40±9.98 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. IC 50 values were defined as the concentration which inhibits 50% of biological activity. - 49 -

Table 11. NO radical scavenging activity in of A. annua extracts (%) Sample code 1) Concentration (μg/ml) 125 250 500 1,000 2,000 IC 50 values (μg/ml) LW 25.91±1.74 ab2) 31.85±1.15 bb 33.27±1.96 bb 38.57±1.24 cb 48.27±1.02 db 2,000 < 3) LE 26.42±1.76 ab 28.22±1.06 aa 30.85±0.86 bb 40.65±1.29 cbc 50.54±1.18 dc 1937.56±16.44 SW 28.74±1.30 ab 37.10±0.85 bc 39.31±0.75 cc 42.58±0.48 dc 49.95±1.27 ebc 2,000 < SE 22.76±1.68 aa 27.19±0.63 ba 27.02±1.83 ba 29.46±1.78 ba 33.50±0.68 ca 2,000 < 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. 3) 50% inhibition was not appeared at concentrations(125~2,000 μg/ml) of A. annua extracts. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (6) 환원력개똥쑥의잎과줄기추출물의환원력은 Fig. 4와같이모든시료에서농도의존적으로환원력이증가하였다. 잎은줄기에비해흡광도값이 2배이상높게측정되었는데, 흡광도값이 0.5에이르는추출물의농도는잎에탄올추출물에서 284.60 μg/ml, 물추출물에서 355.00 μg/ml이었으며, 줄기추출물은 1,000 μg/ml이상으로 LE > LW > SE > SW의순으로환원력이높았다. Abs at 700 nm 2.5 2 1.5 1 0.5 0 LW 1) LE SW SE ad2) ac aa aa bd bc ba ba cc cb 0 125 250 500 1,000 2,000 ca ca dc db da da ec eb ea ea 1) Refer to the comment in Table 5. 2) Each value represents mean±sd, n=3. Concentration (μg/ml) Fig. 4. Reducing power of A. annua extracts. a-e Means with different superscripts in the same extract are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same concentration are significantly different at p<0.05. - 50 -

시료의환원력은전자공여를통한라디칼의소거능과관련성이높기때문에 DPPH 라디칼 소거능이높은시료가환원력도높으며 (Gordon MF, 1990), 이또한시료중의페놀화합물의 함량에의존적이라고알려져있다 (Tabart J et al, 2009). (7) FRAP법에의한항산화활성개똥쑥추출물의 FRAP 측정결과를 FeSO 4 당량으로나타낸결과는 Table 12와같다. 첨가된추출물의농도에의존적으로활성이유의적으로증가하였으나, 잎에탄올추출물 (LE) 의경우에는 1000~2000 μg/ml의농도에서 133.58~136.96 μm로유의차를보이지않았다. 1000 μg/ml 이상의농도에서 FRAP 활성은줄기물추출물 (SW) 이유의적으로가장높았고, 다음으로잎에탄올추출물 (LE) 이었으나, 그차이가작아 LE는 SW와 FRAP 활성이비슷한것으로여겨진다. FRAP법에의한항산화활성은산화반응의촉매제로작용하는금속이온을환원시키는효력을의미하는데, 시료의환원력은전자공여를통한라디칼의소거활성과도관련이높으며 (Gordon MF, 1990), 시료중에함유된페놀화합물의함량에대한의존도가높은것으로보고되어있다 (Tabart J et al, 2009). 또한 Lee HR et al(2008) 은시판포도주스에서총페놀함량과 FRAP법에의한항산화활성과의상관계수가 0.97이상으로총페놀함량이많을수록항산화활성이높다고보고한바있는데, 비름과식물류추출물의경우에는총페놀함량과 FRAP법에의한항산화활성과의상관관계가 0.48, DPPH 라디칼소거활성과의상관관계는 0.20으로총페놀함량과항산화활성과의관련성이낮다는보고 (Nsimba RY et al, 2008) 도있다. 이러한결과는시료의총페놀함량이높더라도 ascorbic acid, phytic acid, sterol, saponin, carotenoid 등의비페놀성물질이항산화활성의주된물질로작용되기때문이라고보고되어있는데 (Nsimba RY et al, 2008), 본실험결과도이와관련성이있을것으로추정된다. Table 12. Ferric reducing antioxidant power of A. annua extracts (FeSO 4 eq μm) Sample Concentration (μg/ml) IC 50 values code 1) 125 250 500 1,000 2,000 (μg/ml) LW 16.87±0.37 aa2) 24.90±0.15 ba 37.09±0.17 ca 54.53±0.71 da 71.73±8.68 ea 2,000 < 3) LE 34.88±0.91 ac 58.51±1.08 bc 99.64±0.83 cd 133.58±0.66 dc 136.96±0.50 dc 1937.56±16.44 SW 35.31±1.63 ac 58.84±2.19 bc 92.88±1.05 cc 136.48±0.71 dd 143.59±1.41 ed 2,000 < SE 19.40±0.19 ab 30.20±0.10 bb 49.87±28.09 cb 78.76±0.74 db 124.06±0.96 eb 2,000 < 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. - 51 -

(8) Fe +2 킬레이팅활성체내세포에서지질및단백질의산화를촉진하는 Fe +2 과같은금속이온인자에대하여개똥쑥추출물의킬레이팅활성을측정한결과는 Table 13과같다. 모든시료에서추출물의첨가농도에의존적으로활성이증가하였으며, 잎과줄기의물추출물은에탄올추출물에비해월등히높았는데, IC 50 값은잎물추출물 (LW) 에서 265.98 μg/ml, 줄기물추출물 (SW) 에서 785.60 μ g/ml이었으나, 잎과줄기의에탄올추출물 (LE, SE) 은 1,000 μg/ml이상으로물추출물에서 Fe +2 킬레이팅활성이다소높았다. 항산화성물질에의한 Fe +2 킬레이팅활성은활성산소종의생성을억제하여세포의산화적손상을막고, 지질과산화물의생성에촉매역할을하는전이금속의농도를낮추므로금속이온의킬레이팅활성은중요한항산화기작으로알려져있는데 (Duh PD et al, 1999), 이는금속이온을제거하는물질과라디칼을소거하는물질이다르며, 유리라디칼을소거할수있는페놀화합물의함량은높으나, 금속이온을포집할수있는물질의함량이낮기때문이라고추정된바있다 (Woo JH et al, 2010). 이는본연구결과에서개똥쑥추출물의 ABTS 및 NO 라디칼소거활성이여타추출물에비해높은반면, Fe +2 킬레이팅활성이낮았던점과유사한결과라사료된다. Table 13. Fe +2 Sample code 1) chelating activity of A. annua extracts Concentration (μg/ml) 125 250 500 1,000 2,000 (%) IC 50 values (μg/ml) LW 20.45±1.10 ac)2) 55.32±0.10 bd 87.44±0.46 cc 96.29±0.78 dd 98.73±0.49 ed 265.98±1.57 LE 0.27±0.00 aa 4.00±0.08 ba 8.65±0.92 ca 28.99±1.42 db 52.47±0.92 ea 1868.45±39.29 SW 11.20±2.21 ab 34.88±1.33 bc 46.37±0.76 cb 61.32±0.57 dc 94.21±1.07 ec 785.60±15.10 SE 2.30±0.69 aa 9.01±2.01 bb 9.31±1.85 ba 20.35±0.09 ca 82.52±1.37 db 1382.45±10.55 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (9) Tyrosinase 저해활성개똥쑥의미백효과를간접적으로측정하기위한일환으로개똥쑥추출물의 tyrosinase 저해활성을측정한결과는 Fig. 5와같다. 개똥쑥의부위별에탄올추출물 (LE, SE) 은물추출물 (LW, SW) 에비해높은저해활성을보여 2000 μg/ml 농도에서각각 71.30% 와 61.76% 이었으나, 물추출물의활성은 50% 미만에불과하였다. IC 50 값은잎과줄기에탄올추출물에서각각 338.17-52 -

μg/ml 및 448.36 μg/ml이었으며, 물추출물은 2000 μg/ml 이상이었다. 생쑥은건조쑥에비해 tyrosinase 저해활성이높았으며, 생쑥의 hexane 및 chloroform 분획물은 10,000 μg/ml 농도에서각각 96.7% 와 98.9% 의저해활성을보였다는보고가있다 (Kwak JH et al, 2001). Hyun SH et al(2007) 은비쑥 70% 메탄올추출물의 tyrosinase 저해활성을측정한결과 10,000 μg/ml 농도에서 33.40% 의활성을보였다고보고하였다. 80 LW 1) dd Inhibition activity (%) 60 40 20 LE SW SE ad2) ac ab bd bc bb bc cc cb ca cb cd cc db db dc eb ec aa 0 0 125 250 500 1,000 2,000 Concentration (μg/ml) Fig. 5. Tyrosinase inhibition activity of A. annua extracts. 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same extract are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same concentration are significantly different at p<0.05. (10) α-glucosidase 저해활성개똥쑥잎과줄기의 α-glucosidase 저해활성은 Fig. 6에나타낸바와같이농도의존적으로저해활성이증가하였다. 줄기에탄올추출물 (SE) 은모든실험농도에서 56.25~86.49% 의범위로가장활성이높았고, 다음으로줄기물추출물 (SW) 이 43.00~84.13% 의저해활성을보여항산화능및 tyrosinase 저해활성의결과와는달리줄기추출물이잎추출물에비해유의적으로높은활성을나타내어 IC 50 값은줄기물추출물이 220.56 μg/ml이었으며, 줄기에탄올추출물은 125 μg/ml 미만에서도 50% 이상의저해활성을보였다. 따라서개똥쑥줄기추출물은탄수화물의소화과정에서 α-glucosidase에의한단당류생성을저해함으로서식후혈당이급격히상승하는작용을효과적으로감소시킬수있을것으로예측된다. 식물류의페놀및플라보노이드물질은구조적특징에따라항당뇨활성에차이를보이는것으로알려져있다 (Sharma B et al, 2008). 더욱이당뇨쥐에게쑥추출물을급이함으로서나타난혈당강하와체중감소저해효과는시료에의해말초조직에서당이용성이증가되었기때 - 53 -

문으로보고된바있는데 (Tastekin D et al, 2006), 본실험결과개똥쑥의 α-glucosidase 저해활 성은생체내항당뇨활성에도유효할것으로예상되며, 이는개똥쑥줄기에함유된섬유소의 함량과도관련성이높을것으로생각된다. Inhibition activity (%) 100 80 60 40 20 LW 1) LE SW SE ad2) ac ab aa bd bc bb aa cb cb ba ba dd dd cb ca eb eb da da 0 0 125 250 500 1,000 2,000 Concentration (μg/ml) Fig. 6. α-glucosidase inhibition activity of A. annua extracts. 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same extract are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same concentration are significantly different at p<0.05. (11) 암세포증식억제활성개똥쑥물및에탄올추출물의암세포증식억제활성을알아보기위하여유방암세포 (MCF-7), 자궁경부상피암세포 (HeLa) 및위암세포 (AGS) 를이용하여 MTT assay를하였으며, 추출물을첨가하지않은대조구에대한개똥쑥추출물이암세포의증식에미치는영향을 Table 14, 15 및 16에나타내었다. 또한대조군과실험군의암세포모양변화를관찰하기위하여위상차현미경으로세포의형태학적변화를관찰하였다. 1 MCF-7 cell에대한증식억제활성개똥쑥잎과줄기추출물이인체유방암세포인 MCF-7의증식억제미치는영향을알아보기위하여추출물의농도를 62.5, 125, 250 및 500 μg/ml로달리하여 MTT assay를하였다 (Table 14). 개똥쑥의 MCF-7 세포에대한증식억제활성은추출물의첨가농도가증가함에따라유의적으로상승하였으며, 250 μg/ml 농도에서잎에탄올추출물 (LE) 은 70% 이상, 줄기에탄올추출물은 51.97% 의활성을보였는데, 500 μg/ml 농도에서는잎과줄기에탄올추출물모두 70% 이상의활성을보였다. 반면에물추출물은 500 μg/ml 농도에서도 50% 미만의활성이었으며, 잎과줄기추출물간에유의적인차이가없었다. - 54 -

Table 14. Growth inhibition rates of A. annua extracts on MCF-7 human breast adenocarcinoma cell (%) Sample Concentration (μg/ml) IC 50 values code 1) 62.5 125 250 500 (μg/ml) LW 24.65±2.76 aa2) 27.26±2.73 aa 47.07±2.78 bb 49.00±0.17 ba 453.35±8.68 LE 26.92±0.73 aa 30.20±4.91 aa 76.26±1.48 bd 76.44±0.03 bc 209.12±0.50 SW 20.36±5.32 aa 28.18±2.91 ba 38.83±1.46 ca 49.09±0.14 da 500 < 3) SE 25.05±2.85 aa 43.24±1.14 bb 51.97±0.93 cc 72.68±0.30 db 256.68±5.90 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. 3) 50% inhibition was not appeared at concentrations(62.5~500 μg/ml) of A. annua extracts. a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. 2 HeLa cell에대한증식억제활성인체자궁경부상피암세포인 HeLa에대한증식억제활성은 Table 15와같이첨가된시료의농도가증가됨에따라활성이유의적으로증가하였다. 개똥쑥의부위별에탄올추출물 (LE, SE) 은물추출물 (LW, SW) 에비해모든농도에서증식억제활성이높았으며, 잎에탄올추출물 (LE) 은 250 μg/ml 농도에서 50% 이상의활성을보였고 500 μg/ml 농도에서는 60% 이상의활성을보였으나, 여타추출물의활성은 500 μg/ml에서도 50% 미만이었다. IC 50 값은잎에탄올추출물 (233.64 μg/ml) 을제외한나머지추출물에서 500 μg/ml 이상으로확인되었다. 3 AGS cell에대한증식억제활성인체위암세포인 AGS에대한증식억제활성은 Table 16와같다. 시료의첨가농도에증가할수록활성은유의적으로상승하였으며, 개똥쑥부위별에탄올추출물 (LE, SE) 은물추출물 (LW, SW) 에비해높은증식억제활성을보였다. 특히, 잎에탄올추출물 (LE) 은모든농도에서활성이가장높아 IC 50 값이 368.00 μg/ml인반면, 여타추출물은 500 μg/ml 이상이었다. Jung MJ et al(2008) 은인진쑥메탄올추출물이 300 μg/ml 농도에서인체위암세포 NCI-N87 및결장암세포 HT-29에대하여각각 67.15% 와 48.72% 의증식억제활성을보였으며, 항암제인 paclitaxel(5 μg/ml) 은 37.96% 및 68.02% 의억제활성보였다고보고하였다. Xu Q et al(1989) 은쑥의수용성추출물이종양괴사인자를활성화시킨다고하였으며, 이러한효과는시료중에함유된페놀화합물에의한것으로보고된바있다. Singh와 Lai(2001) 는개똥쑥의 artemisinin이유방암세포를선택적으로괴사시킨다고하였다. - 55 -

Table 15. Growth inhibition rates of A. annua extracts on HeLa human cervix epitheloid carcinoma cell (%) Sample Concentration (μg/ml) IC 50 values code 1) 62.5 125 250 500 (μg/ml) LW 31.07±0.95 aa2) 36.48±0.47 bb 41.57±1.06 cb 44.37±0.42 db 500 < 3) LE 37.10±4.02 ab 49.71±1.04 bd 54.59±1.61 cd 61.07±1.38 dd 233.64±6.69 SW 28.64±1.00 aa 31.85±0.02 ba 33.78±0.84 ca 40.66±0.54 da 500 < SE 31.57±0.82 aa 41.75±0.57 bc 44.06±1.13 cc 49.22±0.94 dc 500 < 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. 3) 50% inhibition was not appeared at concentrations(62.5~500 μg/ml) of A. annua extracts. a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. Table 16. Growth inhibition rates of A. annua extracts on AGS human stomach adenocarcinoma cell (%) Sample Concentration (μg/ml) IC 50 values code 1) 62.5 125 250 500 (μg/ml) LW 14.00±0.67 aa2) 23.19±3.75 bb 29.10±0.54 cb 35.10±1.84 da 500 < 3) LE 27.76±1.12 ab 38.74±0.60 bc 43.52±1.19 cc 57.24±0.40 dc 368.00±2.60 SW 13.93±2.38 aa 16.72±0.57 ba 24.11±1.59 ca 33.58±3.54 ca 500 < SE 13.14±0.81 aa 22.29±1.92 bb 27.85±1.29 cb 41.75±0.57 db 500 < 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Each value represents mean±sd, n=3. 3) 50% inhibition was not appeared at concentrations(62.5~500 μg/ml) of A. annua extracts. a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. 또한쑥의물및에탄올추출물은 500 μg/ml 의농도에서인체폐암세포인 A549 에대해 22% 및 22.5%, 유방암세포인 MDA 에서는 30% 및 27% 로물추출물에서증식억제활성이다소 - 56 -

높은것으로보고되어있다 (Park CS & Kim ML, 2006). 본실험결과와는다소상이한경향이었는데, 이는시료의종류에따른차이로해석된다. 본연구에서도개똥쑥추출물이암세포증식억제효과가높게나타나는것으로보아비록암세포주의종류는다르나국화과식물이인체암세포주에강한활성이있는것으로추정된다. (12) 암세포의형태학적변화개똥쑥잎과줄기추출물중암세포증식억제활성이가장높게나타난잎에탄올추출물 (LE) 을 MCF-7, HeLa 및 AGS 세포에 125 및 500 μg/ml농도로처리한후 48시간동안배양하여광학현미경으로관찰한결과는 Fig. 7, 8 및 9와같다. 무처리군의암세포는배양용기에안정적으로부착되어조밀하게중첩되어증식이이루어진모습이었다. 반면, 개똥쑥잎에탄올추출물 (LE) 을첨가하였을경우세포의결속력이감소되어일정한모양을잃고세포가배양용기에서떨어져배지에부유하는것을관찰할수있었다. 또한무처리군에비하여세포의밀도와수가시료처리구에서급격히감소하였다. Fig. 7. Morphological changes of MCF-7 human breast adenocarcinoma cell by ethanol extract of leaves in A. annua treatment. Fig. 8. Morphological changes of HeLa human cervix epitheloid carcinoma cell by ethanol extract of leaves in A. annua treatment. - 57 -

Fig. 9. Morphological changes of AGS humam stomach adenocarcinoma cell by ethanol extract of leaves in A. annua treatment. (13) HPLC에의한페놀화합물의분석 동정 HPLC를이용하여개똥쑥추출물의페놀화합물을 phenolic acid, flavonol 및 catechin류로분류하여분석한결과는 Table 16, 17 및 18과같다. Phenolic acid는 Table 16과같이 12종의화합물이동정되었으며, 줄기 (SW, SE) 에비해잎추출물 (LW, LE) 에서총량이 2,857.36 mg/kg, 2,327.66 mg/kg으로약 5.4~6.7배정도높게정량되었다. Table 16. The contents of phenolic acid compounds in A. annua extracts (mg/kg, dry basis) Phenolic acids LW 1) LE SW SE Gallic acid 59.93-2) 25.72 18.98 Protocatechuic acid 238.87 215.48 56.79 60.21 Gentisic acid 50.20 - - - ρ-hydroxybenzoic acid 103.35 77.44 25.42 45.48 Vanillic acid 241.84 148.92 55.00 87.99 Caffeic acid 102.13 207.97 45.82 150.60 Chlorogenic acid 884.59 129.54 46.99 - Salicylic acid 669.31 597.10 - - ρ-coumaric acid 113.56 44.04 19.84 - Sinapic acid 392.58 839.87 152.11 - Ferulic acid - 62.11-60.97 t-cinnamic acid - 7.19 - - Total 2,857.36 2,327.66 427.69 424.23 1) Refer to the comment in Table 9. 2) Not detected. - 58 -

Table 17. The contents of flavonol compounds in A. annua extracts (mg/kg, dry basis) Flavonols LW 1) LE SW SE Rutin - 2) 266.21 - - Quercetin 202.11 106.89 - - Kaempferol - 21.84 - - Total 201.11 394.94 - - 1) Refer to the comment in Fig. 2. Not detected. Flavonol류는총 3종을동정하였는데, 잎에탄올추출물 (LE) 에서 3종모두검출되었으며, 잎의물추출물 (LW) 에서는 quercetin만이확인되었다. 반면에줄기추출물에서는검출되지않았다 (Table 17). Catechin류는 7종을동정하였으며, 잎에탄올추출물 (LE) 은타시료에비해 1.7~2.7배정도높게정량되었으며, 물추출물은잎과줄기에서비슷한함량이었다. 특히, 잎에탄올추출물 (LE) 에서 epicatechin gallate, catechin 및 gallocatechin gallate의함량이타시료에비해월등히높았으며, epicatechin gallate는총량의약 48.6% 를차지하였다 (Table 18). 녹차의항산화활성은 catechin류함량에의존적이며, catechin 성분중 epicatechin, epicatechin gallate 및 epigallocatechin gallate 등이항산화활성에영향을주는주요성분으로보고된바있는데 (Lee MJ et al, 2007), 개똥쑥추출물의항산화활성도이들 catechin류와관련성이높은것으로판단된다. Table 18. The contents of catechin compounds in A. annua extracts (mg/kg, dry basis) Catechins LW 1) LE SW SE Epigallocatechin 416.72 327.29 217.24 - Catechin 2083.59 3704.16 544.07 1675.18 Epicatechin 3014.29 1201.39 439.48 457.15 Epigallocatechin gallate - 2) 252.30 151.09 263.58 Gallocatechin gallate 881.30 1272.48 349.40 618.94 Epicatechin gallate - 7930.79 1074.90 4982.66 Catechin gallate 30.13 1625.77 3264.81 1377.84 Total 6,425.03 16,314.18 6,040.99 9,375.35 1) Refer to the comment in Fig. 2. 2) Not detected. - 59 -

쑥속의식물은다양한플라보노이드를함유하고있으며, 참쑥전초의에탄올추출물은 21가지의플라보노이드성분이분리 동정된바있는데, 이들물질은쥐간의마이크로좀에대하여지질과산화억제효과를나타내었으며, 비타민 E보다높은항산화활성을가지는것으로보고되어있다 (Lee SJ et al, 1999). 사철쑥의용매별생리활성을분석한결과에서도메탄올추출물이여타추출물보다항산화활성이높았는데, 시료중의페놀화합물에의존적이며 chlorogenic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid 및 3,4-dicaffeoylquinic acid 등의페놀화합물이동정되었다고보고되어있다 (Seo HC et al, 2003). 본연구에서개똥쑥추출물은항산화및암세포증식억제활성이높은것으로확인되었으며, 이들의활성은시료중의페놀화합물에대한의존성이높으나, 그외미지의물질도관여하는것으로추정되며, 향후지속적인연구가필요하리라생각된다. 2) 흑마늘의추출조건별생리활성스크리닝 (1) 흑마늘추출물의수율 Fig. 10은흑마늘을에탄올의농도를달리하고추출온도및시간을달리한조건에서추출한후추출수율을측정한결과는 Fig. 10과같다. No. 10 추출물 (90, 9시간, 50% EtOH) 에서수율이 157% 로가장높았는데반하여 No. 14 추출물 (70, 9시간, 100% EtOH) 은 32% 로가장낮았다. No. 14 추출물은추출용매 100% 에탄올로수율이낮은것으로추정된다. Fig. 10. Extraction yield of black garlic extract under different conditions. (2) 흑마늘추출물의 ph 및당도흑마늘추출물의 ph를측정한결과는 Fig. 11에나타낸바와같이모든추출조건에서 4.43~5.90 범위의산성성격을띠었다. 상대적으로용매의에탄올비율이커질수록 ph는증가하였고물의비율이커질수록 ph가감소하는양상을보였다. 가열처리된마늘에서 ph의변화는고온일경우가열초기부터산성화가진행되며, ph가산성화될수록갈변반응이촉진되는것으로보고되어있다 (Choi JH et al, 1981). - 60 -

Fig. 11. ph of black garlic extract under different conditions. Fig. 12. Sugar contents of black garlic extract under different conditions. Fig. 12 는추출물의당도를측정한결과로 70 에서 9 시간동안 100% 물로추출한 No. 13 추출물이 2.8 brix 로가장값이낮았으며상대적으로용매의에탄올비율이커질수록당도가 높아지는경향을보여에탄올이물보다당의용출이크기때문이라생각된다. (3) 흑마늘추출물의갈색도흑마늘추출물의갈색도를알아보고자각기다른파장인 490 nm와 660 nm에서흡광도를측정한결과는 Table 19와같다. No. 10 추출물 (90, 9시간, 50% EtOH) 이 490 nm와 660 nm에서각각 3.000, 1.659로흡광도가가장높았다. 3.000, 1.527의값을보인 No. 8 추출물 (80, 12시간, 75% EtOH) 이그다음으로흡광도가높았다. 반면에 70 에서 9시간동안 100% 에탄올로추출한 No. 14 추출물이 0.123, 0.022의흡광도값을보여다른추출물의갈색도와비교되었다. 마늘의갈변화반응은가열초기에주로발생되며, 90 의고온에서는급격한변화를보이는데, polyphenol oxidase가 50~70 에서활성을잃기때문에흑마늘의갈변과정은비효소적반응 - 61 -

이라고보고된바있다 (Bae Sk & Lim MR, 2002). Table 19. Browning intensity in 490 and 660 nm of black garlic extract under different conditions Exp No. Condition hr EtOH (%) 490 nm 660 nm 1-1 -1-1 1.457 0.229 2-1 -1 +1 1.085 0.438 3-1 +1-1 1.409 0.247 4-1 +1 +1 1.245 0.519 5 +1-1 -1 2.176 0.575 6 +1-1 +1 2.753 1.190 7 +1 +1-1 2.400 0.706 8 +1 +1 +1 3.000 1.257 9-2 0 0 1.440 0.271 10 +2 0 0 3.000 1.659 11 0-2 0 2.148 0.594 12 0 +2 0 2,849 0.914 13 0 0-2 1.325 0.191 14 0 0 +2 0.123 0.022 15 0 0 0 2.238 0.615 16 0 0 0 2.389 0.656 17 0 0 0 2.246 0.654 (4) 흑마늘추출물의항산화활성흑마늘추출물을에탄올의비율, 추출온도및시간을달리한조건에서추출물의항산화활성을 DPPH, ABTS 라디칼소거활성및 FRAP법에따라실험한결과는 Table 20과같다. ABTS와 DPPH는라디칼의일종이나 DPPH는자유라디칼이며 ABTS는양이온라디칼이라는점에서차이가나며항산화물질의종류에따라각각의라디칼에대한각각의라디칼에대한결합정도가다르므로항산화능에차이를보이게된다 (Wang et al, 1998). FRAP법은 DPPH법과마찬가지로전자공여능력을통해항산화활성을검증하는방법중하나로산화제로작용하는 Fe +3 와항산화제와의반응을통해생성된 Fe +2 을흡광도를통해정량을할수있는방법이다. No. 10 추출물 (90, 9시간, 50% EtOH) 의 DPPH, ABTS 라디칼소거활성및 FRAP법에의한항산화활성결과는각각 66.1±0.7%, 75.0±0.4%, 375.4±4.8 μmol/g으로가장활성이높았다. 반면에 No. 14 추출물 (70, 9 시간, 100% EtOH) 은각각 9.6±0.5%, 20.6±0.3%, 67.1±1.1 μ mol/g의값으로다른조건들에비해활성이낮았다. No. 10 추출물의경우추출온도가모든조건중에서가장높아추출온도가높을수록흑마늘의항산화물질용출이더용이한것으로사료된다. 또한, No. 14 추출물은추출온도와시간이중심조건이었음에도불구하고항산화활 - 62 -

성이모든조건들과비교해볼때가장낮았는데이는추출용매에서기인된것으로생각된다. 따라서에탄올과물이적정비율로혼합되었을경우에는시료의추출시생리활성을증가시킬수있으나때는에탄올 100% 로시료를추출했을때에는오히려물추출물보다활성이저하되는것으로확인되었다. Table 20. Antioxidant activity of black garlic extract under different conditions Exp No. Condition hr EtOH(%) DPPH (%) ABTS (%) FRAP (μm/g) 1-1 -1-1 44.4 ± 0.6 52.8 ± 0.7 166.3 ± 3.2 2-1 -1 +1 26.3 ± 0.3 42.2 ± 0.4 146.0 ± 1.1 3-1 +1-1 31.7 ± 0.4 46.2 ± 0.3 156.1 ± 0.7 4-1 +1 +1 27.4 ± 0.3 44.4 ± 0.2 156.5 ± 1.5 5 +1-1 -1 37.8 ± 0.6 55.4 ± 0.5 212.8 ± 1.3 6 +1-1 +1 39.1 ± 0.2 61.7 ± 0.3 270.3 ± 1.4 7 +1 +1-1 38.8 ± 0.6 55.9 ± 0.7 219.0 ± 4.2 8 +1 +1 +1 42.7 ± 0.2 63.8 ± 0.9 297.2 ± 3.1 9-2 0 0 33.1 ± 0.3 47.4 ± 0.4 170.8 ± 1.3 10 +2 0 0 66.1 ± 0.7 75.0 ± 0.4 375.4 ± 4.8 11 0-2 0 34.2 ± 0.3 48.1 ± 0.7 201.3 ± 3.2 12 0 +2 0 33.9 ± 0.2 52.2 ± 0.4 232.3 ± 1.9 13 0 0-2 32.7 ± 0.3 46.4 ± 0.2 158.2 ± 4.5 14 0 0 +2 9.6 ± 0.5 20.6 ± 0.3 67.1 ± 1.1 15 0 0 0 32.8 ± 0.5 48.0 ± 0.3 199.7 ± 0.9 16 0 0 0 34.0 ± 0.4 45.5 ± 0.4 206.5 ± 2.1 17 0 0 0 32.3 ± 0.3 45.3 ± 0.4 194.1 ± 1.6 (5) 흑마늘추출물의총페놀및플라보노이드화합물함량흑마늘추출물에존재하는총페놀화합물과플라보노이드의함량을정량한결과는 Table 21과같다. 항산화활성이가장높았던 No. 10 추출물이총페놀과플라보노이드화합물의함량또한가장많았으며, No. 8 추출물 (80, 12시간, 75% EtOH) 이그다음이었다. 반면에 100% 에탄올에서추출한 No. 14 추출물의함량이가장적어항산화결과와유사한경향을보여추출물의항산화활성에페놀성화합물이직접적으로관여하는것으로사료된다. 또한추출온도가높을수록, 극성과비극성용매가공존할때시료의추출이극대화되는것으로확인되었다. 흑마늘의용매별분획물의총페놀및플라보노이드함량을분석한결과에서총페놀화합물은클로로포름분획물에서가장높았으며, 물분획물에서가장낮았다. 플라보노이드함량도이와같은경향으로물분획물의함량은클로로포름분획물함량의 10% 수준인것으로보고되어흑마늘중의생리활성유효물질은비극성용매에용출성이큰것으로보고된바있다 (Shin JH et al, 2010a). - 63 -

Table 21. Contents of total phenol and flavonoid of black garlic extract under different conditions Exp No. Condition hr EtOH(%) Total Phenol (mg/g) Flavonoids (mg/g) 1-1 -1-1 225.9 ± 2.0 75.8 ± 2.7 2-1 -1 +1 204.5 ± 1.6 43.6 ± 2.7 3-1 +1-1 226.8 ± 1.0 68.8 ± 0.9 4-1 +1 +1 214.7 ± 3.3 49.3 ± 2.3 5 +1-1 -1 264.8 ± 1.8 99.9 ± 1.7 6 +1-1 +1 318.3 ± 2.0 112.5 ± 5.2 7 +1 +1-1 275.0 ± 2.3 104.5 ± 1.8 8 +1 +1 +1 364.2 ± 2.4 142.9 ± 1.7 9-2 0 0 240.0 ± 1.6 63.7 ± 1.5 10 +2 0 0 562.7 ± 3.4 266.3 ± 1.6 11 0-2 0 258.3 ± 3.6 98.9 ± 2.2 12 0 +2 0 293.6 ± 2.1 123.6 ± 1.1 13 0 0-2 245.7 ± 1.0 71.6 ± 2.5 14 0 0 +2 122.5 ± 1.4 8.4 ± 0.5 15 0 0 0 265.6 ± 1.0 108.5 ± 1.6 16 0 0 0 286.4 ± 4.4 121.2 ± 2.2 17 0 0 0 270.5 ± 1.7 103.1 ± 0.5 (6) 흑마늘추출물의 thiosulfinate 함량흑마늘추출물중의 thiosulfinate 함량을분석한결과는 Table 22와같다. Thiosulfinate 역시총페놀화합물과마찬가지로 No. 10 추출물이 149.9±0.7 mmol/g으로다른조건에서추출된시료에비해월등히많았으며다음으로 No 8 추출물 (80, 12시간, 75% EtOH) 이었는데, No. 2 추출물 (60, 6시간, 75% EtOH) 은 No. 8 추출물과비교해볼때동일한용매조건에서추출시간과온도가낮은것으로이에따른 thiosulfinate 함량은상당히차이가나는것으로확인되어, 식물류의추출시, 추출시간과온도는상당히관련성이큰것으로판단되었다. 그외의추출물에서는 10~60 mmol/g 범위였으며, No. 2 추출물 (60, 6시간, 75% EtOH) 의경우 thiosulfinate 함량이 10 mmol/g 이하로가장낮았으며, 그외추출물은 10~60 mmol/g 범위였다. Thiosulfinate는생마늘중 alliinase에의해 cysteine sulfoxide가분해되어생성되는황화합물로, 60~80% 가 allicin인것으로알려져있다 (Lawson LD et al, 1991). 더욱이전화속도가상당히빨리진행되어매우불안정하고용매, 온도및농도에의존력이큰성분이다. 또한흑마늘제조시가공공정의진행과더불어 thiosulfate의함량은유의적으로증가하는경향을보이는데, 이는저급황화합물의생성증가와수분의감소에따른상대적인고형분증가에의한것으로추정되고있다 (Shin JH et al, 2008a). - 64 -

Table 22. Contents of Thiosulfinate of black garlic extract under different conditions Exp No. Condition hr EtOH(%) Thiosulfinate (mmol/g) 1-1 -1-1 52.4 ± 0.2 2-1 -1 +1 7.0 ± 0.6 3-1 +1-1 46.2 ± 0.3 4-1 +1 +1 10.8 ± 0.8 5 +1-1 -1 57.3 ± 0.9 6 +1-1 +1 47.3 ± 0.7 7 +1 +1-1 55.7 ± 0.5 8 +1 +1 +1 59.9 ± 0.7 9-2 0 0 41.1 ± 0.1 10 +2 0 0 149.9 ± 0.7 11 0-2 0 43.4 ± 0.3 12 0 +2 0 56.4 ± 0.6 13 0 0-2 46.9 ± 0.1 14 0 0 +2 29.8 ± 0.0 15 0 0 0 46.7 ± 0.3 16 0 0 0 47.1 ± 0.4 17 0 0 0 47.1 ± 0.7 (7) 반응표면분석 (RSM) 에따른흑마늘추출조건의최적화 Fig. 13 및 14는반응표면분석을이용하여흑마늘추출물의항산화활성, 총페놀및플라보노이드화합물함량과 thiosulfinate 함량을추출온도, 시간및용매의특성을기초로하여분석한결과이다. 이그래프를바탕으로반응회귀식을도출하여 (Table 23) 흑마늘의생리활성이극대화되는추출조건을추정하였다 (Table 24). 흑마늘은평균적으로 89.68 에서 9.79시간동안 55.72% 의에탄올로추출하였을때생리활성이극대화될것으로추정되었으며, 실험을시행한조건중에서는 No. 10 추출물 (90, 9시간, 50% EtOH) 이이와가장비슷한조건이었다. 결과를종합해볼때극성의용매와비극성의용매가균형을이루면서고온에서추출할때흑마늘추출물의생리활성이우수할것으로생각된다. 흑마늘은제조과정중열처리과정을통하여마늘의자체성분에의한갈변반응으로갈변을거쳐서서서히흑변하여이루어진것으로이러한과정이효소적갈변반응의온도범위를벗어난고온에서이루어지는것으로고려해볼때마늘의흑변은비효소적갈변반응이며, 주된성분은당과아미노산인것으로추정된바있다 (Choi DJ et al, 2008). 따라서흑마늘은제조과정중고온열처리과정을거친바흑마늘의유효생리활성물질은고온에서안정적인것으로판단된다. - 65 -

[DPPH radical scavenging activity] [ABTS radical scavenging activity] [FRAP assay] Fig. 13. Response surface plot for antioxidant activities of black garlic extract. - 66 -

[Total Phenol content] [Total Flavonoid content] [Thiosulfinate content] Fig. 14. Response surface plot for total phenol and flavonoid contents, thiosulfinate contents of black garlic extract. - 67 -

Table 23. Polynomial equation calculate by RSM for extraction conditions of black garlic Items Second order polynomial equations R 2 Significance DPPH radical scavenging activity y=33.578261+5.912500x 1-0.475000x 2-3.962500x 3 +4.209783x 1 2 +0.322283x 2 2-2.902717x 3 2 +2.025000x 1 x 2 +2.050000x 1 x 3 +3.450000x 2 x 3 0.9136 0.0223 ABTS radical scavenging activity y=48.013043+6.650000x 1 +0.400000x 2-3.112500x 3 +3.951630x 1 2 +1.189130x 2 2-2.973370x 3 2 +0.875000x 1 x 2 +1.300000x 1 x 3 +3.325000x 2 x 3 0.8542 0.0371 FRAP assay y=200.921739+48.975000x 1 +5.962500x 2-4.150000x 3 +18.352717x 1 2 +4.277717x 2 2-21.759783x 3 2 0.9228 0.0330 +4.100000x 1 x 2 +5.175000x 1 x 3 +19.450000x 2 x 3 Total phenol content y=266.445043+62.235125x 1 +8.607375x 2-8.580125x 3 +30.849755x 1 2-0.515745x 2 2-23.470870x 3 2 +5.638750x 1 x 2 +5.611500x 1 x 3 +22.011000x 2 x 3 0.8811 0.0373 Flavonoid content y=104.089826+39.211375x 1 +5.192750x 2-7.961625x 3 +12.666603x 1 2-0.768022x 2 2-18.583397x 3 2 +4.544250x 1 x 2 +4.801250x 1 x 3 +12.838750x 2 x 3 0.8990 0.0853 Thiosulfinate y=42.841913+20.097688x 1 +2.163313x 2-11.274938x 3 0.9123 0.0001 +11.617614x 1 2 +0.210614x 2 2-6.399386x 3 2 +1.674875x 1 x 2 +3.027625x 1 x 3 +9.361875x 2 x 3 x 1 : Temperature ( ), x 2 : Time (hr), x 3 : EtOH (%) Table 24. Optimal conditions of black garlic extract based on response surface methodology Items Temperature ( ) Time (hr) EtOH (%) DPPH radical scavenging activity 89.61 10.02 54.88 ABTS radical scavenging activity 89.72 9.77 55.34 FRAP assay 89.54 9.82 58.09 Total phenol content 89.72 9.65 56.28 Flavonoids content 89.63 9.93 55.53 Thiosulfinate content 89.85 9.53 54.17-68 -

3) 개똥쑥의추출조건별생리활성스크리닝 (1) 개똥쑥추출물의수율추출온도, 시간및에탄올비율을달리한조건에서개똥쑥을추출하였을때추출수율은 Fig. 15와같다. 다른추출조건에비하여 90 에서 9시간동안 50% 에탄올로추출한 No. 10 추출물이 56.7% 로가장높았으며, 다음으로 No. 8 추출물 (80, 12시간, 75% EtOH) 이었으며, 7 0 에서 15시간동안 100% 에탄올로추출한 No. 14 추출물은 10.2% 로가장수율이낮았다. 그외추출물은 15.6~24.9% 의범위였다. Fig. 15. Extraction yield of Gaeddongssuk extract under different conditions. (2) 개똥쑥추출물의 ph 및당도 개똥쑥추출물의 ph 와당도를측정한결과는 Fig. 16 과 17 에나타내었다. 추출물의 ph 는모두 산성을띠었으며 No. 10 추출물이 5.26 으로가장낮았고그외추출물은 5.6~6.56 의범위였다. Fig. 16. ph of gaeddongssuk extract under different conditions. - 69 -

당도는 No. 13 추출물 (70, 9시간, 50% EtOH) 이 0.1이하로낮아측정되지않았으며, 시료간편차가커 6.0~8.6 brix의범위인시료들이있는반면일부추출조건에서는 16.4~20.4 brix로당도가높았다. ph와당도의상관관계를살펴보면전반적으로 ph가높은추출물에서높은당도값을보였다. 이들은추출온도와시간및용매의특성에따라복합적인영향을다는것으로생각되나, 특히물과에탄올의혼합비에의한영향이가장클것으로추정된다. Fig. 17. Sugar contents of Gaeddongssuk extract under different conditions. (3) 개똥쑥추출물의갈색도 Table 25는개똥쑥추출물의갈색도를 490 nm와 660 nm에서측정하여흡광도값으로나타낸결과이다. 추출물의갈색도는 No. 10 추출물이가장높았으며 490 nm와 660 nm에서갈색도는전반적으로차이는있었지만물과에탄올의혼합비율의차이가클수록상대적인흡광도값이낮았으며, 물과에탄올혼합비율이 1:1의균형을이룰때갈색도가다소높은값을보였다. 갈색도는갈색화반응물의생성정도를측정하는척도로이들물질은항산화활성과상호관련이있어 No. 14 추출물에서흡광도값이가장높은것으로볼때이추출물의생리활성도높을것으로추정된다. (4) 개똥쑥추출물의추출물의항산화활성 Table 26은추출물의항산화활성을 DPPH와 ABTS 라디칼소거활성및 FRAP법을이용하여측정한결과이다. 모든추출조건중 No. 10 추출물이 76.4±0.7%, 83.4±0.1%, 737.3±11.3 μ mol/g의값으로모든항목에서가장높은활성을가졌으며 No. 14 추출물이각각 13.5±0.5%, 12.0±0.5%, 264.8±4.9 μmol/g의값을보여가장활성이낮았다. 쑥수십종의 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성을측정한결과총페놀및플라보노이드함량이높았던시료에서높은라디칼소거활성을나타내었다고보고된바있으며 (Choi YM et al, 2006), 식물체의 DPPH 라디칼소거능은플라보노이드를비롯한페놀성화합물에연유되며 (Kim EY et al, 2004), 시료의 ABTS 라디칼소거활성은페놀화합물에기인된다는것으로볼때 - 70 -

(Choi YM et al, 2003), 개똥쑥추출물의항산화활성은시료중의총페놀화합물의함량에의 존적인것으로판단된다. Table 25. Browning intensity in 490 and 660 nm of Gaeddongssuk extract under different conditions Exp No. Condition hr EtOH (%) 490 nm 660 nm 1-1 -1-1 0.922 0.317 2-1 -1 +1 0.466 0.508 3-1 +1-1 1.174 0.378 4-1 +1 +1 0.610 0.614 5 +1-1 -1 1.638 0.596 6 +1-1 +1 1.107 0.681 7 +1 +1-1 1.945 0.664 8 +1 +1 +1 1.109 0.957 9-2 0 0 0.795 0.527 10 +2 0 0 3.000 2.812 11 0-2 0 1.169 0.618 12 0 +2 0 1.555 0.711 13 0 0-2 0.905 0.259 14 0 0 +2 0.583 1.067 15 0 0 0 1.654 0.778 16 0 0 0 1.305 0.595 17 0 0 0 1.660 0.812 Table 26. Antioxidant activity of Gaeddongssuk extract under different conditions Exp No. Condition hr EtOH (%) DPPH (%) ABTS (%) FRAP (μm/g) 1-1 -1-1 50.1 ± 0.9 45.6 ± 0.4 423.3 ± 5.6 2-1 -1 +1 45.1 ± 0.3 44.7 ± 0.7 478.4 ± 5.1 3-1 +1-1 60.4 ± 0.8 57.8 ± 0.6 464.7 ± 5.8 4-1 +1 +1 48.9 ± 0.6 46.5 ± 0.3 472.6 ± 4.0 5 +1-1 -1 71.4 ± 1.0 69.9 ± 0.3 582.0 ± 4.9 6 +1-1 +1 72.7 ± 1.0 73.4 ± 1.2 661.6 ± 6.6 7 +1 +1-1 67.6 ± 0.9 68.4 ± 0.5 565.0 ± 3.7 8 +1 +1 +1 72.9 ± 0.9 74.0 ± 0.3 664.3 ± 3.9 9-2 0 0 46.3 ± 0.8 46.6 ± 0.9 406.7 ± 5.5 10 +2 0 0 76.4 ± 0.7 83.4 ± 0.1 737.3 ± 11.3 11 0-2 0 60.9 ± 0.7 59.3 ± 0.5 516.0 ± 3.5 12 0 +2 0 63.1 ± 0.4 64.0 ± 0.8 563.8 ± 4.3 13 0 0-2 30.7 ± 0.6 33.5 ± 0.7 335.9 ± 3.1 14 0 0 +2 13.5 ± 0.5 12.0 ± 0.5 264.8 ± 4.9 15 0 0 0 63.5 ± 0.3 66.9 ± 0.3 564.5 ± 6.0 16 0 0 0 58.0 ± 0.7 61.7 ± 0.4 532.1 ± 5.7 17 0 0 0 67.0 ± 1.0 64.8 ± 0.5 551.7 ± 3.9-71 -

이상의결과를추출조건 ( 온도, 시간, 용매비율 ) 을고려하여분석한결과전체적으로개똥쑥 추출물의항산화활성은추출온도가높고추출시간이길어질수록, 추출용매중물과에탄올 의혼합비율에서 1:1 의균형이이루어질때증가하는양상을보였다. (5) 추출물의페놀및플라보노이드화합물함량 Table 27은추출물의페놀및플라보노이드화합물을정량한결과이다. No. 10 추출물이 1322.1±11.0 mg/g, 650.9±8.9 mg/g으로총페놀및플라보노이드함량이가장많았으며, 301.4±2.7 mg/g, 125.0±2.7 mg/g으로 No. 14 추출물의함량이가장적었다. 이들함량역시온도가높고추출시간이길수록, 추출용매의비율에서도물과에탄올의혼합비율에균형을이룰때 (1:1) 생리활성물질의함량이증가하는결과를보여전술한항산화활성의결과와유사한경향이었다. 쑥의주된항산화활성은페놀및플라보노이드함량에의존적인것으로알려져있어 (Hong JH et al, 2007) 본연구의결과와상응하였다. Table 27. Contents of total phenol and flavonoid of Gaeddongssuk extract under different conditions Exp No. Condition hr EtOH (%) Total phenol (mg/g) Flavonoid (mg/g) 1-1 -1-1 458.2 ± 3.7 140.5 ± 0.4 2-1 -1 +1 470.6 ± 4.0 164.9 ± 1.1 3-1 +1-1 523.1 ± 3.9 187.9 ± 2.2 4-1 +1 +1 505.4 ± 3.5 175.0 ± 2.3 5 +1-1 -1 584.7 ± 6.7 240.0 ± 3.8 6 +1-1 +1 701.9 ± 5.5 271.0 ± 2.8 7 +1 +1-1 640.9 ± 7.1 230.0 ± 1.6 8 +1 +1 +1 755.6 ± 7.3 304.4 ± 2.1 9-2 0 0 483.8 ± 5.4 178.7 ± 1.9 10 +2 0 0 1322.1 ± 11.0 650.9 ± 8.9 11 0-2 0 577.2 ± 4.8 204.9 ± 3.3 12 0 +2 0 600.7 ± 6.0 234.2 ± 2.7 13 0 0-2 437.2 ± 4.3 125.9 ± 1.9 14 0 0 +2 301.4 ± 2.7 125.0 ± 2.7 15 0 0 0 643.5 ± 3.2 253.7 ± 8.9 16 0 0 0 592.3 ± 5.8 214.1 ± 2.0 17 0 0 0 636.4 ± 5.7 264.3 ± 1.5 식물기원의시료에서페놀화합물은그함량은많을수록항산화활성이높으며, 식물시료의변색에주된영향을미치는인자로알려져있다 (Choi KS & Lee HY, 1999). 플라보노이드류는 polyphenolic substance로서화학구조에따라 flavonols, flavones, catechins, isoflavones 등으로분류되며, 물과에탄올에대한용해도가다르고이들의구조적차이에따라과산화지질생성억제등의생리활성에영향을주는것으로알려져있다 (Middleton EJ & Kandaswami C, 1994). - 72 -

(6) 반응표면분석 (RSM) 에따른개똥쑥추출조건의최적화 반응표면분석법을이용하여개똥쑥추출물의항산화활성, 총페놀및플라보노이드화합물 함량을추출온도, 시간및용매의성질을바탕으로분석한결과는 Fig. 18 및 19 와같다. [DPPH radical scavenging activity] [ABTS radical scavenging activity] [FRAP assay] Fig. 18. Response surface plot for antioxidant activity of gaeddongssuk extract. - 73 -

[Total phenol content] [Flavonoid content] Fig. 19. Response surface plot for total phenol and flavonoid contents of Gaeddongssuk extract. 반응표면분석결과로부터반응회귀식을도출하여 (Table 28), 개똥쑥의생리활성이극대화되는추출조건을예측하였다 (Table 29). 그결과, 평균적으로개똥쑥은 89.68 에서 8.46시간동안 53.70% 의에탄올로추출하였을때생리활성이극대화될것으로예상되며, 본실험을수행한조건중에서는 No. 10 추출물 (90, 9시간, 50% EtOH) 이가장비슷한조건인것으로나타났다. 이상의결과를종합해볼때흑마늘추출물과마찬가지로극성의용매와비극성의용매가균형을이루면서고온에서추출할때개똥쑥추출물의생리활성이우수한것으로확인되었다. (7) 흑마늘및개똥쑥추출물의생리활성에대한전반적인평가흑마늘과개똥쑥을이용하여 50~90 의범위에서물과에탄올의용매비율, 추출시간을달리한조건을설정하여생리활성을분석하였다. 그결과, 흑마늘과개똥쑥추출물은각각평균적으로 89.68 에서 9.79시간동안 55.72% 의에탄올과 89.68 에서 8.46시간동안 53.70% 의에탄올로추출하였을때생리활성이극대화될것이라는결과를반응표면분석 (RSM) 을통하여얻을수있었다. - 74 -

Table 28. Polynomial equation calculate by RSM for extraction conditions of gaeddongssuk Items Second order polynomial equations R 2 Significance DPPH radical scavenging activity y=65.986958+8.768750x 1 +0.931250x2-2.768750x 3 +0.023370x 1 2 +0.185870x 2 2-9.789130x 3 2-2.212500x 1 x 2-0.312500x 1 x 3 +2.887500x 2 x 3 0.8938 0.2078 ABTS radical scavenging activity y=66.752174+10.2937500x 1 +1.406250x 2-2.881250x 3 +0.419022x 1 2-0.418478x 2 2-10.143478x 3 2-1.862500x 1 x 2-1.037 500x 1 x 3 +2.662500x 2 x 3 0.9315 0.0996 FRAP assay y=566.326087+80.943750x 1 +7.306250x 2 +6.231250x 3 +7.75326 1x 1 2-0.271739x 2 2-60.159239x 3 2-6.237500x 1 x 2-3.437500x 1 x 3 + 0.9095 0.0635 14.487500x 2 x 3 Total phenol content y=609.723739+150.163062x1+16.032687x 2-2.826062x 3 +67.9 20592x 1 2-10.571283x 2 2-65.489783x 3 2 0.8890 0.0460 +1.277375x 1 x 2-4.076125x 1 x 3 +29.646875x 2 x 3 Flavonoid content y=231.253565+82.587625x 1 +8.709000x 2 +7.190375x 3 +41.0970 71x 1 2-7.722929x 2 2-31.239304x 3 2 0.8736 0.1172-4.264000x 1 x 2 +0.782750x 1 x 3 +11.740500x 2 x 3 x 1 : Temperature ( ), x 2 : Time (hr), x 3 : % EtOH Table 29. Optimal conditions of gaeddongssuk extract based on Response Surface Methodology Items Temperature ( ) Time (hr) EtOH(%) DPPH radical scavenging activity 88.94 7.10 52.88 ABTS radical scavenging activity 89.71 8.03 52.52 FRAP assay 89.88 8.70 54.96 Total phenol content 89.92 9.23 54.06 Flavonoid content 89.93 9.23 54.09 4) 남해산시판흑마늘의생리활성비교 (1) 시판흑마늘중 total pyruvate 및 thiosulfate의함량시판흑마늘과생마늘의 total pyruvate 및 thiosulfate 함량을생마늘과비교한결과는 Table 30과같이생마늘보다흑마늘에서유의적으로높았으며, total pyruvate 함량은흑마늘의종류에따라 194.09~255.86 mm/100 g의범위였으며, thiosulfate 함량은 496.71~565.97 mm/100 g이었다. - 75 -

Table 30. Contents of total pyruvate and thiosulfate in fresh and black garlics (mm/100 g raw garlic) Samples Total pyruvate Thiosulfate Fresh garlic 177.26±2.70 A 178.33±4.49 A A 243.09±6.46 D 544.05±4.98 D Black garlics B 255.86±2.00 E 565.97±4.99 E C 194.09±1.92 B 496.71±12.25 B D 218.01±9.70 C 514.15±10.29 C A-E Means with different superscripts in the same column are significantly different at p <0.05. Total pyruvate와 thiosulfate 함량은서로비례적으로 total pyruvate 함량이유의적으로높았던 B제품에서 thiosulfate의함량도가장높았으며, total pyruvate이가장낮았던 C제품에서 thiosulfate 함량도유의적으로낮았다. Pyruvate는 alliin이 allinase에의하여 allicin 및암모니아와함께생성되는것으로, 상온보다높은온도에저장할경우생성량이증가된다고보고되어있다 (Hwang JB et al, 2004). Thiosulfate 는생마늘내의 alliinase에의하여 cysteine sulfoxide가분해되어생성되는것으로매우불안정하고용매, 온도및농도에매우의존적인성분으로 (Ross ZM et al, 2001) 마늘의총 thiosulfate 함량은숙성온도에따라큰차이를보인다고보고된바있다 (Byun PH et al, 2001). (2) 흑마늘추출물의총페놀및플라보노이드함량흑마늘의물및에탄올추출물중총페놀및플라보노이드함량을분석한결과는 Table 31 과같이생마늘에비해흑마늘에서유의적으로높았으며, 물추출물이에탄올추출물에비해더높게정량되었다. 흑마늘의총페놀화합물은물추출물에서 157.11~179.04 mg/g, 에탄올추출물은 60.03~77.57 mg/g으로 A제품의함량이가장높았다. 플라보노이드함량의경우에탄올추출물은 5.90~6.36 mg/g으로시료간에유의차를보이지않았으나, 물추출물에서는 A제품이 27.08 mg/g으로유의적으로높은함량이었다. 흑마늘은제조과정이진행될수록총페놀및플라보노이드함량이생마늘에비해약 7배및 16배정도증가되는데 (Kwon OC et al, 2006), 고온처리에의해생마늘의여러화합물이유용성의폴리페놀화합물로전환되었거나, 수분감소에따른고형분함량이증가하였기때문에상대적인함량이증가된것으로해석된바있다 (Shin JH et al, 2008a). 식물류의페놀성화합물은일반적으로물보다는에탄올에서용출되기쉬운데, 에탄올추출물의경우에는추출온도가높을수록수율, 플라보노이드및전자공여활성이증가되는것으로보고되어있다 (Jeong JE et al, 2011). 본연구결과흑마늘은에탄올추출물보다물추출물에서유용물질의용출이더높았는데이는흑마늘중에수용성페놀성물질의함량이더높으며, 실 - 76 -

온에서장시간의추출과정에의해물추출물의유용물질용출이높아진결과로해석된다. Table 31. Contents of total phenol and flavonoids in the extracts of fresh and black garlics Samples Total phenol Flavonoids (mg/g extract) Water extract Ethanol extract Water extract Ethanol extract Fresh garlic 108.63±6.57 A 47.40±0.81 A 7.29±0.71 A 1.70±0.18 A Black garlics A 179.04±5.77 C 77.57±4.79 D 27.08±0.77 D 6.11±0.27 B B 174.47±1.44 C 60.03±0.44 B 24.88±0.53 C 5.90±0.39 B C 157.11±2.93 B 68.51±0.80 C 18.72±1.26 B 6.26±0.77 B D 171.32±0.80 C 70.56±2.06 C 19.95±0.53 B 6.36±1.43 B A-D Means with different superscripts in the same column are significantly different at p <0.05. (3) 항산화활성흑마늘의물및에탄올추출물의 DPPH, ABTs, hydroxyl 및 nitric oxide 라디칼소거활성을생마늘추출물과비교한결과는 Table 32~35와같다. 시료의첨가농도를 100, 250, 500 및 1000 μg/ml로달리하였을때모든시료에서첨가농도가높아질수록소거활성은유의적으로증가하였으며, 생마늘추출물에비해흑마늘추출물에서라디칼소거활성이더높았다. Table 32에서흑마늘물추출물의 DPPH 라디칼소거활성은 250 μg/ml 농도에서는 50% 이상, 1000 μg/ml 농도에서는 60.75~71.48% 로활성이증가하였으며 B제품에서유의적으로소거활성이높았다. 에탄올추출물의활성은물추출물보다는낮아 1000 μg/ml의농도에서도대부분의활성이 50% 미만이었으며, B제품이 52.35% 로다소높은활성을보였다. Table 32. DPPH radical scavenging activity of water and 80% ethanol extracts made from fresh and black garlics (%) - 77 -

Sample extracts Sample concentrations (μg/ml) 100 250 500 1000 Fresh garlic 33.00±2.06 aa 45.37±0.23 ba 49.93±0.39 ca 51.90±0.25 ca Water extract Black garlics A 49.82±0.47 ac 56.10±0.06 bd 62.83±0.42 cd 69.98±0.23 dd B 50.61±0.25 ac 56.27±0.90 bd 63.53±0.68 cd 71.48±0.59 de C 47.38±0.41 ab 50.66±0.49 bb 55.33±0.51 cb 62.11±0.29 dc D 49.96±0.77 ac 55.16±0.28 bc 58.89±0.97 cc 60.75±0.25 db Fresh garlic 27.45±0.36 aa 33.02±0.22 ba 34.11±0.12 ca 35.29±0.28 da Ethanol extract Black garlics A 39.82±0.93 ab 43.42±0.29 bb 46.64±1.00 cb 49.82±1.08 dc B 39.71±0.30 ab 45.28±0.47 bd 46.44±0.28 cb 52.36±0.22 dd C 43.83±0.26 ac 44.62±0.14 bc 46.48±0.45 cb 47.38±0.31 db D 43.18±0.19 ac 44.19±0.15 bc 46.09±0.17 cb 46.97±0.17 db Means with different superscripts in the same row(a-d) and column(a-e) are significantly different at p <0.05. ABTS 라디칼소거활성은 1000 μg/ml 농도에서흑마늘물추출물이 65.04~86.15%, 에탄올추출물은 46.42~58.41% 로모든농도의물추출물은 B제품의활성이유의적으로높았으며, 에탄올추출물에서는 A제품의활성이다소높았다 (Table 33). Hydroxyl 라디칼소거활성은 1000 μg/ml 농도에서흑마늘물추출물은 51.51~61.91%, 에탄올추출물은 45% 미만이었으나, A제품의소거활성이타제품에비해유의적으로높았다 (Table 34). Nitric oxide 라디칼소거활성은흑마늘물추출물이 1000 μg/ml 농도에서 49.54~58.33% 였으며, 에탄올추출물이 26.62~33.80% 로 C제품에서유의적으로활성이낮았다 (Table 35). 흑마늘은숙성이진행됨에따라추출수율이높아지며, 특히에탄올보다물추출시수율이더높은데, 열처리에의한가용성성분의용출이증가되었기때문으로이는시료의 DPPH 라디칼소거활성이나환원력과일치한다는보고가있다 (Shin JH et al, 2008a,b). 더욱이 DPPH 라디칼소거활성의경우, 생마늘은에탄올추출물이열수추출물보다소거활성이높았으나, 흑마늘은오히려열수추출물에서더높은소거활성을보였으며, hydroxyl 라디칼소거활성은생마늘및흑마늘모두에탄올추출물이열수추출물보다높았다는보고도있다 (Shin JH et al, 2008b). 흑마늘의순차용매별분획물에서항산화활성이물추출물에비해 chloroform 및 ethyl acetate 획분에서유의적으로높았다는보고 (Shin JH et al, 2010a) 는본연구결과와는상이하나, 시료추출물을얻기위한전처리공정인추출시간, 방법, 농축또는건조방법등이잔존하는활성성분의함량에주된영향을끼치는것으로추정된다. - 78 -

Table 33. ABTS radical scavenging activity of water and 80% ethanol extracts made from fresh and black garlics (%) Sample extracts Sample concentrations (μg/ml) 100 250 500 1000 Fresh garlic 10.95±0.45 aa 13.12±0.75 ba 17.79±0.45 ca 23.71±0.45 da Water extract Ethanol extract Black garlics A 25.13±0.69 ad 44.52±0.31 bd 68.03±0.92 cd 83.13±0.36 dd B 26.55±0.47 ae 46.21±0.29 be 69.54±0.09 ce 86.15±0.15 de C 14.92±0.67 ab 26.41±0.18 bb 42.42±0.14 cb 65.04±0.37 db D 20.81±0.36 ac 36.27±0.46 bc 58.26±0.09 cc 79.66±0.09 dc Fresh garlic 6.39±0.39 aa 9.15±0.32 ba 10.74±0.41 ca 12.29±0.46 da Black garlics A 10.66±0.41 ac 20.16±0.44 bc 33.06±1.48 cc 58.41±0.14 dd B 9.47±0.40 ab 19.18±1.96 bc 31.41±2.40 cc 46.42±1.35 db C 9.65±0.31 ab 16.84±0.72 bb 26.70±0.49 cb 46.45±0.86 db D 9.53±0.31 ab 20.72±0.95 bc 33.84±0.63 cc 51.71±1.17 dc Means with different superscripts in the same row(a-d) and column(a-e) are significantly different at p <0.05. Table 34. Hydroxyl radical scavenging activity of water and 80% ethanol extracts made from fresh and black garlics (%) Sample extracts Sample concentrations (μg/ml) 100 250 500 1000 Fresh garlic 26.81±0.60 aa 30.54±0.46 ba 38.70±1.00 ca 44.45±0.57 da Water extract Ethanol extract Black garlics A 32.73±0.46 ad 35.81±1.45 bc 47.21±0.79 cc 61.91±0.65 dd B 30.89±0.86 ac 33.17±0.53 bb 44.49±0.40 cb 59.98±0.95 dc C 29.40±0.55 ab 31.90±0.46 bab 37.43±1.22 ca 51.51±1.12 db D 34.75±0.77 ae 37.96±0.79 bd 47.39±2.10 cc 59.32±1.14 dc Fresh garlic 21.81±0.92 aa 23.52±0.39 ba 28.83±0.86 ca 34.27±0.93 da Black garlics A 28.48±0.46 ad 32.43±0.27 bd 37.52±1.40 cd 43.18±0.46 dd B 27.29±0.72 acd 30.14±0.42 bc 33.22±0.75 cbc 37.34±1.27 db C 24.35±0.88 ab 28.78±0.82 bb 31.72±0.27 cb 33.04±0.88 ca D 26.24±0.53 ac 30.85±0.55 bc 33.61±0.72 cc 39.84±0.66 dc Means with different superscripts in the same row(a-d) and column(a-d) are significantly different at p <0.05. - 79 -

Table 35. Nitric oxide scavenging activity of water and 80% ethanol extracts made from fresh and black garlics (%) Sample extracts Sample concentrations (μg/ml) 100 250 500 1000 Fresh garlic 13.19±2.08 aa 26.39±1.84 ba 37.27±1.06 ca 43.75±0.69 da Water extract Black garlics A 24.77±2.81 ad 37.73±1.45 bc 49.54±1.75 cc 58.33±1.84 dd B 18.75±1.20 abc 33.56±3.50 bbc 46.30±2.12 cc 55.09±1.75 dc C 15.74±0.40 aab 28.94±1.45 bab 42.82±0.40 cb 49.54±1.06 db D 20.37±2.12 ac 37.50±3.61 bc 48.61±2.41 cc 56.94±2.50 dcd Fresh garlic 10.42±0.69 aa 15.28±0.69 ba 17.82±0.80 ca 22.22±0.69 da Ethanol extract Black garlics A 16.44±0.80 ac 21.06±1.06 bc 29.17±1.39 cd 33.80±2.44 dd B 14.81±1.45 ac 18.29±0.80 bb 21.99±1.06 cb 29.63±2.23 dbc C 12.73±1.06 ab 17.59±1.06 bb 21.30±1.06 cb 26.62±2.12 db D 16.44±1.45 ac 20.37±1.06 bc 26.62±0.80 cc 32.64±2.41 dcd Means with different superscripts in the same row(a-d) and column(a-d) are significantly different at p <0.05. 흑마늘의항산화활성이생마늘보다높은것은장시간의고온처리로마늘중아미노산, 펩타이드, 단백질등의 amino기와당의반응으로비효소적갈변반응을일으켜갈변물질을생성하기때문이다 (Bas SK & Kim MR, 2002). 이로써새로이생성된 melanoidin과흑마늘에서발견되는 S-allylcysteine과같은함황화합물이항산화활성을증가시키게된다 (Ide N et al, 1999). 또한열처리에의해생성된물질은열에안정하여열수추출시유효물질의추출이용이하고, 또 thiosulfate 함량의증가와도밀접한관련이있다고판단된다 (Lawson LD, 1998). 본연구결과, 흑마늘과생마늘추출물에서 DPPH, ABTS, hydroxyl 및 nitric oxide 라디칼소거활성의차이는라디칼의종류에따라시료와의반응기전이다르기때문이라고생각된다 (Lee SO et al, 2005). 또한지역별흑마늘제품간의항산화활성의차이도제조공정및항산화반응의기작에따른것으로보고되어있는데 (You BR et al, 2011), 이는본연구에서도마찬가지로흑마늘제품에따른항산화활성은원료가동일하더라도각가공업체마다고유의숙성온도와시간을달리한제조공정을채택하고있으므로이에따른차이로판단된다. (4) 아질산염소거활성 시판흑마늘의물및에탄올추출물에대한아질산염소거활성을생마늘추출물과비교한 결과는 Table 36 과같다. ph 2.5 의반응계에서각추출물을 1, 2.5 및 5 mg/ml 농도로첨가하 - 80 -

였을때시료의첨가농도에의존적으로아질산염소거활성은유의적으로증가하였다. 흑마늘추출물은생마늘추출물보다소거활성이높았으며, 물추출물이에탄올추출물보다높은활성이었다. 특히 5 mg/ml 농도에서흑마늘물추출물은 75.49~87.50% 의범위로 C제품을제외한 3 종의제품에서는 80% 이상이었다. 에탄올추출물의경우에는 63.04~67.35% 로제품간의유의차가없었다. Table 36. Nitrite scavenging activity of water and 80% ethanol extracts made from fresh and black garlics at ph 2.5 (%) Sample extracts Sample concentrations (mg/ml) 1 2.5 5 Fresh garlic 45.26±1.82 aa 53.16±2.41 ba 60.00±3.65 ca Water extract Black garlics A 52.08±3.61 aa 62.50±0.00 ba 87.50±0.00 cd B 65.69±1.70 ab 84.31±3.40 bb 83.33±4.49 bcd C 47.06±2.94 aa 61.76±2.94 ba 75.49±3.40 cb D 50.67±3.05 aa 60.00±4.00 ba 81.33±2.31 bc Fresh garlic 18.67±2.31 aa 37.33±2.31 ba 46.67±4.62 ca Ethanol extract Black garlics A 40.82±12.74 ab 61.22±3.53 bc 67.35±3.53 bb B 48.84±2.01 ac 61.63±0.00 bc 66.28±5.33 bb C 52.63±3.16 ac 53.68±1.82 ab 64.21±6.57 bb D 46.74±8.21 abc 58.70±6.79 bbc 63.04±4.98 bb Means with different superscripts in the same row(a-d) and column(a-d) are significantly different at p <0.05. 아질산염은햄, 소세시등의식육가공시에첨가되어육색의고정이나독소생성및산패방지에널리이용되고있으며섭취시생체내에서발암성물질인 nitrosamine의생성을초래할가능성이높은것으로알려져있다 (Im KJ et al, 2000). 반면에당과아미노산의가열반응으로생성되는멜라노이딘은아질산염을효과적으로분해하는데 (Kim SB et al, 1988) 본연구에서흑마늘의아질산염소거활성은페놀성화합물과알릴화합물, 특히가공중생성되는갈변물질의상호작용이라는 Jang EK et al (2008) 의보고와유사한결과로해석된다. - 81 -

5) 강제운동부하시흑마늘과개똥쑥추출혼합물의 in vivo 생리활성강제운동부하에의해산화적스트레스가발생되는과정에서흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이가생리기능에미치는영향을측정하므로써기능성증강음료개발을위한기초자료를확보하였고, 이때흑마늘및개똥쑥의추출물도각각비교하였다. (1) 체중변화, 식이섭취량및식이효율트레드밀을이용한강제운동에의해산화적스트레스를유발시킨흰쥐에게흑마늘추출물 (BG), 개똥쑥추출물 (GS) 및흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ, Ⅱ) 을경구투여하였다. 이때흰쥐의체중변화, 식이섭취량, 식이효율을측정한결과는 Table 37과같다. 초기체중은 143.33~150.00 g이었으며, 4주간의운동과식이섭취후실험최종일의체중은 283.33~306.67 g 으로모든실험군간에유의적인차이는낮았고, 체중증가량도유사한경향을보였다. 식이섭취량은모든실험군간에유의차를보이지않았으나, 식이효율은대조군에비해흑마늘과개똥쑥추출혼합물급이군 (MBS-Ⅰ) 에서유의적으로증가하였으며, 그외실험군에서는유의차가작았다. Table 37. Changes of body weight, food intake and FER by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats Groups Initial body weight (g) Final body weight (g) Total body weight gain (g/4 weeks) Food intake (g/day) FER Control 148.33±7.53 1)NS 295.00±10.49 AB2) 146.67±8.16 AB 18.89±0.05 NS 0.24±0.20 AB BG 143.33±21.60 293.33±17.51 AB 150.00±16.73 AB 18.91±0.00 0.25±0.29 BC GS 145.00±5.48 283.33±10.33 A 138.33±7.53 A 18.90±0.03 0.22±0.20 A MBS-Ⅰ 150.00±8.94 306.67±8.16 B 156.67±5.16 B 18.89±0.05 0.26±0.10 C MBS-Ⅱ 146.67±12.11 296.67±5.16 AB 150.00±8.94 AB 18.73±0.44 0.23±0.18 AB 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Means with different superscript in the same column are significantly different at p <0.05 NS Not significant FER: Food efficiency ratio. (2) 장기중량 Table 38은흑마늘과개똥쑥추출혼합물을급이하여 4주간강제운동한후체내장기의중량을측정한결과이다. 간장, 신장, 심장, 지라, 고환및폐의중량을측정하여단위체중 100 g에대한중량으로표시하였다. 신장과폐조직을제외한장기의중량은시료군간에유의적차 - 82 -

이가없었다. 신장의중량은 0.77~0.83 g/100 g bw로개똥쑥추출물급이군 (GS) 의중량이유의적으로가장높았고 MBS-Ⅰ군이가장작았다. 폐의중량은 0.37~0.44 g/100 g bw의범위로모든실험군간에유의차는작았으나, 흑마늘추출물급이군 (BG) 은개똥쑥추출물급이군 (GS) 및혼합물급이군 (MBS-Ⅰ,-Ⅱ) 에비해서다소낮았다. Table 38. Changes of weight of liver, kidney, heart, spleen, testis and lung by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats (g/100 g body weight) Organs Control BG GS MBS-Ⅰ MBS-Ⅱ Liver 2.66±0.13 1)NS 2.87±0.43 2.73±0.08 2.84±0.17 2.74±0.12 Kidney 0.79±0.50 AB2) 0.80±0.36 AB 0.83±0.20 B 0.77±0.40 A 0.79±0.42 AB Heart 0.35±0.03 NS 0.33±0.02 0.34±0.01 0.35±0.01 0.35±0.03 Spleen 0.19±0.02 NS 0.19±0.04 0.20±0.01 0.22±0.01 0.20±0.02 Testis 1.09±0.02 NS 1.00±0.37 1.11±0.04 1.10±0.08 1.12±0.05 Lung 0.40±0.05 AB 0.37±0.06 A 0.44±0.02 B 0.44±0.05 B 0.44±0.01 B 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Means with different superscript in the same column are significantly different at p <0.05 NS Not significant. (3) 혈당함량흑마늘과개똥쑥추출혼합물의농도를달리하여강제운동한흰쥐에게 4주간급이한후혈당을측정한결과는 Fig. 20과같다. 대조군이 157.18 mg/dl으로유의적으로가장낮은함량을보였다. 실험군에서는흑마늘추출물급이군 (BG) 이 210.36 mg/dl로유의적으로가장높았으며, 개똥쑥추출물급이군 (GS) 은 158.80 mg/dl로대조군과유사한수준이었다. 혼합물의경우에는 MBS-Ⅱ군이 MBS-Ⅰ군에비해유의적으로낮았으며, 이는대조군및 GS군과유사하였다. 본연구의결과에서는흑마늘추출물급이군 (BG) 이대조군및여타의실험군에비하여유의적으로높은혈당수준을보였는데, Jain AK et al (1993) 및 Ali M과 Thomson M (1995) 은임상실험결과에서마늘투여로인한혈당의증가는관찰할수없다고보고하였으며, Chang ML과 Johhnson MA (1980) 는고당질식이를섭취했을때마늘및양파등과같은 allium속식물류는인슐린의분비를증가시켜혈당을감소시킨다고고찰한바있어본연구와는다소간상이한점이있었다. 반면에마늘중유리당을분석한결과에서생마늘은 4종, 흑마늘은 6종이검출된바있으며, 흑마늘은생마늘에비해 sucrose 함량은약 1.6배, glucose 함량은약 2배, fructose 의함량은무려 32배정도높았다는보고가있다 (Choi DJ et al, 2008). 더욱이생마늘이흑마늘 - 83 -

로제조되는과정중마늘내의이당류는점차분해되고상대적으로단당류의함량이증가됨으로써이러한단당류가흑마늘의갈변반응에관여하는것으로추정된다는보고도있다 (Shin JH et al, 2008a). 본연구에서흑마늘추출물급이군 (BG) 에서혈당이유의적으로높았던것도시료중당의함량과밀접한관련이있는것으로추측된다. 개똥쑥은폴리페놀및플라보노이드함량이높은것으로보고된바있는데 (Ryu JH et al, 2011a), 폴리페놀성물질은당뇨성산화적스트레스로생성된유리라디칼을효과적으로소거하여혈당의정상화에기여할수있다고보고되어있다 (Ashok Kumar BS et al, 2011). 따라서 MBS-Ⅰ및 MBS-Ⅱ군은흑마늘과개똥쑥의상호작용에의해흑마늘추출물급이군에비해유의적으로혈당을감소시킬수있는것으로판단된다. 이로써개똥쑥은흑마늘에첨가됨으로써흑마늘의당성분에의한혈당상승의저해효과를나타낼것으로예상된다. Fig. 20. Serum glucose level by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats. Values are mean±sd (n=7) A-C Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p<0.05. (4) 혈청총 protein, albumin 및 globulin 함량 Table 39는강제운동과함께흑마늘과개똥쑥추출혼합물을 4주간흰쥐에게급이하였을때혈액내단백질영양상태에미치는영향을알아보고자혈청총단백질, 알부민및글로불린함량을측정한결과이다. 총단백질함량은 6.35~7.21 g/dl범위로실험군간에유의차가없었다. 알부민함량은대조군에서 4.42 g/dl였으며, 개똥쑥추출물급이군 (GS) 이 5.57 g/dl로유의적으로높았으며, 그외실험군은 5.00~5.30 g/dl로비슷한함량으로흑마늘과개똥쑥추출혼합물의농도에따른유의적차이는보이지않았다. 글로불린함량은 1.52~2.21 g/dl의범위로실험군간에유의차가없었다. - 84 -

혈청총단백질함량은체내의아미노산요구량과각단백질의합성율을반영하여체내단백질상태를평가하는데유효한지표로이용된다 (Hwang EH et al, 2001). 혈청알부민은혈청총단백질의 50~70% 를차지하며혈장교질삼투압의유지와각종영양소등의운반에중요한기능을담당하며, 일반적으로총단백질의농도와상관관계를가지며체내단백질대사의좋은지표로이용되고있다 (Lee CU et al, 2007). Table 39. Serum total protein, albumin and globulin level by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats (g/dl) Groups Total protein Albumin Globulin Control 6.35±0.28 1)NS 4.42±0.27 A2) 1.90±0.50 NS BG 7.21±1.07 5.00±0.16 B 2.21±1.09 GS 7.09±0.41 5.57±0.13 C 1.52±0.52 MBS-Ⅰ 6.85±0.11 5.30±0.10 B 1.54±0.18 MBS-Ⅱ 7.11±0.52 5.16±0.42 B 1.95±0.81 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05 NS Not significant. (5) 혈청 BUN 함량강제운동시흑마늘과개똥쑥추출혼합물을급이하여혈액내요소질소함량을측정한결과는 Table 40과같다. BUN(Blood urea nitrogen) 은혈중요소질소로써단백질대사이상을나타내는지표로사용되고있으며고단백질식이, 체단백질의분해, 신장의배설기능장애, 핍뇨, 약물등에의한신장장애시에증가되며, 중증, 간부전, 선천성요소 cycle의결손등에의해감소된다. 더욱이흰쥐의 BUN 정상범위는 5~21 mg/dl 수준으로알려져있다 (Baker HJ et al, 1984). 본연구에서대조군의 BUN 함량은 19.34 mg/dl로흑마늘추출물급이군 (17.47 mg/dl) 과 MBS-Ⅱ군 (16.74 mg/dl) 은대조군에비해유의적으로낮았으며, 대조군을비롯한모든실험군의 BUN 수준은흰쥐의정상범위에속하는것으로확인되었다. 고지방식이에생마늘즙을첨가급이한경우 1% 급이군에서는대조군에비해 BUN 함량의증가가보이지않았으나, 2% 급이군에서유의적으로증가되어 BUN 함량의증가가마늘에의해영향을받는다는보고도있다 (Sheo HJ 1999). 이와같이생마늘의다량복용은신장이나간조직의기능에독성을유발할수있다는지적이있는데, 흑마늘은생마늘과달리고온에서숙성과정을거침으로써폴리페놀화합물이나플라보노이드물질이증가되며, 무기물및아미노산의함량도훨씬높은것으로보고되고있다 (Choi DJ et al, 2008). 따라서본연구결과흑마늘추출물급이군이대조군에비해 BUN 함 - 85 -

량이유의적으로낮은것도상기의보고와관련이있을것으로추정된다. Table 40. BUN content on serum by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats Groups BUN (mg/dl) Control BG GS MBS-Ⅰ MBS-Ⅱ 1) Values are mean±sd (n=7) 19.34±0.96 B1,2) 17.47±0.33 A 18.81±0.37 B 18.72±0.14 B 16.74±0.28 A 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (6) 혈청 AST, ALT 및 ALP 활성강제운동에의한산화적스크레스의유발시흑마늘과개똥쑥추출혼합물을 4주간급이하였을때흑마늘추출물및개똥쑥추출물급이군과비교하여 AST, ALT 및 ALP 활성을측정한결과는 Table 41과같다. Table 41. AST, ALT and ALP activities by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats Groups AST (U) ALT (U) ALP (U) Control 82.33±2.08 1)B2) 23.00±1.00 NS 22.10±1.93 B BG 70.00±7.00 A 21.33±2.08 18.20±0.46 A GS 74.00±3.46 A 22.00±1.73 17.67±1.89 A MBS-Ⅰ 73.67±0.58 A 21.00±0.00 17.58±1.74 A MBS-Ⅱ 74.02±3.00 A 20.67±2.89 16.69±2.35 A AST and ALT ; Karmen unit/ml, ALP ; K-A unit 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05 NS Not significant. 혈중 AST 및 ALT 의활성은산화적스트레스를받게될경우활성이현저히증가된다. 이는 간조직중주로세포내에존재하다가간세포의손상시간세포의막투과성이항진되어혈액 - 86 -

중으로유출되어혈액내에증가되는것으로두효소의활성을측정해봄으로써간손상의정도를알아볼수있다. 특히간염이나알콜성간질환및일반간질환을판정하는데지표로이용되기도한다 (Lee EH & Chyun JH, 2007). ALP는여러가지인산에스터화합물을가수분해시키는효소로골질환, 간질환, 담도질환, 악성종양등에서활성치가상승하는것으로보고된바있다 (Moon YH et al, 2006). 본실험결과 AST 활성도는대조군에서 82.33 Karmen unit/ml로시료급이군에비해유의적으로높았으며, 실험군에서는 70.0~74.0 Karmen unit/ml의범위로유의차가없었다. ALT 활성도는모든실험군간에유의차가없었다. ALP 활성은 AST 활성과비슷한경향이었으며, 실험군에서는 17.58~18.20 K-A unit의범위였다. (7) 혈청총지질, 중성지방및총콜레스테롤의함량 강제운동에의한산화적스트레스가유발된흰쥐에게흑마늘과개똥쑥추출혼합물을급이 한후혈청의총지질, 중성지방및총콜레스테롤의함량을측정한결과는 Table 42 와같다. Table 42. Total lipid, triglyceride and total cholesterol level on serum by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats (mg/dl) Groups Total lipid Triglyceride Total cholesterol Control 182.58±2.89 1)B2) 37.48±3.82 B 70.28±6.54 B BG 179.25±4.33 B 34.92±3.15 AB 66.07±4.01 AB GS 170.92±3.82 A 39.88±3.94 C 65.56±1.08 AB MBS-Ⅰ 166.97±2.96 A 31.35±0.98 A 62.02±0.72 A MBS-Ⅱ 165.50±2.20 A 32.97±0.52 AB 61.00±0.52 A 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05 흑마늘추출물급이군 (BG) 을제외한실험군에서는대조군에비하여혈청중의총지질함량이유의적으로낮은경향이었다. 중성지방은개똥쑥추출물급이군 (GS) 이 39.88 mg/dl으로유의적으로가장높은함량이었으며, 이는대조군보다높은수치였다. 총콜레스테롤은대조군이 70.28 mg/dl로모든실험군은대조군에비해유의적으로낮은수준이었다. Kang MJ et al(2008) 은고지혈증이유발된쥐에게각각생마늘, 찐마늘및흑마늘을급이시킨결과, 흑마늘을급이한실험군에서생마늘과찐마늘을급이한군에비해유의적으로높은지질개선효과를보였으며, Kim SH와 Baek YH(2011) 은유산소운동을수행한흰쥐에흑마늘을 - 87 -

급이한결과, 중성지방과총콜레스테롤함량이시료무첨가군에비해유의적으로감소된경향이었다고보고한바있는데, 이는본연구결과와유사하였다. 혈청지질성분을분석한결과, 전반적으로대조군이실험군에비하여지질함량이높은경향을보였으며, 흑마늘과개똥쑥추출혼합물을급이한실험군이흑마늘및개똥쑥단일추출물급이군보다총지질, 중성지방, 총콜레스테롤의모든항목에서지질함량이유의적으로낮은경향이었다. 또한, 혼합물간의비교에서 MBS-Ⅰ군과 MBS-Ⅱ군간의유의차는보이지않았다. 일반적으로혈청콜레스테롤농도의상승은사람을비롯한동물에서순환기계질환발생의위험인자로알려져왔으며, 식이지방은지질농도의중요한조절인자임이밝혀져왔다 (Grundy SM, 1986; Gurr MI et al, 2002). 따라서생체가산화적스트레스를받을경우흑마늘과개똥쑥추출혼합물의섭취는흑마늘의생리활성을증가시킬수있을것으로기대된다. (8) 혈청 HDL, LDL 및 VLDL-콜레스테롤함량산화적스트레스를받은흰쥐에게흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이에따른혈청 HDL-, LDL- 및 VLDL-콜레스테롤수준의변화는 Table 43과같다. HDL-콜레스테롤함량은모든실험군간에유의차가적었으나, 개똥쑥추출물급이군이다소낮았다. LDL-콜레스테롤함량은대조군이 39.28 mg/dl로유의적으로높았으며, MBS-Ⅰ군및 -Ⅱ군이대조군에비해유의적으로감소되었다. VLDL-콜레스테롤함량은대조군에비해 MBS-Ⅰ군이유의적으로감소된경향이었다. HDL-콜레스테롤은항동맥경화의지표로이용되며, 콜레스테롤을말초혈관에서간조직으로수송을촉진함으로써동맥경화의진행을억제시키거나경감시키는작용을하며 (Gordon T et al, 1977), 일반적으로 좋은콜레스테롤 로널리알려져있다. 개똥쑥추출물급이군은흑마늘추출물급이군에비해 HDL-콜레스테롤의함량이유의적으로낮았으나, 이들흑마늘과개똥쑥의추출혼합물의급이시에는개똥쑥단일추출물의급이보다 HDL-콜레스테롤의함량이상승하여흑마늘추출물급이군과유사한수준이었다. 혈관내에콜레스테롤을축적하여동맥경화증과심장질환의발병을증가시키며 (Lichtenstein AH et al, 2006; Rosamond W et al, 2008), 일명 나쁜콜레스테롤 로통하는 LDL-콜레스테롤의함량은대조군과흑마늘또는개똥쑥단일추출물급이군간에유의적인차이가없었다. 반면에혼합물의급이시에는유의적으로감소되는결과였는데, 특히혼합물의농도가높을수록 LDL-콜레스테롤의감소는더욱효과적이었다. 전반적으로혼합물의경우농도에따른콜레스테롤수준에대차를보이지는않았으며, 흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이시이들의단일추출물의급이보다 HDL-콜레스테롤의함량은증가하고 LDL- 및 VLDL-콜레스테롤의함량은감소할것으로예측되었다. 즉, 체내지질개선의약물요법으로사용되는합성의약품들은 LDL-콜레스테롤이나중성지방을감소시키는반면복통, 소화불량, 고혈당, 망막병증, 불면증, 근육병증등의부작용이따르기도하는데 (Cha BY, 2001), 이러한부작용을최소화할수있고체내지질개선효과가뛰어난천연소재의개발이 - 88 -

절실히필요한현재의상황에서흑마늘과개똥쑥추출혼합물은충분히매력적인소재가될 수있을것으로생각된다. Table 43. HDL-, LDL- and VLDL-cholesterol level on serum by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats (mg/dl) Groups HDL LDL VLDL Control 23.45±2.18 1)AB2) 39.28±7.83 C 7.69±0.81 B BG 26.88±5.97 B 35.23±3.41 BC 6.88±0.73 AB GS 19.44±5.02 A 36.48±3.24 BC 7.62±0.42 B MBS-Ⅰ 25.98±2.08 B 30.92±1.56 AB 6.24±0.24 A MBS-Ⅱ 29.23±3.33 B 25.15±0.48 A 6.72±0.28 AB 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05 (9) 간조직의총지질, 중성지방및총콜레스테롤의함량강제운동으로산화적스트레스가유발된흰쥐에게흑마늘및개똥쑥추출혼합물의급이시간조직의지질성분변화에미치는영향을측정한결과는 Table 44에나타내었다. 총지질은 26.98 mg/g인대조군에비하여실험군에서는 22.40~25.21 mg/g으로대조군에비해유의적으로낮은함량이었다. 특히흑마늘추출물급이군 (BG) 과 MBS-Ⅰ군에서가장낮앗다. 중성지방함량은대조군에비해흑마늘추출물급이군에서유의적으로낮았으며, 개똥쑥추출물급이군은대조군과비슷한수준이었다. 또한 MBS-Ⅰ군과 MBS-Ⅱ군은시료의농도에따른유의차를보이지않았다. 총콜레스테롤함량도대조군에비해흑마늘추출물급이군에서유의적으로가장낮은함량이었다. 개똥쑥추출물급이군은대조군과비슷한수준이었다. 흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이군은시료의농도에따른유의차를보이지않았다. 식물류중에존재하는페놀성화합물은동물체의혈액 (Woo MN et al, 2009) 및간조직 (Jain AK et al, 1993) 의지질함량을감소시키는것으로알려져있으며, 마늘생리활성의주요인자인 allicin 역시체내지질함량을낮추는주된물질로보고되어있다 (Yu YY & Shaw MY, 1994). 본연구에서는대조군에비하여실험군에서흑마늘이나개똥쑥의추출물급이시체내지질수준이감소되는경향이었는데, 개똥쑥추출물의급이시총지질함량에는유의적인감소를보였으나, 중성지방과총콜레스테롤함량은대조군과유의적차이를보이지않아흑마늘과개똥쑥추출혼합물의지질개선효과는흑마늘중의 allicin이나갈변물질등의항산화물질에의한영향이크게작용할것으로생각된다. - 89 -

Table 44. Total lipid, triglyceride and total cholesterol level on liver tissue serum by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats (mg/g liver tissue) Groups Total lipid Triglyceride Total cholesterol Control 26.98±0.73 1)C2) 11.11±0.77 B 2.94±0.06 C BG 23.13±0.78 A 8.66±0.12 A 2.26±0.08 A GS 25.21±0.42 B 11.40±0.69 B 2.86±0.05 C MBS-Ⅰ 22.40±1.43 A 8.96±0.74 A 2.48±0.07 B MBS-Ⅱ 22.79±1.49 A 9.53±1.18 A 2.39±0.08 B 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05 (10) 혈청및간조직의항산화활성 흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이가강제운동에의한산화적스트레스유발시흰쥐의혈 청및간조직의항산화활성에미치는영향을측정한결과는 Table 45 와같다. Table 45. Antioxidant activity by DPPH radical scavenging on serum by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats Groups Antioxidant activity by DPPH radical scavenging (%) In serum In liver Control 29.86±0.66 1)A2) 49.63±1.64 A BG 33.81±2.44 B 53.42±0.71 B GS 36.84±2.42 C 55.77±0.84 CD MBS-Ⅰ 38.00±2.34 C 53.75±0.65 BC MBS-Ⅱ 39.43±1.24 C 57.09±2.55 D 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05 시료추출물을급이한실험군에서항산화활성은대조군보다유의적으로높았으며, 개똥쑥추출물급이군은흑마늘추출물급이군보다유의적으로높은활성이었다. 흑마늘과개똥쑥추출혼합물은농도에따른항산화활성의유의적인차이는없었으나, 흑마늘추출물급이군에비해서는혼합물에서유의적으로활성이높았다. 간조직의항산화활성은혈청에비해전반적으로높았으며, 혈청의항산화활성과마찬가지 - 90 -

로실험군의활성이대조군보다유의적으로높았다. 더욱이흑마늘추출물급이군에비해개똥쑥추출물급이군과 MBS-Ⅱ군에서유의적으로높은활성을보였다. 특히, 흑마늘과개똥쑥추출혼합물에서도농도가높은 MBS-Ⅱ군이 57.09% 로 MBS-Ⅰ군 (53.75%) 보다유의적으로항산화활성이높았다. 양파와마늘과같은 allium속식물류에함유된플라보노이드와항산화활성은밀접한관련이있으며 (Haenen GR et al, 1997), Ćavar S et al(2012) 과 Ryu JH et al(2011a,b) 은개똥쑥의항산화활성이시료중의페놀성화합물에의존적이라고한점을미루어볼때흑마늘및개똥쑥추출물의섭취는산화적스트레스시흰쥐의혈액및간조직의항산화활성유지또는증가에대한기여도가높을것으로사료된다. 따라서흑마늘과개똥쑥추출혼합물은생체내산화적스트레스시높은유리라디칼소거능력을가짐으로써산화적스트레스를완화시킬수있을것으로생각된다. (11) 혈청및간조직의 TBARS 함량흑마늘과개똥쑥추출혼합물이강제운동에의한산화적스트레스를유발한흰쥐에서체내지질과산화물의변화에미치는영향은 Table 46과같다. 지질과산화물은 TBARS 함량으로나타내었으며, 혈청및간조직모두대조군에비하여실험군의지질과산화물함량이유의적으로감소되었다. 혈청의경우에는 31.16~34.67 mmol/ml로실험군간에유의차가작았으나간조직의경우에는 205.17~218.60 mmol/g으로실험군간에유의적인차이를보였다. 특히, 실험군중항산화활성이가장낮았던흑마늘추출물급이군에서지질과산화물함량이가장많았으며, 항산화활성이가장높았던 MBS-Ⅱ군에서는지질과산화물의함량이오히려낮은경향을보여시료추출물의항산화활성과지질과산화물의생성간에는음 (-) 의상관관계가성립되었다. Table 46. TBARS contents on serum and liver tissue by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats Groups In serum (mmol/ml) TBARS contents In liver (mmol/g) Control 41.60±2.30 1)C2) 238.72±4.40 D BG 33.11±2.17 AB 218.60±5.31 C GS 34.67±2.38 B 210.33±4.13 AB MBS-Ⅰ 31.16±1.81 A 214.73±2.88 BC MBS-Ⅱ 31.78±1.05 AB 205.17±5.37 A 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05-91 -

산화적스트레스는체내의활성산화물과항산화물질사이의불균형으로일어나며 (Gutteridge JMC & Halliwell B, 1994), 운동으로인한지질과산화물이나 malondialdehyde 함량의증가에대한많은선행연구를볼때 (Kanter MM et al, 1993; Allessio HM, 1993), 본연구결과강제운동을통하여체내에축적된활성산화성물질이흑마늘과개똥쑥추출물중에존재하는페놀성물질을비롯한여러항산화인자에의해제거됨으로써산화적스트레스가감소되는것으로추정된다. Haenen GR et al (1997) 은 allium속식물류에함유된플라보노이드는항산화효소의활성증가및직접적인유리라디칼의제거제로작용하여체내과산화지질의생성을억제함으로써조직을보호한다고보고한바있다. (12) 간조직의항산화효소활성산화적스트레스가유발된흰쥐에게흑마늘과개똥쑥추출혼합물을급이하였을때간조직의항산화효소활성에미치는영향을측정한결과는 Table 47과같다. 세포질의항산화계 (cytosolic antioxidant system) 는복잡한기전으로이루어지며, catalase는과산화수소를주로제거하고 superoxide dismutase(sod) 는 superoxide 라디칼을제거한다. Glutathione peroxidase (GSH-px) 는과산화수소제거, 해독작용, 손상된세포의복구등다양한역할에관여하는데특히, DNA의파괴또는변형과같은손상을복구하는역할도신속하게진행시킨다 (Niess AM et al, 1999). Table 47. Catalase, SOD and GSH-px activities by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk extract in exercised rats Groups Catalase SOD GSH-px mitochondrial fr. microsomal fr. cytosolic fr. cytosolic fr. Control 0.66±0.08 1)A2) 1.17±0.13 A 32.89±2.96 A 193.92±26.46 A BG 0.74±0.08 A 1.28±0.07 A 41.07±2.30 B 230.12±11.78 B GS 1.20±0.06 B 1.24±0.05 A 48.19±1.50 D 281.76±14.22 C MBS-Ⅰ 1.54±0.11 C 2.17±0.05 B 42.38±4.21 BC 278.69±19.30 C MBS-Ⅱ 1.41±0.06 C 2.32±0.30 B 47.37±2.88 CD 319.25±7.43 D Catalase; μmol/min/mg protein, SOD; U/min/mg protein, GSH-px; nmol/min/mg protein 1) Values are mean±sd (n=7) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05 본실험결과모든항산화계효소의활성이대조군에비해실험군에서높았는데, 특히 microsome 분획물에서 catalase 활성을제외하고는개똥쑥추출물급이군이흑마늘추출물급 이군보다유의적으로높은경향을보여이는 DPPH 라디칼소거에의한항산화활성 (Table 45) - 92 -

과도유사한경향이었다. 또한흑마늘과개똥쑥추출혼합물은흑마늘과개똥쑥단일추출물보다활성이높았으나, 혼합물 (MBS-Ⅰ, Ⅱ) 에서농도에따른활성의차이는작았다. 생체내의산화작용의주된요인으로작용하는활성산소는탈진운동에관계된대사에서발생한다는보고가있으며 (Davies KJ et al, 1982), 또한인간의근육운동은운동시와회복기에라디칼을발생시키고특히강도높은운동시활성산소의생성이증가된다는학설이광범위하게받아들여지고있다 (Davies KJ et al, 1982; Jenkins RR, 1988; Parker L, 1998). 강제운동을통하여산화적스트레스를유발시킨흰쥐에게흑마늘또는개똥쑥추출물및이들의혼합물을급이한결과 catalase, SOD 및 GSH-px 등의항산화효소활성도가증가되는것을확인할수있었으며, 특히흑마늘과개똥쑥의추출혼합물급이군은단일추출물의급이군에비해활성이높아지는것으로볼때이들추출물들을혼합함으로써시너지효과가나타나는것을예상할수있었다. Yoon GA (2007) 은운동을통하여스트레스를유발시킨흰쥐에마늘을급이시켜 catalase 및 SOD의활성을측정한결과, 마늘급이군의 catalase 활성이마늘을급이하지않은운동군보다높았고, SOD 활성의경우에는운동군뿐만아니라정상군보다높은결과를보인다고하였으며, 제 2형당뇨쥐를대상으로동결건조한마늘과흑마늘을섭취시킨결과또한항산화효소활성이증가하였다는보고도있다 (Lee YM et al, 2009). Allicin을함유하고있는물질을섭취시켰을때 malondialdehyde와같은지질과산화물의생성은억제되고 SOD, catalase, GSH-px 등의항산화효소의활성은증가되었다는보고 (Lee YM et al, 2009) 와흑마늘과개똥쑥의항산화활성에관여하는주요물질이플라보노이드와폴리페놀성물질이라는연구결과 (Haenen GR et al, 1997; Ćavar S et al, 2012) 로미루어볼때, 본연구에서흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이시생체내항산화효소계의활성을높일수있을것으로해석된다. 상기의결과로부터흑마늘과개똥쑥의혼합물은흑마늘이나개똥쑥의단일추출물보다활성이우수하였으나추출물의농도에따른차이는작았기때문에적정농도는추출물제조에따른경제성을고려해볼때 MBS-Ⅰ이효과적일것으로판단되었다. 6) 강제운동부하시흑마늘과개똥쑥추출혼합물의적정섭취량분석강제운동부하에의해산화적스트레스가발생되는과정에서흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이시생리기능증대에효과적인혼합비율로 MBS-Ⅰ을선정하였으며, 이에따른적정섭취량을알아보고자하였다. (1) 체중변화, 식이섭취량, 및식이효율트레드밀에의한강제운동으로산화적스트레스를유발할때흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (7 brix+ 0.7 brix, 93:7, MBS-Ⅰ) 의급이는흑마늘이나개똥쑥단일추출물의급이보다효과적으로체내지질저하및항산화계의활성을나타내었다. 이어서혼합물의급이량을달리하여섭취시킬때생체내산화적스트레스에미치는영향을알아보고자 MBS-Ⅰ의섭취량을체중 60 kg - 93 -

인성인을기준으로하여 1일 100 ml, 200 ml 및 400 ml의섭취량으로조절하여흰쥐에게급이하였다. 이때체중변화, 식이섭취량및식이효율은 Table 48에나타내었다. 실험사육 4주후최종체중은 276.00~288.00 g으로대조군과비교해볼때 MBS-100과 MBS-200군은유의차가없었으나, MBS-400군은유의적으로감소되었다. Table 48. Changes of body weight, food intake and FER by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Groups Final body weight (g) Body weight gain (g/4 weeks) Food intake (g/day) FER Control 288.00±8.37 B1,2) 146.00±8.94 B 18.88±0.06 B 23.50±1.84A AB MBS-100 282.00±5.70 AB 139.00±8.94 AB 18.73±0.17 B 24.00±0.71 AB MBS-200 281.00±9.62 AB 134.00±5.48 A 18.65±0.16 AB 24.20±0.84 B MBS-400 276.00±4.13 A 135.00±5.00 A 18.46±0.28 A 22.40±1.14 A 1) Values are mean±sd (n=5) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. 이러한현상은체중증가량에서도볼수있었는데, 흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이로전반적인체중의증가가대조군에비해작은것으로나타났다. 식이섭취량은 MBS-200과 MBS-400군에서만대조군에비해유의적으로감소되었으며, MBS-100군의경우에는식이섭취량의조절에영향을미치지않는것으로생각되었다. 식이효율은 MBS-200군에서다소높았으며, 이는대조군과유의차는없었으나, MBS-400군에비해서는유의적으로높았다. 따라서 MBS-400 군에서볼수있듯이 1일 400 ml의섭취량은체중증가는감소시킬수있으나, 식이섭취량및식이효율을저하시키므로이러한관점에서볼때 200 ml/day의섭취량이적절하리라생각된다. (2) AST 및 ALT 활성강제운동에의한산화적스트레스시흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의급이에따른간기능지표인 AST 및 ALT 활성은 Table 49와같다. AST 활성은 MBS-400군이여타의실험군에비해유의적으로감소된경향이었으며, 그외의실험군에서는유의차가없었다. ALT 활성도 AST 활성과유사한경향이었다. 20% 의알코올을 4주간급이함으로써간손상에따른스트레스유발시마늘과한약재추출물의혼합급이는 AST 및 ALT 활성도를감소시키는데, 마늘추출물의농도가 0.5% 인경우보다 1% 일때유의적인차이를보였다는보고가있다 (Lee SJ et al, 2009). 한약재를비롯한식물류의조성물은알코올을섭취한흰쥐에급이시킬때 AST 및 ALT 활성도를감소시킴으로써간손상억제효과가있다는보고도있다 (Zheng CX et al, 2004). - 94 -

반면에생마늘, 찐마늘및흑마늘의동결건조분말을고콜레스테롤혈증유발흰쥐에급이시 AST 및 ALT 활성도가시료간에유의차를보이지않았는데 (Kang MJ et al, 2008), 본연구결과에서흑마늘추출물은대조군에비해유의적으로 AST 활성을감소시켰으나, ALT 활성의감소에는영향을주지않았다. 흑마늘의진한흑색을완화시켜제조한적갈색의홍마늘추출물을비만유도흰쥐에농도별로급이한결과 AST 활성은 3% 이상급이시, ALT 활성은 1% 이상급이시대조군에비해유의적으로감소되었다고보고된바있다 (Lee SJ et al, 2011). 이러한결과는 AST 및 ALT 활성이시료의항산화활성과관련이있으므로홍마늘의비만쥐에대한 AST 및 ALT 활성의감소는시료중의페놀화합물이나갈변물질등에기인한다고보고되어있다. Table 49. AST and ALT activities by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats (Karmen unit/ml) Groups AST ALT Control 82.33±2.08 B1,2) 23.00±1.00 B MBS-100 81.50±1.32 B 23.75±0.44 B MBS-200 80.33±1.53 B 23.50±1.32 B MBS-400 74.17±1.04 A 20.67±0.58 A 1) Values are mean±sd (n=5) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (3) 혈중지질성분강제운동에의한산화적스트레스시흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의급이에따른혈중지질성분은 Table 50과같다. 혈중총지질함량은대조군이 182.58 mg/dl로흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이군보다유의적으로높았으며, MBS-100과 MBS-200군은대조군에비해유의차는있으나, 감소폭이낮았다. MBS-400군은대조군에비해약 7% 감소하였다. 중성지방함량은대조군에비해 MBS-100군은유의차를보이지는않았으나, 다소상승된경향이었다. MBS-200 및 MBS-400군은대조군과유의차는적었으나, 다소감소된경향이었으며, MBS-100군과비교해보아유의적으로감소된수준이었다. 총콜레스테롤함량은대조군의경우 73.62 mg/dl로흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이군에비해유의적으로높았으며, MBS-100군에서는유의차를보이지않았으나, 시료의급이량이많아짐에따라유의적인차이로감소되는경향이었다. 마늘의황화합물함량은양파나브로컬리의약 4배에이르며마늘의효과에대한 90% 이상의연구결과가황화합물을중심으로수행되어있다 (Wood D, 2001). 마늘의지질저하작용은이 - 95 -

미알려진바있으며 (Sheo HJ, 1999; Kang MJ et al, 2008), 마늘과식물류의복합처방시혈중콜레스테롤수준은대조군에비해약 20% 정도, 중성지방은약 15% 정도감소되었으나마늘의첨가량에따른유의차는없는것으로보고되어마늘과식물류의상호작용때문이라고보고되어있다 (Shin JH et al, 2010b). Table 50. Total lipid, triglyceride and total cholesterol level on serum by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats (mg/dl) Groups Total lipid Triglyceride Total cholesterol Control 182.58±2.89 C1,2) 37.48±3.82 AB 73.62±1.71 C MBS-100 177.63±2.88 B 39.88±3.94 B 72.28±0.87 C MBS-200 175.53±1.30 B 35.10±0.80 A 69.34±0.98 B MBS-400 169.53±0.65 A 34.95±0.73 A 65.20±1.07 A 1) Values are mean±sd (n=5) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (4) 간조직중의지질성분 산화적스트레스를유발한흰쥐에흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의함량을달리하여 4 주간급이한후간조직의지질성분을분석한결과는 Table 51 과같다. Table 51. Total lipid, triglyceride and total cholesterol level on liver tissue by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats (mg/g liver tissue) Groups Total lipid Triglyceride Total cholesterol Control 27.14±1.01 B1,2) 12.04±0.33 NS 2.94±0.06 B MBS-100 27.25±0.70 B 11.90±0.48 2.96±0.03 B MBS-200 24.78±0.46 A 11.95±0.77 2.90±0.02 AB MBS-400 23.70±1.07 A 11.23±0.24 2.83±0.02 A 1) Values are mean±sd (n=5) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. 총지질함량은대조군이 27.14 mg/g 이었으며, MBS-100 군은대조군과유의차가없었다. - 96 -

MBS-200 및 MBS-400군은대조군에비해유의적으로감소되었다. 증성지방함량은대조군에비해시료급이시다소간감소되기는하였으나, 전실험군간에유의차가없었다. 총콜레스테롤함량은대조군이 2.94 mg/g이었으며, MBS-100 및 MBS-200군은대조군과유의차가없었으나, MBS-400군은 2.83 mg/g으로대조군에비해유의적으로낮은함량이었다. 따라서산화적스트레스를감소하기위한흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의적정섭취량은 200~400 ml/ 일의범위가적정수준이라고생각된다. 마늘은간지방합성효소를억제함으로써간조직에지방축적을감소시키고, 혈중콜레스테롤을개선시키는효과가있다. 고콜레스테롤식이성흰쥐에마늘과한약재의복합처방시간조직의총지질함량은대조군에비해유의적으로감소되어졌으며, 마늘추출물의첨가량이총식이량에대해 0.3%, 0.5% 및 0.7% 로증가되어졌을때 0.7% 의농도로첨가될경우유의적인효과를보이는것으로보고된바있다 (Lee SJ et al, 2009). 이러한현상은간조직의총콜레스테롤및중성지방의함량에서도유사한경향으로나타났다. 따라서마늘이식이중에첨가되어질때유효효과를내기위한섭취량에는한계량이있을것으로추정된다. 본연구에서도흑마늘과개똥쑥추출혼합물의경우성인 60 kg 체중을기준으로할때 200 400 ml/ 일의범위가산화적스트레스에의한체내지질개선에유효섭취량인것으로생각된다. (5) 혈청및간조직의항산화활성흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의급이가강제운동에의한산화적스트레스를유발한흰쥐에서혈청및간조직의항산화활성을 DPPH 라디칼소거에의해측정한결과는 Table 52와같다. 혈청의항산화활성은대조군에서 29.86% 였으며, MBS-100군은대조군과유사한수준이었다. MBS-200군은 32.13% 였으며, MBS-400군은 39.55% 로 200 ml/ 일이상급이시항산화활성에유의적인증가현상을볼수있었다. 간조직의항산화활성은대조군에서 49.01% 였으며, MBS-100 및 MBS-200군은대조군과유의차를보이지않았다. MBS-400군에서 57.01% 으로 400 ml/ 일이상급이시비로소간조직의항산화활성이유의적으로증가되는현상이었다. Table 52. Antioxidant activity with DPPH radical scavenging on serum by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Antioxidant activity by DPPH radical scavenging (%) Groups In serum In liver Control 29.86±0.66 A1,2) 49.01±1.56 A MBS-100 29.83±0.67 A 49.52±0.68 A MBS-200 32.13±1.75 B 50.03±0.40 A MBS-400 39.55±0.73 C 57.01±0.75 B 1) Values are mean±sd (n=5) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. - 97 -

Chung ST et al(2000) 은흰쥐의최대운동시복합항산화제를급이한결과비급이군에비해지질과산화물의함량이유의적으로감소되었으며, 체내지질과산화물의함량은운동의유무보다는이러한항산화제의섭취유무에더욱의존적인것으로보고된바있다. 인체를대상으로한경우에도 β-카로틴, 비타민 C, 비타민 E 등의항산화복합제제를 5주간섭취시킨후최대산소섭취량의 60% 및 90% 수준의운동을수행하였을때혈액중지질과산화물함량은운동의강도와는관계없이항산화제급이군에서모두유의적인효과를보였으나, 65% 의운동강도에서는항산화제급이에따른차이가없었다고보고되어있다 (Kanter MM et al, 1993). 따라서항산화제의섭취는운동방법이나강도에따라서는상이한결과를보일수있으나, 이들물질의장기적인섭취는산화적손상으로부터생체보호에긍정적인효과를얻을수있을것으로예상된다. (6) 간조직의항산화효소활성강제운동에의한산화적스트레스유발시흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의급이가흰쥐의간조직중항산화효소활성에미치는영향을측정한결과는 Table 53과같다. Catalase, SOD 및 GSH-px 활성은대조군에비해 MBS-Ⅰ을급이한실험군에서효소활성이증가하는현상을보였다. 그러나 MBS-100군은대조군과유의적인차이를보이지않아 100 ml/ 일의혼합물급이는산화적스트레스의감소에두드러진영향을주지않는것으로판단되었다. MBS-200 및 MBS-400군은대조군에비해유의적으로높았으며, 급이량에따른 (+) 의관계를보였다. 쑥추출물을환경오염물질의일종인벤조피렌을투여한흰쥐에게급이시대조군에비해약 20% 정도로항산화효소활성이증가되었다는보고가있다 (Nam SM et al, 1999). 특히쑥의에탄올추출물은 glutathione sulfur transferase(gst) 를활성화시켜활성화된친전자성외부물질에 glutathione을포함시켜물에용해성이증가된물질로변화시켜배설되기용이하도록하여벤조피렌으로부터간손상을방어하는것으로간주되고있다 (Kitahara A et al, 1984). SOD 활성은생체내효소적방어기구의일종으로 superoxide radical을 H 2 O 2 로환원시키므로산소독으로부터생체를보호하는데, 본연구결과강제운동에의해발생된생체내산화적스트레스현상이가속화되어대조군에서는효소활성이감소되었으나, 흑마늘과개똥쑥추출혼합물의급이로산화적손상이다소간완화되는것으로짐작된다. 이러한산화적스트레스로부터생체내대사과정에서유리라디칼이나지질과산화물이지속적으로생성되는데, 생체내에서는이들의축적을저해하는 SOD, GSH-px 등의산화적방어체계가있으나, 산화적스트레스가과도할경우에는방어체계를보완할수있는생리기능성물질이요구되어진다. 따라서상기의결과로볼때흑마늘과개똥쑥추출혼합물의 200 400 ml/ 일의급이는대조군에비해전반적으로유의적인효과를나타내어산화적스트레스에의한생체방어시스템의유지또는보강을위한적절한섭취량인것으로판단된다. - 98 -

Table 53. Catalase, SOD and GSH-px activities by supplementation of black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Groups Catalase SOD GSH-px mitochondrial fr. cytosolic fr. cytosolic fr. Control 0.66±0.06 A1,2) 33.57±2.77 A 196.92±6.70 A MBS-100 0.72±0.03 A 35.36±0.80 A 203.38±7.68 A MBS-200 0.95±0.13 B 40.79±2.76 B 213.38±3.62 B MBS-400 1.27±0.03 C 48.63±1.29 C 250.65±4.40 C Catalase ; μmol/min/mg protein, SOD ; U/min/mg protein, GSH-px ; nmol/min/mg protein 1) Values are mean±sd (n=5) 2) Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. 7) 흑마늘과개똥쑥혼합에의한개발제품의 in vivo 생리활성강제운동부하에의해산화적스트레스를발생시키는과정에서흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의효과적인적정섭취량을구명하였으며, 이를베이스로하여개발된제품이동일조건에서 in vivo 생리활성에미치는영향을알아보고자하였다. (1) 식이섭취량, 식이효율및장기중량강제운동에의한산화적스트레스유발시흑마늘과개똥쑥추출혼합물 (MBS-Ⅰ) 의생체내항산화체계활성화에유효한섭취량은 200~400 ml/ 일인것으로나타났다. 따라서흑마늘과개똥쑥추출혼합물을베이스로하여배추출농축액과결정과당등을첨가하여제조한개발제품을 1협동기관으로부터제공받아 300 ml/ 일을기준으로급이하여상기와동일한조건에서실험사육하였다. 식이섭취량, 체중증가량, 식이효율및장기중량을측정한결과는 Table 54와같다. 강제운동에따른 1일식이섭취량, 4주간의총체중증가량및식이효율은대조군과개발제품 (MBS-p) 급이군간에유의차가없었다. 장기중량은간장, 신장, 심장및고환의중량에서대조군과개발제품 (MBS-p) 급이군간에유의차가없었으나, 비장의중량은개발제품급이군에서다소높았다. - 99 -

Table 54. Food intake, body weight gain, FER and organ weight by supplementation of product(mbs-p) based on the black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Analytical items Control MBS-p Food intake (g) 18.81±0.15 NS1) 18.82±0.22 Body weight gain (g/4 weeks) 149.17±2.04 NS 148.33±2.58 FER 23.72±1.73 NS 23.62±0.91 Organ weight (g/100 g body weight) Liver 2.70±0.07 NS 2.72±0.03 Kidney 0.78±0.07 NS 0.79±0.03 Heart 0.34±0.03 NS 0.34±0.01 Spleen 0.19±0.01 0.21±0.02 * Testis 1.09±0.02 NS 1.08±0.10 1) Values are mean±sd (n=9) * Mean compared between control and MBS-p are significantly different by student t-test at p <0.05. NS : Not significant. (2) 혈중단백성분및간기능효소활성산화적스트레스를유발한흰쥐에흑마늘과개똥쑥추출혼합물의개발제품을급이하여혈액내단백성분을측정한결과는 Table 55에나타내었다. 총단백질과알부민함량은대조군과실험군간에유의차가없었다. 혈중요소질소함량은개발제품급이군에서유의적으로높았다. 간기능지표효소로알려진 AST 활성은대조군에비해개발제품급이군에서유의적으로낮았으나, ALT 활성은두군간에유의차가없었다 (Table 55). Table 55. Total protein, albumin, BUN contents and AST, ALT activities by supplementation of product(mbs-p) based on the black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Analytical items Control MBS-p Total protein (g/dl) 6.13±0.20 NS1) 6.24±0.10 Albumin (g/dl) 3.95±0.09 NS 3.59±0.20 BUN (mg/dl) 10.67±0.79 13.03±1.10 * AST (Karmen unit/ml) 70.25±3.77 * 64.50±2.38 ALT (Karmen unit/ml) 24.25±1.71 NS 22.50±0.58 1) Values are mean±sd (n=9) * Mean compared between control and MBS-p are significantly different by student t-test at p <0.05. NS : Not significant. - 100 -

Albumin은혈청단백질의대부분을차지하는데, 유리기와전이금속이온의소거물질로알려져있다 (Soriani M et al, 1994). 본연구결과산화적스트레스시 MBS-p의급이는혈액내단백성분의함량변화에는두드러진영향을주지못하는것으로판단된다. 본연구에서흑마늘추출물은고콜레스테롤식이성흰쥐의 AST 활성을유의적으로감소시키지못하였으나 (Kang MJ et al, 2008), 본연구결과에서흑마늘과개똥쑥의추출혼합물은 400 ml/ 일급이시산화적스트레스가유발된흰쥐의 AST 활성을유의적으로감소시켰다 (Table 49). Table 55에서보는바와같이흑마늘과개똥쑥의추출혼합물을베이스로한개발제품의경우에도 300 ml/ 일급이시 AST의활성감소에유의적인것으로나타났다. 이러한결과는시료중에함유된개똥쑥에기인된것으로추정되어진다. 이는마늘과한약재의혼합물이알코올성산화적스트레스에서 AST 활성을감소시켰다는보고 (Lee SJ et al, 2009) 로미루어짐작해볼수있다. (3) 혈청및간조직의지질성분강제운동에의한산화적스트레스시흑마늘과개똥쑥추출혼합물의개발제품급이에따른흰쥐의혈청및간조직의지질성분을측정한결과는 Table 56과같다. 혈청내총지질및총콜레스테롤함량은개발제품급이군이대조군에비해유의적으로감소되었다. 중성지방및 HDL-콜레스테롤함량은대조군과유의차가없었다. 간조직의총지질, 중성지방및총콜레스테롤함량은대조군과개발제품급이군간에유의차가없었다. Table 56. The lipids profiles on serum and liver tissue by supplementation of product(mbs-p) based on the black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Lipid profiles Control MBS-p In serum (mg/dl) Total lipid 267.83±4.07 *1) 251.52±4.09 Triglyceride 38.14±3.34 NS 36.21±3.13 Total cholesterol 71.53±4.54 * 64.55±1.15 HDL-cholesterol 24.67±2.39 NS 27.13±2.56 In liver (mg/g) Total lipid 27.75±1.15 NS 26.11±1.48 Triglyceride 13.50±1.68 NS 11.86±0.18 Total cholesterol 2.71±0.20 NS 2.30±0.21 1) Values are mean±sd (n=9) * Mean compared between control and MBS-p are significantly different by student t-test at p <0.05. NS : Not significant. - 101 -

운동은혈중콜레스테롤및중성지방함량을감소시키는데, 더욱이고에너지식이를한흰쥐에서인슐린감수성을상승시키고, glucose 내성을개선시키는것으로알려져있다 (Kibenge MT & Chan CB, 2002). 따라서운동은에너지소비로인한체중감량뿐만아니라지질과 glucose 의이용을향상시키게된다. 인체를대상으로장시간의유산소성운동에서마늘의섭취는혈중총콜레스테롤및 LDL-콜레스테롤수준을유의적으로감소시키며, 특히 HDL-콜레스테롤의유의적인증가경향을보였다는보고가있다 (Baek YH, 1995). 또한흰쥐에서운동으로산화적스트레스를유발한경우마늘의섭취는혈액내총콜레스테롤및중성지방함량이다소간낮아지기는하였으나대조군과유의차는없는것으로보고된바있다 (Yoon GA, 2007). 마늘이나마늘조제품이혈중지질성분변화에영향을주는명확한기작은알려져있지않으나, 간조직중지질합성및콜레스테롤합성에관여하는효소의활성을억제하는데 (Yeh YY & Liu L, 2001), 특히황화합물을포함하는마늘추출물이효과적으로혈중콜레스테롤수준을저하시키며, allicin, ajoene, S-allylcysteine, diallyl disulfide 등이효능을내는주요물질로알려져있다 (Yeh YY & Liu L, 2001). 따라서이들황화합물은생마늘에비해흑마늘에그함량이높기때문에본연구결과흑마늘은개똥쑥과함께혼합될경우흑마늘의황화합물과개똥쑥의페놀성화합물 (Ryu JH et al, 2011a,b) 에의해그생리기능을상승시키는데효과적일것으로생각된다. (4) 항산화활성및지질과산화물함량흑마늘과개똥쑥의추출혼합물을베이스로한개발제품을산화적스트레스유발흰쥐에게급이하여혈청및간조직의항산화활성과지질과산화물의함량을측정하였다 (Table 57). 항산화활성은 DPPH 라디칼소거활성으로측정하였는데, 대조군이 26.10% 였으며, 개발제품급이군에서는 39.72% 로유의적인증가를보였다. 간조직도이와유사한경향으로대조군이 48.16% 였으며, 개발제품급이군이 54.29% 로흑마늘과개똥쑥의추출혼합물을베이스로개발된제품의섭취시생체내항산화체계의유지나증강에유효할것으로추정되었다. 지질과산화물의함량은대조군이 47.98 mmol/ml였으며, 개발제품급이군에서는 31.54 mmol/ml로약 34% 정도가감소된것으로나타났다. 간조직의지질과산화물의함량도대조군에서유의적으로높았는데, 개발제품급이시대조군에비해약 21% 정도감소되었다. 생체의지질과산화반응은여러종류의독성화합물이나약물에의한간손상기전으로세포내산화적스트레스로유리라디칼의생성증가, 항산화적방어능력의감소로초래된다. 더욱이이는생체내대사이상을일으키고 DNA 손상, 발암, 돌연변이, 유전자의손실, 및노화기전으로도알려져있다 (Halliwell B & Gutteridge JM, 1984). 이러한조직의과산화적손상의지표가되는간조직의과산화물함량이 MBS-p의급이로유의적인감소를보여흑마늘과개똥쑥은일상생활에서의산화적스트레스로동반될수있는과산화적손상의방지를위한우수한기능성식품으로이용될수있을것으로보여진다. - 102 -

Table 57. Antioxidant activity and TBARS content on serum and liver tissue by supplementation of product(mbs-p) based on the black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Analytical items Control MBS-p Antioxidant activity In serum (%) 26.10±1.24 1) 39.72±1.91 * In liver (%) 48.16±1.22 54.29±1.33 * Lipid peroxide content In serum (mmol/ml) 47.98±2.50 * 31.54±5.24 In liver (mmol/g) 191.87±3.20 * 151.41±1.85 1) Values are mean±sd (n=9) * Mean compared between control and MBS-p are significantly different by student t-test at p <0.05. (5) 간조직의항산화효소활성흑마늘과개똥쑥추출혼합물을베이스로한개발제품의급이가산화적스트레스를유발한흰쥐의간조직중항산화효소활성을측정한결과는 Table 58과같다. Catalase, SOD 및 GSH-px 활성모두 MBS-p의급이로대조군에비해유의적으로증가되었다. 세포에존재하는활성산소에대한항산화방어체계로알려진이들효소는활성산소에대한연소반응의개시를저해하게된다. 마늘에함유량이높은 S-allylcystein은마늘의주요효능과관련된물질이며과산화수소를제거하는작용이있는것으로보고된바있다 (Peng Q et al, 2002). 당뇨로인한산화적스트레스시 S-allylcystein의급이는간및신장조직의지질과산화물함량의감소에유의적이었으며, 더욱이 catalase, SOD 및 GSH-px 등의항산화효소의활성을증가시킴으로써당뇨병이만성적인합병증으로진행의예방에효과적인것으로보고되어있다 (Shin CH & Ihm J, 2008). Glutathion(GSH) 은 glutamic acid, cysteinem glycine으로된 tripeptide로 cysteine의 -SH기에기인되어환원성을가진 GSH로된다. 이러한 GSH는심한운동시유산소성조직의산소소비가증가함에따라활성산소종의생성이증가될때매우중요하게작용된다 (Ji LL, 1995). Kim MJ & Lee SJ (2002) 는유산소운동시녹차를급이한흰쥐에서정상군에비해 20% 정도의 GSH-px 활성이증가된것은녹차중의 catechine이항산화제로작용하여세포막의소기관들을과산화로부터방어하여이들효소활성의최적구조를유지시켜주는데기여한것으로추정하였다. 따라서본연구결과에서도흑마늘과개똥쑥의추출혼합물및이를베이스로한개발제품에서항산화효소활성이대조군에비해증가된것도시료에함유된폴리페놀, 플라보노이드, 흑마늘중의갈변물질등과같은항산화물질에의한항산화효과에의한것으로사료된다. - 103 -

Table 58. Catalase, SOD and GSH-px activities by supplementation of product(mbs-p) based on the black garlic and Gaeddongssuk composite in exercised rats Antioxidant enzyme activities Control MBS-p Catalase (microsomal fr.) 1.15±0.05 1) 1.47±0.11 * SOD (cytosolic fr.) 31.66±1.54 45.68±1.32 * GSH-px (cytosolic fr.) 223.92±9.53 261.51±12.78 * Catalase; μmol/min/mg protein, SOD; U/min/mg protein, GSH-px; nmol/min/mg protein 1) Values are mean±sd (n=9) * Mean compared between control and MBS-p are significantly different by student t-test at p <0.05. - 104 -

8) 흑마늘복합조성물음료제조를위한천연식물류의선정흑마늘복합조성물음료를제조하기위하여항산화및면역활성측면에서기연구된천연식물류를문헌조사로스크리닝하였으며, 결과는 Table 59와같이총 82건의연구자료와 100여종이상의천연식물류가스크리닝되었으며, 이중여러연구자들을통해사용빈도및활성이우수한식물류로인지된 11종을선정하였다. 선정된 11종의천연식물류는구기자, 황금, 오가피, 감국, 산약, 작약, 단삼, 뽕잎, 생강, 상황버섯및옥수수수염이다 (Table 60). Table 59. Screening of functional plant materials for antioxidant and immune enhancement 번호 천연물명칭 사용부위 사용세포주 추출용매참고문헌비고 1 삼지구엽초 (Epimedium koreanum NaKai) 뿌리, 줄기, 잎 T 세포 (Molt-4) B 세포 (Rhamos) hexane, chloroform, ethylacetate, butanol, water/ 단일 1. 삼지구엽초용매별분획추출물의면역관련활성, 2012, Korean J Food Preserv, 19(9) 110-115 2. Icariin 함량에따른삼지구엽초추출물의항돌연변이및면역활성, 2011, Korean J Food Preserv, 18(6) 938-945( 열수및 70% 에탄올추출물 / 단일 ) 2 팽이버섯 (Flammulina velutipes) 비장세포 70% ethanol / 단일 폐한방슬러지로배양한팽이버섯 (Flammulina velutipes) 추출물의면역세포활성화효과, 2012, J Life Sci, 22(6) 828-836 3 포도열매 RAW 264.7 50% Methanol / 단일 포도품종별메탄올추출물로부터면역활성분석, 2007, Korean J Food Preserv, 14(4), 419-424 4 외톨개모자반 (Myagropsis myagroides) 비장세포 물추출물 / 단일 외톨개모자반물추출물의면역활성및이화학적특성에미치는감마선조사의영향, 2011, Korean J Fish Aquat Sci 44(1) 50-57 5 고삼뿌리 RAW 264.7 열수추출물 / 단일 고삼발효추출물의면역활성에관한연구, 2011, Korean J Herbology, 26(2) 17-23 6 승마 (Cimicifugae Rhizoma) RAW 264.7 물추출물 / 단일 Immunomodulatory effects of Cimicifugae rhizoma extracts in macrophages, 2006, J Food Sci Nutr 11: 268-272 - 105 -

번호 7 8 9 10 11 천연물명칭 별불가사리 (Asterina pectinfera) 해당화 (Rosa rugosae) 월계화 (Rosa Chinensis Jacq) 더덕 (Codonopsis lanceolata) 큰갓버섯 (Lepiota procera) 사용부위 뿌리 사용세포주 RAW 264.7 T 세포 (Molt-4) B 세포 (Rhamos) 추출용매참고문헌비고 PBS 추출물 / 단일 물및 ethanol 추출물 / 단일 꽃비장세포열수추출물 / 단일 뿌리 비장세포및 RAW 264.7 대식세포 열수추출물 / 단일 물추출물 / 단일 별불가사리추출물의면역세포활성화효과, 2007, J Korean Soc Food Sci Nutr 36(3): 269-275 1. 해당화뿌리추출물의면역증진효과, 2003, Korean J Medicinal Crop Sci, 11(1) 13-18 2. 해당화의과육및종자추출물이골형성관련세포에미치는영향, 2010, Korean J Plant Res, 23(2) 157-164 월계화추출물의면억억제효능연구, 2011, Korean J Oriental Physiology, Pathology 25(3) 459-465 1. 림포사이트및클로널마이크로파지계를모델로한더덕열수추출물의면역증강작용, 2002, Korean J Food Sci Technol, 34(4) 732-736 2. 더덕추출물이면역세포에미치는영향, 1996, Korean J Food Nutr, 9(4) 379-384 3. 더덕추출물이마우스면역세포증식에미치는영향, 2008, Korean J Food Nutr, 21(3) 263-268 4. 더덕물추출물의경구투여가마우스면역세포활성에미치는효과. Korean J Nutr, 2009, 42(3), 207-212. 큰갓버섯추출물의면역자극활성에의한항암증진효과, 2010, Korean J Pharmacogn, 41(2) 115-121 12 고들빼기, 돌미나리, 메밀, 톳, 생강 비장세포 물및에탄올추출물 / 혼합 1. 식물혼합 ( 고들빼기, 돌미나리, 메밀, 톳, 생강 ) 추출물이마우스면역세포활성에미치는영향, 2007, Korean J Food Nutr, 20(1) 74-78 2. 5 가지 ( 고들빼기, 돌미나리, 메밀, 톳, 생강 ) 혼합식품물추출물의마우스면역세포활성화효과, 2008, Korean J Nutr, 41(2) 141-146 - 106 -

번호 13 14 15 16 17 천연물명칭 와송 ( O r o st ac h y s japonicus A. Berger) 복분자 (Rubus coreanus) 엉겅퀴 (Cirsium japonicum var. ussuriense) 곰의말채 (Cornus macrophylla Wall.) 유자 (Citrus junos), 탱자 (Poncirus trifoliata) 사용부위 줄기 열매 뿌리, 줄기, 잎 수피, 목부, 잎 과피 사용세포주 비장및흉선세포 T 세포 (Molt-4) B 세포 (Rhamos) 대식세포 T 세포 (Molt-4) B 세포 (Rhamos) 비장세포 추출용매참고문헌비고 90% methanol/ 단일 물추출물 물추출물 / 단일 메탄올추출물 80% 에탄올추출물 와송추출물이면역체계에미치는영향, 2004, Korean J Medicinal Crop Sci, 12(4) 315-320 나노입자화한복분자저온추출물의면역활성증진, 2009, 17(1) 54-60 1. 엉겅퀴추출물이종양면역에미치는영향, Korean J. Oriental Medicine, 2006, 27(4) 30-47 2. 엉겅퀴 70% 에탄올추출물의 RAW264.7 세포에서 Heme oxygenase-1 발현을통한항염증효과, 2012, Korean J Pharmacogn 43(1) 39-45 3. 엉겅퀴부위별추출물의항산화, 항염증효과. Kor J Herbology 2011, 26(4), 39-47 곰의말채부위별추출물의항암및면역증진효과, 2008, Korean J Medicinal Crop Sci, 16(5), 349-355 유자와탱자과피추출물의항산화및면역활성효과, 2008, J Life Sci, 18(3) 403-408 18 귀리대식세포 0, 5, 10, 15, 20% ethanol 추출물 추출조건에따른귀리추출물의면역활성, 2005, Korean J Food Sci Technol, 37(1) 103-107 19 함초 (Salicornia herbacea) 비장세포 열수추출물 함초추출물의마우스면역증강활성, 2008, Korean J Microbiol Biotechnol, 36(2) 135-141 20 인삼 ( 백삼및홍삼 ) 뿌리대식세포 70% 에탄올 1. 백삼및홍삼추출물의사상체질별면역세포활성효과, 2009, J Ginseng Res, 33(1) 33-39 2. 백삼이포함된이중탕약침액의 LPS로유발된마우스대식세포의 NO 및 hydrogen peroxide생성에미치는영향. 2011. Korean J Acupuncture 28(1), 61-69 - 107 -

번호 21 22 23 천연물명칭 황금 (Scutellariae Radix) 시라자 (Anethum graveloens L.) 오가피 (Acanthopanas Cortex) 사용부위 사용세포주 뿌리비장세포열수추출물 과실대식세포열수추출물 / 단일 잎, 줄기, 뿌리 대식세포 24 율무 (Job s Teal) 비장세포 추출용매참고문헌비고 50% 에탄올추출물 / 단일 물및에탄올추출물 / 단일 1. 알코올섭취한생쥐에서황금열수추출물이생쥐의면역기능에미치는영향, 2006, J Korean Soc Food Sci Nutr, 35(5), 536-542. 2. 사염화탄소로간손상이유발된흰쥐에서황금열수추출물이면역작용에미치는효과, 2009, Korean J Medicinal Crop Sci, 17(4) 273-279 3. 황금뿌리추출물의화학적매개인자방출과면역반응에대한억제효과, Korean J Medicinal Crop Sci, 2007, 15(2) 132-137. 4. 황금물추출물이마우스대식세포의 hydrogen peroxide 생성에미치는영향. 2011. Kor J Herbology 26(1), 53-58 5. 황금이 LPS로유발된 Raw 264.7 cells의염증인자에미치는영향. Kor J Herbology 26(2), 75-81. 시라자추출물을함유하는면역질환의치료및예방을위한면역증강용조성물, 2007, Korean J Oriental Physiology, Pathology, 21(3) 700-704 1. 오가피 50% 에탄올추출물이면역, 항암, 뇌혈류및혈압에미치는영향, 2005, Korean J Oriental Physiology, Pathology, 19(5) 1213-1219 2. 가시오가피추출물의알코올분해및항염증효과. 2010. Korean J Food & Nutr 23(4), 542-548 1. 율무추출물이마우스면역세포활성에미치는영향, 2005, J Korean Diet Associ, 11(1) 44-50 2. 4 주동안의율무추출물투여가사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α 생성과비장세포증식에미치는영향, 2006, Korean J Food Nutr, 19(2) 201-206 - 108 -

번호 천연물명칭 사용부위 25 생강뿌리 26 상황버섯 27 28 초적삼 (Stachys Sieboldii MIQ) 족제비싸리 (Amoropha fruticosa L.) 29 차가버섯 균사체 ( 뿌리 ) 뿌리 열매, 수피, 목부, 잎, 뿌리 균사체 ( 뿌리 ) 사용세포주 대식세포및비장세포 비장세포 대식세포 T 세포 (Molt-4) B 세포 (Rhamos) 비장세포 추출용매참고문헌비고 물및에탄올추출물 / 단일 열수추출물 / 단일 75% 에탄올추출물 / 단일 에탄올및메탄올추출물 / 단일 열수추출물 / 단일 1. 생강추출물투여가마우스면역세포활성에미치는영향, 2004, Korean Nutr Soc, 37(1) 23-30 2. 생강분획에따른추출물이마우스비장세포와 Cytokine (IL-1, IL-6, TNF-) 의생성량에미치는영향, 2007, Korean J Food Nutr, 20(2) 125-133 3. 생강추출물투여에의한마우스비장세포및대식세포활성효과. 2004. Korean J Nutr 37(9), 780-785 1. 상황버섯균사체추출물의면역증진효능, 2012, Korean J Pharmacogn, 43(2) 157-162 2. 상황버섯추출물이정상마우스와 cyclophosphamide로처리된마우스의체액성면역기능에미치는영향, 2001, J Applied Pharmacology, 9 194-200 3. 바우미상황버섯추출물의항염증효과에관한연구, 2010, Korean J Mycol, 38(2) 179-183 초적삼추출물의항암및면역 효과, 2002, Korean J Biotechnol Bioeng, 17(6) 520-524 족제비싸리부위별추출물의항암및면역활성, 2005, Korean J Medicinal Crop Sci, 13(1) 41-47 1. 차가버섯열수추출물이비장세포증식과 cytokine 생성능에미치는영향, 2010, Yakhak Hoeji, 54(3) 179-183 2. 차가버섯의균사체및세포외다당체의생산조건과면역활성, 2009, J Life Sci, 19(11) 1617-1622 30 인진쑥잎비장세포 메탄올추출물 / 단일 인진쑥 methanol 추출물이암이유발된마우스의비장세포유래 cytokine 함량에미치는영향, 2009, J Vet Clin, 26(5) 408-412 - 109 -

번호 31 32 천연물명칭 팔손이나무 (Fatsia japonica Decne. et Planch) 구기자 (Lycium chinense Mill.) 33 인삼, 당귀 34 옥수수 35 36 37 38 흑대두 (Glycine Max Merr.), 감초 (Glycyrrhiza Uralensis) 여지초 (Salvia plebeia R. Br.) 동충하초 (Cordyceps militaris) 뽕나무버섯 (Armillaria mellea) 사용부위 근피, 수피, 목부, 잎 과실, 잎, 뿌리 사용세포주 T 세포 (Molt-4) B 세포 (Rhamos) 비장세포 비장세포, 대식세포 비장세포, 대식세포 비장세포, 대식세포 비장세포 비장세포 대식세포 추출용매참고문헌비고 물및에탄올추출물 / 단일 열수추출물 열수추출물 물및에탄올추출물 열수추출물 열수추출물및 60% 에탄올추출물 50% 에탄올추출물 열수추출물 39 상기생대식세포물추출물 팔손이용매별추출물의항암및면역활성탐색, 2005, Korean J Medicinal Crop Sci, 13(3) 87-92 구기자부위별추출물이흰쥐비장세포의증식에미치는영향, 2000, Korean J Medicinal Crop Sci, 8(4) 291-296 인삼, 당귀혼합추출물경구투여가생쥐비장포및대식세포활성에미치는영향, 2007, Korean J Oriental Physiology Pathology, 2007, 21(2) 479-484 4주동안의옥수수추출물투여가마우스비장세포와대식세포생성에미치는영향, 2011, Korean J Food Nutr, 24(1) 65-70 흑대두 감초혼합추출물이생쥐의비장세포및대식세포의활성에미치는영향, 2009, Korean J Oriental Physiology Pathology, 23(6) 1385-1391 여지초의 in vitro항암효과및면역세포활성화에미치는영향, 2007, J Korean Soc Food Sci Nutr, 36(4) 377-392 1. 밀리타리스동충하초에탄올추출물의면역억제마우스면역활성에미치는영향, 2012, J Korean Soc Food Sci Nutr, 41(4) 494-500 2. 종양면역에미치는동충하초추출물의효과, 2006, Korean J Ori Med, 27(4) 12-29 대식세포와자연살해 (NK) 세포활성에대한뽕나무버섯 (Armillaria mellea) 추출물의영향, 2004, Korean J Ori Med, 25(4) 161-170 상기생물추출물이대식세포활성화와 Th1 반응에미치는효과, 2008, Korean J Oriental Physiology, Pathology, 22(1) 171-175 - 110 -

번호 천연물명칭 사용부위 사용세포주 추출용매참고문헌비고 40 감태 (Ecklonia cava) 비장세포 물추출물 / 단일 식품알레르기마우스모델에서감태물추출물의 IgE 분비억제효과, 2010, J Korean Soc Food Sci Nutr, 39(12) 1776-1782 41 어성초 (Houttuynia cordata) 비장세포, 대식세포 methanol, hexane, chloroform, ethylacetate, butanol, water 추출물 / 단일 어성초추출물첨가가마우스면역능증진에미치는영향, 2005, J Korean Soc Food Sci Nutr, 34(2) 167-175 42 큰느타리버섯 (Pleurotus eryngii) 자실체비장세포열수추출물 / 단일 큰느타리버섯 ( P l e u r o t u s eryngii) 조다당체의면역세포활성화효과, 2004, J Korean Soc Food Sci Nutr, 33(7) 1092-1097 43 향부자 (Cyperus Rotundus) 비장세포, 대식세포 열수추출물 / 단일 향부자열수추출물의 Nitric oxide 생성및 inos 유전자발현에미치는영향, 2003, Korean J Oriental Physiology Pathology, 17(3) 771-776 44 백렴 (Ampelppsis japonica) 뿌리비장세포물추출물 / 단일 백렴추출물이종양면역에미치는영향, 2005, Korean J Ori Med, 11(2) 113-140 45 치콘 (Cichorium endivia L.) 잎 T 세포 (Molt-4) B 세포 (Rhamos) 물및에탄올초음파추출물 / 단일 초음파추출물을이용한치콘의면역활성증진, 2008, Korean J Medicinal Crop Sci, 16(1) 9-15 46 미강 (Rice Bran) 대식세포에탄올추출물 미강에탄올추출물의 RAW264.7 세포에서항염증효과, Yakkak Hoeji, 2011, 55, 456-461. 47 갯쑥 (Artemisia fukudo Makino) 잎 대식세포 메탄올추출물및열수추출물 갯쑥 (Artemisia fukudo Makino) 추출물의 LPS와 Interferon-γ로자극한 RAW264.7 세포주의 NO 생성저해효과, 2008, J East Asian Soc Dietary Life, 18(2) 198-206 48 일엽추 (Securinega suffructicosa) 잎대식세포에탄올추출물 일엽추추출물이 RANKL 유도 RAW264.7 Cell 의유전자발현에미치는영향, 2010, Korean J Ori Pre Med Soc, 14(3) 13-26 - 111 -

번호 49 천연물명칭 강활 (Ostericum Koreahum) 사용부위 사용세포주 대식세포 추출용매참고문헌비고 물추출물 / 단일 LPS 로자극한 RAW264.7 세포에서강활추출물의염증성세포활성물질의억제효과, 2008, Korean J Herbology, 23(3) 127-134 50 큰비쑥 (Artemisia fukudo) 잎, 줄기 대식세포 80% 에탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올추출물 / 단일 큰비쑥 (Artemisia fukudo) 추 출물의murine macrophage RAW 264.7 세포에서 in vitro 항염효과, 2007, Korean J Food Sci Technol, 39(4) 464-469 51 김 (Callophyllis japonica) 대식세포 70% 에탄올추출물 김의에탄올추출물의생쥐대식세포주 RAW 264.7 세포에서의산화질소와종양괴사인자 - 알파생성작용에관한연구, 2007, Ori Phar Exper Med, 7(4) 341-347 52 고마리 (Persicaria thunbergii) 잎대식세포메탄올추출물 Lipopolysaccharide 로처리된 RAW264.7 세포에서고마리추출물의항염증효과, 2011, J Life Sci, 21(12) 1689-1697 53 홍삼 (Red Ginseng) 뿌리대식세포 70% 에탄올추출물 / 단일 Lipopolysaccharide 로유도된 RAW264.7 세포에서 MAPK 에의한홍삼추출물의항염증효과, 2012, orean J Oriental Physiology Pathology, 26(3) 293-300 54 회향 (Foeniculum vulgare) 열매 대식세포 메탄올, 클로로포름, 부탄올, 물추출물 LPS 로자극한 RAW264.7 대식세포주에서회향추출물에의한염증성매개물의생성억제, 2004, Korean J Soc Food Cookery Sci, 20(3) 505-510 55 개망초꽃대식세포메탄올추출물 RAW264.7 대식세포에서 Heme Oxygenase-1의유도에의한개망초 (Erigeron annuus L.) 꽃 Methanol 추출물의항염증효과, 2011, Korean Soc Food Sci Nutr, 40(11) 1507-1511 56 곰취, 미역취, 삼나물 대식세포 물추출물 곰취 (Ligularia fischeri), 미역취 (Solidago virgaaurea), 삼나물 (Aruncus dioicus) 복합추출물의항염증효과, 2011, J Life Sci, 21(5) 678-683 - 112 -

번호 57 58 59 천연물명칭 상엽 (Mori Folium) 독활 (Angelicae Pubescentis Radix) 싸리나물줄기 (Lespedeza bicolor) 사용부위 사용세포주 잎대식세포에탄올추출물 잎대식세포열수추출물 줄기 대식세포 60 하고초대식세포 61 톳비장세포 62 도토리 (Acorn) 경구투여후복강대식세포 추출용매참고문헌비고 acetone, 75%EtOH, MeOH, 열수추출물 -NO 생성억제능 열수추출물 -NO생성억제능 -cytokine 생성측정에탄올, 물추출물의경구투여 - 비장세포증식능 -cytokine 생성측정 에탄올, 열수추출물 -cytokine 생성측정 1. 桑葉추출물의 LPS 로유도된 RAW 264.7 세포에서의항염증효과, 2012, Korean J Herbology, 27(3) 31-38 2. 청목노상 (Morus alba L.) 추출물에의한 Lipopolysaccharide 로유도된 Raw 246.7 cell 에서염증억제효과, 2008, J Korean Soc Appl Biol Chem, 51(1) 44-48 독활물추출물이대식세포면역활성에미치는영향, 2011, J Korean Ori Med, 32(1) 175-184 싸리나무줄기추출물의추출용매에따른항산화활성과 nitric oxide 생성억제활성. 2011, J Medicinal Crop Sci 19(5), 368-372 하고초열수추출물이대식세포면역반응에미치는영향. 2010, J Oriental Obstetrics & Gynecology 23(3), 91-100 2주동안의톳추출물투여가마우스의비장세포와 cytokine의생성량에미치는영향. 2007. 한국영양학회지, 40(7), 624-629 도토리추출물의경구투여가마우스면역세포활성에미치는효과. 2010, Korean J Food & Nutr 23(2), 135-140 63 섬쑥부쟁이 (Aster glehni Fr. Schm.) 대식세포 순차용매추출 -NO 생성억제능 -HAase 저해능 - 라디칼소거 섬쑥부쟁이분획물의항산화및항염증활성. 2010. Kor J Microbiol Biotechnol 38(4), 434-441 64 작약뿌리대식세포 메탄올추출물 -NO 생성억제능 작약메탄올추출물및분획물의 NO 생성억제효과와피부질환원인균에대한항균활성. 2010, Kor J Pharmacogn 43(2). 173-178 65 송절 ( 소나무가지의마디 ) 줄기 대식세포 에탄올추출물 -NO생성능 - c y t o k i n e, COX-2, HO-1 발현 RAW 264.7 세포에서 HO-1 발현유도를통한송절약침액의항염증효능. 2012, Korean J Acupuncture, 29(1), 37-46. - 113 -

번호 천연물명칭 사용부위 사용세포주 추출용매참고문헌비고 66 적작약대식세포 열수추출물 -NO 생성측정 -PGE 2 생성측정 적작약추출물이대식세포에서 NO 및 PGE 2 생성에미치는영향. 2011, J Korean Acupuncture & Moxibustion Soc 28(1), 77-84 67 육계 (Cinnamomum cassia Presl) 대식세포 에탄올, 열수추출물 -NO 생성측정 -PGE 2 생성측정 육계약침액이 LPS 로유도된대식세포의염증반응에미치는영향. 2012, J Korean Acupuncture & Moxibustion Soc 29(1), 15-24 68 황련 ( 황금, 황련, 황백, 치자 ) 알레르기비염유발흰쥐의대식세포 열수추출물 -inos mrna 발현 황련해독탕약침액의 inos 생성억제를통한항염증효과가알레르기성비염유발생쥐의치료에미치는영향. 2012, J Korean Acupuncture & Moxibustion Soc 29(1), 89-101 69 배추출물 + 구기자배 + 의이인배 + 택사배 + 황기 대식세포 - TNF-α, IL-1 β, IL-6 측정 - 지질대사분석 배추출물과구기자, 의이인, 택사, 황기배합이고지방식이로유발된비만흰쥐의체중, 지질대사및면역기능에미치는영향 (Ⅰ). 2012, Kor J Herbology 27(3), 7-13 70 생약재 40 종 95% 에탄올추출물, 순차용매추출물 -HAase 저해능 OH, DPPH 라디칼소거 생약재추출물이 HAase 저해및라디칼소거활성검색. 2003, Korean J Biotechnol Bioeng 18(4), 282-288 ( 황기 > 두충 > 오미자 > 황금 > 오가피 ) 71 국내산약용식물 163 종 대식세포 80% 메탄올추출물 -in vitro 대식세포활성측정 - 정상세포 (L929) 육계약침액이 LPS로유도된 대식세포의염증반응에미치 는 영향. J Korean Acupunctu식용식물자원으로 부터활성물질의탐색-ⅩⅩ Ⅴ. 식용식물추출물의면역증 강효과. 2007, Korean J Food Sci Technol 39(6), 708-714 ( 마 > 회향 > 골파 > 유채씨 > 자두 > 금귤 > 딸기 > 매생이 > 둥글레 > 녹차 > 차조기 > 질경이 > 후추 > 흑향미 ) - 114 -

번호 천연물명칭 사용부위 사용세포주 추출용매참고문헌비고 72 식물체 33종 대식세포 73 감국, 엉겅퀴 대식세포 74 단삼 뿌리 대식세포 75 작약 뿌리 -NO 생성억제능 - TNF-α, IL-6 측정 -I k -Bα, inos, COX-2 열수, 에탄올추출물 T cell, B cell - 암세포생육저해능 Hep3B, AGS, MCF7, A549, 정상세포 ( 인체폐세포, 293) 100% methanol 추출물 -MTT -assay - 세포배양액내 cytokines 측정 -NO 생성량측정 - 부착분자발현율측정 작약감초탕추출물 -LPS처리 -혈액및간장채취 -Cytokines 정량 -Paeoniflorigeno ne(pfg) -C. albicans 세포벽의분리 -PEG의 NO생성억제검색 -CACW 유발성염증에대한 PFG 의항염효과검색 -PFG 의 T-임파구증식에대한효과 약용식물자원추출물의항염 증활성. 2011, Korean J Medicinal Crop Sci 19, 217-226 ( 생강, 느릅나무수피, 취나물, 금불초 ) 국화과약용식물의면역증진활성검색. 2002, Korean J Medicinal Crop Sci 10, 51-57 단삼메탄올추출물의항염증효과 2007, Kor J Herbology 22(4) 65-73 1. 작약감초탕의함염증효과 2010, Korean J. Orient Int Med 31(2) 365-371 2. Paeoniflorigenone 작양성분의항염효과 2012, Yakhak Hoeji 56(1) 20-25 76 애엽 잎, 어린줄기 대식세포 열수추출물 - 세포독성검사 -H 2 O 2 assay -NO 생성측정 -Cytokines 에대한 Bio-plex cytokine assay 애엽발효추출물의면역활성에관한연구 2008, Kor J Herbology 23(3) 103-112 - 115 -

번호 천연물명칭 사용부위 사용세포주 추출용매참고문헌비고 77 산약뿌리줄기대식세포 산약발효물및메탄올추출물 -세포독성측정 -NO 측정 -Enzyme Linked Immunosorbent Assay - HPLC 분석 LPS 로유도된대식세포활성에서발효산약추출물의억제효과 2011, Yakhak Hoeji 55(5) 78 구기자열매 열수추출물 -혈청중의 AST, ALT 와 LDH 활성측정 -간조직의단백질정량 -간조직중 malondialdehyde의정량 -간조직내 mitochondria 분획의 SOD 활성측정 -간조직중 catalase 활성측정 -간조직중 GPx의활성측정 생약재추출혼합물 - 동물및식이, 당뇨유발 -Immunoblotting 을이용한 cytokines 측정 -NO 생산량측정 -ELISA 을이용한 IgE 항체측정 1. LPS로유도된급성간독 성에대한구기자추출물 의 보호 효과 2007, Yakhak Hoeji 51(5) 296-300 2. Treptozotocin 으로유발한당뇨병성쥐에서의당뇨병성백내장과망막병증에대한구기자와황기혼합추출물등의면역조절및예방효과 2010, Korean J Medicinal Crop Sci 18(1) 15-21 79 천초 (Zanthoxyli Pericarpium) RAW 264.7 물추출물 / 단일 천초추출물의면역조절효과, 2008 Korean J. Oriental Physiology & Pathology, 22(2) 410-414 80 옥수수수염 지방전구세포 열수추출물 -3T3-L1 지방전구세포의분화유도 -세포독성 -Oil Red O 염색 -지방분해능 -Western blot 분석 -체중, 식이섭취량및수분섭취량측정 -총콜레스테롤, 중성지방, 당화헤모글로빈, 인슐린의측정 -복부총지방량과조직의형태학적분석 3T3-L1 지방세포와 db/db 마우스에서옥수수수염물추출물의지방생성억제및혈당저하효과 2011, Kor J Parmacogn 42(2) 201-208 - 116 -

번호 천연물명칭 사용부위 사용세포주 추출용매참고문헌비고 81 산약지방세포 열수, 80% 에탄올추출물 - 체중측정 -FBS 및 OGTT 측정 - 지질및당대사측정 - 혈청랩틴측정 - 지방및간무게측정 - 지방세포크기측정 산수유산약지각상엽으로구성된복합처방투여가고지방, 고탄수화물식이로유발된비만형당뇨병동물모델의대사인자및지방세포염증반응조절에미치는영향 2012, J Korean Oriental Med 33(3) 184-199 82 팔선초 (Galium aparine L.) 잎 RAW 264.7 물추출물 / 단일 팔선초물추출물의면역자극및항종양활성, 2005, Korean J Pharmacogn 36(4) 332-337 Table 60. List of functional plant materials used in this study Sample code Korean name Plant parts used Scientific name A 구기자 Fruit Lycii fructus B 황금 Root Scutellaria baicalensis Georgi C 오가피 Fruit Acanthopanax sessiliflorum Seeman D 감국 Flower Chrysanthemum indicum L. E 산약 Root Dioscorea rhizoma F 작약 Root Paeonia lactiflora Pall. G 단삼 Root Salvia miltiorrhiza Bunge H 뽕잎 Leaves Morus alba L. I 생강 Root (dried) Zingiber officinale J 상황버섯 Fruiting body Phellinus linteus K 옥수수수염 Flower Zea mays L. 9) 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 in vitro 생리활성의평가흑마늘과천역식물류 5종을혼합하므로써흑마늘복합음료를개발함에있어서 1일 1회섭취와 3회섭취에따른항산화활성을비교하였으며, 또한흑마늘복합음료에개똥쑥추출물의첨가유무에따른차이를함께비교하였다. - 117 -

(1) 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른총페놀및플라보노이드함량흑마늘추출물과상황버섯, 황금, 단삼, 뽕잎및작약의혼합추출물로제조한흑마늘복합물에서개똥쑥추출물의첨가에따른총페놀및플라보노이드함량을비교한결과 Table 61과같다. 농도를달리한 2종의흑마늘복합물에서총페놀화합물함량은 BM1에서 179.75 mg/100 ml, BM2는 324.30 mg/100 ml이었으며, 플라보노이드함량은 16.87 mg/100 ml 및 20.51 mg/100 ml로농도의존적이었다. 개똥쑥추출물이첨가된 BM1G, BM2G에서총페놀및플라보노이드함량은유의적으로증가되었다. Table 61. Total phenol and flavonoids contents in mixture of black garlic formulas and Gaeddongssuk extract Sample code Total phenol content (caffeic acid mg/100 ml) Flavonoids (quercetin mg/100 ml) BM1 179.75±0.45 A 16.87±0.80 A BM2 324.30±1.79 B 20.51±0.06 B BM1G 337.17±2.05 C 49.38±2.76 C BM2G 463.07±1.55 D 64.23±0.80 D A-D Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05. BM1 is mixed black garlic extract and MHE-2 (70:30, v/v) BM2 is mixed black garlic extract and MHE-2 (210:90, v/v) and then concentrated to the 100 ml BM1G is mixed BM1 and Gaeddongssuk extract(0.4%) BM2G is mixed BM2 and Gaeddongssuk extract(0.4%) (2) 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 DPPH 라디칼소거활성흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 DPPH 라디칼소거활성은 Table 62와같이모든시료군에서시료의농도 (S1~S4) 가증가됨에따라소거활성은유의적으로상승하였다. 성인의 1일 1회섭취량기준인 BM1은 31.26~81.64% 의범위였으며, BM2는 S2이상의농도에서 50% 이상의소거활성을보여 BM1보다유의적으로높은소거활성이었다. 개똥쑥추출물을첨가한 BM1G와 BM2G는 S1~S3의농도범위에서는개똥쑥의첨가유무에따른차이가두드러진것으로나타났으나, S4의농도에서는그차이가다소작았다. Kim KB et al(2006) 은국내유통중인식용식물추출물중에서개똥쑥추출물이 50 ppm에서 50.1±1.2% 의 DPPH 라디칼소거활성을나타내었고, 50% 의소거활성을띄는시료의농도로 53.96±0.81 ppm인것으로보고한바있다. - 118 -

Table 62. DPPH radical scavenging activity in mixture of black garlic formulas and Gaeddongssuk extract (%) Sample code Concentration condition* S1 S2 S3 S4 BM1 31.26±1.85 aa 41.42±1.32 ba 60.79±1.58 ca 81.64±1.48 da BM2 39.43±2.46 ab 52.70±2.05 bb 74.96±2.69 cb 90.01±3.59 db BM1G 53.31±3.46 ac 77.55±1.66 bc 91.76±1.00 cc 92.05±1.22 cb BM2G 56.62±1.57 ac 77.07±1.35 bc 93.18±1.73 cc 96.58±3.09 dc *Concentration condition : S4 : raw material(100 ml) was diluted to 2.5% concentration with DW S3 : raw material(100 ml) was diluted to 1.25% concentration with DW S2 : raw material(100 ml) was diluted to 0.625% concentration with DW S1 : raw material(100 ml) was diluted to 0.3125% concentration with DW a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-C Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05. Sample code refer to the comment in Table 61 (3) 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 ABTS 라디칼소거활성 Table 63은흑마늘복합물과개똥쑥의혼합에따른 ABTS 라디칼소거활성을나타낸것으로 DPPH 라디칼소거활성과마찬가지로흑마늘복합물에개똥쑥의첨가에따라농도의존적으로유의적으로소거활성이증가하였다. 흑마늘복합물에서는 S2 이상의농도에서 BM1과 BM2간에유의적인차이를보였다. 개똥쑥추출물이첨가된실험구에서는가장낮은농도인 S1에서부터 50% 이상의소거활성을보였는데, 이는 DPPH 라디칼소거활성과도유사한경향이었으며, 흑마늘복합물에개똥쑥의첨가로라디칼소거활성을상당히증가시킬수있을것으로확인되었다. Ryu JH et al(2011b) 은개똥쑥의잎추출물이줄기추출물에비해높은 ABTS 라디칼소거활성을나타내었으며, 이는잎추출물의총페놀및플라보노이드함량이더높았기때문인것으로보고한바있는데, 흑마늘복합물에개똥쑥의첨가로라디칼소거활성이상승된것도시료중의총페놀함량에의존적인것으로판단된다. - 119 -

Table 63. ABTS radical scavenging activity in mixture of black garlic formulas and Gaeddongssuk extract (%) Sample code Concentration condition* S1 S2 S3 S4 BM1 32.94±2.29 aa 43.55±0.63 ba 59.36±1.41 ca 86.40±2.01 da BM2 33.96±3.51 aa 51.93±1.17 bb 72.92±2.79 cb 95.09±2.94 db BM1G 54.87±1.16 ab 77.20±0.46 bc 95.20±1.01 cc 97.41±0.91 dbc BM2G 56.01±0.77 ab 82.08±0.69 bd 97.76±1.60 cc 99.15±0.49 cc *Refer to the comment in Table 62 a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05. Sample code refer to the comment in Table 61 (4) 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 FRAP법에의한환원력흑마늘복합물과개똥쑥추출물의 FRAP 측정결과를 FeSO 4 당량으로나타낸결과는 Table 64와같다. 흑마늘복합물의첨가농도가증가함에따라 Fe +3 를 Fe +2 로환원시키는환원력이증가하는것으로나타났으며, 특히개똥쑥추출물을첨가한 BM2G의환원력이가장높았고그다음은 BM1G였다. Table 64. Ferric reducing antioxidant power in mixture of black garlic formulas and Gaeddongssuk extract (FeSO 4 eq µm) Sample code Concentration condition* S1 S2 S3 S4 BM1 23.61±1.64 aa 43.35±8.89 ba 81.00±3.13 ca 174.48±9.82 da BM2 36.91±5.82 ab 59.70±1.52 bb 121.35±5.04 cb 241.96±6.00 db BM1G 68.57±5.03 ac 140.91±6.09 bc 273.52±5.65 cc 510.30±11.84 dc BM2G 82.83±2.62 ad 156.22±3.53 bd 287.26±10.32 cd 553.35±13.23 dd *Refer to the comment in Table 62 a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05. Sample code refer to the comment in Table 61-120 -

Lee HH et al(2010) 은흑마늘의첨가농도가많아짐에따라흑마늘발효주의 FRAP 활성은증가되는것으로보고하였는데, 이는본연구와유사한결과였으며, 흑마늘의함량이많아짐에따라 FRAP 활성이증가되는것으로판단된다. 따라서 FRAP법에의한항산화활성이산화반응의촉매제로작용하는금속이온의환원효력을의미하는것으로볼때 (Gordon MF, 1990) 흑마늘복합물뿐만아니라개똥쑥의첨가로음료를개발함에있어서생리활성에대한시너지효과를충분히발휘할수있을것으로여겨진다. (5) 흑마늘복합물과개똥쑥추출물의첨가에따른 Fe +2 킬레이팅활성흑마늘복합물에개똥쑥추출물의첨가에따른 Fe +2 킬레이팅활성을측정한결과는 Table 65와같다. Fe +2 킬레이팅활성은다른항산화활성결과와유사한경향을보였다. S1의농도에서 BM1과 BM2는유의적인차이가없었으며, BM1G의활성이가장높았지만, S1보다높은농도에서는흑마늘복합물의함유의증가와개똥쑥의혼합에의해활성이증가하여 BM2G에서유의적으로활성이높았다. 여러한약재혼합물의항산화활성은한약재간의시너지작용에의한결과 (Cho HS et al, 2007) 로식물류는단일성분보다는혼합되어있을경우활성이높아진다고보고되어있다 (Lee JM et al, 2000). 마늘에한약재가첨가되므로써항산화활성이상승하였으며, 이를급이한흰쥐에서알코올성간기능개선에효과적인것으로보고되어있다 (Lee SJ et al, 2009). 본연구에서사용된 5종의생약재추출물은항산화활성이상당히우수한시료로써 (Lee SJ et al, 2013), 흑마늘과혼합한복합물도높은항산화활성을나타내므로이복합물은생체내에서발생되는산화적스트레스에대한라디칼소거에도효과적일것으로생각된다. Table 65. Fe +2 chelating activity in mixture of black garlic formulas and Gaeddongssuk extract (%) Sample code Concentration condition S1 S2 S3 S4 BM1 9.66±0.88 aa 10.51±0.57 aa 17.80±0.71 ba 28.69±0.28 ca BM2 10.42±0.43 aa 13.54±0.33 bb 23.96±0.43 cb 39.58±0.16 db BM1G 14.77±1.78 ac 24.15±0.28 bc 44.60±0.28 cc 63.73±1.08 dc BM2G 12.50±0.49 ab 24.62±0.66 bc 45.17±0.57 cc 62.03±1.62 dc *Refer to the comment in Table 62 a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05. Sample code refer to the comment in Table 61-121 -

10) 간헐적운동부하에의한흑마늘복합물의 in vivo 생리활성평가 (1) 체중변화및식이효율트레드밀을이용하여 5주간의강제적인간헐적운동부하를받은흰쥐에서흑마늘복합물의급이에따른체중변화및식이효율을측정한결과는 Table 66과같다. 모든실험군에서최종체중은흑마늘복합물급이군 (Ex-BM1, Ex-BM2) 이운동대조군 (Ex-con) 에비해유의적으로증가하였는데, 적절한운동과흑마늘복합물의맛과향미에의해식이섭취량이다소높았기때문이라생각된다. 식이효율도운동군이비운동군에비해다소간높았으며, 흑마늘복합물의농도에따른유의차는적었다. 흑마늘및쑥추출물, 이들의혼합물을흰쥐에게급이하였을때흑마늘추출물급이군의식이섭취량이여타의실험군에비해유의적으로높았던것이흑마늘자체의단맛때문이라는보고가있는데 (Lee SJ et al 2013) 본연구결과도유사한경향이었다. 1일 30분씩매일강제운동을한흰쥐에서개똥쑥추출물급이군보다흑마늘과개똥쑥의혼합물급이군에서식이섭취량이유의적으로증가된것 (Kang JR et al 2013) 도본연구결과와유사하였다. 본연구에서 2일에 1회씩의간헐적인운동에의한체중감소는미미할것으로예상되는데, Ex-BM2군에서 Ex-BM1군보다체중증가량이다소간낮은것은흑마늘복합물을장기적으로섭취할경우체중감소효과를발휘할수있을것으로예상된다. Table 66. Changes of body weight, food intake and FER in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas Sample code Initial body weight (g) Final body weight (g) Total body weight gain (g/5 weeks) Food intake (g/day) FER Control* 133.33±10.00 NS1) 337.14±12.54 A 200.00±5.77 A 20.54±0.71 AB 26.85±0.61 A Ex-con 133.33±10.00 351.43±15.74 A 214.29±17.18 A 20.29±0.65 A 29.31±2.44 AB Ex-BM1 135.56±8.82 378.57±22.68 B 241.43±25.45 B 20.87±0.28 B 32.57±3.26 C Ex-BM2 135.56±8.82 372.86±9.51 B 235.71±7.87 B 20.89±0.49 B 30.82±0.49 BC 1) Values are mean±sd (n=8) NS: Not significant. FER: Food efficiency ratio a-c Means with different superscript in the same column are significantly different at p <0.05. *Control : Non exercised group with normal diet administration Ex-con : Exercised group by interval training with normal diet administration Ex-BM1: Exercised group with BM1 supplementation Bx-BM2: Exercised group and BM2 supplementation - 122 -

(2) 장기중량흑마늘과천연식물류혼합물을흰쥐에게급이하여 4주간사육한후장기중량을측정한결과는 Table 67과같다. 간, 신장및고환의중량은정상군, 대조군및실험군간에유의차가없어이들혼합물의섭취가장기중량에는영향을미치지않는것으로생각된다. 심장은운동군에서정상군에비해다소작았으나, 실험군에서는유의차가없었다. 지라는정상군에비해운동군에서유의적으로작았으며, 운동대조군과실험군간에는유의차가없었다. Lee SJ et al(2013) 은비장의중량이비구속정상군에서가장컸으며, 흑마늘과쑥추출물의혼합물을급이한실험군에서정상군에비해유의적으로작았으나, 그외실험군에서는유의차를보이지않았다는보고는본연구와일치하는결과였다. 흑마늘과천연식물류혼합물의섭취에따라정상군에비해실험군의장기중량이다소낮았다. 실험군간의결과를비교해볼때흑마늘천연식물류의급이가장기중량에큰영향을미치지는않았다. Table 67. Organ weight in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas (tissue g/bw 100 g) Sample code Liver Heart Kidney Spleen Lung Testis Control* 2.62±0.08 NS 0.35±0.02 B 0.76±0.06 NS 0.22±0.03 C 0.40±0.06 B 1.05±0.10 NS Ex-con 2.57±0.16 0.32±0.03 A 0.77±0.13 0.19±0.02 AB 0.39±0.03 AB 0.99±0.09 Ex-BM1 2.64±0.23 0.33±0.02 AB 0.72±0.03 0.20±0.03 BC 0.39±0.03 AB 0.98±0.08 Ex-BM2 2.49±0.07 0.33±0.02 AB 0.74±0.02 0.17±0.02 A 0.36±0.03 A 0.97±0.05 *Refer to the comment in Table 66 a,b Means with different superscript in the same column are significantly different at p <0.05. NS; Not significant. (3) 혈중단백질, 알부민, 글로불린함량간헐적운동부하시흑마늘복합물을급이한흰쥐에서혈중총단백질, 알부민및글로불린함량은 Table 68과같다. 총단백질함량은운동유무에따른유의차가없었으나, 급이한흑마늘복합물의농도가높았던 Ex-BM2군이 Ex-BM1군보다유의적으로높았다. 알부민함량은운동대조군에비해흑마늘복합물급이군에서다소높았으며, 복합물의농도에따른유의차는적었다. 글로불린함량은정상군에비해운동군에서다소낮았는데, Ex-BM2군은정상군과비슷한수준이었다. 체내대사과정에서에너지원으로써단백질이이용될경우체단백질의분해나체중이감소되는데 (Koh JB & Kim JY 2002), 운동군에서비운동군에비해체중증가량이많았으며 (Table 65), - 123 -

Ex-BM1군의혈중단백질함량이높은것으로볼때본연구에서수행한간헐적인운동에의한체단백질의분해는없는것으로사료되며, 흑마늘복합물의급이는혈중알부민함량증가로적절한영양상태유지와관련되는것으로여겨지므로흑마늘복합물의 1회 3회섭취가무방하리라생각된다. Table 68. Total protein, albumin and globulin contents in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas (g/dl) Sample code Total protein Albumin Globulin Control* 7.01±0.46 AB 4.19±0.31 A 3.04±0.23 B Ex-con 7.18±0.31 AB 4.32±0.56 AB 2.80±0.76 AB Ex-BM1 6.89±0.33 A 5.07±0.87 BC 1.83±1.02 A Ex-BM2 7.37±0.60 B 5.15±0.70 C 2.48±1.13 AB *Refer to the comment in Table 66 1) Values are mean±sd (n=8) A-C Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (4) AST, ALT 및 ALP 활성트레드밀에의한간헐적인운동을수행한흰쥐에서흑마늘복합물의급이에따른혈중 AST, ALT 및 ALP 활성을측정한결과는 Table 69에나타낸바와같다. AST 활성은운동대조군 (70.17 Karmen unit/ml) 이정상군 (54.50 Karmen unit/ml) 에비해서약 1.3배높았으며, 흑마늘복합물급이군은운동대조군에비해유의적으로감소되었다. ALT 활성도 AST 활성과유사한경향이었으며, ALP 활성은흑마늘복합물급이군이정상군보다유의적으로낮은수준까지감소되었다. 흑마늘음료를 4주간급이시킨후 24시간의 1회성구속에따른흰쥐의혈청 AST, ALT 활성은유의적으로증가하였으며, 흑마늘음료급이군은정상군과유사한수준까지회복되었는데, 이는시료의항산화활성과관련이있으며, 항산화활성이높은식물의보충급이는일시적인스트레스에의한간기능지표효소활성의증가를제어할수있는것으로보고되어있다 (Lee SJ et al 2013). 1% 의마늘추출물급이군은수영부하스트레스직후유의적으로증가된 AST 활성도를정상수준으로회복시켰는데 (Kang MJ 2011), 마늘의알리신성분에기인된결과로보고된바있다 (Lee SJ et al 2009). 본연구에서운동의강도는낮으나, 강제적인수행에따른스트레스에의해간기능지표효소활성이상승된것으로추정되므로, 흑마늘복합물급이로이들효소활성도가감소되었다는것은일상생활속의스트레스에대한완화효과도얻을수있을것으로사료된다. - 124 -

Table 69. AST, ALT and ALP activities in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas Sample code AST (Karmen unit/ml) ALT (Karmen unit/ml) ALP (K-A unit) Control* 54.50±2.35 A 9.17±0.68 A 16.78±1.80 B Ex-con 70.17±4.17 B 17.00±2.90 B 21.99±2.46 C Ex-BM1 58.00±2.97 A 11.32±1.77 A 14.44±1.66 A Ex-BM2 55.17±3.54 A 9.42±0.38 A 13.77±1.92 A *Refer to the comment in Table 66 1) Values are mean±sd (n=8) A-C Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (5) 혈중지질성분변화 5주동안흑마늘복합물의급이와간헐적인운동부하를병행한흰쥐에서혈중지질성분을분석한결과는 Table 70과같다. 운동부하에따른지질성분의변화에는유의차를보이지는않았다. 총지질과중성지방함량은운동대조군에비해흑마늘복합물급이군에서유의적으로감소되었으며, 특히 Ex-BM2군은 13.9% 및 9.2% 의감소를보였다. 중성지방및총콜레스테롤함량에서 Ex-BM1군은운동대조군과유의차를보이지않았으나, Ex-BM2군은유의적으로감소되었다. HDL-콜레스테롤함량은정상군및운동대조군에비해 Ex-BM1군은유의차가없었으며, Ex-BM2군만유의적으로증가되었다. LDL-콜레스테롤함량은흑마늘복합물급이군이정상군보다유의적으로감소되었는데, 특히 Ex-BM2에서 14% 감소되었다. HDL-콜레스테롤에대한총콜레스테롤의함량비 (HTR) 는심혈관질환의위험정도를나타내는것으로운동군에서정상군보다다소간감소되기는하였으나통계적인유의차는없었으며, Ex-BM2군이운동대조군에비해유의적으로감소되어, 운동의강도가낮고, 흑마늘복합물의섭취량이 1일 3회정도일때체내지질수준의변화로심혈관질환의예방에도움이될것으로사료된다. 4주동안자양강장기능성식품의급이와주 2회의강제수영훈련에따른체중감소현상은운동보다는기능성식품에의한효과이며, 혈청중성지방함량의변화에서강제수영시간을 90 분으로제한한경우운동대조군과기능성식품급이군간에유의차를보였으나, 탈진때까지의운동을수행한경우에는기능성식품의급이에따른유의차를보이지않았다고보고된바있다 (Song TC et al 2005). 운동과청국장분말의급이는운동대조군에비해혈중총콜레스테롤및중성지방의유의적인감소를보였는데, 청국장의유효성분과유산소운동에의한시너지효과인것으로보고되어있다 (Kim SW et al 2013). 또한트래드밀을이용한지구성운동을수행한실험쥐에서매실, 오가피및맥문동음료의급이는혈중중성지방수준을다소간감소시켰는데단일추출물보다 - 125 -

혼합추출물급이군에서운동수행시간을유의적으로증가시켰으나, 피로관련인자로써혈중암모니아, 젖산및무기인산의함량에는유의차가없는것으로보고되어있다 (Kim YJ et al, 2012). 반면에고지방식이로비만이유도된흰쥐에서운동과마늘의병행급이는혈중지질성분의변화에유의차를보이지못하였다 (Lee HM et al, 2010). 이처럼식이와운동과의상관관계에서는다양한결과들이존재하는데운동강도가크고시간이길수록규칙적인유산소운동은혈중콜레스테롤수준을감소시키는데효과적인데 (Park JY et al, 1999), 본연구와같은간헐적인운동은운동강도가낮아흑마늘복합물급이군에서혈중지질수준의감소는흑마늘과천연식물류의페놀화합물 (Kang JR et al, 2013) 에의존적인것으로판단된다. Table 70. Serum lipids level in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas Sample code Total lipid Triglyceride Total cholesterol (mg/dl) HDL-C LDL-C HTR Control* 217.52±3.10 C 39.89±1.74 B 68.33±1.16 B 24.52±1.40 A 35.83±1.33 C 2.79±0.14 B Ex-con 213.50±5.57 C 39.71±1.34 B 67.15±2.33 B 25.07±1.63 A 34.13±1.77 BC 2.68±0.14 B Ex-BM1 204.33±10.52 B 38.28±1.73 B 66.11±0.79 AB 25.03±0.89 A 33.43±1.08 B 2.65±0.11 B Ex-BM2 183.91±4.68 A 36.06±0.97 A 64.70±2.57 A 26.70±1.07 B 30.79±2.24 A 2.43±0.10 A *Refer to the comment in Table 66 1) Values are mean±sd (n=8) A-C Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (6) 간조직의지질성분흑마늘복합물을급이한흰쥐의간조직에서지질성분은 Table 71과같다. 운동의유무에따른간조직중총지질, 중성지방및총콜레스테롤의함량변화에는유의차가없었다. 총지질함량은흑마늘복합물급이군이정상군보다는유의적으로낮았으나, 운동대조군과는유의차가적었다. 중성지방함량은 Ex-BM2군이타실험군에비해유의적으로낮아흑마늘복합물의농도에따른유의차를보였다. 총콜레스테롤함량은정상군및운동대조군보다흑마늘복합물급이군에서유의적으로감소하였다. 수영부하스트레스에대하여마늘추출물의단독급이는수영부하여부에따른간조직의지질성분변화에유의차를보이지않았으나, 비타민 B 1 의혼합급이시대조군에비해간조직의중성지방함량을효과적으로감소시켰다는보고 (Kang MJ et al, 2011) 는본연구결과와도유 - 126 -

사한경향이었다. 반면에흑마늘과개똥쑥추출물이강제운동한흰쥐의간조직중지질성분변화에는흑마늘추출물급이군과혼합물급이군간에유의차가적었으며, 혼합물의농도에따른유의차가없었다는보고도있다 (Kang JR et al, 2013). 흑마늘과쑥추출물의혼합급이는구속스트레스를받은흰쥐의간조직중지질성분을흑마늘추출물급이군에비해유의적으로감소시킨것으로보고된바있다 (Lee SJ et al, 2013). 따라서본연구에서간헐적인운동과같은낮은수준의스트레스에서 Ex-BM2군에서중성지방의감소가유의적인것으로볼때흑마늘복합물의지속적인섭취가일상생활로부터초래되는스트레스완화에도움이될것으로짐작된다. Table 71. Lipids level in the liver of the exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas (mg/g) Sample code Total lipid Triglyceride Total cholesterol Control* 23.79±0.56 B 13.75±0.48 B 2.74±0.09 B Ex-con 22.68±0.91 AB 13.50±0.97 B 2.70±0.08 B Ex-BM1 21.50±1.47 A 12.91±0.93 B 2.58±0.06 A Ex-BM2 21.20±1.38 A 11.39±1.09 A 2.49±0.11 A *Refer to the comment in Table 66 1) Values are mean±sd (n=8) A,B Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (7) 혈액및간조직의지질과산화물함량간헐적인유산소운동과함께흑마늘복합물을급이한흰쥐의혈액및간조직의지질과산화물함량은 Table 72와같다. 체내지질과산화물은운동대조군이정상군에비해유의적으로높았으며, 흑마늘복합물급이군은운동대조군보다유의적으로낮았다. 특히혈중지질과산화물함량은흑마늘복합물의급이농도에따라유의적인차이를보였으나, 간조직에서는유의차가적었다. 수영부하스트레스를받은흰쥐의간조직중지질과산화물함량은유의적으로상승하였으며, 마늘이나비타민 B 1 의단일물질급이군보다는이들의혼합급이군에서유의적으로감소되었다 (Kang MJ et al, 2011). 4주간의강제운동과함께흑마늘과개똥쑥의혼합물을급이한흰쥐의혈액과간조직의지질과산화물함량은운동대조군에비해유의적으로감소되었는데시료중페놀화합물에의한항산화활성에기인된결과로 (Kang JR et al, 2013) 체내지질과산화에의한 malondialdehyde의생성이식물류의페놀화합물에의해저해된다는보고 (Azuma K et al, 1999) 와일치하는결과였다. 즉, 생체는강제적이거나부적절한탈진운동에의한산화적스트 - 127 -

레스의유발로체내면역계손상을초래하는데 (Davies KJA et al, 1982), 이때항산화활성이높은식이보충제의급이로생체방어기능의향상이가능하리라생각된다. 또한고지방식이로비만이유도된흰쥐에서운동과함께마늘을급이한경우에도혈중지질과산화물함량은운동보다는오히려마늘급이에의해유의적인감소를보여비만쥐에서도지질과산화물의감소는운동보다식이성분에의한효과가더큰것으로보고된바있다 (Lee HM et al 2010). 본연구에서도식이중흑마늘복합물의함량이높았던 Ex-BM2군에서지질과산화물의함량이유의적으로낮은것으로볼때일상생활로부터초래되는산화적스트레스를경감을위한식이보충제로써흑마늘복합물이적절할것으로기대된다. Table 72. Lipid peroxide contents in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas Sample code Serum (mmol/dl) Liver (mmol/g) Control* 37.62±1.53 B 185.05±11.36 B Ex-con 49.55±5.27 C 201.67±8.68 C Ex-BM1 38.01±0.51 B 174.44±7.08 AB Ex-BM2 30.10±0.93 A 165.70±8.75 A *Refer to the comment in Table 66 Values are mean±sd (n=8) A-C Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. (8) 조직의항산화효소활성 5주간의간헐적인유산소운동과함께흑마늘복합물을급이한흰쥐의간조직중항산화효소활성을측정한결과는 Table 73과같다. 운동부하에의해 catalase와 GSH-px 활성은유의차가없었으나, SOD활성이유의적으로증가되었다. 흑마늘복합물급이시 Ex-BM1군은운동대조군과유의차를보이지않았으나, Ex-BM2군은유의적으로증가되었다. 적절한강도의유산소운동은생체내항산화효소수준을증가시키며지속적인지구성훈련은산화적스트레스에대한방어능력을증대시키나 (Kawanaka K et al, 1997), 탈진적운동은오히려항산화효소활성을감소시키는것으로알려져있다 (Guie CA et al, 1993). 특히대사과정에서생성된활성산소종은생체내에서자연적으로소거되나, 외부로부터항산화물질이유입될경우체내항산화계는더욱활성화될수있다 (Sen CK et al, 1994). 강제운동에의한산화적스트레스가유발된흰쥐에서흑마늘과개똥쑥혼합물의급이는체내항산화효소활성을증가시켰는데시료자체의항산화활성과관련이있는것으로보고된바있다 (Kang JR et al, 2013). 유산소운동을한운동선수들에서상황버섯추출물의섭취는젖산생성을감소시켜피로회복에효과적이었는데단시간의최대운동에서주에너지원이당질 - 128 -

인것으로볼때시료중의다당류에기인된효과로보고되어있다 (Seo JH, 2008). 상황버섯은사염화탄소에의한간손상에대한항염증활성이있어체내면역력증강에효과적이며, 흡연이나스트레스에의한산화적스트레스의해소에도도움이된다고알려져있다 (An CS et al, 2009). 더욱이상황버섯열수추출물의라디칼소거활성이상당히높았다는보고 (Kwoen DJ et al, 2006) 는본연구의선행결과 (Lee SJ et al, 2013) 와도잘일치하였기때문에흑마늘복합물의급이시항산화효소활성이증가된것도시료의항산화활성때문인것으로판단된다. 본연구결과간헐적인운동의유무에따른 catalase와 GSH-px 활성에차이가없는것으로보아운동강도는낮으나, 강제운동시흑마늘복합물급이에의해항산화효소활성이증가된것은현대인의일상생활로부터초래될수있는여러가지의육체적, 정신적스트레스에있어서흑마늘복합물의효과를기대할수있으리라생각된다. Table 73. Hepatic catalase, SOD and GSH-px activities in exercised rats by interval training administered with black garlic and herbal formulas Sample code Catalase (μmol/min/mg protein) SOD (U/mg protein) GSH-px (nmol/min/mg protein) Control* 0.62±0.05 1)A 53.48±2.32 B 449.82±9.92 A Ex-con 0.64±0.02 A 44.85±1.53 A 438.18±16.04 A Ex-BM1 0.74±0.04 A 51.96±2.72 B 472.37±15.74 B Ex-BM2 1.12±0.18 B 58.80±1.26 C 497.10±7.89 C *Refer to the comment in Table 66 1) Values are mean±sd (n=8) A-C Values in a column sharing the same superscript letter are not significantly different at p <0.05. - 129 -

제 2 절개발바이오제품의품질특성및생리활성평가 ( 제 1 협동과제 ) 1. 연구개발의목표및주요결과 1) 세부과제목표 흑마늘의생리활성은항산화, 항고지혈증, 혈행개선등을중심으로추진되고있어아직까지면역활성등에다양한생리활성에대한연구는미진한실정이므로본연구를통하여흑마늘및천연식물류가첨가된융복합제품을개발하고자함. 흑마늘과쑥등추출물을활용하는가공품에있어추출온도및시간은추출물중의유효성분이나생리활성에영향을미칠것으로추정되나대부분추출조건에대한과학적검증이나최적화설정없이통상적인방법들이활용되고있음. 본연구에서는개똥쑥의생리활성을타품종쑥과비교분석하고, 흑마늘추출물과개똥쑥추출물을서로혼합함에있어최적의혼합비율을실험실규모에서 1차설정하고, 반응표면분석법에기초하여 pilot 규모에서최적의추출조건을확립함으로서기능성이향상된면역증강바이오제품을개발하기위한최적의배합비율을설정하고자함. 2) 주요내용 개똥쑥과타품종쑥과의생리활성을비교하고자개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥의항산화활성을시험한결과인진쑥의총페놀함량및플라보노이드의함량이타쑥에비하여약 1.5배높았으며, DPPH를비롯한 3종의라디칼소거능및환원력이가장높았고다음으로는개똥쑥의활성이높았음. Pilot 규모에서흑마늘과개똥쑥추출물각각의생리활성이최적화되는추출조건을설정을하고자대용량농축기를이용하여고온 (110~130 ) 및시간 (2~4시간) 을달리한조건에서반응표면분석법의조건에따라열수추출물을제조하고 ph 및갈변도를측정하였으며, 항산화활성과그유효물질로서총페놀및플라보노이드함량을측정하였음. 흑마늘및개똥쑥열수추출물의반응표면분석법을통한분석결과, 흑마늘은 134 에서 3.61시간, 개똥쑥은 121.86 에서 2.80시간추출한결과항산화활성이가장높은것으로예측되어흑마늘의경우고온추출과정에서도생리활성의감소현상이생기지않는것으로추정됨. 흑마늘과개똥쑥의제품개발을위한최적의혼합비율을알아보고자흑마늘과개똥쑥의비율을달리한혼합물의항산화활성및면역활성을실험한결과 nitric oxide 라디칼소거능과 α-glucosidase 저해활성을제외한모든실험에서흑마늘과개똥쑥의비율을 99.3 : 0.7 로하였을때항산화활성이월등히좋았음. 혼합물의농도가높아질수록, 개똥쑥의혼합비율이증가함에따라서항산화활성도유의적으로증가하여, 혼합물의항산화활성이개똥쑥의높은항산화력과흑마늘의갈변물질에의한항산화능에기인한결과라고판단됨. - 130 -

면역세포증식효과는쑥추출물중개똥쑥이가장우수하였으며, 흑마늘과혼합할때개똥쑥추출물의첨가비율이높아질수록활성도더증가하였음. 생리활성에대한연구결과와관능평가결과를종합하여흑마늘과개똥쑥추출물의최적혼합비율은 99.3:0.7의비로하였으며, 또농도별로 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와같은 cytokine 의생성량을확인한결과대조군에비해유의적으로높은수준의 cytokine을생성함을확인하였음. 흑마늘과개똥쑥 (Artemisia annua L.) 추출물의혼합비율에따라음료베이스를제조하고, 관능평가를통하여베이스와첨가물간의최적혼합비율을정하여최종제품을위한재료혼합비율을설정하였음. - 개발된제품의품질기준을설정하고, 특성을확인하고자이화학적성분을분석함으로써영양적기능성을확인하였으며, 생리활성을확인하고자 in vitro에서항산화활성, α- glucosidase, xanthine oxidase 저해활성및면역활성을분석하였음. - 개발된제품의가용성고형분함량은 8.4%, ph는 5.23, 산도는 0.42% 였으며, 총페놀화합물및플라보노이드의함량은각각 1866.08 µg/ml 및 500.00 µg/ml로정량되었음. - 항산화활성분석을위하여개발제품에증류수로희석하여 2, 4, 6, 8 및 10% 농도로조절한후분석한결과농도가높을수록활성은유의적으로증가하였는데, 특히 ABTS 라디칼소거활성은 6% 시료첨가물이 95.3% 로매우높은소거활성을나타내었으며, Fe +2 chelating 활성을제외한모든실험항목에서시료농도의상승과함께그활성역시증가하였음. - 여타생리기능성을확인하고자아질산염소거활성, α-glucosidase 및 xanthine oxidase 저해활성을측정하였으며, α-glucosidase 저해활성은 10% 농도에서 28.3% 로그절대값은항산화활성에비해서는낮았고, XO 저해활성은시료의농도가증가할수록유의적으로증가하는경향으로 10% 농도에서는 2% 농도시료에비해약 4.3배증가한 63.8% 의저해활성을보였음. RAW 264.7 세포를이용하여세포독성을평가한결과개발음료를 20% 까지희석하였을때세포독성을나타내지않아 1, 2, 5, 10, 20% 농도로희석하여 NO 생성량을확인한결과음료의처리농도가높을수록생성량은감소하였음. - 개발음료의면역활성을평가하고자 RAW 264.7에 LPS로유도된 cytokine 생성량을측정한결과시료의처리농도가높을수록 IL-1β 생성량이유의적으로증가하였으며, 최대 20% 농도에서는 272.34 pg/ml로양성대조군이 LPS 처리구 (40.93 pg/ml) 에비해생성량이증가하였으며, TNF-α의생성도비슷한경향인바, 개발음료는면역기능증강에효과적으로작용할것으로사료됨. - 개발음료는강력한항산화활성을지니고있으며, 생체내에서항산화활성과관련된여러생리활성에긍정적인영향을미친다고생각되며, 이를심층적으로연구 개발한다면기능성식품의개발에효과적으로이용할수있을것으로판단됨. - 131 -

문헌조사결과에기초하여선정된 11종의천연식물류열수추출물에대해항산화및면역활성을측정한결과상황버섯에서총페놀및플라보노이드함량이가장높았고라디칼소거활성이우수하였으며, 황금추출물은 LPS처리로생성된 NO 생성을 72% 정도감소시켜, 활성이우수한황금, 상황버섯, 단삼, 뽕잎및작약등 5종을최종적으로선택하였음. 5종의천연식물류와이들의추출조건별영양성분 ( 유리당, 유기산 ) 및생리활성을비교하기위하여추출후혼합한시료 (MHE-1) 와 5종을혼합추출한시료 (MHE-2) 의항산화활성을비교하였음. 유리당은 3종이검출되었으며, 상황버섯에서 fructose와 glucose의함량이가장높았음. 혼합물의경우시료간에차이가작았음. 유기산은총 11종이검출되었으며, 뽕잎에서가장높은함량이었으며, 다음으로작약이었음. 혼합물의유기산함량은 MEH-1의함량이더높았음. - 혼합물 (MHE-1, MHE-2) 의생리활성을비교한결과 xanthin oxidase 저해활성은시료의농도가증가함에따라유의적으로상승하였으며, 시료간에대차는보이지않았음. α -Glucosidase 저해활성은 500~5000 µg/ml 농도범위에서 MHE-2의활성이더높았음. - 혼합물의총페놀및플라보노이드함량은 MHE-2에서유의적으로높았으며, 항산화활성은시료의농도가증가함에따라유의적으로상승하였는데, 유효성분의함량이높은 MHE-2이 MHE-1보다유의적으로높았음. 혼합물의면역활성을측정한결과시료의농도별세포독성은 100 µg/ml에서 84~91% 였으며, 10,000 µg/ml농도에서는 50% 미만이었다. RAW264.7 세포에 LPS 처리로 NO 생성은무처리에비해 10배증가하였으나 2종의혼합물모두 500 µg/ml 농도에서 NO 생성을 50% 감소시켰음. PGE 2 의농도는시료군간에차이가작았다. TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6와같은전염증성 cytokine의발현량도시료처리로감소되어본연구결과천연식물류의혼합물은염증성질환의예방에효과적일것으로예상되어흑마늘복합물을이용한제품개발시생리활성을향상시킬수있을것으로기대됨. 2. 재료및방법 1) 종류별쑥추출물의특성및생리활성비교 (1) 재료개똥쑥 (Artemisia annua L.) 은경남하동군악양면일원에서생육하는것을제공받아이물질을제거하고그늘에서 20일간자연건조하였고, 강화약쑥 (Artemisia princeps Pampanini), 약쑥 (Artemisia Princeps var Orien talis HARA) 및인진쑥 (Artemisia iwayomogi Kitamura) 은건조된것을구입하여재료로사용하였다. (2) 재료의열수추출물제조개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥각 100 g에 20배의증류수를가하여 60 수욕상에서 12 시간씩 2회반복하여추출한후동결건조하여 4 에서냉장보관하여두고실험에사용하였다. - 132 -

개똥쑥을비롯한쑥 4 종은 62.5, 125, 250, 500 및 1000 μg/ml 농도로만들어실험에사용하였 다. 2) Pilot 규모에서흑마늘및개똥쑥추출물제조조건의최적화흑마늘중량에대하여 15배의물을가하여 Table 1의온도및시간에서추출하였으며, 개똥쑥은중량에대하여 30배의물을가하여동일한방법으로추출하였다. 각추출물은동결건조하여 -20 에보관해두었으며, 실험직전에 2000 μg/ml의농도로희석하여실험에사용하였다. Table 1. Levels of extraction conditions in experimental design for extraction from black garlic and Gaeddongssuk No. Temperature ( ) Time (hr) 1 110 2 2 110 4 3 130 2 4 130 4 5 120 3 6 110 3 7 130 3 8 115 2.134 9 115 3.866 10 125 2.134 11 125 3.866 3) 흑마늘및비율별개똥쑥추출물의생리활성비교흑마늘은참여기업인남해보물섬마늘영농조합법인의흑마늘제조공정에따라제조된것을사용하였으며, 추출물의제조는상기 2) 에서설정된최적의조건에서제조된흑마늘및쑥추출물의제조조건에따라실시하였다. 동결건조된흑마늘과개똥쑥추출물은각각 100:0, 99.9:0.1, 99.5:0.5, 99.3:0.7, 99.0:1.0 및 90:10(v/v) 의비율로혼합하여일정농도 (125, 250, 500 및 1000 μg/ml) 로조절한것을시료로하였다. 4) 흑마늘과개똥쑥함유시제품의제조 1차년도연구결과에따라생리활성이가장우수한흑마늘과개똥쑥추출물의혼합비율과관능평가결과선정된최종농도비율에따라 7 brix 농도의흑마늘추출물과 0.7 brix 농도의쑥추출물을 93:7로혼합한것을베이스로하여제품을제조하였다. 흑마늘과쑥은시료무게에대해 10배의물을가하여감압추출 농축기를이용하여 120 에서 3시간동안추출한후여과한것을농축하여원하는농도로조절하여사용하였다. 자연식품으로서의이미지강화를위하여인공식품첨가물의사용을최소화하고자사과추 - 133 -

출농축액, 배추출농축액, xylitol, 효소스테비아및결정과당을첨가부재료로사용하였으며, 관능평가를통해적정혼합비율을설정하였다. 최종선정된시제품제작을위한재료의농도및혼합비율은흑마늘추출물을 7 brix, 90.2%, 쑥추출물은 0.7 brix, 6.8%, 배추출농축액은 60 brix, 2.0%, 결정과당은 1% 로하였다. 5) 천연식물류추출물및그혼합물의제조 (1) 천연식물류추출물의제조문헌조사결과스크리닝된한약재 11종 ( 구기자, 황금, 오가피, 감국, 산약, 작약, 단삼, 뽕잎, 생강, 상황버섯및옥수수수염 ) 을구입하여 90 의진탕배양기 (JSSB-50T, JSR, Gongju, Korea) 에서 60 rpm으로회전시키면서 12시간씩 3회반복하여열수추출하였다. 추출된시료는모두모아여과한후진공동결건조시킨후 -40 에서보관하면서실험에사용하였다. 각추출물은항산화및면역활성측정에사용하였다. (2) 흑마늘과천연식물류추출물의혼합물제조선정된 5종의천연식물류로상황버섯 (Phellinus linteus), 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi), 단삼 (Salvia miltiorrhiza Bunge), 뽕잎 (Morus alba L.) 및작약 (Paeonia lactiflora Pall.) 은각시료를추출하여동량으로혼합한것 (MHE-1), 5종의시료를각각의수율을고려하여 (Table 2) 각각 100 g, 13.5 g, 13.4 g, 21.2 g 및 37.6 g씩혼합한후총시료량에 10배의물을가하고 90 에서 12시간씩 3회반복하여열수추출하였다. 추출물은동결건조후분말화하였으며, 이때천연식물류혼합물의추출수율은 20.03±0.87% 였다 (MHE-2). 흑마늘및천연식물류 5종추출물 ( 흑마늘복합물 ) 은각각물에용해하여 5% 및 1% 로조절하였으며, 맛과향을기준으로한관능평가에의해 70:30 (v/v) 의비율로혼합하여최종부피를 100 ml로하여성인 (70 kg) 의 1일 1회섭취량으로하였으며 (BM1), BM2는 1일 3회섭취량을기준으로하여농축한후최종부피를 100 ml로하였으며, 제 1세부기관에제공하여 in vivo 실험에사용하였다. Table 2. The combined ratio for mixture of 5 kinds of medicinal plants Sample name 상황버섯 (Phellinus linteus) 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi) 단삼 (Salvia miltiorrhiza Bunge) 뽕잎 (Morus alba L.) 작약 (Paeonia lactiflora Pall.) Yield (%) 5.7 42.13 42.47 26.92 15.17 Yield ratio to P. linteus 1 7.39 7.45 4.72 2.66 Weight (g) 100 13.5 13.4 21.2 37.6-134 -

6) 성분의분석 (1) 고형분함량, ph 및산도고형분함량은적외선수분측정기로수분을측정하여 100에서값을제한나머지로부터산출하였다. ph는추출시료를취하여 ph meter(model 720, Thermo Orion, Waltham, MA, USA) 로측정하였으며산도는자동적정기를이용하여측정하였다. (2) 추출물의갈색도측정흑마늘과개똥쑥추출물의갈색도는동일한농도로희석한시료액을대상으로측정하였다. 갈색도는 spectrophotometer를이용하여 280 nm에서증류수를대조로하여측정한흡광도값으로나타내었다. (3) 유리당분석시료액 3 g에 3차증류수를가하여진탕혼합한다음 100 ml로정용하여 4,000 rpm에서 10 분간원심분리시켰다. 상층액을취하여 0.45 μm membrane filter 및 sep-pak C 18 cartridges에차례로통과시킨것을 HPLC(Agilent 1260 infinity, Agilent, Santa Clara, CA, USA) 로분석하였다. 이때분석조건은 Table 3과같으며유리당표준물질 (Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA) 을농도별로동일한조건에서분석한결과로부터확인 정량하였다. Table 3. Conditions for free sugar analysis of garlics Items Conditions Instrument 1260 Infinity (Agilent) Column YMC-pack Polyamine Ⅱ (4.6 250 mm, YMC) Column temperature 35 Mobile phase H 2 O, Acetonitril Flow rate 1.0 ml/min Detector ELSD (4) 유기산분석시료액에 10배의정제수를가하여진탕혼합한후추출 여과한여액을 sep-pack C 18 cartridge에통과시킨다음 0.45 μm membrane filter로여과하여 IC(ICS-2100, Dionex, Salt lake city, USA) 로분석하였다. 이때분석용 column은 IonPac ICE-AS6 analytical column (9 250 mm), detector는 suppressed conductivity를이용하였고, 이동상은 0.4 mm heptafluorobutyric acid를 1.0 ml/min의속도로이동시켰으며, 칼럼온도는 19 로유지하였다. 유기산표준품은 oxalic acid, tartaric acid, citric acid, maleic acid, formic acid, lactic acid, acetic acid, succinic acid, fumaric acid, propionic acid 및 glutaric acid(sigma chemical Co.) 를사용하였다. - 135 -

(5) 총페놀및플라보노이드정량총페놀함량은홍마늘용매분획물 1 ml에 Foline-Ciocalteau 시약및 10% Na 2 CO 3 용액을각각 1 ml씩차례로가하여실온에서 1시간반응시킨후 760 nm에서흡광도를측정하였다. 총플라보노이드는추출물 1 ml에 10% aluminum nitrate 및 1 M potassium acetate 0.1 ml, ethanol 4.3 ml를차례로가하여혼합하고실온에서 40분간반응시킨다음 415 nm에서흡광도를측정하였다. 총페놀및플라보노이드함량은표준물질로각각 caffeic acid 및 quercetin (Sigma Co.) 을이용한검량선에의해계산하였다. 7) 항산화및생리활성평가 (1) DPPH 라디칼소거능측정 DPPH 라디칼소거능은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 에대한전자공여효과로측정하였다. 96 well plate에 10 mg/100 ml 농도로 ethanol에용해한 DPPH 용액 100 µl에일정농도의시료액 50 µl를가한후상온에서 10초간 plate shaker(mx2, FINEPCR, Seoul, Korea) 로혼합한후 30분간반응시켜 ELISA reader를이용하여 520 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거능은시료첨가구와무첨가구의흡광도비 (%) 로나타내었다. (2) ABTS 라디칼소거능측정 ABTS 라디칼소거능은 7 mm ABTs 용액에 potassium persulfate를 2.4 mm이되도록용해시킨다음암실에서 12~16시간동안반응시킨후이를 415 nm에서흡광도가 1.5가되도록증류수로조정하여사용하였다. 96 well plate에 ABTS 용액 200 µl를분주한후일정농도의시료액 50 µl를가하여상온에서 10초간 plate shaker(mx2, FINEPCR, Seoul, Korea) 로혼합한다음 ELISA reader를이용하여 415 nm에서흡광도를측정하였으며, ABTS 라디칼소거능은시료무첨가구에대한시료첨가구의흡광도비 (%) 로나타내었다. (3) FRAP법에의한항산화능홍마늘용매별분획물에대한 FRAP(ferric reducing antioxidant power) 측정은 300 mm acetate buffer (ph 3.6), 40 mm HCl에용해한 10 mm TPTZ(2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 용액및 20 mm FeCl 3 6H 2 O를각각 10:1:1(v/v/v) 의비율로미리혼합한다음 37 의수욕상에서 5분동안가온한뒤 FRAP 측정용기질로사용하였다. 즉, 96 well plate에시료액 40 µl, FRAP 기질액 100 µl 및증류수 40 µl를차례로혼합하여 37 에서 4분간반응시킨후 593 nm에서흡광도를측정하였으며, FeSO 4 로작성한검량선식에대입하여환산하였다. (4) 환원력측정추출물 1 ml에 200 mm의인산완충액 (ph 6.6) 및 1% 의 potassium ferricyanide 1 ml를차례로가한다음 50 의수욕상에서 20분간반응시켰다. 여기에 10% TCA용액 1 ml을가하여반응을정지시킨다음 5,000 rpm에서 5분간원심분리한후얻은상징액 1 ml에증류수및 ferric chloride 용액을각 1 ml씩혼합한후 700 nm에서흡광도를측정하였으며, 시료의환원력은흡광도의값으로나타내었다. - 136 -

(5) Nitric oxide 소거능측정 Nitric oxide 소거능은시료 1 ml에 10 mm sodium nitroprusside 용액 0.5 ml와 20 mm 인산완충액 (ph 7.4) 2 ml를각각가하여상온에서 150분간반응시켰다. 여기에 0.3 ml의 Griess reagent (1% sulfanilamide를함유하는 5% 인산용액 + 0.1% naphthylethylenedi- amide 용액, 1:1) 를가한후 542 nm에서흡광도를측정하였다. Nitric oxide 소거능은 [1-( 시료첨가구의흡광도 - 시료대조구의흡광도 / 무첨가구의흡광도 )] 100으로나타내었다. (6) Fe +2 chelating 활성측정 Fe +2 chelating 활성은시료추출물 0.2 ml, methanol 0.8 ml, 2 mm FeCl 2 4H 2 O 용액 0.05 ml 및 5 mm ferrozine[3-(2-pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazine-4,4''-disulfonic acid] 용액 0.2 ml를혼합하여실온에서 10분간반응시킨후 562 nm에서흡광도를측정하였다. 추출물의 Fe +2 킬레이팅활성은시료무첨가구에대한시료첨가구의흡광도비로나타내었다. (7) 아질산염소거능측정아질산염소거능은 1 mm NaNO 2 용액 0.1 ml에시료액 0.3 ml를가하고 0.1 N HCl과 0.2 M 구연산완충액으로 ph 2.5로조정한다음, 완충액 2 ml를가하였다. 이용액을 37 o C에서 1 시간반응시킨후 2% 초산용액 2 ml와 30% 초산용액으로용해한 Griess reagent(1% sulfanilic acid 1% naphthylamine=1:1) 0.3 ml를차례로가한후진탕혼합하여실온에서 15분간정치한후 520 nm에서흡광도를측정하였다. 아질산염소거활성은시료무첨가구에대한시료첨가구의흡광도비 (%) 로나타내었다. (8) α-glucosidase 저해활성측정 α-glucosidase 활성저해능은 5 mm ρ-nitrophenyl α-d-glucopyranoside를 0.1 M potassium phosphate buffer(ph 6.8) 에첨가하여반응기질로하고 0.7 unit/ml α-glucosidase와시료추출물을차례로가한후효소액을첨가하여 37 에서 10분간반응시킨후, 반응생성물인 ρ- nitrophenol을 405 nm에서분광광도계로측정하여 α-glucosidase 활성의저해정도로나타내었다. (9) Xanthine oxidase(xo) 저해활성측정 Xanthine oxidase 저해활성측정은일정농도로희석한시료 0.3 ml에 0.1 M potassium phosphate buffer(ph 7.5) 에 xanthine 2 mm을녹인기질액 3 ml를첨가하였다. 여기에 0.2 U/mL (Sigma Co., USA) 농도의 XO 0.3 ml를가하여 37 에서 30분간반응시킨다음 20% TCA (trichloroacetic acid) 1 ml를가하여반응을정지시킨후, 반응액중에생성된 uric acid를흡광도 292 nm에서측정하였다. 시료에대한 xanthine oxidase 저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율을백분율 (%) 로나타내었다. 8) 마우스비장세포를이용한면역활성측정 (1) 마우스비장세포의분리및배양 마우스비장세포를분리하기위하여경추탈골법으로마우스를희생시킨후비장을무균으 - 137 -

로적출하여 RPMI 1640 배양액으로씻은후멸균유리봉으로가볍게분쇄하여세포를유리시켰다. 분리된세포현탁액을배양액으로 2번세척하고, RBC lysis buffer에상온에서 5분간처리하여적혈구를제거하였다. 적혈구가제거된비장세포는다시 RPMI 1640 배양액에분산시켜, trypan blue solution으로염색한후 hemocytometer를이용하여그세포수를측정하였다. 세포농도 5.0 10 4 cell/ml로분산시킨다음 96 well plate에 100 µl씩분주한후세포증식능측정에사용하였다. (2) 면역세포증식능측정마우스비장면역세포의증식능을알아보기위하여 CCK-8을이용한발색분석법을사용하였다. 세포농도를 5.0 10 4 cell/ml로분산시킨다음 96 well plate에 100 µl씩분주하고 24시간 5% CO 2 incubator에서배양한후 RPMI 1640 배양액에시료의최종농도가 10, 25, 50, 100, 200 및 400 µg/ml가되도록조절한배지로교체하여다시 24시간동안 5% CO 2 incubator에서배양하였다. 여기에 CCK-8 용액을 10 µl씩분주한다음 3시간동안배양한후 ELISA reader를이용하여 450 nm의파장에서흡광도를측정하였으며, 각실험은독립적으로 3회반복실행하여평균치를구하였다. (3) Cytokine 측정비율별흑마늘과개똥쑥추출혼합물중항산화활성및면역세포증식능을종합적으로볼때가장활성이우수한 99.3 : 0.7 비율의혼합추출물의 cytokine 생성능을측정하였다. 마우스비장세포농도를 5.0 10 4 cell/ml로분산시킨다음 96 well plate에 100 µl씩분주하고 24시간 5% CO 2 incubator에서배양한후 phosphate buffered saline(pbs) 용액으로씻어주었다. Lipopolysaccharide(LPS) 단독혹은배지에농도별로조절한시료를각 well에처리한후 3시간동안배양하였다. 배양후상층액을취하여 ELISA kit(cayman Co., USA) 를이용해각 cytokine(il-1β, IL-6, TNF-α) 의농도를측정하였다. 즉, 배양상층액을 cytokine으로 coating된 96 well plate에 50 μl씩첨가하여 37 에서 90분간반응시킨후 washing buffer로 4회세척하였다. 여기에 100 μl의 streptavidine-hrp solution을처리하여 1시간동안상온에서반응시킨후다시 washing buffer로 3회세척한다음 di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxy benzalmalonate(tmb) substrate를 100 μl씩처리하여 30분간반응시킨후 100 μl의 stop solution을처리한후 450 nm에서흡광도를측정하였다 9) 대식세포를이용한개발제품의면역활성측정 (1) 세포배양마우스대식세포주인 RAW 264.7 세포는한국세포주은행 (KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) 에서분양받았으며, 세포배양을위해 10% FBS와 1% pnicillin-streptomycin을포함하는 DMEM 배지에서 37, 5% CO 2 조건으로배양하였다. (2) 대식세포생존율측정마우스대식세포에대한독성측정은 CCK-8 assay(cell Counting Kit 8, (Dojindo Molecular - 138 -

Technologies, Inc. Gaithersburg, MD, USA) 를이용한발색분석법을사용하였다. 세포농도를 5 10 4 cells/ml로분산시킨다음세포배양용 96 well plate에 80 μl씩분주하여 37 및 5% CO 2 incubator에서 24시간동안배양한후, 농도를달리한시료액을 20 μl씩접종하였다. 이를다시 24시간배양한후 CCK-8 용액 10 μl씩분주한다음 37 에서 3시간배양하고 ELISA reader로 450 nm에서흡광도를측정하였다. (3) Cytokine 측정마우스대식세포농도를 5 10 4 cells/ml로분산시킨다음 96 well plate에 80 μl씩분주하고 24시간동안 37 및 5% CO 2 incubator에서배양한후, 농도를달리한시료액을 20 μl씩처리하고 1시간후 Lipopolysaccharide(LPS) 를처리하였다. 이를다시 18시간배양후상층액만을취하여 ELISA kit(cayman co., USA) 로 cytokine(il-1β, IL-6, TNF-α) 의농도를측정하였다. 10) 통계처리각실험은 3~5회이상반복실험한결과에대하여 SPSS 12.0을사용하여통계처리하였으며, 각각의시료에대해평균 ± 표준편차로나타내었다. 각시료군에대한유의차검정은분산분석을한후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에따라분석하였다. 3. 결과및고찰 1) 개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥추출물의항산화활성 (1) 총페놀및플라보노이드함량식물계에널리분포되어있는페놀성화합물은 2차대사산물의하나로다양한구조와분자량을가진다. 이들은 phenolic hydroxyl기를가지므로단백질및거대분자들과쉽게결합하여, 항산화및항암과같은다양한생리활성을나타낸다 (Choi SY et al, 2005; Lee JH & Lee SR, 1994). 개똥쑥을비롯한쑥 4종의물추출물에대한총페놀및플라보노이드함량을측정한후그결과를 Table 4에나타내었다. 인진쑥의총페놀함량은 183.27±2.77 mg/g, 플라보노이드함량은 27.92±1.88 mg/g으로가장높았다. 다음으로개똥쑥에서총페놀함량은 175.14±0.33 mg/g, 플라보노이드함량은 24.36±0.43 mg/g으로높았다. Ryu JH et al(2011b) 은개똥쑥의잎과줄기의페놀함량이각각 88.19 mg/g과 45.03 mg/g 이라고보고한바있는데이는본실험의결과와상이한결과로쑥의채취시기에따라그함량에차이가있기때문으로판단된다. (2) 전자공여능 DPPH 용액을기질로하여측정한개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥물추출물의전자공여능은 Table 5와같다. 반응액에첨가된시료의농도가증가됨에따라소거능은유의적으로상승하였다. 개똥쑥, 강화약쑥및약쑥은 250 µg/ml, 인진쑥은 125 µg/ml 농도에서 50% 이상의라 - 139 -

디칼소거능을보였으며, 특히인진쑥은타쑥 3 종에비해 62.5~500 µg/ml 농도에서유의적으 로라디칼소거능이높았다. 반면에 1000 µg/ml 의고농도에서는 83.98±2.29~88.87±0.27% 로 쑥 4 종의 DPPH 라디칼소거능은유의차가없었다. Table 4. Total phenol and flavonoids contents of water extract from various Artemisia (mg/g) Kinds of Artemisia Phenol Flavonoid Gaeddongssuk 175.14±0.33 B 24.36±0.43 B Ganghwayakssuk 146.13±0.22 A 12.71±0.55 A Yakssuk 172.86±0.19 B 22.64±0.48 B Injinssuk 183.27±2.77 C 27.92±1.88 C Each value represents mean±sd (n=3) A-E Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. Hong JH et al(2007) 의연구에서는약쑥분획물의 DPPH 라디칼소거능을측정한결과약 IC 50 52.71~321.95 µg/mg의우수한소거활성을보였으며, 이중에탄올분획층이가장소거활성이높았다. 일반적으로쑥은다양한플라보노이드를함유하고있으며 6-methoxy flavonoid의공통적인구조를가지고있고플라보노이드는항산화효과가대단히커서, 효소적또는비효소적으로지질과산화를효과적으로억제한다고알려져있다 (Kang YH et al, 1997). Table 5. Electron donating activity of water extract from various Artemisia (%) Kinds of Artemisia Concentration (µg/ml) 62.5 125 250 500 1000 Gaeddongssuk 25.78±2.40 aa 42.63±1.71 bb 60.51±2.91 cc 77.34±2.73 db 88.82±1.14 eb Ganghwayakssuk 25.14±0.88 aa 36.27±0.40 ba 51.93±2.40 ca 69.41±2.02 da 83.98±2.29 ea Yakssuk 24.41±0.37 aa 42.05±0.81 B 57.92±1.62 cbc 75.54±0.29 db 88.40±0.12 eb Injinssuk 30.66±1.50 ab 58.44±1.14 bc 84.10±0.36 cd 89.17±0.19 dc 88.84±0.46 eb Each value represents mean±sd (n=3) a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. - 140 -

(3) ABTS 라디칼소거능 ABTS법은 potassum persulfate와의반응에의해생성된 ABTS + 이시료중의항산화성물질에의해제거되어라디칼특유의청록색이탈색되는것을이용한항산화력의측정법이다. ABTS 라디칼소거능은 DPPH 라디칼소거능과상관관계가높은데 DPPH는유리라디칼이고, ABTS는양이온라티칼이라는점에서차이가있으며항산화성물질의정도에따라두라디칼과결합하여제거되는능력에도차이가있어 (Wang MF et al, 1998) ascorbic acid의경우 DPPH 법에의한항산화력은 29%, ABTS법은 45% 로 ABTS법에의한경우가항산화력이다소높게측정된다는보고가있다 (Jeong JW et al, 1994). 4종의쑥으로부터 ABTS 라디칼소거능을측정한결과는 Table 6에나타내었다. 4종의쑥모두반응액에시료의첨가농도가증가함에따라 ABTS 라디칼소거능이유의적으로상승하였다. DPPH 라디칼소거능과유사한경향으로인진쑥이다른 3종의쑥에비해모든농도에서유의적으로높은라디칼소거능을보였지만, 1000 µg/ml의고농도에서는인진쑥이 97.75±0.08%, 강화약쑥이 98.20±0.21% 로강화약쑥이인진쑥에비해더높은라디칼소거활성을나타내었다. 또한 500 µg/ml 농도에서모든시료가 90% 이상의높은라디칼소거능을보였다. Table 6. ABTS radical scavenging acitivity of water extract from various Artemisia (%) Kinds of Concentration (µg/ml) Artemisia 62.5 125 250 500 1000 Gaeddongssuk 24.09±0.20 ab 42.04±0.33 bb 75.16±3.52 cb 95.39±0.28 da B 97.85±0.16 db Ganghwayakssuk 22.94±0.47 ab 39.96±0.74 ba 69.88±1.08 ca 95.62±0.27 db 98.20±0.21 ec Yakssuk 19.06±0.73 aa 39.70±0.92 ba 73.74±0.69 cb 95.08±0.13 da 97.35±0.06 ea Injinssuk 26.91±0.22 ac 55.12±0.86 bc 89.87±0.46 cc 96.21±0.03 dc 97.75±0.08 eb Each value represents mean±sd (n=3) a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-E Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (4) FRAP value 측정 FRAP 방법은비교적최근에개발된총항산화능을측정하는방법으로낮은 ph에서환원제에의해 ferric tripyridyltriazine(fe +3 -TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine(fe +2 -TPTZ) 으로환원되는원리를이용한것으로대부분의항산화제가환원력을가지고있다는점에착안하여고안되어진방법이다. 4종의쑥을 FRAP법으로측정한결과를 FeSO 4 당량으로환산하여 Table 7에나타내었다. - 141 -

Table 7. FRAP(ferric-reducing antioxidant potential) value of water extract from various Artemisia (FeSO 4 eq µm) Kinds of Artemisia Concentration (µg/ml) 62.5 125 250 500 1000 Gaeddongssuk 72.21±4.94 ab 125.16±2.53 bc 226.86±0.83 cc 403.34±4.43 db 854.25±3.75 eb Ganghwayakssuk 56.30±4.00 aa 100.73±2.05 ba 189.14±4.51 ca 345.96±5.18 da 618.00±5.41 ea Yakssuk 94.14±2.60 aa 102.66±3.09 bb 197.09±4.21 cb 475.50±4.85 dc 986.86±4.50 ed Injinssuk 89.02±3.26 ac 166.18±2.12 bd 393.57±2.47 cd 748.34±4.74 dd 977.77±1.82 ec Each value represents mean±sd (n=3) a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-E Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. FRAP value는타실험결과와유사한경향으로모든시료의농도가증가함에따라 FRAP value도유의적으로증가하였다. 62.5 µg/ml 농도에서약쑥이 94.14±2.60 FeSO 4 eq µm로가장높았으며 125~500 µg/ml 농도범위에서는인진쑥이 166.18±2.12~748.34±4.74 FeSO 4 eq µm 농도로가장높았고, 1000 µg/ml 농도에서는약쑥이 986.86±4.50 FeSO 4 eq µm로가장높은 FRAP value를나타내었다. Sanchez-Gonzalez I et al(2005) 은총페놀함량과 FRAP value는높은상관관계가있다고보고하였는데본연구결과와비교해보았을때총페놀함량과 FRAP value가유사한경향을나타내었다. (5) 환원력개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥물추출물의환원력을측정하여흡광도값으로나타낸결과는 Table 8같다. 모든시료에서시료첨가농도가높아질수록환원력도유의적으로증가하였으며, 4종의쑥의모든농도에서인진쑥이 0.35±0.00~1.89±0.03범위의흡광도로가장높은환원력을나타내었고, 1000 µg/ml 농도에서는인진쑥, 약쑥, 개똥쑥및강화약쑥순서였다. 인진쑥메탄올추출물의환원력은 50~500 µg/ml 농도에서 0.058~0.627 범위의흡광도를보여시료의첨가농도에의존적으로증가하였으나, 동일농도의 tocopherol 보다는활성이낮았다고보고된바있다 (Jung MJ et al, 2008). 시료의환원력은전자공여를통한라디칼의소거능과관련성이높기때문에 DPPH 라디칼소거능이높은시료인경우환원력이높은것으로알려져있으며 (Gordon MF 1990), 이또한시료중의페놀화합물의함량에의존적인것으로알려져있다 (Tabart J et al 2009). - 142 -

Table 8. Reducing power of water extract from various Artemisia (Absorbance at 700 nm) Kinds of Artemisia Concentration (µg/ml) 62.5 125 250 500 1000 Gaeddongssuk 0.31±0.00 aa 0.42±0.00 bb 0.61±0.01 cb 0.84±0.01 da 1.31±0.02 eb Ganghwayakssuk 0.33±0.00 ab 0.41±0.01 ba 0.53±0.00 ca 0.82±0.00 da 1.23±0.01 ea Yakssuk 0.31±0.00 aa 0.44±0.01 bc 0.61±0.00 cb 0.97±0.01 db 1.53±0.02 ec Injinssuk 0.35±0.00 ac 0.51±0.00 bd 0.78±0.02 cc 1.15±0.05 dc 1.89±0.03 ed Each value represents mean±sd (n=3) a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-E Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (6) Nitric oxide 라디칼저해능개똥쑥을비롯한쑥 4종의 nitric oxide 라디칼저해능을측정한결과이다 (Table 9). Table 9 에나타낸바와같이모든시료에서시료의농도가증가함에따라 nitric oxide 라디칼소거능은상승하였다. 62.5~250 µg/ml농도에서는인진쑥이 54.56±4.61~62.39±2.11% 의범위로타쑥에비해라디칼소거능이높았지만 500 µg/ml 농도에서는개똥쑥 (64.52±1.59%) 과유사하였고, 1000 µg/ml 농도에서는오히려개똥쑥 (74.95±0.63%) 이인진쑥 (71.08±0.73%) 보다라디칼소거능이높았다. 또한시료농도 250 µg/ml에서모든시료의 nitric oxide 라디칼소거능이 50% 이상이었다. Table 9. Nitric oxide radical scavenging of water extract from various Artemisia (%) Kinds of Artemisia Concentration (µg/ml) 62.5 125 250 500 1000 Gaeddongssuk 45.74±2.86 ac 53.99±1.67 bb 57.63±2.49 bb 64.52±1.59 cc 74.95±0.63 dd Ganghwayakssuk 32.98±3.07 aa 43.68±3.15 ba 50.49±2.62 ca 55.35±1.91 cda 56.60±2.49 da Yakssuk 39.92±1.08 ab 50.02±0.68 bb 54.10±2.33 cab 60.28±2.03 db 67.57±1.36 eb Injinssuk 54.56±4.61 ad 58.14±1.74 abc 62.39±2.11 bcc 64.73±1.92 cc 71.08±0.73 dc Each value represents mean±sd (n=3) a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. - 143 -

Hong JH et al(2007) 은약쑥분획추출물의 NO 라디칼소거능을측정한결과헥산분획물의 IC 50 값이 98.40 µg/mg, 클로로포름분획물이 81.85 µg/mg, 부탄올분획물이 76.34 µg/mg, 물추출 물이 71.66 µg/mg 이라고보고하였다. (7) α-glucosidase 저해능개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥물추출물의 α-glucosidase 저해활성은 Table 10에나타낸바와같이농도의존적으로저해활성이증가하였다. 타항산화실험에서인진쑥추출물의활성이높았던것과는달리모든농도에서강화약쑥과약쑥이 14.70±1.09~53.61±1.99% 범위로높은저해활성을보였다. Ryu JH et al(2011) 의연구에서는개똥쑥의줄기에탄올추출물이모든실험농도에서 56.25~86.49% 범위로가장활성이높았고, 다음으로줄기물추출물이 43.00~84.13% 의저해활성을나타낸다고보고하였다. 식물류의페놀및플라보노이드물질은구조적특징에따라항당뇨활성에차이를보이는것으로알려져있는데 (Sharma B et al, 2008), 본연구결과도이에기인한결과라사료되며, 강화약쑥과약쑥추출물이개똥쑥과인진쑥에비하여생체내항당뇨활성에유효할것으로예상된다. Table 10. α-glucosidase inhibition activity of water extract from various Artemisia (%) Kinds of Artemisia Concentration (µg/ml) 62.5 125 250 500 1000 Gaeddongssuk 9.23±2.22 aa 20.05±1.32 ba 21.10±1.71 ba 29.63±2.61 ca 41.57±0.62 da Ganghwayakssuk 14.70±1.09 ab 25.60±1.49 bb 36.88±1.10 cc 44.39±3.94 db 52.97±1.83 ec Yakssuk 21.88±0.81 ac 21.69±3.22 aa 27.20±2.04 bb 32.93±3.27 ca 53.61±1.99 dc Injinssuk 9.94±3.46 aa 19.78±1.37 ba 21.26±0.92 ba 33.76±0.22 ca 47.08±0.90 db Each value represents mean±sd (n=3) a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-C Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. 2) 다양한조건에서제조된흑마늘추출물의생리활성스크리닝을통한추출조건의최적화 (1) 흑마늘고온열수추출물의 ph 각각의온도및시간을달리한추출조건에서추출한흑마늘열수추출물의 ph를측정한결과는 Fig. 1과같다. - 144 -

Fig. 1. ph in black garlic extract under different conditions. 모든조건에서 ph 는 4.12~5.26 의범위로다소산성을띄는경향이었다. 흑마늘의경우갈변 물질의생성증가와함께 ph 가저하하는경향인데, 본연구결과흑마늘이고온에서추출되었 기때문에 ph 가낮은것으로생각된다. (2) 흑마늘고온열수추출물의갈변물질함량온도와시간을달리하여추출한흑마늘열수추출물의갈변물질함량을 280 nm에서측정한결과 (Fig. 2) 흡광도값은 0.194~0.278 범위로시료간의대차를보이지는않았다. 특히 110 및 130 에서 2시간추출한시료에서갈변물질의함량이가장높은것으로확인되었으며, 이들은동일동온도에서 4시간추출한것보다갈변물질의함량이높은것으로나타났다. 반응표면분석법에의해흑마늘추출물의갈변물질함량이극대화되는조건을분석한결과 (Fig. 3) 124.10 에서 3.30시간추출할때최고값 0.25를가졌다. 이는이조건에서벗어나시간및온도가낮아지거나높아질수록갈변도의최적조건에서멀어지는것을의미한다. Fig. 2. Browning intensity in 280 nm of black garlic extract under different conditions. - 145 -

Fig. 3. Response surface plot for browning intensity in 280 nm of black garlic extract. (3) 흑마늘고온열수추출물의 DPPH 라디칼소거활성흑마늘추출물의 DPPH 라디칼소거활성은 Fig. 4와같다. 130 에서 3시간추출한시료 (7번) 에서활성이가장컸으며 4번 (130, 4시간 ) > 5번 (120, 3시간 ) 순으로높은활성을보였으며, 110 에서 2시간추출된시료 (1번) 에서소거활성이가장낮아흑마늘추출물의경우, DPPH 라디칼소거활성은추출온도와비례적인것으로사료된다. DPPH 라디칼소거활성을반응표면분석법에의해분석한결과는 Fig. 5와같다. 144.53 에서 3.21시간추출하였을때정상점 (stationary point) 중최고값 67.90% 를가졌다. 144.53 는최대온도인 130 를벗어난값으로 ABTS 소거활성역시 DPPH와마찬가지로추출조건의최대온도인 130 를벗어나더라도그활성은증가할것으로생각된다. Fig. 4. DPPH radical scavenging activity of black garlic extract under different conditions. - 146 -

Fig. 5. Response surface plot for DPPH radical scavenging activity of black garlic extract. (4) 흑마늘고온열수추출물의 ABTS 라디칼소거활성흑마늘추출물의 ABTS 라디칼소거활성을측정한결과는 Fig. 6과같이, DPPH 라디칼소거활성과유사한경향이었다. 130 에서 4시간추출한 4번시료의활성이 36.53% 로가장높았으며, 다음으로 7번 (130, 3시간 ) 시료가 31.30% 였다. 그외의시료는모두 30% 미만의활성을보였다. 6번시료 (110, 3시간 ) 의경우가장낮은온도에서추출된것으로항산화활성은추출시간보다는추출온도에더욱의존적인것으로판단된다. ABTS 라디칼소거활성을반응표면분석법을이용하여분석한결과 Fig. 7에나타낸바와같이 143.12 에서 3.48시간추출하였을때정상점 (stationary point) 중최고값 33.19를보였는데, 이는본연구에서설정한온도범위를벗어가는하였으나, 본실험결과를통하여흑마늘은고온의추출조건에서도생리활성물질의안정도가높은것으로예상되어뜻밖의결과를얻었다. Fig. 6. ABTS radical scavenging activity of black garlic extract under different conditions. - 147 -

Fig. 7. Response surface plot for ABTS radical scavenging activity of black garlic extract. (5) 흑마늘고온열수추출물의 FRAP법에의한항산화활성흑마늘추출물의 FRAP를측정한결과 Fig. 8과같이 130 에서 4시간추출한 4번시료의활성이 36.86 μmol/g으로가장높았으며, 3번시료 (130, 2시간 ) 는 28.53 μmol/g, 7번시료 (13 0, 3시간 ) 는 27.47 μmol/g이었다. FRAP 활성이높았던상위 4번, 3번및 7번시료는모두추출최대온도인 130 에서 2~4시간동안추출한것으로흑마늘의 FRAP법에의한항산화활성도추출시간보다는추출온도의관련성이더큰것으로판단된다. Fig. 8. FRAP assay of black garlic extract under different conditions. FRAP법에의한항산화활성을반응표면분석법으로분석한결과는 Fig. 9와같다. 129.90 에서 3.42시간추출하였을때정상점 (stationary point) 중최고값을가졌다. 이는 130 에서 4시간추출한시료에서가장높은활성을보인 FRAP의결과와일치하였으며, 최고점이본실험계획의실험영역범위내에존재함을알수있었다. - 148 -

Fig. 9. Response surface plot for FRAP assay of black garlic extract. (6) 흑마늘고온열수추출물의총페놀및플라보노이드화합물함량흑마늘추출물의총페놀과플라보노이드화합물함량을측정한결과는 Fig. 10과같다. 4번시료 (130, 4시간 ) > 7번시료 (130, 3시간 ) > 11번시료 (125, 3.87시간 ) 의순으로총페놀및플라보노이드함량이높았다. 흑마늘은상기에기술된항산화활성이높은시료에서항산화유효물질인총페놀화합물및플라보노이드함량이높은것으로나타나, 이들물질이흑마늘의항산화활성과밀접한관련이있을것으로판단된다. Fig. 10. Total phenol and flavonoid contents of black garlic extract under different conditions. 반응표면분석법을통하여총페놀과플라보노이드화합물의함량이극대화되는흑마늘추출 조건을분석하였다 (Fig. 11). 흑마늘추출물의페놀화합물의경우 174.43 에서 3.714 시간추출 - 149 -

했을때최고값 214.55 mg/g으로그함량이가장클것으로예상된다. 174.43 는이번실험에서실행한최대추출온도인 130 를크게벗어난것으로흑마늘의경우추출조건이 130 이상으로높아지더라도생리활성에유효물질로인지되는페놀화합물함량이높은것으로분석되었다. 이는흑마늘이이미고온에서가공되는것으로보아고온의추출조건에서도이들물질의활성이감소되지는않는것으로생각된다. 반면에플라보노이드화합물의경우 108.335 에서 1.60시간추출할경우 12.74 mg/g의최적값을보였는데이는보는관점에따라최소점이되기도하고최대점이되기도하는안부값으로나타났다. 흑마늘추출물은전체적으로 130 에서 4시간추출한경우에항산화활성이가장높았으며, 총페놀및플라보노이드화합물의함량또한가장많았다. 이는고온에서장시간동안추출할수록흑마늘에있는페놀및플라보노이드화합물의용출이많아지면서항산화활성이높아진것으로판단된다. 또한, 추출물의갈변도, 항산화활성, 그유효물질로서페놀및플라보노이드화합물의함량을반응표면분석 (RSM) 을통하여분석한결과평균적으로 137.40 에서 3.12시간추출했을때흑마늘의활성을극대화할수있을것으로예상된다. [Total Phenol] [Total Flavonoid] Fig. 11. Response surface plot for total phenol and flavonoid contents of black garlic extract. 3) 개똥쑥고온열수추출물의최적추출조건의스크리닝 (1) 개똥쑥고온열수추출물의 ph 개똥쑥추출물의 ph를측정한결과모든추출물이산성을띠고있었으며그중에서 5번 (12 0, 3시간추출 ) 의 ph가가장낮았는데 (Fig. 12) 이역시흑마늘추출물과마찬가지로고온에서추출한영향으로생각된다. - 150 -

Fig. 12. ph of Gaeddongssuk extract under different conditions. (2) 개똥쑥고온열수추출물의갈변물질함량 Fig. 13은 280 nm에서개똥쑥추출물의갈변도를측정한결과로흡광도값이 0.212로다른추출물의 50% 밖에되지않는 3번 (130, 2시간 ) 을제외한모든추출조건의흡광도값은 0.400 이넘는높은값을가졌다. 280 nm에서측정한갈변도를반응표면분석을통하여분석한결과 (Fig. 14) 130.98 에서 3.35 시간추출할때최소흡광도값 0.434를가져온도와시간이각각 131.00, 3.35보다커질수록갈변도는증가할것으로생각된다. Fig. 13. Browning intensity in 280 nm of Gaeddongssuk extract under different conditions. - 151 -

Fig. 14. Response surface plot for browning intensity in 280 nm of Gaeddongssuk extract. (3) 개똥쑥고온열수추출물의 DPPH 라디칼소거활성 개똥쑥추출물의 DPPH 라디칼소거활성결과 (Fig. 15) 120 에서 3 시간추출한 5 번의활성이 72.06% 를보여다른조건들에비해활성이월등히좋았다. Fig. 15. DPPH radical scavenging activity of Gaeddongssuk extract under different conditions. Fig. 16은추출물의 DPPH 라디칼소거활성결과를바탕으로 DPPH 라디칼소거활성을반응표면분석을통하여분석한결과이다. 121.01 에서 2.91시간추출했을때 DPPH 라디칼소거활성이최고값 65.32% 에이를것으로추정된다. 이는 Fig. 15의결과와도상통하는것으로실험을시행한추출조건중 120 에서 3시간추출할때개똥쑥추출물의 DPPH 라디칼소거활성이최고조에달할것으로생각되며이범위를벗어날수록활성이떨어질것으로사료된다. - 152 -

Fig. 16. Response surface plot for DPPH radical scavenging activity of Gaeddongssuk extract. (4) 개똥쑥고온열수추출물의 ABTS 라디칼소거활성 Fig. 17은개똥쑥추출물의 ABTS 라디칼소거활성을나타낸결과로모든조건에서 50% 가넘는높은활성을보였으며, 대부분의추출조건에서 70% 가넘는비슷한값을보여 DPPH의활성과는차이를보였다. ABTS 라디칼소거활성을반응표면분석을통하여분석한결과 (Fig. 18), 개똥쑥을 119.85 에서 3.06시간추출할때최소값이 68.25% 로이이상의조건일때 ABTS 라디칼소거활성이증가할것으로생각된다. 실험을시행한추출조건중 120 에서 3시간추출하는조건이이와가장비슷한조건으로 120 이상의온도에서 3시간이상추출을할때개똥쑥의 ABTS 라디칼소거활성은증가할것으로판단된다. Fig. 17. ABTS radical scavenging activity of Gaeddongssuk extract under different conditions. - 153 -

Fig. 18. Response surface plot for ABTS radical scavenging activity of Gaeddongssuk extract. (5) 개똥쑥고온열수추출물의 FRAP법에의한항산화활성 Fig. 19는개똥쑥추출물을 FRAP법에따라항산화활성을측정한결과로 120 에서 3시간추출한 5번이활성이높았고, 130 에서 4시간추출한 4번이그다음으로높은값을보였다. 다른추출조건에서도 238.83~288.98 μmol/ g으로높은값을보였는데반하여 130 에서 2시간추출한 3번은 20.80 μmol/ g으로다른추출조건과비교하여매우낮은값을보였다. Fig. 20은추출물의 FRAP법에의한항산화활성을반응표면분석을통하여분석한결과이다. 그결과, 120.38 에서 2.98시간추출할때활성이가장높을것으로추정된다. 이는 DPPH 및 ABTs 라디칼소거활성과비슷한조건이며실험을시행한추출조건중에서는 120, 3시간추출하는조건과가장가까운조건이다. DPPH 및 ABTs 라디칼소거활성및 FRAP 결과모두 120 에서 3시간추출하는조건과가까운범위에서그활성이높아이조건에서가장항산화활성이활발할것으로생각되며이범위를벗어날수록활성은감소할것으로예상된다. Fig. 19. FRAP assay of Gaeddongssuk extract under different conditions. - 154 -

Fig. 20. Response surface plot for FRAP assay of Gaeddongssuk extract. (6) 개똥쑥고온열수추출물의총페놀및플라보노이드화합물함량개똥쑥추출물의페놀및플라보노이드화합물의함량 (Fig. 21) 은 130 에서 2시간추출하는 3번을제외하고는전체적으로높은함량을보였다. 그중에서도 120 에서 3시간추출하는 5번이가장페놀과플라보노이드화합물의함량이높았다. 개똥쑥추출물의페놀및플라보노이드화합물의함량을반응표면분석을통하여분석한결과 (Fig. 22) 페놀화합물의경우 119.91 에서 2.35시간추출할때 120.31 mg/g의함량으로안부점을가질것으로예상되며, 120.91 에서 1.79시간추출할때플라보노이드화합물의함량이가장높을것으로추정된다. 페놀및플라보노이드화합물함량의경우앞선항산화결과와비교하여볼때, 추출시간이다소짧은점에서최적값을보였다. Fig. 21. Total phenol and flavonoid contents of Gaeddongssuk extract under different conditions. - 155 -

[Total Phenol] [Total Flavonoid] Fig. 22. Response surface plot for total phenol and flavonoid contents of Gaeddongssuk extract. 개똥쑥추출물은전체적으로 120 에서 3시간추출한것이항산화활성이가장높았으며페놀및플라보노이드화합물의함량또한가장많았다. 이범위에서벗어날수록항산화활성이상대적으로떨어지는것을관찰할수있었다. 또한, 추출물의항산화활성과페놀및플라보노이드화합물의함량을반응표면분석 (RSM) 을통하여분석한결과평균적으로 122.17 에서 2.74 시간추출했을때개똥쑥의활성이극대화될것으로판단된다. 4) 혼합비율을달리한흑마늘및개똥쑥혼합물의항산화활성 (1) 총페놀및플라보노이드함량혼합비율을달리한흑마늘및개똥쑥혼합물의총페놀및플라보노이드함량을측정한결과는 Table 11과같다. 개똥쑥의비율이높아질수록총페놀과플라보노이드함량이다소증가하는경향을나타내었지만플라보노이드함량은흑마늘추출물에혼합한개똥쑥추출물의비율 0~1% 범위에서는유의적인차이는없었다. 개똥쑥을 10% 비율로혼합하였을때총페놀함량은 41.54±1.02 mg/g, 플라보노이드함량은 5.35±1.68 mg/g 타시료에비하여월등히높았다. 이결과로보아흑마늘및개똥쑥혼합물의총페놀과플라보노이드의함량증가는개똥쑥의비율에기인한결과라고판단된다. Kwon JW et al(2008) 은흑마늘의총페놀과플라보노이드함량은고온고압처리조건에따라다소상이하기는하지만생마늘에비해각각 7배와 16배정도증가하는데이는고온고압처리에의해여러화합물이폴리페놀화합물로전환되었거나, 추출이더용이해졌기때문이라고보고하였다. - 156 -

Table 11. Total phenol and flavonoids contents of the composites by water extract of black garlic and Gaeddongssuk (mg/g) Black garlic : Gaeddongssuk (v/v) Total phenol Flavonoids 100 : 0 23.22±0.49 A 0.28±0.06 A 99.9 : 0.1 25.0±00.50 BC 0.66±0.49 A 99.5 : 0.5 24.17±0.64 AB 0.90±0.58 A 99.3 : 0.7 26.14±0.42 C 1.42±0.57 A 99.0 : 1.0 26.18±0.83 C 0.94±0.37 A 90.0 : 10.0 41.54±1.02 D 5.35±1.68 B Each value represents mean±sd (n=3) A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (2) DPPH 라디칼소거활성 DPPH는짙은자색을띄는비교적안정한자유라디칼로서 cystein, glutathion과같은함황아미노산과 L-ascorbic acid 및 BHA 등에의해환원되어탈색되므로다양한천연소재로부터항산화물질을검색하는데많이이용되고있다. 자유라디칼은인체내에서지질또는단백질등과결합하여노화를일으키기쉬운데페놀성화합물의경우자유라디칼을환원시키거나상쇄시키는능력이강해인체내에서자유라디칼에의한노화를억제하는척도로이용할수있다 (Kim HK et al, 1995). 흑마늘및개똥쑥의혼합물의 DPPH 라디칼소거활성을측정한결과는 Table 12와같다. 모든시료에서 DPPH 용액에첨가된시료농도가증가함에따라유의적으로소거활성이증가한반면에혼합물중개똥쑥의비율이 0~1% 범위에서는큰유의차가없었으며, 개똥쑥을 10% 첨가하였을때 15.49±1.36~60.27±0.69% 의범위로전자공여능이월등히높아지는것을알수있었다. 식물체추출물의 DPPH 라디칼소거에의한전자공여능이페놀류나플라보노이드물질에기인하여항산화활성을나타내는것으로볼때 (Kang YH et al, 1996), 흑마늘및개똥쑥혼합물중개똥쑥의비율이증가할수록전자공여능이증가하는것도개똥쑥의높은함량의총페놀및플라보노이드에기인한것으로판단된다. Shin JH et al(2008a) 은흑마늘물추출물및에탄올추출물의 DPPH 라디칼소거능을측정한결과열수추출물 10 mg/ml 농도에서 69.40% 의활성을나타내었으나에탄올추출물은 15 mg/ml 농도에서도 50.55% 의활성을나타내었다. - 157 -

Table 12. Electron donating activity of the composites by water extract of black garlic and Gaeddongssuk Black garlic : Gaeddongssuk (v/v) Concentration (µg/ml) 125 250 500 1000 100 : 0 9.55±0.90 aa 14.35±0.60 bab 21.16±1.08 ca 33.90±1.03 da 99.9 : 0.1 12.42±5.31 aab 17.04±0.78 abc 25.03±0.32 bbc 41.06±2.29 cb 99.5 : 0.5 8.48±1.94 aa 15.50±0.95 babc 21.72±1.14 ca 33.61±2.89 da 99.3 : 0.7 12.89±1.88 aab 15.32±0.77 aabc 22.05±2.27 bab 34.68±0.95 ca 99.0 : 1.0 9.78±0.67 aa 14.86±1.83 aa 27.14±2.76 bc 36.07±0.33 ca 90.0 : 10.0 15.49±1.36 ab 20.30±1.53 bc 37.71±1.74 cd 60.27±0.69 dc Each value represents mean±sd (n=3) a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-C Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (%) (3) ABTS 라디칼소거능 ABTS 라디칼소거활성은 DPPH 라디칼소거활성과상관성이높으며그유효물질은페놀화합물인것으로보고되어있다 (Choi YM et al, 2003). 또한서로다른라디칼을이용한항산화활성측정에서소거활성의차이는시료의산화환원및라디칼의화학구조적차이에기인된다고알려져있다 (Gardner PT et al, 1998). 흑마늘및개똥쑥의혼합비율을달리한후 125, 250, 500 및 1000 µg/ml 농도로조정하여 ABTS 라디칼소거능을측정한결과를 Table 13에나타내었다. DPPH 라디칼을이용한전자공여능과유사한경향으로시료농도가증가할수록라디칼소거능이높아졌고, 개똥쑥의혼합비율을 10% 로첨가한혼합물의라디칼소거능이높았다. 1000 µg/ml 농도에서개똥쑥의비율 0~1% 범위의시료는 30% 이상의라디칼소거활성을보였으며, 10% 혼합시료는라디칼소거활성이약 59% 로가장높았다. (4) FRAP value 혼합비율을달리한흑마늘및개똥쑥혼합물의 FRAP value를측정하여 FeSO 4 로환산하여 Table 14에나타내었다. 개똥쑥이포함되지않은흑마늘추출물이모든농도에서 9.14±0.74~84.93±1.30 FeSO 4 eq µm로가장낮은활성을나타내었고, 개똥쑥의비율이증가함에따라유의적이지는않지만 FRAP value가증가하는경향을나타내었다. 시료농도 500 µg/ml에서는개똥쑥 10% 혼합물만이 FRAP value가 100 FeSO 4 eq µm 이상이었고, 1000 µg/ml 농도에서는모든시료가 100 FeSO 4 eq µm 이상을나타내었다. - 158 -

Table 13. ABTS radical scavenging activity of the composites by water extract of black garlic and Gaeddongssuk Black garlic : Gaeddongssuk (v/v) Concentration (µg/ml) 125 250 500 1000 100 : 0 8.48±0.25 aa 13.31±0.20 ba 22.09±0.17 ca 36.44±0.51 dab 99.9 : 0.1 8.25±0.21 aa 14.18±0.20 bab 24.19±0.30 cbc 35.03±0.71 da 99.5 : 0.5 10.65±1.63 ab 15.93±0.92 bc 23.63±0.73 cb 35.45±0.74 dab 99.3 : 0.7 8.76±0.18 aa 14.49±0.23 bb 23.94±1.11 cb 37.03±0.48 dbc 99.0 : 1.0 8.39±0.10 aa 14.71±0.45 bb 25.17±0.43 cc 38.24±0.78 dc 90.0 : 10.0 13.38±0.39 ac 22.52±0.61 bd 39.41±0.17 cd 59.10±1.51 dd Each value represents mean±sd (n=3) a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. Table 14. FRAP (ferric-reducing antioxidant potential) value of the composites by water extract of black garlic and Gaeddongssuk (FeSO 4 eq µm) Black garlic : Gaeddongssuk (v/v) Concentration (µg/ml) 125 250 500 1000 100 : 0 9.14±0.74 aa 21.41±2.13 ba 41.87±3.26 ca 84.93±1.30 da 99.9 : 0.1 25.50±1.17 ad 34.82±8.40 bbc 54.82±1.41 cb 104.71±3.31 dc 99.5 : 0.5 19.48±5.89 ac 37.32±7.45 bc 61.18±1.55 cc 102.43±1.76 dbc 99.3 : 0.7 13.91±0.59 aab 26.64±1.72 ba 56.64±1.60 cb 109.82±1.20 dd 99.0 : 1.0 15.61±3.74 abc 28.57±0.68 bab 55.96±1.34 cb 100.39±1.63 db 90.0 : 10.0 32.77±4.50 ae 77.20±4.46 bd 111.30±5.83 cd 194.03±3.04 de Each value represents mean±sd (n=3) a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-E Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. 일반적으로페놀성물질은수소공여체나금속이온의킬레이터로작용함으로써항산화능을 나타내며, 페놀화합물의함량이높을수록항산화능이증가하는것으로보고되어있다. 식물로 부터추출된페놀화합물은항산화능을포함한다양한생물학적효능을나타낸다고하였으며, - 159 -

이들의효능이주로산화환원력에기인된다는것으로볼때, 흑마늘과개똥쑥혼합물의항산화능도총페놀및플라보노이드함량과관련성이높은것으로판단된다. 따라서본실험결과흑마늘과개똥쑥의혼합비율을달리한혼합물간에총페놀및플라보노이드의함량에유의적인차이를보이는것으로보아흑마늘및개똥쑥혼합물의항산화능은이들물질의상호작용에기인된결과인것으로판단된다. (5) 환원력 흑마늘및개똥쑥의혼합비율을달리하여농도를 125~1000 µg/ml 로달리하였을때 Fe 이온 을환원시키는환원력을흡광도값으로나타낸결과는 Table 15 와같다. Table 15. Reducing power of the composites by water extract of black garlic and Gaeddongssuk Black garlic : Gaeddongssuk (v/v) Concentration (µg/ml) 125 250 500 1000 100 : 0 0.20±0.01 aa 0.23±0.00 ba 0.27±0.01 cns 0.36±0.01 dab 99.9 : 0.1 0.21±0.00 NSAB 0.23±0.01 A 0.38±0.18 0.35±0.01 A 99.5 : 0.5 0.22±0.01 ab 0.2±40.01 ba 0.28±0.00 c 0.36±0.00 dab 99.3 : 0.7 0.22±0.00 ac 0.23±0.01 aa 0.28±0.01 b 0.38±0.01 cc 99.0 : 1.0 0.21±0.00 aab 0.23±0.01 ba 0.29±0.01 c 0.37±0.00 db 90.0 : 10.0 0.23±0.01 ad 0.27±0.01 bb 0.35±0.01 c 0.48±0.01 dd Each value represents mean±sd (n=3) NS Not significantly a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. 흑마늘과개똥쑥의혼합비율이 99.9 : 0.1인시료를제외한나머지비율에서는시료의농도가증가함에따라환원력도유의적으로증가하였다. 특히 1000 µg/ml 농도에서 90 : 10 비율의혼합물은 0.50에가까운환원력을나타내었다. 흑마늘의환원력은흑마늘제조과정중에마이얄반응에의해생성된갈색물질의세포기질내의 hydroxy기와수소원자를공격함으로써라디칼반응을조절할수있는환원성물질에의해환원력을나타내는것으로알려져있으므로 (Lertittikul W et al, 2007) 흑마늘의항산화능은흑마늘중의갈변물질함량과도관련성이있을것으로사료된다. - 160 -

(6) Nitric oxide 라디칼소거능 Nitric oxide (NO ) 는생체내에서 NO synthase의촉매작용에의해 L-arginine으로부터생성되는반응성이강한자유라디칼로세포독성이강하며다량생성될경우염증반응, 면역체계이상등의산화반응을일으키는것으로알려져있다 (Ding AH et al, 1988). 흑마늘및개똥쑥의혼합물의 NO 라디칼소거능을측정한결과 (Table 16) 개똥쑥이혼합되지않은흑마늘추출물은농도증가에따라유의차가없었지만, 1000 µg/ml 농도에서다소증가하였다. 또한타실험과달리개똥쑥을첨가한혼합물보다첨가하지않은흑마늘추출물의 NO 라디칼소거능이 34.89±5.79~42.58±8.73% 범위로모든농도에서가장높은활성이었다. 반면에흑마늘과개똥쑥의비율이 99 : 1인혼합물은 1.58±0.63~32.38±1.84% 범위로가장활성이낮았다. Table 16. Nitric oxide radical scavenging of the composites by water extract of black garlic and Gaeddongssuk Black garlic : Gaeddongssuk (v/v) Concentration (µg/ml) 125 250 500 1000 100 : 0 34.89±5.79 NSC 35.86±0.31 D 34.96±4.13 D 42.58±8.73 B 99.9 : 0.1 28.07±3.36 abb 24.05±3.19 ac 29.15±1.74b BCD 38.67±0.86 cab 99.5 : 0.5 24.27±2.00 ab 27.23±2.94 ac 24.05±3.25 ab 33.42±1.83 ba 99.3 : 0.7 27.05±3.54 ab 24.95±6.21 ac 31.01±6.21 acd 45.67±5.26 bb 99.0 : 1.0 1.58±0.63 aa 2.96±2.06 aa 14.40±1.17 ba 32.38±1.84 ca 90.0 : 10.0 4.18±0.92 aa 9.90±1.50 bb 25.88±1.03 cbc 40.70±1.56 dab Each value represents mean±sd (n=3) NS Not significantly a-c Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-C Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. Lee SJ et al(2010) 은생마늘, 홍마늘및흑마늘의 NO 라디칼소거능을측정한결과흑마늘의소거능이가장높았으며, 이들의소거능은 2000 µg/ml 농도에서도 50% 미만이라고보고하였다. 식물류의 NO 라디칼소거능은페놀화합물이나플라보노이드류의함량에의존적인것으로보고되고있는데, 흑마늘과개똥쑥혼합물에서도같은경향을보였다. 또한마늘추출물의산소라디칼저해능은시료의갈색도와양의상관관계가있는것으로보고되어 (Moreno FJ et al, 2006) 본실험에서흑마늘과개똥쑥혼합물의 NO 라디칼소거능은페놀화합물및갈색물질의함량에기인된것으로추정된다. - 161 -

(7) α-glucosidase 저해능흑마늘및개똥쑥혼합물의 α-glucosidase 저해능을측정한결과 (Table 17) 타실험결과와달리시료의농도가증가함에따라개똥쑥혼합비율 0, 0.1 및 10% 만이저해능이유의적으로증가하였으며개똥쑥의첨가비율증가와저해능과는상관관계가없었다. 흑마늘과개똥쑥을 90 : 10으로혼합한추출물이 125 µg/ml 농도에서 1.09±1.10% 로가장낮은저해활성을나타내었고, 99.3 : 0.7으로혼합한추출물이 250 µg/ml 농도에서 19.16±0.42% 로가장저해활성이높았다. α-glucosidase는당질분해속도를조절하는효소로작용함으로써소장에서탄수화물의흡수저해및혈당상승을억제하는것으로알려져있는데, 마늘중의성분은가공조건에따라달라지며, 마늘중 diallyl trisulfide와같은유기황화합물이혈당강하에효과적인것으로보고된바있다 (Lee SJ et al, 2010). 또한생마늘, 홍마늘및흑마늘의 α-glucosidase 저해활성을측정한결과 2000 µg/ml 농도에서 19.68~30.37% 의저해활성을나타내었으며, 흑마늘의저해활성이가장높았다고보고하였다. Table 17. α-glucosidase inhibition activity of the composites by water extract of black garlic and Gaeddongssuk Black garlic : Gaeddongssuk (v/v) Concentration (µg/ml) 125 250 500 1000 100 : 0 8.01±0.95 ab 8.50±1.68 aa 15.68±4.23 bb 7.93±1.97 aa 99.9 : 0.1 7.08±1.50 ab 13.02±3.76 bb 13.86±2.31 bb 18.77±2.21 cb 99.5 : 0.5 13.30±0.85 ac 18.70±2.27 bc 17.65±3.56 abb 16.22±2.37 abb 99.3 : 0.7 18.61±0.71 bd 19.16±0.42 bc 14.77±1.19 ab 13.90±1.40 ab 99.0 : 1.0 6.31±2.19 ab 8.13±2.46 aa 7.72±2.70 aa 15.47±1.74 bb 90.0 : 10.0 1.09±1.10 aa 8.71±2.13 ba 15.31±2.07 cb 16.81±4.59 cb Each value represents mean±sd (n=3) a-c Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. A-D Means with different superscript in the same column are significantly different at p<0.05. (8) 면역활성측정흑마늘및품종별쑥추출물의면역활성비교를위하여농도별추출물이마우스비장세포증식능에미치는영향을검색하기위한지표로 CCK-8 발색법을이용하여측정하였다. 본실험에서시료로사용된흑마늘물추출물의비장세포증식능을알아본결과는 Fig. 23과같다. 흑마늘추출물의농도가증가할수록면역세포증식능도유의적으로증가함을확인할수있었는데 10 µg/ml의농도에서는증식능이미미하였으나실험된최고농도인 400 µg/ml에서는 158% 로증식율이증가하였다. - 162 -

Fig. 23. Effect of water extract from black garlic on viability of mouse splenocytes. 마우스비장세포에 4종류쑥의물추출물을투여한결과면역세포증식능 (Fig. 24) 은 10~50 µg/ml의낮은농도에서는 100~130% 범위로쑥의종류에관계없이면역세포증식률이유사하였으나, 100 µg/ml의농도에서부터개똥쑥의면역세포증식률이다른쑥추출물에비해유의적으로증가함을확인할수있었다. 또한, 모든쑥추출물은흑마늘추출물에비해면역세포증식능이더우수하여 100 µg/ml 이상의농도부터는활성이월등히더높음을확인할수있었다. Fig. 24. Effect of water extract from 4 kinds ssuk on viability of mouse splenocytes. - 163 -

흑마늘과개똥쑥물추출물을 99.9 : 0.1, 99.5 : 0.5, 99.3 : 0.7 및 99.0 : 1.0의비로혼합하여비장세포에투여한후면역세포증식능을측정한결과는 Fig. 25에나타내었다. 시료를투여하지않은군에비해서흑마늘과개똥쑥추출물혼합물을투여한군에서면역세포증식능이증가하였는데, 개똥쑥추출물의혼합비율이증가할수록면역세포증식이더증가하였다. 이는흑마늘에비해쑥추출물의면역세포증식능이상대적으로더우수하기때문으로판단되며, 관능평가결과개똥쑥추출물을 99.0 : 1.0 정도로첨가할경우쑥에기인하는쓴맛이강하여기호도가낮았다. Fig. 25. Effect of water extract mixture from black garlic and Gaeddongssuk on viability of mouse splenocytes. IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α와같은여러가지 cytokine은암세포에대한세포독성을나타내는물질로제시되어왔으며, 그중에서도 IL-1, IL-6, TNF-α는초기염증반응에서세포간신호전달을수행함으로써면역반응에중요한역할을담당한다고알려져있다. 본실험에서는 IL-1β, IL-6, TNF-α의분비량을측정하였고, 양성대조군으로는 LPS(15 mg/ml) 로비장세포를자극하여분비된 cytokin를측정하여비장세포의활성화에대한지표로삼았다. 상기의항산화실험결과, 비장세포에대한증식능실험결과및관능평가를종합하여흑마늘과개똥쑥추출물이상호시너지효과를나타내는최적의비율로 99.3 : 0.7을설정하였으며이혼합비로제조된추출혼합물을 125, 250, 500, 1000 µg/ml로농도를조절하여 IL-1β 생성량에미치는영향을 ELISA kit를이용하여측정한결과는 Fig. 26에나타내었다. 흑마늘및개똥쑥추출혼합물을처리하였을때대조군에비해 IL-1β의생성량이증가되었음을확인하였으며, 흑마늘및개똥쑥추출혼합물의처리농도가증가할수록 IL-1β의생성량또한증가함을확인할수있었다. - 164 -

Fig. 26. IL-1β production by activated mouse splenocytes cultured with water extract mixture from black garlic and Gaeddongssuk (99.3 : 0.7). IL-6 생성량을 ELISA kit를이용하여측정한결과는 Fig. 27에나타내었다. 대조군은 80.28 pg/ml의 IL-6를생성하였으며, mytogen인 LPS를투여한경우에는 570.48 pg/ml의 IL-6 생성하여대조군에비해생성량의상승을확인할수있었다. 흑마늘및개똥쑥추출혼합물의농도를증가시킬수록 IL-6의생성량또한증가함을확인할수있었다. Fig. 27. IL-6 production by activated mouse splenocytes cultured with water extract mixture from black garlic and Gaeddongssuk (99.3 : 0.7). - 165 -

TNF-α는 T 림프구의활성과성장을조절하고암세포의세포용해를유도함으로써직접적인항암작용을일으키기도하며, 염증및면역반응에관여한다고알려져있다. TNF-α 생성량을 ELISA kit를이용하여측정한결과는 Fig. 28에나타내었다. mytogen인 LPS를투여하였을때 TNF-α의생성량은 81.45 pg/ml 였는데흑마늘및개똥쑥추출혼합물의농도를증가시킬수록대조군에비해 TNF-α 생성량이증가하는것을확인할수있었다. 이같은 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의생성량증가는외부항원의자극시흑마늘및개똥쑥추출혼합물이면역반응을증진시킬가능성이있음을보여주는결과로사료된다. Fig. 28. TNF-α production by activated mouse splenocytes cultured with water extract mixture from black garlic and Gaeddongssuk (99.3 : 0.7). 5) 개발제품의이화학적특성분석 (1) 고형분함량, ph 및산도개발제품의기초품질특성을확인하고자가용성고형분함량, ph 및산도를측정한결과는 Table 18과같다. 개발된제품의가용성고형분함량은 8.4%, ph는 5.23, 산도는 0.42% 로향후개발제품은동등또는 5% 이내의오차범위의품질을유지하도록관리하는기준으로활용할계획이다. Table 18. Soluble solid, ph and acidity of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk Analysis item Soluble solid (%) ph Acidity (%) Contents 8.40±0.01 5.23±0.25 0.42±0.04-166 -

(2) 총페놀및플라보노이드함량일반적으로페놀성화합물은식물계에널리분포되어있는 2차대사산물의하나로다양한구조와분자량을갖는것으로알려져있는데, 이는 phenolic hydroxyl기를가지기때문에단백질을비롯한다른거대분자들과쉽게결합하여항산화, 항염증, 항암등의다양한생리적기능을나타내는것으로보고된바있다 (Kim EY et al, 2004). Fig. 29는개발시제품의페놀화합물및플라보노이드함량을정량한결과로그함량은각각 1866.08 µg/ml 및 500.00 µg/ml로페놀화합물의함량이플라보노이드함량에비해약 3.7 배더높게정량되었다. Fig. 29. Total phenol and flavonoid contents in drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. 마늘중의총페놀및플라보노이드함량과관련하여생마늘, 찐마늘및흑마늘의총페놀화합물과플라보노이드의함량을측정한결과, 생마늘과찐마늘은페놀화합물의함량이시료간에유의차가없었으나, 흑마늘은 1.56 mg/100 g으로이들마늘에비해약 2.6배더높게정량되었고, 플라보노이드의함량역시흑마늘 > 생마늘 > 찐마늘순으로높았다는 Choi DJ et al(2008) 의보고가있다. 개똥쑥의경우에는페놀화합물의함량이잎은 88.19 mg/g, 줄기에서는 45.03 mg/g으로보고된바있는데 (Ryu JH et al, 2011a), 이는상기 Choi DJ et al(2008) 의보고에의한흑마늘중의페놀화합물보다월등히높은함량이었다. Cai et al(2004) 은개똥쑥의대표적페놀성화합물로 chlorogenic acid, ρ-coumaric acid, coumarin, 6,7-dimethoxycoumarin, luteolin-7-glucoside, rutin, quercetin, luteolin 및 kaempferol 등을분리 동정하였고, Ryu JH et al(2011b) 은 catechin류를분리 동정한바있다. 선행연구의결과와본연구의결과를종합해볼때개발된음료중의총페놀화합물과플라 - 167 -

보노이드함량은흑마늘보다는쑥추출물에서기인하는것으로추정되며, 생마늘에비해서는함량이높으나쑥에비해서는상대적인함량이낮은흑마늘추출액에쑥을혼합함으로서총페놀및플라보노이드함량을증가시킴으로서항산화활성을비롯한생체내활성에더욱긍정적인영향을미칠수있을것으로기대된다. (3) 유리당의함량개발된제품중의주요성분인유리당의함량을분석한결과는 Table 19와같다. 흑마늘과개똥쑥추출혼합물이베이스이며, 당류가가미된음료이므로베이스가된흑마늘과개똥쑥추출물중의유리당함량을함께분석하였다. 개똥쑥추출물에서는 fructose, glucose 및 sucrose 가검출되었으며흑마늘과제품에서는 sucrose가검출되지않았다. 흑마늘에는 fructose가 40.02±0.71 mg/ml로가장함량이높으며, 개똥쑥추출물에비해서도약 2배정도더높았다. Fructose는흑마늘중의주요유리당으로써흑마늘자체가지니는감미에기여하는것으로판단된다. 개똥쑥추출물중에 sucrose가 11.03±0.07 mg/ml 함유되어있었으나음료에서는검출되지않았는데, 이는혼합되는비율을고려할때상대적인함량이낮았기때문으로생각된다. Table 19. Free sugar contents of extracts powder made from Gaeddongssuk, black garlic and drink product (mg/ml) Sample Fructose Glucose Sucrose Gaeddongssuk extract powder 26.42±0.63 5.54±0.07 11.03±0.07 Black garlic extract powder 40.02±0.71 2.10±0.05 - Drink product 14.76±0.29 1.15±0.00 - (4) 유기산의함량흑마늘과개똥쑥함유음료를제조하여유기산함량을분석하고, 원재료인개똥쑥과흑마늘중의유기산함량과비교한결과는 Table 20과같다. 유기산은시료마다차이를보이면서 7~8종이검출되었는데, 개똥쑥추출물에서는 lactic acid 가검출되지않았으며, 흑마늘과개발제품에서는 tartaric acid와 succinic acid가검출되지않았다. 개똥쑥추출물은흑마늘추출물에비해유기산의총량이약 8.7배더높았으며, 유기산중 oxalic acid의함량이가장높았고, 다음으로 citric acid, malic acid의순이었고, 이들유기산을제외한나머지유기산의함량은 200 mg/100 g 미만이었다. 흑마늘추출물에서는 citric acid 의함량이가장많았고다음으로 oxalic acid, malic acid의순으로절대함량의차이는있었으나상대적으로함량이높은유기산의종류는비슷한경향이었다. 제품중의유기산총량은 217.7 mg/100 g이었고, 유기산의대소함량패턴은흑마늘추출물과동일하였다. - 168 -

Lactic acid는흑마늘추출물에서 20.6 mg/100 g, 개발제품에서는 15.8 mg/100 g의농도로검출되었다. 함량이높았던유기산도개발제품에서는단일추출물중의함량에비해상대적으로더적게검출된것을고려해볼때제품중의 lactic acid는첨가된배추출농축액과결정과당으로부터유래된것으로생각된다. Table 20. Organic acid contents of extracts powder from Gaeddongssuk, black garlic and drink product Gaeddongssuk extract powder Black garlic extract powder (mg/100 g) Product Oxalic acid 4241.6 217.4 23.9 Tartaric acid 22.6 - - Citric acid 2411.4 339.9 82.2 Malic acid 1145.7 131.9 53.6 Glycolic acid 110.6 65.1 15.1 Formic acid 179.9 105.8 14.7 Lactic acid - 20.6 15.8 Acetic acid 184.8 85.9 12.4 Succinic acid 135.7 - - Total 8,432.3 966.6 217.7 6) 개발제품의항산화활성규명 (1) DPPH 라디칼소거활성개발된제품은흑마늘과쑥추출물자체의색으로인하여원액을그대로항산화활성측정에사용할수없으므로증류수를가하여 2, 4, 6, 8, 및 10% 농도로희석하여 DPPH 라디칼소거활성을측정한결과는 Fig. 30과같다. 2% 희석액에서라디칼소거활성은 22.9% 였으며, 시료의농도가증가함에따라 DPPH 라디칼소거활성도유의적으로증가하였다. 최고농도인 10% 희석액의 DPPH 라디칼소거활성은 51.7% 로 2% 희석액에비해활성이약 2.3배더높은활성을보였다. DPPH에의한항산화측정법은비교적간단하고실제항산화활성과관련성이높아다양한천연소재로부터항산화물질을탐색할때널리이용되고있다 (Choi SY et al, 2006). Shin JH et al (2008b) 은흑마늘추출물의항산화활성은생마늘및찐마늘보다높았으며, DPPH 및환원력등의일부항목에서는흑마늘열수추출물의활성이에탄올추출물보다도높았는데, 이는생마 - 169 -

늘과비교하여흑마늘을고온에서장시간숙성시키는과정에서 amino-carbonyl 반응에의해서 새로생성된갈변물질에의하여항산화활성이높아졌기때문으로추정하였다. Fig. 30. DPPH radical scavenging activity of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 반면, 개똥쑥은항산화활성이높은약용식물중의하나로이는페놀성화합물에의한것으로보고된바있으며 (Zheng W & Wang SY, 2001; Hong JH et al, 2007; Brisibe EA et al, 2009), 페놀성화합물중에서도항산화활성에영향을주는주요성분으로알려진 catechin류가주로항산화활성에기여하는것으로추측된다 (Ryu JH et al, 2011b). DPPH 라디칼소거활성에따른항산화활성은페놀성화합물에의하며 (Kim EY et al, 2004; Lee HR et al, 2008), 이러한페놀성물질은전자공여체또는금속이온의 chelator로작용하여항산화활성을나타내는것으로알려져있다 (Rice-Evans CA et al, 1996). (2) ABTS 라디칼소거활성개발음료희석액의 ABTS 라디칼소거활성은시료의함유비율이증가함에따라그활성역시증가하는경향을나타내었다 (Fig. 31). 2% 희석액의라디칼소거활성은 24.1% 였으나농도가 2배증가된 4% 희석액에서는활성이약 3.1배증가하여 76.3% 로가장큰폭으로활성이증가하였다. 6% 희석액의활성은 4% 희석액에비해 1.2배증가하여 95.3% 에달하는높은 ABTS 라디칼소거활성을보였다. 또한 8% 와 10% 희석액의농도에서는거의 100% 에근접하는라디칼소거활성을보였는데, 그차이는크지않아 90% 이상의활성을나타내는농도이상에서는시료의농도증가에따른활성증가폭이완화됨을확인할수있었다. - 170 -

Fig. 31. ABTS radical scavenging activity of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. ABTS 라디칼과 DPPH 라디칼모두체내의산화원인물질로 ABTS 라디칼은양이온라디칼인반면, DPPH 라디칼은자유라디칼로기질의성질이다르며, 추출물중항산화물질의특성에따라결합정도가다를수있어 (Shin JH et al, 2008a), 추출물의항산화활성을측정할때에는두종류의라디칼소거활성을모두측정하여비교할필요가있다고보고되어있다 (Woo JH et al, 2010a,b). Kim HY et al(2008) 은사과를 0~150 로가열추출한결과, 열처리를하지않은시료에비해열처리를한시료가 ABTS 라디칼소거활성이크게증가하였다고하였고, 또 Choi YM et al(2003) 은시료중의 ABTS 라디칼소거활성이페놀화합물에의한다고보고한바있다. 이와같은선행연구의보고를미루어볼때, 본연구에서흑마늘및개똥쑥혼합물의높은 ABTS 라디칼소거활성은시료를고온에서열수추출함에따라페놀화합물의용출이상대적으로증가하여 ABTS 라디칼소거활성또한증가된것으로생각된다. (3) 환원력환원력은 reductions이제공하는수소원자가자유라디칼사슬을분해함으로써시작되는데, 이때흡광도의값자체가시료의환원력을나타내게된다 (Gordon MF, 1990). 시료의환원력은항산화활성과관련성이높기때문에 DPPH 라디칼소거능이높은시료인경우환원력이높은것으로알려져있고, 이또한시료중의페놀화합물의함량에의존적인것으로알려져있다 (Gordon MF, 1990). 흑마늘과개똥쑥을혼합한개발제품을 2, 4, 6, 8 및 10% 농도로희석하여환원력을측정하여흡광도값으로나타낸결과는 Fig. 4와같다. 환원력은모든시료에서첨가농도가증가함 - 171 -

에따라유의적으로상승하였으며 2% 희석액에서흡광도값은 0.8 이었으나 10% 희석액에서는 2.6 으로약 3.25 배정도활성이증가함을알수있었다. Fig. 4. Reducing power of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 흑마늘은장시간고온에서가공되는과정중 amino-carbonyl 반응에의해갈변화되고 (Choi DJ, 2008), 이때기질내 hydroxyl기와수소원자를공여함으로써라디칼반응을제어할수있는환원물질이생성되기때문에생마늘에비해환원력이더높게나타난다고보고되어있다 (Lertittikul W et al, 2007). 이러한보고들로미루어볼때흑마늘및개똥쑥혼합음료의환원력은이들음료중에함유되어있는페놀화합물과흑마늘의숙성과정중생성된환원물질이주된인자인것으로사료된다. (4) FRAP법에의한항산화활성대부분의항산화제가환원력을갖는다는측면에서고안된방법으로, 산성 ph의영역에서 ferric tripyridyltriazine(fe +3 -TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine(fe +2 -TPTZ) 으로환원되는원리를이용한 FRAP법에의한시료의항산화활성을측정한결과는 Fig. 5와같다. FRAP법에의한항산화활성역시다른항산화실험의결과와마찬가지로시료의농도가높아질수록그활성역시유의적으로증가하는경향을보였다. 즉, 2% 시료첨가농도에서는 FRAP값은 214.8 µm/ml이었으나 10% 농도에서는 599.7 µm/ml로활성이 2.8배정도증가하였다. 일반적으로열처리과정을거치면서시료의 FRAP 활성은감소하는데, 흑마늘은열처리숙성을통하여제조되었음에도불구하고일정수준이상의환원력에의한 FRAP 활성을가지는것으로알려져있는데 (Jastrzebski Z et al, 2007), 남해, 의성및창녕산통흑마늘의항산화력을 - 172 -

FRAP 법으로측정한결과, 각각 1.7, 1.4, 1.7 M/mL 의값으로보고된바있다 (You BR et al, 2011). Fig. 33. Ferric-reducing antioxidant potential ability (FRAP) of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 본연구결과 FRAP를비롯한흑마늘및개똥쑥혼합물의항산화활성이높은것은페놀화합물의함량이높기때문이며, 이를뒷받침하는근거로 Holasova M et al (2002) 의보고를들수있다. 또, Kim HK et al (2010) 은페놀화합물및플라보노이드함량에따른밀원별벌꿀의항산화활성을측정한결과, FRAP 활성과페놀및플라보노이드함량의상관관계를비교했을때플라보노이드 (r 2 =0.84) 보다총페놀함량이 (r 2 =0.95) 더높은상관관계가있다고보고하였다. Moon GS et al (2003) 은 FRAP 법에의한항산화활성과 DPPH 라디칼소거활성은높은상관관계를나타낸다고보고한바있다. (5) Fe +2 chelating 활성측정체내세포에서지질및단백질의산화를촉진하는 Fe +2 과같은금속이온인자 (Decker EA & Hultin HO, 1992) 에대하여시료의 chelating 활성을측정한결과는 Fig. 34와같다. 시료의 Fe +2 chelating 활성은 6% 희석액까지는농도의존적으로활성이증가하였으나 8% 와 10% 희석 액에서는 6% 희석액과비교할때유의적인활성의차이가없었다. 즉, 본실험에서가장저농도인 2% 희석액의 chelating 활성은 22.6% 였으나 6% 희석액의활성은약 1.8배상승한 41.8% 로증가한반면 8% 와 10% 희석액에서는평균 44.0% 및 43.7% 의활성을나타내었다. 항산화성물질에의한 Fe +2 chelating 활성은활성산소종의생성을억제하여세포의산화적손상을막고, 지질과산화물의생성에촉매역할을하는전이금속의농도를낮추므로금속이 - 173 -

온의 chelating 활성은중요한항산화기작으로알려져있다 (Duh PD et al, 1999). Ryu JH et al (2011b) 이개똥쑥의물추출물과에탄올추출물의 Fe +2 chelating 활성을측정한결과, 잎과줄기의물추출물은에탄올추출물에비해월등히높았다고보고하였으며, 가압 열처리가톱풀과울릉미역취어린잎의 Fe +2 chelating에미치는효과를분석한결과 (Woo JH et al, 2010b) 에서도두종모두가압 열처리에의하여 Fe +2 chelating 효과가증가되었음이보고되어있다. 따라서흑마늘및개똥쑥혼합음료의높은 chelating 활성도이들추출물의제조과정을통하여향상되는것으로추정된다. Fig. 34. Ferrous ion (Fe +2 ) chelating activity of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-c Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 7) 개발제품의생리활성규명 (1) 아질산염소거활성 Fig. 35는흑마늘과개똥쑥혼합물을이용하여식품중의대표적인발암성물질인 N-nitrosamine의생성전구체로작용하는아질산염에대한소거활성을측정한결과이다. 시료의아질산염소거활성은농도의존적으로증가하였는데, 2, 4, 6, 8 및 10% 희석액에서각각평균적으로 18.8, 32.8, 46.6, 55.1 및 63.8% 의활성을보였다. 실험에사용된 10% 희석액의경우, 2% 희석액의시료와비교할때약 3.4배더높은아질산염소거활성을나타내었으며, 농도의증가와더불어소거활성또한지속적으로유의성있게증가하는점을미루어보아 10% 희석액이상의농도로섭취되었을때도지속적으로그활성의증가될가능성이높을것으로예측된다. - 174 -

다류소재로애용되고있는감잎, 뽕잎, 두충잎및둥글레차등의아질산염소거활성은시료의첨가농도를높일수록비례적으로증가하여시료농도 50~200 mg/100 g일경우, 그활성은약 1.8 5배증가된다고보고되어있다 (Lee JM & Ahn MS, 1997). Lee JW et al (2001) 은홍삼의수용성갈변물질에대한아질산염소거활성은 15.9~38.7% 의범위이며, 갈변물질의분자량이높을수록소거능이증가되는데주된성분은비효소적갈변물질인 melanoidin이라고보고한바있다. 또한열처리된마늘은 nitric oxide와산소의반응으로생성되는 peroxynitrite에대한소거활성이있는데, 유효물질은열에안정적이고 allinase의활성보다는 thiosulfinate의생성과관련이있다고보고되어있다 (Lawson LD, 1998). 이들보고를미루어볼때혼합물의아질산염소거활성은열에안정적인갈변물질및흑마늘속에존재하는함황화합물에의한것으로추정된다. Fig. 35. Nitrite scavenging activity in drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. (2) α-glucosidase 저해활성측정흑마늘및개똥쑥혼합음료의당분해억제활성의존재여부를확인함으로써기능성을탐색하고자항당뇨효과의지표로가장널리활용되는 α-glucosidase 저해활성을측정한결과는 Fig. 36과같다. 2, 4, 6, 8 및 10% 희석액의농도에서각각 10.1, 13.5, 18.5, 22.8 및 28.3% 의 α- glucosidase 저해활성이있었으며, 시료의농도증가와더불어활성이증가하였으나그절대값은 30% 미만으로항산화활성에비해서는활성이낮았다. Yin Y et al(2009) 의보고에따른약재인 6년근황기의경우 α-glucosidase 활성억제효과는 0.5 mg/ml의농도에서 14.62%, 1 mg/ml의농도에서 49.71% 로시료첨가농도가높아지면서그활성또한증가하는경향이었다. 마전자추출물중페놀성분은 DPPH 라디칼소거활성과 - 175 -

α-glucosidase 의저해활성에상관관계가있다고보고되어있으며 (Lee JM et al, 2010), Xu ML et al(2010) 은토후박추출물에서총페놀화합물의함량과 DPPH 라디칼소거활성이높을수록 α-glucosidase 의활성이높다고하였다. Fig. 36. α-glucosidase inhibition of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 본연구결과흑마늘및개똥쑥혼합물의 α-glucosidase 저해활성역시시료중의페놀화합물및플라보노이드함량이높고, DPPH 라디칼소거활성과비슷한경향으로활성이증가하여상기연구결과들과일치하는결과였다. 또한시료의첨가농도에따라저해활성은농도증가와더불어계속적으로상승하는결과로미루어볼때 10% 희석액이상의고농도시료첨가농도에서도이들혼합물의 α-glucosidase 저해활성은더욱증가할수있을것으로기대된다. α-gglucosidase 저해활성은탄수화물의섭취후혈당상승을억제할수있어항당뇨활성의측정법으로이용되는데 (Gua J et al, 2006), 흑마늘과개똥쑥혼합음료는탄수화물의소화과정에서 α-glucosidase에의한단당류생성을저해함으로써식사후혈당이급격히상승하는등의증상에도효과적으로이용될수있음을예측할수있었다. (3) Xanthine oxidase 저해활성측정 Xanthine oxidase (XO) 는 purine 대사에관여하는효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine의산소를떼어내면서과산화수소 (H 2 O 2 ) 를생성하게되고, 나머지골격이 uric acid를형성하여혈장내에과량존재하게되면골절에축적되어심한통증을유발하는통풍과신장에침착되어신장질환을일으키는효소로알려져있으며, 일종의항산화활성을측정하는방법으로도사용되고있다 (Cho HE et al, 2010). 흑마늘및개똥쑥혼합물이 XO 저해활성을측정한결과 (Fig. 37), 시료의농도가증가할수 - 176 -

록그활성또한유의적으로증가하는경향을보였는데, 특히 10% 희석액에서는 2% 희석액에비해약 4.3배증가한 63.8% 의저해활성을보였다. Yeo SG et al (1995) 은녹차, 오룡차및홍차추출물과같은차류의 xanthin oxidase 저해능을측정한결과, 녹차는 10 mg/ml에서 89.2~93.2%, 오룡차는 10 mg/ml에서 88.8% 그리고홍차는 10 mg/ml에서 78.7% 의저해능을가진다고보고하였다. 또한 Kim MH et al (2007) 은차조기잎물추출물에서 46.9% 의 XO 저해활성을보고하였다. 이들결과와본연구결과를비교하여보면흑마늘과개똥쑥혼합음료의 XO 저해활성도 XO 저해제로서효과를나타내기에충분함을알수있다. 따라서개발제품은 XO 저해활성에효과가있다고생각되는바, 심층적으로연구 개발한다면기능성식품의개발에효과적으로이용할수있을것으로판단된다. Fig. 37. Xanthine oxidase inhibition activity of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 8) 개발제품의면역활성규명 (1) 쑥혼합물이 RAW 264.7 세포의생존율에미치는영향대식세포인 RAW 264.7은체액성면역과세포매개성면역의효과세포로, NADPH oxidase와 inducible nitric oxide synthase(inos) 에의해 superoxide anion(o - 2 ) 과 nitric oxide(no) 를합성하고, 면역반응과관련된 Interleukin(IL), interferon(ifn), tumor necrosis factor(tnf) 과같은사이토카인의생성에영향을미친다. RAW 264.7에대한쑥혼합물의세포독성을알아보기위하여 CCK-8 assay를수행하였다. 쑥혼합물을농도별 (1, 2, 5, 10, 20 %) 로처리한결과 (Fig. 38), 99~106% 범위로독성을나타내지않았다. 따라서쑥혼합물이 RAW 264.7의생존율에영향을주지않는것으로판단하고면역활성검증을위한농도로설정해다음실험을진행하였다. - 177 -

Fig. 38. Effect of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk on RAW 264.7 cells viability. Each value represents mean±sd, n=3. A-B Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. (2) 쑥혼합물이 RAW 264.7 세포내의 nitric oxide(no) 생성에미치는영향 NO는고도의반응성을가진과산화질소로과도한 NO의분비는정상숙주의조직을손상시켜염증을유발하게된다. 쑥혼합물이 LPS로처리된 RAW 264.7의 NO의생성량에미치는영향을 Fig. 39에나타내었다. 대조군과비교할때쑥혼합물을처리농도가증가할수록 NO 생성량이감소하는것으로나타났다. Fig. 39. Effect of drink product made from black garlic and Gaeddongssuk on NO production in RAW 264.7 cells. Each value represents mean±sd, n=3. A-F Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. - 178 -

(3) 쑥혼합물이 RAW 264.7 세포내의사이토카인 (IL-1β, TNF-α) 생성량에미치는영향 IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α와같은여러가지사이토카인은암세포에대한세포독성을나타내는물질로제시되어왔으며, 그중에서도 IL-1, IL-6, TNF-α는초기염증반응에서세포간신호전달을수행함으로써면역반응에중요한역할을담당한다고알려져있다. 본연구에서는 IL-1β 및 TNF-α의분비량측정하였고, LPS로자극한대식세포로부터분비된사이토카인을측정하여대식세포의활성화에대한지표로삼았다. IL-1β의함량을 ELISA kit를이용하여측정한결과 (Fig. 40), 쑥혼합물의첨가농도에의존적으로 IL-1β 생성량이유의하게증가하였으며, 최대 20% 농도에서는 272.34 pg/ml로양성대조군이 LPS 처리구 (40.93 pg/ml) 에비해높은생성량이증가하였다. TNF-α의함량을측정한결과 (Fig. 41), IL-1β의함량과유사한경향으로시료의농도가증가할수록대조군에비해 TNF-α의생성량이증가하였다. 따라서쑥혼합물은외부로부터의항원에대항하여 IL-1β 및 TNF-α의생성을촉진시킴으로써면역기능증강에효과적으로작용할것으로사료된다. TNF-α는면역반응의초기에분비되는전염증기 cytokine으로천식이나류마티스관절염등여러가지질환에서의염증반응조절에관여하는것으로알려져있다. TNF-α는생체내에서단독으로또는다른 cytokine들과협력작용하여일부종양에대해서는혈관을손상시킴으로써종양괴사를유발시키거나말라리아또는레지오넬라에의한감염, 바이러스혹은기생충에의한감염에대하여숙주의저항성을유도시키기도한다. Fig. 40. IL-1β production by RAW 264.7 cells cultured with drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. A-F Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. - 179 -

Fig. 41. TNF-α production by RAW 264.7 cells cultured with drink product made from black garlic and Gaeddongssuk. Each value represents mean±sd, n=3. A-F Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 또한, TNF-α는중요한염증매개인자중하나로서, 경우에따라서는오히려생체에해로운영향을미칠수도있는데, 이러한유해작용중특히중요한것은내피세포에서항응고성을상실하게하여 fibrin 침착을증가시킴으로써혈관내응고현상을유발시킬수있으며, ICAM-1 을발현시켜염증세포의부착력을증대시켜염증세포가염증부위를빠져나가는것을촉진시킨다. 이로인하여 TNF-α는순환장애및광범위한조직괴사를유발할수있는주요매개인자로간주되고있으며만성염증성질병상태에서지방세포의 lipoprotein lipase의활성을억제시켜 cachexia를유발시키기도한다. 9) 흑마늘과천연식물류복합물제조를위해선정된천연식물류의생리활성평가 (1) 추출수율및갈색도 11종의천연식물류열수추출물의추출수율및갈색도는 Table 21과같다. 추출수율은상황버섯이 5.70% 로가장낮았고, 열매부위를사용한구기자의수율이 52.10% 로가장높았으며, 그외시료에서는 14.50~42.47% 였다. 뿌리부위를사용한시료중황금및단삼의수율은 40% 이상으로높았으나산약, 작약및생강의수율은 14.50~18.53% 에불과하였다. 본실험결과는 Ju JC et al(2006) 이보고한 95 에서 3시간동안환류추출한감국 (9.25%), 단삼 (36.49%), 뽕잎 (15.48%) 및옥수수수염 (11.82%) 열수추출물의수율과비교해볼때높게정량되어, 추출시간의차이와추출과정중진탕배양기의사용에의한것으로사료된다. 다류소재로이용되는천연식물류의물추출물은시료의종류에따라 1.38~33.20% 의수율로시료간에차이가큰것으로보고된바있는데 (Kim MH et al, 2001), 본실험에서사용한시료중상황버 - 180 -

섯을제외한대부분의시료에서추출수율이높아식품가공에적용할경우산업적활용도가 높을것으로예상된다. Table 21. Yields and browning intensity from hot water extracts in the medicinal plant materials Sample code Korean name Yields (%) Browning intensity in 420 nm A 구기자 52.10±1.65 F 0.085±0.001 D B 황금 42.13±2.73 E 0.251±0.002 H C 오가피 34.76±3.82 D 0.522±0.003 I D 감국 31.47±2.82 D 0.046±0.001 B E 산약 18.53±1.05 B 0.051±0 C F 작약 15.17±2.37 B 0.039±0.001 A G 단삼 42.47±2.80 E 0.084±0.001 D H 뽕잎 26.92±2.27 C 0.218±0.002 G I 생강 14.50±2.04 B 0.103±0.001 E J 상황버섯 5.70±0.53 A 0.903±0.001 J K 옥수수수염 16.07±0.47 B 0.180±0.001 F Each value represents mean±sd, n=3. A-I Means with different superscripts in the column are significantly different at p<0.05. 420 nm에서증류수를대조로하여 1,000 μg/ml 농도로제조한시료추출물의갈색도는상황버섯이 0.903으로가장높았다. 다음으로오가피가 0.522였으며, 황금, 뽕잎, 생강및옥수수수염은 0.1~0.3의범위였고, 그외시료는 0.1 이하의흡광도를나타내었다. 420 nm에서시료추출물의흡광도값은시료의추출과정중갈색화반응생성물의함량의추정에적용되며, 시료중갈색물질의함량과항산화활성과의관계를예측할수있는지표로이용된다 (Kang YH et al, 1995). 16종의한약재열수추출물에서갈변물질의함량은 0.040~1.312의흡광도값을보였는데, 감국, 단삼및옥수수수염열수추출물에서각각 0.445, 0.240 및 0.917의흡광도값을보여본실험결과보다는상당히높았으나, 뽕잎은 0.302로비슷한수준이었다. 또한시료중갈변물질의함량이많을수록항산화활성이높았다고보고되어 (Ju JC et al, 2006), 본실험결과에서도갈색도가높은시료에서생리활성이높을것으로예상된다. (2) 총페놀화합물및플라보노이드함량 11 종의천연식물류열수추출물의총페놀화합물및플라보노이드함량은 Table 22 와같다. - 181 -

총페놀함량은 38.01~78.53 mg/g이었으며, 상황버섯이가장높았고산약 (38.01 mg/g) 이가장낮은함량으로시료의종류에따라유의적인함량차를보였다. 플라보노이드함량은상황버섯이 41.02 mg/g으로가장높았고, 다음으로황금 (31.65 mg/g), 뽕잎 (21.30 mg/g) 의순으로, 그밖의시료에비해월등히높은함량이었으며, 구기자, 산약및작약은 1 mg/g 미만이었다. 페놀성화합물은화학적구조내의 phenolic hydroxyl기에의해항산화활성의정도나 2가금속이온과의결합이결정되며 (Jo DH et al, 2007), 이들작용기에의한유리라디칼의소거효과도높아생체내에서항암이나면역증진활성과도관련이크다 (Lee YS, 2007). 따라서황금, 오가피, 단삼, 뽕잎및상황버섯등은총페놀이나플라보노이드함량이높아생체에적용시생리활성의증대를기대할수있을것으로생각된다. (3) 천연식물류열수추출물의 DPPH 라디칼소거활성 11종의천연식물열수추출물을 100~1,000 μg/ml의농도범위에서 DPPH 라디칼소거활성과 50% 의소거활성을나타내는시료의농도인 EC 50 값을산출한결과는 Table 23과같다. 모든시료에서시료의첨가농도가많아짐에따라소거활성이유의적으로증가되었다. 본실험에사용된추출물의농도범위에서시료들의 EC 50 값을확인한결과, 단삼이 100 μg/ml 이하로시료중활성이가장높았으며, 상황버섯, 황금및작약이각각 113.38, 124.73 및 130.51 μg/ml였으며, 그외시료의 EC 50 값은 200 μg/ml 이상이었다. Table 22. Total phenol and flavonoids contents in the medicinal plant materials (mg/g dried extracts) Sample code Total phenol Flavonoids A 43.51±0.19 B 0.53±0.13 A B 68.82±1.32 G 31.65±0.36 H C 69.08±0.30 G 12.05±0.46 E D 56.78±0.22 F 16.71±0.34 F E 38.01±0.40 A 0.42±0.08 A F 47.40±0.34 D 0.33±0.17 A G 75.42±0.59 H 8.36±0.80 C H 53.16±0.49 E 21.30±0.36 G I 45.07±0.51 C 11.13±0.36 D J 78.53±0.11 I 41.02±0.34 I K 47.73±1.07 D 6.76±0.10 B Refer to the sample code in Table 21. Each value represents mean±sd, n=3. A-I Means with different superscripts in the column are significantly different at p<0.05. - 182 -

Table 23. DPPH radical scavenging activity in the medicinal plant materials Sample code Concentration (μg/ml) 100 250 500 1000 EC 50 (μg/ml) A 2.04±0.80 aa 5.83±0.74 ba 10.93±0.89 cb 19.35±0.16 db 1000 < B 45.65±0.89 ad 71.94±0.28 bg 72.20±0.28 bh 74.82±0.70 ci 124.73±4.56 C 26.30±2.83 ab 43.43±2.67 bc 48.80±0.69 cd 50.37±1.63 cc 828.55±87.15 D 26.02±0.89 ab 55.09±2.64 bd 72.32±0.80 ch 73.16±1.55 chi 224.43±11.37 E 2.09±0.66 aa 5.52±0.16 ba 8.00±0.50 ca 14.28±1.59 da 1000 < F 44.48±1.44 ad 71.34±1.00 bg 68.48±2.22 cg 71.67±0.95 ch 130.51±5.36 G 57.57±1.24 af 71.35±0.47 bg 71.62±0.81 bh 71.98±0.16 bh < 100 H 25.53±1.08 ab 58.19±1.08 be 65.90±1.08 cf 62.67±2.22 de 212.40±4.45 I 32.64±0.32 ac 43.40±1.07 bc 58.47±0.48 ce 69.44±0.60 dg 358.94±13.06 J 48.37±2.84 ae 62.16±1.40 bf 65.68±0.27 cf 67.03±0.47 cf 113.38±24.24 K 26.39±1.03 ab 32.33±1.91 bb 38.56±3.69 cc 53.41±1.34 dd 879.48±64.54 Refer to the sample code in Table 21. Each value represents mean±sd, n=3. Means with different superscripts in the same row (a-d) and column (A-I) are significantly different at p<0.05. 약용식물류 32종의 DPPH 라디칼소거활성을검색한연구에서단삼및황금이가장우수하였다는보고 (Kwon JW et al, 2007) 는본연구결과와도유사하였다. 단삼의경우과산화수소에의한산화적스트레스에대한방어활성은상당히높으나, 감마선에의한산화적스트레스에대한방어활성은상반된결과를보여동일식물체라도산화적스트레스의유형에따라방어능에차이가있다는보고도있다 (Kim JH et al, 2000). Park YS(2002) 은 8종의한약재추출물중총페놀함량과 DPPH 라디칼소거활성과의관계에서구기자와작약은상호반비례관계였으나국화는비례관계였으며, 대다수의식물체가항산화활성을지니나, 시료중활성성분의종류및함량차이에따라활성차이가큰것으로보고한바있다. (4) 천연식물류열수추출물의 ABTS 라디칼소거활성 11종의천연식물류열수추출물의 ABTS 라디칼소거활성을 EC 50 값으로나타낸결과는 Table 24와같다. ABTS 라디칼소거활성은 DPPH 라디칼의소거활성과같은경향으로단삼에서 EC 50 값이 100 μg/ml 이하로가장활성이높았고, 황금 (115.68 μg/ml), 상황버섯 (149.57 μg/ml) 및작약 (167.29 μg/ml) 은 200 μg/ml이하였다. 특히, 오가피는 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활 - 183 -

성을비교해볼때 EC 50 값이각각 828.55, 238.36 μg/ml 로라디칼의종류에따른활성차이가 상당히큰것으로나타났다. Table 24. ABTS radical scavenging activity in the medicinal plant materials Sample code Concentration (μg/ml) 100 250 500 1000 A 5.17±1.63 aab 13.92±1.34 bb 23.83±1.06 cb 44.40±0.87 db 1000 < EC 50 (μg/ml) B 46.33±3.05 ae 80.03±0.73 bi 83.23±2.11 cg 85.41±0.59 cf 115.68±12.02 C 20.44±6.22 ac 52.37±1.29 bf 72.03±1.77 ce 74.65±2.29 cd 238.36±6.21 D 18.16±1.22 ac 42.72±1.29 be 71.14±4.39 ce 77.94±3.90 de 315.52±18.83 E 1.92±0.94 aa 10.25±0.45 ba 16.23±0.37 ca 29.79±2.45 da 1000 < F 32.84±1.96 ad 71.02±0.94 bh 83.98±1.43 cg 84.11±2.55 cf 167.29±4.70 G 53.98±2.12 ae 82.44±4.07 bi 83.52±1.17 bg 84.57±1.60 bf < 100 H 20.90±1.59 ac 51.70±1.65 bf 78.06±2.28 cf 79.11±1.30 ce 242.12±7.73 I 8.92±1.08 ab 31.67±1.72 bd 55.68±2.33 cd 78.43±0.44 de 441.48±23.11 J 42.79±5.91 ae 62.05±1.80 bg 74.14±1.12 ce 74.52±1.44 cd 149.57±32.18 K 7.09±1.81 ab 18.69±1.56 bc 33.18±2.49 cc 57.63±1.20 dc 842.77±29.78 Refer to the sample code in Table 21. Each value represents mean±sd, n=3. Means with different superscripts in the same row (a-d) and column (A-I) are significantly different at p<0.05. 식물체에함유된페놀성분은종류에따라라디칼소거활성이다양하게발휘되는데, 한약재를대상으로한라디칼소거활성결과에서 ABTS라디칼소거활성은시료의페놀화합물의함량에관계없이우수한것으로보고된바있다 (Chae JW et al, 2012). Joo SY(2013) 은약용식물류 10종의 DPPH 및 ABTS라디칼소거활성은라디칼의종류에따라서로다르며, DPPH 라디칼소거활성이다소높게측정되었다고보고한바있는데본연구결과도이와유사한경향이었다. (5) 천연식물류열수추출물의 superoxide anion 라디칼소거활성천연식물류열수추출물의 superoxide anion 라디칼소거활성은 Table 25와같다. 구기자, 산약및뽕잎추출물을제외한시료에서 EC 50 값은 348.16~918.16 μg/ml로 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성에비해대부분의시료에서활성이낮았다. 하지만, 단삼의 superoxide anion 라디칼소거활성이가장높았던것은 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성과도일치하는경향이었다. - 184 -

Table 25. Superoxide anion radical scavenging activity in the medicinal plant materials Sample code Concentration (μg/ml) 100 250 500 1000 EC 50 (μg/ml) A 6.34±1.98 aa 10.93±0.65 ba 13.23±3.06 ba 35.48±2.66 cab 1000 < B 17.65±1.19 abcd 28.17±1.02 be 53.80±3.95 ce 76.54±1.27 dd 467.08±32.52 C 20.45±2.73 ad 23.87±1.79 bd 50.33±1.96 ce 76.50±2.12 dd 488.99±6.54 D 18.20±3.77 abcd 20.41±1.90 ac 38.06±1.55 bd 56.30±3.73 cc 837.00±85.95 E 16.11±1.13 abc 23.71±1.58 bd 24.67±2.33 bb 32.43±2.67 ca 1000 < F 14.94±2.15 ab 18.32±2.38 bc 32.72±1.98 cc 52.42±2.04 dc 918.16±31.83 G 20.28±1.94 ad 37.52±2.44 bf 69.28±2.75 cg 89.86±2.83 df 348.16±13.92 H 17.62±1.27 abcd 19.57±1.52 ac 24.71±2.08 bb 39.19±3.91 cb 1000 < I 19.95±3.06 ad 29.72±2.82 be 61.10±4.78 cf 83.72±2.36 de 413.35±26.35 J 18.66±2.07 acd 18.99±2.80 ac 53.30±3.11 be 78.84±2.67 cd 468.51±18.48 K 8.85±1.52 aa 13.98±1.34 bb 29.13±1.44 cc 55.09±0.76 dc 902.07±14.83 Refer to the sample code in Table 21. Each value represents mean±sd, n=3. Means with different superscripts in the same row (a-d) and column (A-F) are significantly different at p<0.05. 약용식물추출물의 superoxide anion 라디칼소거활성연구에서오가피와황금추출물의활성이상당히높았으며, 이들시료에서 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성과의상관관계가각각 0.695, 0.851로써유의적으로높은관계가성립되는것으로보고되어있다 (Joo SY et al, 2013). 또한맨드라미꽃의메탄올추출물에서도상기의라디칼소거활성간에 0.9 이상의상관관계가보고된바있다 (Kim HY et al, 2012). 본연구에서사용된천연식물류추출물중단삼, 황금및상황버섯은다양한라디칼에대한소거활성이우수하여생체내산화적스트레스에대한항산화성물질로써효과가클것으로사료된다. (6) 천연식물류열수추출물의환원력천연식물류열수추출물의환원력은 Table 26에나타내었다. 시료의환원력은 700 nm에서측정한흡광도값으로나타내었으며 (Gordon MF, 1990), 흡광도값이 0.5에도달하는데소요되는시료의양을 EC 0.5 값으로나타내었다. 시료의첨가량이증가됨에따라환원력은유의적으로상승하였으며, 구기자, 산약및옥수수수염의 EC 0.5 값은 1000 μg/ml 이상인것으로추정되었다. 상황버섯, 단삼및황금의 EC 0.5 값은 500 μg/ml 이하로특히상황버섯의환원력이가장높 - 185 -

았는데, 이는시료의총페놀화합물함량과일치하는경향이었다. Table 26. Reducing power in the medicinal plant materials Sample code Concentration (μg/ml) 100 250 500 1000 EC 0.5 (μg/ml) A 0.09±0.00 ab 0.13±0.00 bb 0.22±0.00 cd 0.42±0.00 dc 1000 < B 0.13±0.00 aef 0.27±0.00 bg 0.52±0.00 ci 0.96±0.00 di 482.67±6.73 C 0.13±0.00 af 0.26±0.00 bf 0.44±0.00 ch 0.74±0.00 dh 591.11±6.84 D 0.11±0.00 ac 0.21±0.00 bd 0.34±0.00 ce 0.61±0.00 de 834.00±18.33 E 0.07±0.00 aa 0.10±0.00 ba 0.14±0.00 cb 0.24±0.00 da 1000 < F 0.12±0.01 ad 0.21±0.00 bd 0.37±0.00 cf 0.67±0.00 df 718.89±15.12 G 0.22±0.00 ah 0.47±0.00 bh 0.85±0.00 ck 1.44±0.02 dk 270.00±8.08 H 0.12±0.00 ae 0.23±0.00 be 0.40±0.00 cg 0.70±0.00 dg 684.83±12.82 I 0.11±0.00 ac 0.18±0.00 bc 0.05±0.00 ca 0.50±0.01 dd 940.00±38.44 J 0.21±0.01 ag 0.53±0.01 bi 0.80±0.01 cj 1.36±0.04 dj 230.70±4.32 K 0.09±0.00 ab 0.14±0.00 bb 0.22±0.00 cc 0.37±0.00 db 1000 < Refer to the sample code in Table 21. Each value represents mean±sd, n=3. Means with different superscripts in the same row (a-d) and column (A-I) are significantly different at p<0.05. 또한본실험에사용된천연식물류중감국, 단삼및뽕잎의환원력은 1,000 μg/ml의농도에서 Ju JC et al(2006) 이보고한결과에비해 2배이상높았으나, 오가피는비슷한수준이었다. 식물류에서환원력은전자공여를통한라디칼의소거활성과상관성이높은것으로알려져있는데 (Gordon MF, 1990), 본실험결과도이와잘일치하였다. 환원력측정을통한여러식물체의항산화활성비교에서 16종의한약재열수추출물 (Ju JC et al, 2006), 10종의약용식물에대한 70% 에탄올추출물 (Joo SY, 2013) 의비교연구가있으나, 상황버섯추출물의환원력이라디칼소거활성과유사한경향으로나타난것은본연구에서처음으로확인된결과라생각된다. (7) 천연식물류열수추출물의 Fe +2 킬레이팅활성천연식물류열수추출물에서금속이온인 Fe +2 에대한킬레이팅활성은 Table 27에나타낸바와같이시료의첨가농도가증가됨에따라유의적으로상승하였다. 오가피와감국은 EC 50 값이 1,000 μg/ml 이상이었으며, 그외 9종의시료에서 214.72~550.05 μg/ml의범위로구기자와생강을제외한시료에서 EC 50 값은 500 μg/ml 이하였다. 특히뽕잎의킬레이팅활성이가장높았으며, 다음으로옥수수수염이었다. - 186 -

Table 27. Fe +2 chelating activity in the medicinal plant materials Sample code Concentration (μg/ml) 100 250 500 1000 EC 50 (μg/ml) A 37.54±1.92 agh 39.53±1.90 acd 50.66±2.16 bd 52.83±3.15 bc 550.06±59.13 B 13.93±2.11 ac 38.75±1.17 bc 64.25±2.44 cg 85.75±3.68 dg 360.94±16.35 C 9.32±1.35 ab 21.95±2.93 bb 31.58±1.44 cb 44.66±2.06 db 1000 < D 6.23±1.07 aa 10.47±0.22 ba 16.30±2.59 ca 23.10±2.42 da 1000 < E 36.57±1.26 ag 42.15±1.34 bde 55.13±3.62 ce 68.19±3.49 de 407.91±47.92 F 27.50±0.95 af 44.42±1.12 be 68.47±2.61 ch 89.97±3.10 dgh 308.03±10.57 G 19.96±1.87 ae 38.07±3.22 bc 56.40±1.45 ce 74.00±5.11 df 411.79±25.91 H 25.00±1.54 af 57.71±1.52 bg 87.93±1.53 cj 94.87±2.23 di 214.72±6.16 I 25.54±0.73 af 39.25±3.81 bcd 46.82±0.90 cc 91.11±1.44 dhi 535.68±8.31 J 17.29±2.43 ad 37.57±0.76 bc 74.14±1.68 ci 87.75±3.30 dgh 335.03±5.82 K 39.11±2.24 ah 51.72±2.57 bf 60.25±1.57 cf 62.34±3.81 cd 235.50±36.37 Refer to the sample code in Table 21. Each value represents mean±sd, n=3. Means with different superscripts in the same row (a-d) and column (A-I) are significantly different at p<0.05. 본실험에서사용한 11종천연식물류는라디칼소거활성과환원력이비슷한경향을보였는데, Fe +2 킬레이팅활성은다소상이한양상으로특히옥수수수염의경우라디칼소거활성은낮았으나 Fe +2 킬레이팅활성은타시료에비해유의적으로높았다. 개똥쑥추출물은 ABTS 및 NO 라디칼소거활성이높았으며 (Ryu JH et al, 2011b), Gordon MF, 1990), 마가렛, 국화및낙동구절초추출물은 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성이높아시료중의총페놀함량과비례적이었으나 (Woo JH et al, 2010a), 이들시료는모두 Fe +2 킬레이팅활성이낮은것으로보고된바있다 (Ryu JH et al, 2011b; Woo JH et al, 2010a). 이처럼라디칼소거활성과 Fe +2 킬레이팅활성은서로상반된결과를나타내기도하는데, 이러한현상은식물류의성분중금속이온의제거와라디칼소거에관여하는물질의종류가상이하거나 (Seo SJ et al, 2008) 시료중금속이온을포집할수있는물질의함량이낮기때문이라고추정되고있다 (Woo JH et al, 2010a). 본실험에서도황금, 상황버섯은라디칼소거활성은우수한반면, Fe 2+ 킬레이팅활성에서 EC 50 값이 335.03, 360.94 μg/ml로라디칼소거활성이낮았던옥수수수염및뽕잎에비해활성이낮게측정되어라디칼소거활성과 Fe +2 킬레이팅활성간의상관관계가작다는상기의보고 [(Ryu JH et al, 2011b; Seo SJ et al, 2008; Woo JH et al, 2010a)] 와유사한결과 - 187 -

였다. 이상의보고들에서와같이시료의환원력만으로 Fe +2 킬레이팅활성정도를평가할수는없으며 (Chu YH et al, 2000), 시료의라디칼소거활성에관여하는유효물질의대부분이페놀화합물및플라보노이드성분이라고보고 (Ju JC et al, 2006; Park HJ et al, 2012) 로미루어볼때본연구에서 Fe +2 킬레이팅활성과라디칼소거활성의동시분석은시료의라디칼소거활성에관여하는다른 phytochemicals의존재를짐작케하는결과로써가치가있다고판단된다. (8) 천연식물류열수추출물이 LPS에의해유도된 NO 생성에미치는영향마우스대식세포인 RAW 264.7 세포를이용한면역활성평가에앞서천연식물류추출물의세포독성을확인하기위하여시료자체의세포독성및 LPS를병용처리하였을때 MTT assay 를수행한결과는 Fig. 42에나타내었다. 시료자체의세포독성결과 (Fig. 42A) 에기초하여 LPS로산화적스트레스를유발한후천연식물류추출물을 50 μg/ml 농도로처리하였을때대부분의시료에서 80% 이상의세포생존율을보였으나, 오가피에서세포생존율은 72.97% 로다소간의세포독성이있는것으로확인되었다 (Fig. 42B). 시료추출물을 100 μg/ml 처리구에서는황금, 오가피, 생강, 상황버섯및옥수수수염에서세포생존율이 80% 이하였으나, 오가피 (71.76%) 를제외한황금, 생강, 상황버섯및옥수수수염의세포생존율이 77.53~79.93% 의범위로 100 μg/ml의시료처리구에서도천연식물류에대한세포독성이그다지높지는않은것으로확인되었다. 마우스대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 처리후천연식물류추출물을첨가하였을때 NO 생성에미치는영향을측정한결과는 Fig. 43과같다. LPS 무처리구에비해 LPS 처리후 NO 생성량은 12배증가되었으며, 11종의천연식물류추출물을 50 및 100 μg/ml 첨가시 NO 생성량은 12.89~26.18 μm, 6.86~26.11 μm로산약및옥수수수염을제외한시료에서 LPS 처리구보다낮은함량이었다. 특히 100 μg/ml의황금및감국의처리는 LPS 처리구에비해각각 72% 및 58.6%, 황금 (50 μg/ml) 및상황버섯 (50 및 100μg/mL) 은각각 47.3% 및 32.0~36.4% 로 LPS 처리구에비해유의적으로 NO 생성을감소시켰다 (p <0.05). NO는산화적스트레스상태에서증가되는물질로 (Yun HY et al, 1996), RAW264.7 세포에 LPS 처리로증가된 NO의함량은천연식물류추출물의처리로감소되었는데, 특히황금과상황버섯의활성이가장우수하였다. 황금은 flavonoid류인 baicalin, baicalein, wogonin 및 skullcapflavone 등을함유하고있으며, 이들성분들에의한항염증및항산화작용이보고되어있다 (Chi TS et al, 2003; Gao D et al, 1998). 이들물질중 baicalin, baicalein은화학적구조중 O-di-hydroxyl기를가지므로 wogonin보다활성이높으며, 이는 DPPH 라디칼소거와도밀접한관련이있는것으로알려져있다 (Gao Z et al, 1999). - 188 -

(A) (B) Fig. 42. Effects of the medicinal plant materials on cell viability of RAW 264.7 macrophages without(a) and with(b) LPS. Refer to the sample code in Table 21. Results are presented as mean±sd of three independent experiments. a-g Values with different letters in the each bars are significantly different among control and 50 μ g/ml sample treated group at p<0.05 according to Duncan s multiple range test. A-G Values with different letters in the each bars are significantly different among control and 100 μ g/ml sample treated group at p<0.05 according to Duncan s multiple range test. - 189 -

Fig. 43. Effects of the medicinal plant materials on NO synthesis in LPS-induced RAW264.7 macrophages. Refer to the sample code in Table 21. Results are presented as mean±sd of three independent experiments. a-e Values with different letters in the each bars are significantly different among control and 50 μ g/ml sample treated group at p<0.05 according to Duncan s multiple range test. A-E Values with different letters in the each bars are significantly different among control and 100 μ g/ml sample treated group at p<0.05 according to Duncan s multiple range test. 2% 의상황버섯추출물을 4~8주간급이는 H 2 O 2 에의한산화적스트레스를받은림프구에서 DNA 손상에대한방어효과가 29~33% 정도였다는보고가있다 (Kim JH et al, 2008). 이는상황버섯에서분리한 phellinsin A가체내에서 superoxide anion을생성하는 xanthine oxidase의활성을강하게억제한다는보고와도유사하며 (Hwang EI et al, 2006), 생체내 glutathione, glutathione reductase 및 GSH-px 활성을증가시키므로써세포내 ROS의생성을억제시키게된다고보고되어있다 (Ye SF et al, 2007). 본연구에서 11종의천연식물류는세포독성이낮으며, 총페놀화합물의함량이높아항산화활성이높고 LPS 처리에의한 NO 생성을감소시켰는데, 그중황금, 상황버섯, 단삼, 뽕잎, 작약등 5종의활성이전반적으로우수하여항산화및면역증강용기능성음료제조를위한부재료로써이들을선별하는것이적절하리라판단된다. - 190 -

10) 선정된천연식물류 5종및혼합물의영양성분분석 (1) 유리당함량상황버섯, 황금, 단삼, 뽕잎및작약추출물중의유리당함량을분석한결과는 Table 28과같으며, 이들 5종의천연식물류추출물동량혼합물 (MHE-1) 과원재료를수율이동일하도록혼합한후추출한추출물 (MHE-2) 중의유리당함량을함께분석하였다. 황금, 단삼, 뽕잎, 작약추출물에서 fructose, glucose 및 sucrose가검출되었으며, 상황버섯추출물에서는 sucrose가검출되지않았다. 그러나상황버섯추출물에서 fructose와 glucose는각각 34.86 g/100 g 및 31.33 g/100 g으로가장함량이높으며, 5종의천연식물류혼합물인 MHE-1, MHE-2에비해서도높았다. Sucrose의함량은작약과황금과작약추출물에서각각 42.24 g/100 g 및 41.67 g/100 g으로여타천연식물류추출물에비해높았다. 5종의천연식물류혼합물의경우 MHE-2보다는추출물을동량혼합한 MHE-1에서 glucose와 sucrose의함량이더높았다. 각각의천연식물류추출물과천연식물류혼합물중의유리당함량에있어큰차이가없었는데, 이는혼합되는비율을고려할때상대적인함량이낮았기때문으로생각된다. Table 28. Free sugar contents in the medicinal plant materials Samples 상황버섯 (Phellinus linteus) Free sugar contents (g/100 g) Fructose Glucose Sucrose 34.86±0.62 31.33±0.17 ND * 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi) 21.47±0.08 27.89±0.33 41.67±2.89 단삼 (Salvia miltiorrhiza Bunge) 22.33±0.10 28.11±0.00 30.89±0.01 뽕잎 (Morus alba L.) 23.19±0.06 28.63±0.04 39.10±0.03 작약 (Paeonia lactiflora Pall.) 24.44±0.14 29.29±0.15 42.24±0.07 MHE-1 23.55±0.12 29.65±0.06 37.06±0.58 MHE-2 23.20±0.10 28.85±0.09 33.77±0.22 ND : not detected Extract MHE-1 is mixed by same weight from each hot water extracts of Phellinus linteus, Scutellaria baicalensis, Salvia miltiorrhiza, Morus alba, and Paeonia lactiflora Extract MHE-2 is extracted with hot water of mixture by 100 g, 13.5 g, 13.4 g, 21.2 g and 37.6 g for Phellinus linteus, Scutellaria baicalensis, Salvia miltiorrhiza, Morus alba, and Paeonia lactiflora (2) 유기산함량 상황버섯, 황금, 단삼, 뽕잎및작약추출물의유기산함량을분석하고, 이들천연식물류 5 종 의추출물동량혼합물 (MHE-1) 과추출전혼합추출물 (MHE-2) 중의유기산함량을분석한결 - 191 -

과는 Table 29 와같다. 유기산은추출물에따라차이를보였는데, 천연식물류중뽕잎추출물 의총유기산함량이 8938.7 mg/l 로가장높았고, 다음으로작약추출물이 5671.5 mg/l 였다. Table 29. Organic acid contents in the medicinal plant materials (mg/l) Organic acids 상황버섯 (Phellinus linteus) 황금단삼 (Scutellaria (Salvia baicalensis miltiorrhiza Georgi) Bunge) 뽕잎 (Morus alba L.) 작약 (Paeonia lactiflora Pall.) MHE-1 MHE-2 Oxalic acid 1213.4 318.0 1925.4 351.7 1580.6 1128.7 368.9 Maleic acid ND 54.8 ND ND ND ND ND Tartaric acid ND 174.3 91.7 21.8 18.2 38.7 65.9 Citric acid 239.7 1384.8 1190.8 2645.2 3312.3 1807.7 1594.2 Malic acid 575.5 640.3 1260.7 3950.8 660.7 1447.1 1186.7 Glycolic acid 78.5 20.4 ND 41.6 ND 34.0 37.4 Formic acid ND 21.4 30.5 88.4 ND ND 68.8 Lactic acid 200.6 41.6 ND ND ND 45.7 31.9 Acetic acid 49.3 43.1 64.8 499.0 99.7 138.6 155.8 Succinic acid 27.7 ND * 83.6 178.7 ND 61.5 48.6 Fumaric acid 43.7 ND ND 1161.5 ND 231.5 164.8 Total 2428.4 2698.6 4647.5 8938.7 5671.5 4933.7 3723.0 ND : not detected Sample code refer to the foot note of Table 28. 유기산중 oxalic acid, citric acid, malic acid, acetic acid의경우모든추출물에서검출되었는데, oxalic acid의함량은단삼추출물에서가장많았고, citric acid의함량은작약추출물에서가장많았다. Malic acid와 acetic acid의함량은뽕잎추출물에서가장많았다. Maleic acid의경우황금추출물에서만검출되었으며, lactic acid는상황버섯추출물에서가장많은함량이었고, fumaric acid는뽕잎추출물에서가장많았다. 5종의천연식물류혼합물의총유기산함량은 MHE-1은 4933.7 mg/l이었고, MHE-2는 3723.0 mg/l였다. 혼합물중의유기산중 oxalic acid, citric acid 및 malic acid의함량이대체적으로높게검출되었으며, formic acid의경우혼합물중 MHE-2에서만검출되었다. Oxalic acid, citric acid 및 malic acid의함량은각각의한약재를추출하여동량혼합할때 (MHE-1) 더높은것으로나타났다. - 192 -

(3) 총페놀화합물및플라보노이드함량천연식물류 5종의혼합조건에따른총페놀및플라보노이드함량을측정한결과는 Table 30과같다. 총페놀함량은 131.35±9.64 mg/g로 MHE-2가더높게나타났으며, 플라보노이드함량역시 28.77±1.52 mg/g로 MHE-1보다 MHE-2가유의적으로높은결과를보였다. Table 30. Total phenol and flavonoids contents in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal plants (mg/g dried extract) Sample code Total phenol Flavonoids MHE-1 109.82±1.71 20.29±1.34 MHE-2 131.36±9.64 * 28.77±1.52 * Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=3) * This superscripts are significantly different among the different sample by Student t-test at p<0.05. 11) 선정된천연식물류 5종의혼합조건에따른생리활성비교항산화및면역활성측정을통해선별된 5종의천연식물류 ( 상황버섯, 황금, 단삼, 뽕잎및작약 ) 의혼합물 (MHE-1, 5종의천연식물류를각각추출한후얻은추물건조물을동량으로혼합 ; MHE-2, 5종천연식물류의각추출수율을고려한배합조건으로혼합하여추출 ) 의생리활성을비교하였다. (1) α-glucosidase 저해활성 α-glucosidase는소장상피세포의 brush-border membrane에존재하는효소로서소장에서음식물중의전분을포도당과같은단당으로분해하여흡수시킨다. 즉 α-glucosidase의저해는당질의가수분해와흡수를지연시킴으로식후혈당상승을제한할수있다 (Kim MJ et al, 2006). 황금, 작약, 단삼, 뽕잎, 상황버섯을각각추출하여동량으로혼합한군 (MHE-1) 과이들 5종의천연식물을추출전에혼합하여추출한군 (MHE-2) 의 α-glucosidase 저해활성을측정한결과는 Table 31과같다. 250, 500, 1000, 2000 및 5000 μg/ml 농도로처리한결과, 모든시료에서농도가증가함에따라그활성이증가하는경향이었다. 1000 μg/ml 농도에서 MHE-1은 36.99% 인데비해 MHE-2는 51.98% 로더높았다. MHE-2는 2000 μg/ml 농도에서 70% 이상의저해활성을나타낸반면, MHE-1은 5000 μg/ml 농도에서 70% 이상이었다. Ji ST et al(2002) 는작약용매분획물의 α-glucosidase 저해능을측정한결과, 20 μg/ml 농 - 193 -

도에서에틸아세테이트추출물이 77~85% 의높은활성을나타내는것으로보고하였다. Park et al(2004) 는뽕잎에는 α-glucosidase에대한저해활성을갖는 γ-aminobutyric acid(gaba) 와 1-deoxynojirimycin(DNJ) 이함유되어있어이들성분에의해강력한혈당강화효과가나타나는것으로보고하였다. 또 Cho HS et al(2010) 는상황버섯열수추출물의 α-glucosidase 저해능측정결과, 3000 μg/ml 농도에서약 50% 정도의활성을나타낸것으로보고하였다. Table 31. α-glucosidase inhibition activity in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal plants (%) Sample code Concentration (μg/ml) 250 500 1000 2000 5000 MHE-1 27.83±1.18 a 32.39±1.05 b 36.99±1.20 c 56.49±2.24 d 71.33±1.01 e MHE-2 27.70±0.98 a 40.34±2.40 b 51.98±0.86 c 72.11±1.73 d 84.64±2.45 e Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=5) a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. (2) Xanthine oxidase 저해활성 XO는 purine 대사에관여하는효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine의산소를떼어내면서과산화수소 (H 2 O 2 ) 를생성하게되고, 나머지골격이 uric acid를형성하여혈장내에과량존재하게되면골절에축적되어심한통증을유발하는통풍과, 신장에침착되어신장질환을일으키는효소로알려져있으며일종의항산화활성을측정하는방법으로도사용되고있다 (Cho HE et al, 2010). 5종의한약재추출물 MHE-1 및 MHE-2의 XO 저해활성을측정한결과 (Table 32), 시료의농도가증가할수록그활성또한유의적으로증가하는경향을보였다. 250~1000 μg/ml 농도에서 MHE-1과 MHE-2 시료군모두 50% 미만이었으며, 2000 μg/ml 농도에서는 60% 이상이었으나, 시료간에큰차이가없었다. 5000 μg/ml 농도에서는 MHE-1군이 93.40% 로 MHE-2보다높게나타났다. 건조뽕잎과발효뽕잎추출물의 XO 저해능측정결과, 500 μg/ml 농도에서각각 51.82% 및 46.36% 의저해능을가진다고보고되어있다 (Lee SI et al, 2012). 단삼, 두충및진피중에서는단삼이 79.3% 로 XO 저해활성이가장높았다고보고되어있다 (Kim SH & Kim IC, 2008). Cho YC et al(1993) 은 XO의저해물질로다양한탄닌류및관련페놀성물질이라보고하였으며, 그중플라보노이드류는 hydroxy기의수와위치에따라각종효소의저해효과가다르게나타나는것으로보고되어있다 (An BJ et al, 1998). 황금의총페놀및플라보노이드함량을측 - 194 -

정한결과, 각각 103.53 mg/g 및 101.98 mg/g이었고 (Joo SY, 2013), 단삼의페놀함량은 414 mg/g으로 16종의약용식물중가장높았으며 (Ju JC et al, 2006), 상황버섯에탄올추출물의페놀및플라보노이드함량은각각 432.42 mg/g 및 42.61 mg/g이었다는보고가있다 (Kim JO et al, 2008). 이러한보고들을토대로본실험의천연식물류혼합물중에는 XO의억제메커니즘에작용하는또페놀성화합물들이다량존재하는것으로추정되며, 이러한물질의상호작용에의한상승효과라생각된다. Table 32. Xanthine oxidase inhibition activity in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal plants (%) Sample code Concentration (μg/ml) 250 500 1000 2000 5000 MHE-1 8.57±0.40 a 17.38±1.42 b 29.79±0.21 c 64.04±1.95 d 93.40±2.45 e MHE-2 10.57±1.17 a 20.07±0.65 b 30.38±0.70 c 64.75±0.25 d 87.66±0.21 e Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=5) a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. (3) DPPH 라디칼소거활성 천연식물류 5 종의혼합조건에따른 DPPH 라디칼소거활성의결과는 Table 33 과같다. Table 33. DPPH radical scavenging activity in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal plants (%) Sample code Concentration (μg/ml) 25 50 100 250 500 1000 MHE-1 37.79±1.90 a 51.43±2.69 b 68.07±4.08 c 87.64±1.42 d 89.71±1.91 dns 90.36±0.89 d MHE-2 40.29±1.25 a* 56.47±2.44 b* 76.18±3.63 c* 91.18±0.64 d* 91.55±1.21 d 92.50±0.62 d* Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=3) NS: not significant a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. * This superscripts are significantly different among the different sample by Student t-test at p<0.05. - 195 -

25~1000 μg/ml의농도범위에서두시료모두농도가증가됨에따라 DPPH 라디칼소거활성이유의적으로높아졌다. 그러나두시료모두 250 μg/ml의이상의농도에서는시료의농도가 1000 μg/ml까지증가하여도활성에는유의적인차이가없었다. MHE-1와 MHE-2를비교해봤을때모든농도에서 MHE-1보다 MHE-2가더높은소거활성을보였으며, 500 μg/ml의농도에서는그차이가적어유의적인차이가나타나지않았다. 본연구결과천연식물류를각각추출하여혼합한시료보다천연식물류를모두섞어서추출한시료에서 DPPH 라디칼소거활성이높은것으로나타났다. 이는천연식물류의항산화효과는추출조건에따라달라질수있으며, 실험에쓰인시료의항산화기능성이높은것으로사료된다. (4) ABTS 라디칼소거활성천연식물류 5종혼합물에대한 ABTS 라디칼소거활성은 Table 34와같다. MHE-1의라디칼소거능은 17.39~98.35% 이었고, MHE-2는 28.18~99.55% 이었다. 25~250 μg/ml 농도에서혼합하여추출한추출물인 MHE-2가각각추출하여혼합한 MHE-1보다활성이더뛰어나다는것을알수있었다. 하지만 500 μg/ml 이상에서는두추출물간의유의차는없었다. Table 34. ABTS radical scavenging activity in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal plants (%) Sample code Concentration (μg/ml) 25 50 100 250 500 1000 MHE-1 17.39±1.41 a 27.53±1.54 b 40.08±1.30 c 82.18±0.88 d 97.64±0.68 ens 98.35±0.86 ens MHE-2 28.18±3.74 a* 31.91±2.53 b* 50.60±1.27 c* 95.26±2.04 d* 97.87±1.14 de 99.55±0.29 e Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=3) NS: not significant a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. * This superscripts are significantly different among the different sample by Student t-test at p<0.05. (5) Superoxide anion 라디칼소거활성천연식물류 5종혼합물에대한 superoxide anion 라디칼소거활성은 Table 35와같다. MHE-1, MHE-2 추출물모두농도가증가할수록유의적으로증가하였다. 하지만저농도인 25 μg/ml에서는라디칼소거활성이나타나지않았다. 1000 μg/ml의농도에서 MHE-1은 68.91% 이었지만, MHE-2는 94.61% 의소거활성을보였는데, superoxide anion 라디칼소거활성또한 MHE-1 추출물보다 MHE-2 추출물의활성이더뛰어나다는것을알수있었다. - 196 -

Table 35. Superoxide anion radical scavenging activity in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal plants (%) Sample code Concentration (μg/ml) 25 50 100 250 500 1000 MHE-1-1.68±0.46 a 11.09±1.59 bns 28.53±3.40 c 52.10±3.06 d 68.91±3.32 e MHE-2-7.48±1.60 a* 13.03±1.22 b 48.90±4.21 c* 70.04±3.26 d* 94.61±4.79 e* Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=3) NS: not significant a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. * This superscripts are significantly different among the different sample by Student t-test at p<0.05. (6) Fe +2 킬레이팅소거활성추출물 MHE-1, MHE-2의 Fe +2 킬레이팅소거활성을나타낸결과는 Table 36과같다. 농도가증가함에따라추출물 MHE-1, MHE-2의 Fe +2 킬레이팅소거활성은의존적으로높아졌으며, 50 μg/ml의농도에서추출물간의유의적인차이는없었다. 100 μg/ml의저농도에서는 MHE-2 의활성이더높았으나, 그이상의고농도에서는 MHE-1의활성이유의적으로더높아시료의농도도생리활성의발현에영향을미치는주요인자임을알수있었다. Table 36. Fe +2 plants Sample code chelating activity in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal (%) Concentration (μg/ml) 25 50 100 250 500 1000 MHE-1-11.25±1.74 ans 21.10±1.61 b 62.93±2.46 c* 86.43±1.02 d* 95.70±1.10 e* MHE-2-12.99±1.24 a 24.35±2.82 b* 53.49±1.96 c 77.05±2.40 d 89.92±1.65 e Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=3) NS: not significant a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. * This superscripts are significantly different among the different sample by Student t-test at p<0.05. - 197 -

(8) 환원력추출물 MHE-1, MHE-2의환원력을나타낸결과는 Table 37과같다. 두가지추출물은농도가높아짐에따라환원력또한높아졌으며, 25~50 μg/ml의농도에서추출물사이에유의적인차이는없었고, 100~1000 μg/ml의농도에서추출물 MHE-2는추출물 MHE-1보다높은환원력을나타내었다. Joo SY(2013) 는 1 mg/ml의농도에서황금추출물이 1.69의흡광도를나타낸다고보고한바있으며, 본실험에서다른식물체와혼합하여추출했을때환원력은높게나타났다. 여러천연식물류를각각추출하는것보다함께추출하여사용함으로써천연식물류간의시너지효과를만들어항산화활성이높은것으로보인다. Table 37. Reducing power in different condition for mixture of 5 kinds of medicinal plants (Absorbance value at 700 nm) Sample code MHE-1 MHE-2 Concentration (μg/ml) 25 50 100 250 500 1000 0.087 0.115 0.162 0.325 0.581 1.038 ±0.004 ans ±0.006 bns ±0.002 c ±0.004 d ±0.007 e ±0.014 f 0.087 0.120 0.179 0.363 0.599 1.107 ±0.001 a ±0.001 b ±0.005 c* ±0.006 d* ±0.004 e* ±0.022 f* Sample code refer to the foot note of Table 28 Each value represents mean±sd (n=3) NS: not significant a-e Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. 12) 선정된천연식물류 5종의혼합조건에따른 RAW 264.7 대식세포에대한염증활성측정 (1) 세포생존율 CCK assay를이용하여 RAW 264.7 대식세포에서 5종의한약재추출물 MHE-1 및 MHE-2의세포독성을확인하였다. MHE-1 및 MHE-2를농도별 (0, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 μ g/ml) 로처리한결과 (Fig. 44), 50 μg/ml 농도에서는대조군과비교하여 100% 이상의생존율을보여어떠한독성도없는것으로확인되었으며, 100 μg/ml 농도로처리시에는 84~91% 범위의생존율을나타내었다. 500 μg/ml와 1000 μg/ml의농도로처리하였을떄 62~73% 범위의생존율을보였고, 5000 μg/ml로처리시에는 60% 미만이었다. 최고농도인 10000 μg/ml로처리시 50% 미만으로생존율이크게감소하였다. - 198 -

Fig. 44. Effect of medicinal plant extracts on cell viability in RAW 264.7 cells. Sample code refer to the foot note of Table 28 MEH-1 and MEH-2 were treated with various concentrations in RAW 264.7 cells for 24 hr. Each value represents the mean±sd of determinations made in triplicate experiments. (2) NO 함량 NO는 NO 합성효소에의해생성되는무기유리체로면역반응, 세포독성, 신경전달계및혈관이완등여러생물학적인과정에관여하며농도에따라세포기능유지에중요한작용을하기도하고세포독성을일으키기도한다 (Kim JY et al, 2004). 특히 NO는염증유발에도중요한역할을하는것으로알려져있으며 (Weisz A et al, 1996), 매우불안정하여 NO 2- 의형태로바로전환되기때문에 NO 2- 의형태로 Griess 시약을이용하여 NO의농도를정량할수있다 (Lee MH et al, 2007). RAW 264.7 세포에 LPS(1 μg/ml) 를처리하였을때, 생성된 NO의함량은 78.86 μm로무처리군에비해약 10배정도증가하였다 (Fig. 45). 그러나 100, 500, 1000 μg/ml 농도의 MHE-1 과 MHE-2를처리시 LPS 처리군에비해농도의존적으로 NO의양이감소되었다. 500 μg/ml 농도로처리시 MHE-1과 MHE-2 모두 NO의생성을약 50% 정도감소시켰다. Yoon SB et al(2011) 은 RAW 264.7 세포주에대하여황금추출물의 NO 생성저해효과를측정한결과, 농도의존적으로 NO의생성이감소되었으며, 작약에틸아세테이트추출물의경우 100 μg/ml의농도에서 LPS 처리군에비해 50% 이상의 NO 생성억제효과를보였으며 (Im DY & Lee KI, 2012), 단삼의메탄올추출물도 LPS로부터유도된 NO의생성에상당한억제효과를보였는데, 특히 300 μg/ml에서 90% 이상의억제활성을나타낸것으로보고되어있다 (Yun HJ et al, 2007). - 199 -

Fig. 45. Effect of medicinal plant extracts on NO production in RAW 264.7 cells. RAW 264.7(2 10 5 cells/ml) were pre-treated for 2 h with the induced MEH-1 and MEH-2(100, 500, 1000 μg/ml) before being stimulated with LPS(1 μg/ml) for 24 h. Each value represents the mean±sd of determinations made in triplicate experiments. Sample code refer to the foot note of Table 28 (3) PGE 2 함량 PGE 2 는세포의분열이나증식을조절함으로써각종인체질병과밀접한연관이있는것으로보고되어있다. 특히염증반응을유도하는중요한인자로서 arachidonic acid로부터 cyclooxygenase(cox) 의작용에의해합성되어진다. MHE-1과 MHE-2을 LPS와함께 RAW 264.7 세포에처리후 PGE 2 의농도를측정한결과는 Fig. 46에나타내었다. LPS로활성화된처리군의 PGE 2 생성량은 755.54 pg/ml 수준으로증가하였으며, MHE-1과 MHE-2를각각 100, 500, 1000 μg/ml 농도로처리하였을때유의하게감소하는경향을나타내었다. 100 μg/ml 농도에서 MHE-1과 MHE-2는각각 646 pg/ml 및 673 pg/ml, 500 μg/ml 농도에서는각각 400 pg/ml 및 465 pg/ml로정량되었다. Kim YJ & Son DY(2012) 은산양삼추출물의 LPS로부터유도된 PGE 2 생성억제효과를측정한결과, 염증이유도된세포에서 983.4 pg/ml로증가하였으나 100 μg/ml 농도의산양삼추출물을처리시정상군과유사한수준을나타낸것으로보고하였다. Pang L & Hoult JRS(1997) 은 PGE 2 생성억제는 COX-2 효소의발현억제및 NO의생성억제를통해조절되는것으로보고하였으며, 배암차즈기잎추출물의 PGE 2 저해효과또한 NO의생성량이감소함에따라동일한경향으로감소한다고하였는데, 이는본연구결과와도일치하였다. - 200 -

Fig. 46. Effect of medicinal plant extracts on PGE 2 production in RAW 264.7 cells. Sample code refer to the foot note of Table 28 RAW 264.7(2 10 5 cells/ml) were pre-treated for 2 h with the induced MEH-1 and MEH-2(100, 500, 1000 μg/ml) before being stimulated with LPS(1 μg/ml) for 24 h. Each value represents the mean±sd of determinations made in triplicate experiments. (4) Cytokine 함량 Cytokine은염증을나타내는중요한지표로서 LPS 자극에의해염증반응이활성화된세포는 TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6와같은전염증성 cytokine을생산하게된다. MHE-1과 MHE-2을 LPS와함께 RAW 264.7 세포에처리후 cytokine 농도를측정한결과 (Fig. 47), LPS의처리는 RAW 264.7 대식세포의 TNF-α, IL-2, IL-6의생성량을유의적으로증가시켰다. MHE-1과 MHE-2를농도별 (100, 500, 1000 μg/ml) 로처리하여 TNF-α 생성량을측정한결과 (Fig. 47A), LPS 처리군 (214 pg/ml) 에비해농도의존적으로 TNF-α 생성량이감소하였다. 그러나 MHE-1과 MHE-2간에는유의적인차이가없었다. Fig. 47B는 MHE-1과 MHE-2의 IL-2 생성량을측정한결과로, LPS 무처리군의 IL-2 생성량은 8.7 pg/ml이었으나 LPS를처리함으로써 76 pg/ml로유의하게증가되었다. RAW 264.7 cell에 MHE-1과 MHE-2 처리한결과농도의존적으로 IL-2 생성량감소하였는데, 이는 TNF-α의생성억제효과와같은결과였다. IL-6는면역반응및조혈작용에관여하는 cytokine으로서 B와 T 림프구기능을조절하는급성기반응의유도물질이다. RAW 264.7 세포에 LPS를처리하였을때 (Fig. 47C), 앞서 IL-2의경우와유사하게 LPS 무처리군에비해 IL-6의생성량이급격하게증가하였으며, 100, 500, 1000 μg/ml 농도로 MHE-1과 MHE-2를처리한결과모든시료에서 LPS 처리군에비해 IL-6의생성이억제되었다. - 201 -

Fig. 4. Effect of medicinal plant extracts on TNF-α, IL-2, IL-6 production in RAW 264.7 cells. Sample code refer to the foot note of Table 28 RAW 264.7(2 10 5 cells/ml) were pre-treated for 2 h with the induced MEH-1 and MEH-2(100, 500, 1000 μg/ml) before being stimulated with LPS(1 μg/ml) for 24 h. Each value represents the mean±sd of determinations made in triplicate experiments. - 202 -

면역활성에대한결과를요약하면, 상황버섯, 황금, 단삼, 뽕잎및작약을각각추출하여동량씩혼합하였을때 (MHE-1) 와추출물의수율을고려하여동일한수율을가지도록원재료를혼합한후동시추출하였을때 (MHE-2) 항산화활성은시료간에차이를나타내었으나, 면역활성과관련된제인자들을분석한결과에서는추출방법의차이에따른활성의차이는없었다. 그러나, 두시료모두 LPS만처리한대조군에비해더효과적으로농도의존적인면역활성을가지고있어이들추출물이면역활성증강에기여할것으로기대된다. - 203 -

제 3 절흑마늘과쑥혼합면역증진용음료의테스트마케팅 ( 제 2 협동과제 ) 1. 연구개발의목표및주요결과 1) 세부과제목표 흑마늘의제조조건의최적화를통한고품질흑마늘생산조건설정및이에기초한대량생산공정을확립하고자하였음. 개발기술에기반한상품화추진및지적재산권을확보하여기업의기술경쟁력을확보하고자하였음. 1차년도에개발된흑마늘을활용하여면역증강에효능이있는음료를개발하고자 1세부과제및 1협동과제의연구결과에기초하여면역증진용음료의테스트마케팅을통한최적공정확립및상품화추진. 흑마늘, 쑥및천연식물류추출물을함유한면역증진용제품의상품화추진을위한소비자선호도조사, 대량생산공정확립및국내외시장조사자료확보. 2) 주요내용 통마늘, 쪽분리피마늘, 깐마늘로마늘의전처리형태를달리하여고온에서장시간저장및숙성시키는과정중성분의변화를파악하여기존의흑마늘가공시가장적합한가공형태를확립하고그결과를활용하여특허출원함. 국내외흑마늘관련연구가아직미흡한실정으로흑마늘가공과정중이화학적성분변화와기능성물질의생성등을분석하여흑마늘의최적가공적성을밝히고설정된조건에의해생산된흑마늘의상품화를추진함. 흑마늘의제조공정을온도변화에따라 1회반복싸이클을각단계로하여 3회및최종숙성단계인 4단계로나누어각단계마다시료를채취하고이화학적성분의변화를비교하였음. - 흑마늘의조직감은숙성이진행됨에따라수분함량의감소와더불어증가하였고, ph도점차산성화되어 4단계시료에서 4.14±0.01~4.32±0.01의범위로산도 (2.81±0.01~3.58± 0.05%) 와반비례하는경향이었음. - 숙성중당도, 총당및환원당등의탄수화물의함량은증가하였으며, 최종숙성 4단계에서유효성분의함량이가장높은통마늘로제조한흑마늘에서총페놀화합물은약 4.6배, total pyruvate 및 thiosulfinate의함량은각각 2.2배및 25.1배가증가하였는데연구결과를종합하여볼때깐마늘과쪽분리통마늘에비하여통마늘에서부드러운조직감과함량보존에용이한경향을나타내어통마늘을최적의전처리형태로확정하였음. 흑마늘의숙성조건설정에따른성과활용및향후가공품에적용하고자흑마늘의제조방법및이에따라생산된흑마늘을이용한고농축액의제조조건을최적화하고특허출원하였음. - 204 -

- 특허기술은가온및냉각을반복하여흑마늘을제조하고이를활용하여저점도, 고영양흑마늘고농축액을제조하기위한것으로액상추출물을고농축하여제조되는제품의경우소비자가원하는농도로조절하여섭취할수있는장점과더불어제품의성분함량대비부피가감소하고, 고농도로인하여저장기간이더증가한다는장점이있음. - 고농축물을제조하기위해서직화로계속하여가열할경우지나친가열에의해휘발성유효성분의소실, 탄맛이나쓴맛이증가하고수율이낮음. 따라서종래기술의단점을보완하고기호에맞게농도조절하여섭취할수있는흑마늘고농축액을제조코져잔사의초미립분말을첨가함. 이렇게제조한제품은일정량을취하여희석시키기에적당한점성이유지되고, 수율이높고, 영양성분이강화된제품, 즉흑마늘고농축액을얻을수있음. 제 1협동과제의연구성과에기초하여면역증강에효능이있는음료를개발하고개발공정을최적화하여발명특허를출원하였음. 흑마늘과쑥은단군신화에서부터같이등장하는식품이며, 기존의흑마늘이중장년층남성들이주로선호하였던것에주목하여여성이즐길수있는흑마늘음료를개발하고자하였으며, 제품명은 오천년애 로선정하였음. 쑥추출물이첨가된흑마늘음료오천년애의소비자선호도조사결과맛에대한응답자의 78% 가긍정적인반응을보였으며부정적인반응은 22% 정도였음. - 오천년애는기존의흑마늘음료에비해첨가된쑥의향미로인해마늘냄새는감소되었으며맛이한층더부드러워져기존흑마늘음료에비해여성들에게선호도가높았으며, 기존흑마늘음료의주소비층인남성의선호도도높았음. - 제품출시후시장성조사결과 47.6% 가구매계획이있으며음료로써만족한다는응답을하였으며, 24.4% 는매우좋다고응답해오천년애흑마늘음료가출시되면기존의흑마늘음료보다선호도가더높을것으로예견됨. 기술개발결과및소비자선호도조사결과에기초하여개발제품의시장성을확인하고, 대량생산을위한제조공정을확립하고상품화를위한제품포장디자인을개발하였음. 2차년도에개발된흑마늘음료오천년애에 1세부과제및 1협동과제의연구결과를종합하여흑마늘에쑥, 한약재를혼합추출후최적배합비율을선정하여면역증진용흑마늘음료오천년애프리미엄을제조하고선호도조사를실시하였으며병음료의단점을보완하여생산비용을줄일수있는스파우트파우치음료로제형을다변화하고제품명을 오천년애파워 로선정하였음. - 오천년애프리미엄 의선호도조사결과 40대남성의선호도가높았고시장성조사에서여성의선호도가높아 오천년애프리미엄 의개발은시장성이밝다고판단됨. 흑마늘액상제품은물류비가높고부피가커보관이불편한점을개선하기위하여흑마늘액상추출물을분말화하여타블렛형태로제조하여정제제품의공정을확립하고시제품화하였으며제품명은 오천년애파워 로선정하였음. - 오천년애파워 의시제품을제조후액상제품과정제제품의선호도를비교한결과액 - 205 -

상제품보다정제제품이선호도가높아향후흑마늘액상제품에서다른제형으로다변화하는것은시장확보에도움이될것으로판단됨. 흑마늘음료 오천년애, 면역증강에효능이있는 오천년애프리미엄, 오천년애골드 및흑마늘타블렛 오천년애파워 등 4종류의시제품에대한선호도조사후최적공정을확립하였으며이에대한포장디자인을개발하여상품화를추진하였음. 2. 재료및방법 1) 마늘의처리형태에따른흑마늘의제조조건설정을위한시료의제조 (1) 실험재료본실험에사용된마늘은경남남해군에서재배, 수확하여예건처리된것을뿌리를절단하고줄기는마늘구위쪽으로 2~3 cm 남기고절단하여시료로사용하였으며, 마늘의전처리조건은인편을분리한후껍질을완전히제거한깐마늘, 껍질은그대로두고인편만을분리한쪽분리피마늘, 뿌리와줄기만제거한통마늘의세가지로구분하여실험에사용하였다. (2) 흑마늘의제조조건상기의실험재료를각각스테인레스스틸용기에 4 kg을담아서뚜껑을덮고가열숙성기에서온도를상온에서 75~95 까지 70~75시간에걸쳐순차적으로상승시키면서숙성하는단계 (1 단계 ), 승온후 0~10 까지급속하게냉각시켜 20~28시간동안유지하는단계 (2단계), 1단계와 2 단계를 190~210시간동안 3회반복 (3단계) 한후 40~60 에서 190~210시간동안숙성시키는단계 (4단계) 를거쳐흑마늘을제조한후각시료는외피를모두제거하여믹서 (HMF-1000, Hanil, Seoul, Korea) 로완전히분쇄하여폴리에틸렌팩에넣어 -70 이하에서보관해두고실험에사용하였다. (3) 시료액의제조각각마쇄한흑마늘 1 g에탈이온수 50 ml를가하여 1시간동안진탕추출한후여과지 (Whatman No. 2) 로여과하여분석용시료용액으로사용하였다. 2) 저점도고농축흑마늘진액제조를위한시료의제조 (1) 고농축액의제조가공성상이가장우수한통마늘을숙성하여만든흑마늘에 4~8배의물을가하여 70~90, 22~26시간동안가열또는 65~75 mmhg에서 80~100, 5~7시간동안감압농축하여흑마늘추출액을제조한후압착하여착즙하고남은잔사는진공동결건조기로완전건고시킨다. 이것을초미립분쇄기로분쇄한후 150메쉬이상의체에걸러흑마늘진액농축시 25~35 brix의농도가되었을때, 흑마늘진액량대비 10~15% 의초미립분말 ( 중량비 ) 을첨가하여 60 brix로농도조절하여흑마늘고농축액을제조하였다. 상기와동일한조건으로고농축액제조시흑마늘진액량대비 8% 및 20% 중량의초미립분말을첨가하여제조한시료와비교분석하였다. - 206 -

3) 마늘의처리형태에따른흑마늘숙성중특성변화 (1) 숙성기간별흑마늘조직감의측정숙성기간별흑마늘의조직감은 Texture analyzer(ta-xt Express 20140, Stable micro systems, Vienna Court, UK) 로측정하였다. (2) 수분및당도의측정숙성기간별흑마늘의수분은시료 1 g을취하여수분측정기 (MB45, OHAUS, Switzerland), 당도는시료액 1 ml를취해당도측정기 (PR-201α, Atago, Japan) 로측정하였다. (3) ph, 산도및갈변도의측정 ph는시료액 10 ml를취하여 ph meter(model 720, Thermo Orion, Beverly, USA) 로측정하였고, 산도는시료액 10 ml에 0.1 N NaOH를가하여 ph 8.4가될때까지소모되는양을젖산계수로환산하여나타내었다. 갈변반응에의한갈색화물질은 420 nm에서흡광도 (GB/UV310, Biochrom, Cambridge, UK) 를측정하였다. (4) 총당및환원당의정량총당은 phenol-h 2 SO 4 법에따라시료액 1 ml를취하여 5% phenol과진한황산을각 1 ml씩첨가하고, 30분간방치한뒤 490 nm에서흡광도를측정하였다. 환원당의함량은 DNS법에따라시료액 1 ml에 1% dinitrosalicylic acid 3 ml를가하여끓는물에서 15분간중탕하고, 찬물에냉각시킨뒤 570 nm에서흡광도를측정하였다. D-glucose(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) 를이용하여작성된표준검량곡선으로부터시료중의총당및환원당의함량을산출하였다. (5) 총페놀화합물의정량총페놀화합물은시료액 1 ml에 Foline-Ciocalteau 시약및 10% Na 2 CO 3 용액을각각 1 ml 씩차례로가하여실온에서 1시간반응시킨후 700 nm에서흡광도를측정하였다. 흑마늘의총페놀화합물은 caffeic acid(sigma-aldrich Co.) 를이용한검량선에의해계산하였다. (6) Total pyruvate 및 total thiosulfinate의정량 Total pyruvate는시료액 1 ml를취해 10% TCA 10 ml를첨가하고 1시간방치한뒤, 2 N HCl에용해한 0.0125% DNPH와 0.6 N NaOH 5 ml를혼합하여 420 nm에서흡광도를측정한후 sodium pyruvate(sigma-aldrich Co.) 를 0~100 μg/ml의농도로제조하여시료와동일한방법으로분석하여얻은표준검량곡선으로부터시료중의 total pyruvate의함량을산출하였다. McBreen의방법에따라 total thiosulfinate는시료액 1 ml를취해 10% TCA 10 ml를첨가하고 1시간방치한뒤, 0.4 mm DTNB 1 ml를혼합하여 412 nm에서흡광도를측정한후 L-cysteine (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) 을 0~100 μg/ml의농도로제조하여시료와동일한방법으로분석하여얻은표준검량곡선으로부터시료중의 total thiosulfinate 함량을산출하였다. 4) 통계처리 각처리별평균치간의통계처리및유의성검정은 SPSS 18.0(Statistical Package for Social - 207 -

Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software 를이용하였고, 평균간유의적차이가있는항 목에대해서는 Duncan's multiple range test 로 p<0.05 수준에서유의차검정을실시하였다. 5) 개발제품의소비자선호도조사 (1) 오천년애의흑마늘음료의소비자선호도조사개요 쑥혼합흑마늘음료 ( 오천년애 ) 시제품선호도조사 는 ( 재 ) 남해마늘연구소의지원을받아실시하였다. 쑥혼합흑마늘음료 ( 오천년애 ) 시제품선호도조사 는 2012년 4월남해군농업기술센터및장평소류지주변에서개최된튜울립축제기간중보물섬남해마늘영농조합법인을방문한관광객및제품을구입한소비자 250명을대상으로실시하였다. 쑥혼합흑마늘음료 ( 오천년애 ) 시제품선호도조사 는흑마늘음료에대한고객평가및선호도를파악하고조사결과를바탕으로고부가가치가높은상품을제조하기위해실시하였다. 오천년애 에대한선호도조사는성별, 연령층으로구분하여맛, 향, 상품화되었을때의시장성에대하여조사하였다. 구분 조사영역 조사내용 남해마늘인지도 1 흑마늘인지도 1 맛에대한선호도 쑥혼합흑마늘음료 오천년애 향미에대한선호도 3 상품화되었을때시장성 통계변수성별, 연령, 거주지역 3 (2) 오천년애프리미엄흑마늘음료의소비자선호도조사개요 쑥및천연식물혼합흑마늘음료 ( 오천년애프리미엄 ) 시제품선호도조사 는 2013년 4월남해군농업기술센터및장평소류지주변의튜울립축제를기간중보물섬남해마늘영농조합법인을방문한관광객및제품을구입한소비자 250명을대상으로실시하였다. 쑥및천연식물혼합흑마늘음료 ( 오천년애프리미엄 ) 시제품선호도조사 는흑마늘음료에대한고객평가및선호도를파악하고조사결과를바탕으로면역력이증강되어고부가가치가한층업그레이드된상품을제조하기위해실시하였다. 또한이번조사는기존의음료에천연식물을첨가함으로써음료의맛, 향의개선과함께기능성향상을위하여향후중장년층여성 남성의체력증진및과도한스트레스에노출된젊은소비층을타켓으로공략하기위한기초자료로사용하고자하였다. - 208 -

오천년애프리미엄 의선호도조사는 2 차년도에실시한항목과같은조건으로성별, 연령층으로나누고맛, 향, 상품화되었을때의시장성에대하여조사하였다. 구분 조사영역 조사내용 남해마늘인지도 1 흑마늘인지도 1 맛에대한선호도 쑥, 한약재혼합향미에대한선호도흑마늘음료상품화되었을때시장성오천년애프리미엄 4 전반적인기호도 통계변수 성별, 연령, 거주지역 3 (3) 오천년애파워타블렛제제의소비자선호도조사개요 음료제조는추출의한가지공정으로유효성분의변화를최소화할수있고, 공정이비교적간편한제품이나, 다량의수분으로인해부패할가능성이높고, 부피가크며물류비용이높은단점이있으며, 소비자도간편하게섭취하기불편한점이있어액상제품보다는분말제품, 정제제품의선호도가높아지는추세이다. 흑마늘에쑥, 천연식물 5종을첨가하여추출후분말화하여타블렛형태의제형으로개발하여소비자의선호도를조사하였다. 오천년애파워 의선호도조사는오천년애흑마늘음료와비교하였을때맛, 상품화되었을때의시장성에대하여조사하였다. 구분 조사내용 흑마늘액상제품과정제제품과의비교 1 조사영역 오천년애파워의선호도 맛에대한선호도 상품화되었을때시장성 2 3. 결과및고찰 1) 고품질흑마늘의제조조건의최적화및이에기초한대량생산공정확립 (1) 숙성기간별흑마늘의조직감측정흑마늘제조공정의진행과더불어 1단계에서 3단계로숙성이진행될수록전단가 (Table 1) 는점차증가하여 3단계에서 188.81±18.81~233.83±22.66 g로가장높았다. 숙성 4단계에서는오히려감소하여생마늘에비해조직감이더낮은 158.73±10.58~188.90±11.62 g의범위였고, 깐마늘로제조한흑마늘의조직감이가장높았다. 마늘이흑마늘로가공되는과정중수분의증발로인해조직감이단단해지는것이일반적 - 209 -

인데 (Shin JH et al, 2008) 깐마늘로흑마늘을가공할경우가장단단하였으며, 외피가존재하는쪽분리피마늘과통마늘에서는마늘의외피가마늘의수분을보호해주어부드러운조직감을유지해주므로서결과적으로식감을좋게하였음을알수있다. 따라서흑마늘특유의부드러운조직감을유지하기위해서는깐마늘보다외피가있는쪽분리피마늘및통마늘로흑마늘을제조하는것이유리함을알수있다. Table 1. Changes of shearing strength during aging of black garlic (g) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 171.13±2.81 a 178.40±30.57 a 233.83±22.66 c 188.90±11.62 b Separated peel garlic 124.13±7.29 a 136.45±12.27 a 233.37±32.23 c 158.73±10.58 b Whole bulb garlic 176.10±45.02 b 168.53±45.61 a 188.81±18.81 c 162.67±11.14 a a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05 Shearing strength of fresh garlic : 361.60±26.16 g. (2) 수분함량및당도흑마늘의수분을측정한결과는 Table 2와같다. 흑마늘제조과정중수분은지속적으로감소하여숙성초기 1단계에서는 55.75~56.05% 의범위였는데숙성이진행됨에따라점차감소하였다. 최종단계에는초기단계에비하여약 20% 가량의수분손실이이루어졌으며, 깐마늘로제조한흑마늘의수분은숙성 4단계에서 38.32% 였는데비해쪽분리피마늘및통마늘에서는 42% 이상으로더높게유지되었다. Shin JH et al(2008) 은흑마늘제조숙성초기 65.24±0.24 g/100 g이었던수분함량이숙성후기 58.48±0.41 g/100 g으로보고한바있는데그절대값에서는차이가있으나숙성과함께마늘의수분함량이감소됨은본실험결과와도동일한경향이었다. Table 2. Changes of moisture content during aging of black garlic (%) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 56.03±0.49 d 50.82±1.50 c 47.86±1.88 b 38.32±0.81 a Separated peel garlic 55.75±0.25 d 52.54±1.08 c 49.80±0.89 b 43.26±1.60 a Whole bulb garlic 56.05±0.23 c 51.56±0.56 b 50.57±0.01 b 42.32±1.63 a a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05 Moisture content of fresh garlic : 55.29±1.59% - 210 -

흑마늘의숙성중당도의변화 (Table 3) 는초기단계에비하여최종단계로진행될수록증가하였다. 이는수분함량감소에따른상대적인당도증가와함께, 갈변화가진행되면서마늘자체의당이점차분해되고쉽게유리되기때문이다. 숙성전 2.6~2.7 brix의범위이던당도는숙성과더불어점차증가하였는데, 마늘의전처리상태에따라증가경향이서로상이하여피마늘의경우 3단계에서 4단계로될때가장큰폭으로증가하였으며, 쪽분리피마늘과통마늘의경우숙성 2단계까지는당도에변화가없다가그이후에큰폭으로증가하였다. 최종 4단계에서통마늘의당도는 6.10±0.00 brix로깐마늘 (5.13±0.06 brix) 및쪽분리피마늘 (5.23±0.93 brix) 에비하여더높았다. Table 3. Changes of sugar content during aging of black garlic (brix) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 2.70±0.00 a 3.30±0.00 b 3.80±0.00 c 5.13±0.06 d Separated peel garlic 2.60±0.00 a 2.60±0.00 b 3.87±0.06 c 5.23±0.93 d Whole bulb garlic 2.60±0.00 a 2.60±0.00 a 4.20±0.00 a 6.10±0.00 a a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05 Sugar content of fresh garlic : 2.97±0.06 brix. (3) ph, 산도및갈변도의측정흑마늘숙성과정중 ph 및산도의변화는 Table 4 및 Table 5와같다. 흑마늘의제조중 ph는점차산성화되는경향이었는데생마늘은 6.57±0.01인데비하여숙성 1단계에서는 ph가 6.20±0.01~6.84±0.01이던것이마지막단계에서는 4.14±0.01~4.32±0.01로산성화되었다. Table 4. Changes of ph during aging of black garlic Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 6.84±0.01 d 5.49±0.01 c 4.98±0.01 b 4.32±0.01 a Separated peel garlic 6.36±0.02 d 5.28±0.01 c 4.85±0.01 b 4.21±0.01 a Whole bulb garlic 6.20±0.01 d 5.06±0.01 c 4.62±0.01 b 4.14±0.00 a a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05 ph of fresh garlic : 6.57±0.01-211 -

홍삼제조시에도갈변물질의생성과더불어 ph가저하하는데온도가높을수록 ph는더많이감소하며 (Lee JW et al, 1998), 열처리한홍삼엑기스에서도 ph는온도가높을수록저장시간이경과할수록산성화된다는보고 (Choi JH et al, 1981) 는본실험의결과와잘일치하였다. 흑마늘의산도 (Table 5) 는숙성 1단계에서 0.41±0.03~0.67±0.01% 범위였는데숙성과정이진행됨에따라점차증가하여 ph의변화와는상반되는경향이었다. 깐마늘로제조된흑마늘의숙성최종단계에서 ph는 2.81±0.01% 로가장낮았고, 쪽분리피마늘과통마늘의경우숙성 2 단계까지는쪽분리피마늘의산도증가폭이더컸으나그이후부터는통마늘의산도가더높아져최종 4단계에서는쪽분리피마늘의산도는 3.38±0.04% 였고, 통마늘은 3.58±0.05% 로증가하였다. Table 5. Changes of titrable acidity during aging of black garlic (%) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 0.48±0.03 a 0.95±0.01 b 1.17±0.02 c 2.81±0.01 d Separated peel garlic 0.59±0.04 a 1.05±0.01 b 1.90±0.01 c 3.38±0.04 d Whole bulb garlic 0.67±0.01 a 0.71±0.01 a 2.04±0.01 a 3.58±0.05 a a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05 Acid content of fresh garlic : 0.44±0.01% Fig. 1. Browning intensity(od value) of black garlic during aging at 420 mn. 갈변물질의함량을예측할수있는흡광도수치 (Fig. 1) 는제조공정의진행과더불어유의적 으로상승하여 2 단계에비하여 3 단계에서는약 1.80 배증가하였으며, 마지막 4 단계에서는 2 단 - 212 -

계에비하여약 3 배증가하였다. Kim MH 와 Kim BY(1990) 은마늘의열풍건조중갈변화물질 생성율과관련한온도의영향은 Q 10 값과도상관성이있으며, 온도가높을수록갈변화반응은 촉진된다고보고한바있다. (4) 총당및환원당의함량흑마늘의가공형태및숙성기간별총당및환원당의함량을분석한결과는 Table 6 및 Table 7과같다. 총당의함량은흑마늘로숙성이진행됨에따라점차증가하였다. 최종 4단계에서통마늘의총당함량은 22.34±0.37 mg/100 g로깐마늘과쪽분리피마늘에비하여높은함량이었다. 환원당은총당과유사하게숙성과더불어그함량이증가하였으며통마늘에서 3.96±0.05 mg/100 g으로가장높은함량이었다. Table 6. Changes of total sugar content during aging of black garlic (mg/100 g) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 15.36±3.82 a 16.71±2.21 a 19.03±2.00 b 20.89±0.46 c Separated peel garlic 15.26±3.60 a 16.77±2.26 b 18.67±1.41 b 20.31±0.83 c Whole bulb garlic 12.78±1.14 a 19.12±0.35 b 21.89±0.59 c 22.34±0.37 d a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05 Total sugar content of fresh garlic : 16.06±0.57 mg/100 g Table 7. Changes of reducing sugar content during aging of black garlic (mg/100 g) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 2.42±0.03 a 3.27±0.03 b 3.25±0.05 c 3.47±0.06 d Separated peel garlic 2.41±0.03 a 2.92±0.03 b 3.69±0.20 b 3.74±0.06 c Whole bulb garlic 2.47±0.03 a 3.29±0.12 b 3.82±0.06 c 3.96±0.05 d a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05 reducing sugar content of fresh garlic : 2.41±0.03 mg/100 g. (5) 총페놀화합물의함량 흑마늘의가공형태및숙성기간별총페놀화합물의함량을분석한결과는 Table 8 과같다. - 213 -

흑마늘숙성 1단계에서총페놀화합물의함량은모든시험군에서 28 mg/100 g으로차이가없었으나제조공정이진행됨에따라지속적으로증가하였으며, 숙성 4단계에서는통마늘에서 131.72±0.88 mg/100 g으로가장높았는데, 이는깐마늘및쪽분리피마늘에비하여약 30% 더높은함량이었다. Kwon OC et al(2006) 은마늘의총페놀과플라보노이드함량은고온고압처리조건에따라다소상이하기는하지만생마늘에비하여각각 7배와 16배정도증가하는데이는고온고압처리에의해여러화합물이폴리페놀화합물로전환되었거나추출이더용이해졌기때문이라고고찰하였다. 본실험의결과에서도흑마늘로숙성되면서페놀화합물의유리가용이해졌기때문에함량이증가하였으며, 페놀화합물들은수용성물질로서수분또는장시간고열노출등외부의영향에의해쉽게파괴될수있는데, 통마늘가공시마늘외피및내피의보호작용으로인하여페놀화합물의보존이더용이했기때문에피마늘에서그함량이더높게정량된것으로판단된다. Table 8. Changes of total phenol content during aging of black garlic (mg/100 g) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 28.14±0.13 a 62.59±1.65 b 91.68±2.04 c 102.76±0.55 d Separated peel garlic 28.22±0.13 a 68.19±0.50 b 93.65±0.34 c 114.44±0.55 d Whole bulb garlic 28.80±0.34 a 77.24±1.78 b 101.31±0.71 c 131.72±0.88 d a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. Total phenol content of fresh garlic : 31.28±0.13 mg/100 g. (6) Total pyruvate 및 total thiosulfinate의함량 Total pyruvate와 total thiosulfinate의함량은생마늘에서각각 611.18±16.52 mg/100 g과 0.99±0.06 µg/100 g이었는데, 흑마늘로숙성이진행되면서유의적으로함량이증가하였다. Total pyruvate와 total thiosulfinate의두성분모두깐마늘에비해피마늘에서그함량이더높았으며, 숙성단계를거치면서이러한경향은더두드러졌으며, 최종 4단계에서는통마늘에서가장높은함량이었다. 숙성 4단계에서통마늘에서의 total pyruvate(table 9) 함량은 1478.69±39.10 mg/100 g으로숙성 1단계에비해약 2.2배더증가하여각각 1.4배와 1.5배가증가한깐마늘및쪽분리피마늘로제조한흑마늘에비해더높은함량이었다. 마늘중의 total pyruvate는 alliinase에 alliin이분해되면서 allicin, 암모니아와더불어생성되는것으로알려져있는데 (Miron TI et al, 2002), 본실험에서 total pyruvate의함량이증가한 - 214 -

것은제조과정중 90 까지승온시킨것을고려할때 alliinase 의작용만으로보기는어려우 며, 고온에의한당의분해산물이더해진것으로추정되나이에대한정확한메커니즘을규명 하기위하여서는관련성분들에대한더심도깊은연구가진행되어야할것으로판단된다. Table 9. Changes of total pyruvate content during aging of black garlic (mg/100 g) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 631.12±6.01 a 646.62±10.23 b 690.51±20.91 c 887.97±46.01 d Separated peel garlic 692.62±7.20 a 720.89±3.35 b 896.41±12.68 c 1057.59±31.62 d Whole bulb garlic 662.66±4.56 a 719.62±8.30 b 987.97±1.27 c 1478.69±39.10 d a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. Total pyruvate content of fresh garlic : 611.18±16.52 mg/100 g. Table 10은마늘의전처리를달리하였을때흑마늘로숙성중 total thiosulfinate의함량은변화를분석한결과이다. 숙성초기마늘중 total thiosulfinate의함량은 1.64±0.04~1.93±0.00 µg/100 g이었으나숙성과더불어큰폭으로증가하여숙성최종 4단계에서깐마늘은 26.92±0.02 µg/100 g으로약 14.7배, 쪽분리피마늘은 32.23±0.13 µg/100 g으로약 16.7배증가하였고, 통마늘은약 25.1배증가하여 41.21±0.05 µg/100 g이었다. Table 10. Changes of total thiosulfinate content during aging of black garlic (µg/100 g) Processing stage Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Peeled garlic 1.83±0.01 a 9.92±0.03 b 14.53±0.02 c 26.92±0.02 d Separated peel garlic 1.93±0.00 a 10.17±0.05 b 19.48±0.12 c 32.23±0.13 d Whole bulb garlic 1.64±0.04 a 10.56±0.08 b 22.00±0.02 c 41.21±0.05 d a~d Means with different superscripts in the same row are significantly different at p<0.05. Total thiosulfinate content of fresh garlic : 0.99±0.06 µg/100 g. 이상의연구결과를종합하여흑마늘숙성을위한최적의온도조건및마늘의전처리조건 을확인하였으며, 그결과를활용하여상품화한흑마늘은다음의사진과같다. - 215 -

연구결과에따라제조된흑마늘의상품화 기업고유의흑마늘제조조건에따라흑마늘제조방법을특허출원함에있어기존의방법 들과차별화하고, 새로운개발제품의아이디어를반영하고자흑마늘및저점도고농축액의제 조에대한연구를실시하였으며, 그결과는다음과같다. 2) 저점도고농축흑마늘진액의제조조건설정흑마늘을이용한고농축액의제조시마늘자체의높은당분으로인하여 60 brix 이상으로고농축하기위해서는간접가열, 회전식농축기사용등의조건이요구되며, 고압, 장시간고온가열등상대적으로높은에너지소비가필요하다. 또, 이렇게제조된 60 brix 이상의고농축액도상대적으로점도가낮아소량씩덜어소비하기에불편함이있다. 따라서고농도를유지하면서상대적으로점도가낮아소량씩덜어소비할때번거러움을감소시킬수있는제품을개발하고자하였다. 또한, 본연구를통하여타기업의제품대비상대적으로관능적특성이우수한흑마늘의제조가가능한조건을설정하였으나최근흑마늘제조방법에관한특허가 30여개이상으로증가하여본연구의성과를활용한지적재산권의확보가용이하지않으므로이를보완하고, 기업의상품개발력을더향상시키고자하였다. 본과제를통하여다양한조건에서흑마늘고농축액을제조한결과의최적제조방법은 Fig. 2와같다. - 216 -

Garlic 75~95,70~75hrHeating 0~10,20~28hrCooling 3times 40~60,190~210hrAging Addingpurified water 70~90,22~26hr Makeablackgarlicjuice Aftervaccum freezingdrying ofblackgarlicand madeit 150meshpowder 70~90,22~26hrheatingor 70~90,5~7hr,65~75mmHgevaporating Make60brixconcentrated blackgarlicjuice Addingabovepowderwhen concentrationofblackgarlic reached at25~35brix Packing Fig. 2. Procedure to make black garlic extracts of high quality from its residue. 3) 본연구를통하여개발된저점도고농축흑마늘진액의품질특성흑마늘잔사를첨가하여흑마늘고농축액을완성한후점도계 (VISCO STAR plus, FUNGILAB. S.A., Korea) 를이용하여점도를측정하였다. 흑마늘잔사건조물의첨가량을달리한후동일하게농도를 60 brix로맞추어제조한고농축액의점도를측정한결과 (Table 11) 흑마늘잔사건조물의함량이 8% 인시료 (A) 는점도가너무낮고 20% 인시료 (C) 는점도가너무높아성상이적합하지않았다. - 217 -

Table 11. Changes in viscosity of black garlic extracts (60brix) by adding powder made from its residue (CPs) Sample code Immediately after After 30 minute A 13.40±0.22 19.20±1.40 B 17.74±0.51 34.44±4.00 C 54.60±4.10 61.71±0.40 A : black garlic residue 8% added concentrate B : black garlic residue 10% added concentrate C : black garlic residue 20% added concentrate Fig. 3은직화로추출액을농축하여제조한 60 brix의흑마늘진액 (A) 과본특허에명시된방법으로제조한흑마늘고농축액 (B) 의점도를비교한사진이다. 흑마늘로부터추출한잔사의분말을 10% 중량비로첨가할경우 (B) 첨가초기점도는낮으나 30분정도경과하면분말이충분히고루분산되면서적당한농도를가지므로 (Fig. 3-B) 원하는성상의흑마늘고농축액을제조할수있다. Fig. 3. High concentrated black garlic juice added black garlic residue. 4) 흑마늘과쑥혼합면역증진음료의테스트마케팅 (1) 개발상품의소비자선호도조사 1 조사표본의특징 성별특징을살펴보면, 전체설문응답자 200명중남자가 68명으로전체의 27%, 여자는 182명으로 73% 로조사되었다. - 218 -

연령대별특징을보면 20 대미만이전체의 2.7% 로가장적었고, 20 대가 8.4%, 30 대는 13.1%, 40 대가 25.1%, 50 대가 36%, 60 대이상이 14.7% 로조사되었으며그중 50 대의응답 율이 36% 로가장높았다. < 남녀성별비 > < 연령대별응답율 > 그림 4. 조사표본의남녀성별비및연령. 지역별특징을살펴보면, 응답자중경남지역의거주자가전체의 82.4% 로가장많았고, 수도권거주자가 5.2%, 경남외영남지역거주자가 8.0%, 기타지역거주자가 4.4% 였다. 설문응답자의거주지역별특징을분석한결과, 시지역거주자가전체의 68%, 군지역거주자가 32% 였다. < 지역별응답율 > < 시도지역별응답율 > 그림 5. 조사표본의지역별구성비율. 2 남해마늘및흑마늘에대한인지도조사결과 남해마늘에대한인지도 남해마늘의인지도에대해조사한결과는표 12와같으며남해마늘에대한인지도는들어본적이있다에응답빈도가 43% 로가장높았고매우잘안다가 35%, 잘모른다가 11%, 전혀모른다가 1% 로조사되었다. - 219 -

조사분석결과응답자 10 명중 8 명이상이남해마늘에대해들어보았거나알고있는 것으로조사되어남해마늘에대한인지도는매우높은편이었다. 표 12. 남해마늘에대한인지도조사결과 남해마늘인지도 조사항목 매우잘안다 안다 들어본적이있다 조금안다 잘모른다 모른다 전혀모른다 안다 모른다 빈도 85 108 32 23 2 225 25 (%) (34) (43) (13) (11) (1) (90) (12) 흑마늘에대한인지도 마늘을숙성시켜만든흑마늘에대한선호도롤조사한결과, 매우잘안다가 20% 였으며, 들어본적이있다가 35.6% 로가장높은빈도를보였고, 조금안다가 29.6% 였다. 반면에흑마늘에대해모른다가 14.8% 로나타났으며, 흑마늘에대해알고있는사람은 10명중 8.5명으로조사되어흑마늘에대한인지도역시상당히높은것으로평가되었다 ( 표 13). 표 13. 흑마늘에대한인지도조사결과 흑마늘에대한인지도 조사항목 매우잘안다 안다들어본적이있다 조금안다 모른다전혀잘모른다모른다 안다 모른다 빈도 50 89 74 22 15 213 37 (%) (20) (35.6) (29.6) (8.8) (6) (85.2) (14.8) 3 쑥혼합흑마늘음료 ( 오천년애 ) 에대한선호도조사 오천년애 흑마늘음료의맛에대한선호도 음료의맛에대한선호도는 78% 가긍정적인반응을보였으며부정적인반응은 22% 정도였다. 그중빈도가가장높은것은좋다가 36% 로가장많았고, 매우좋다는 16.8%, 매우나쁘다는 6.8% 로조사되어 10명중 9명은쑥혼합추출물에대해긍정적인반응을보였다 ( 그림 6). - 220 -

그림 6. 오천년애 흑마늘음료의맛에대한선호도. 표 14. 오천년애 흑마늘음료의성별및연령층에따른맛에대한선호도 ( 명 /(%)) 성별 연령 구분남자여자 20대미만 20대 30대 40대 50대 60대이상 오천년애의선호도 매우좋다 좋다 보통 나쁘다 매우나쁘다 12 32 15 6 2 (17.9) (47.8) (22.4) (9.0) (3.0) 30 58 48 32 15 (16.4) (31.7) (26.2) (17.5) (8.2) 0 1 1 1 3 (0) (16.7) (16.7) (16.7) (50) 0 1 6 5 9 (0) (4.8) (28.6) (23.8) (42.9) 4 14 6 7 3 (11.8) (41.2) (17.6) (20.6) (8.8) 15 26 20 3 1 (23.1) (40.0) (30.8) (4.6) (1.5) 12 43 19 15 1 (13.3) (47.8) (21.1) (16.7) (1.1) 11 5 11 7 0 (32.4) (14.7) (32.4) (20.6) (0.0) 오천년애 흑마늘음료의성별및연령층에다른선호도조사는표 14 와같으며쑥 혼합흑마늘음료의선호도는여자보다남자가높았고, 매우좋다고응답한비율이남자 - 221 -

는 17.9% 여자는 16.4% 였다. 부정적인반응 ( 나쁘다. 매우나쁘다 ) 은여자가 25.7% 로남자 (11.0%) 에비해높았다. 여성에서부정적인반응이높은것은흑마늘냄새와강한맛에의한것으로판단되나기존의흑마늘음료를섭취해본경험이있는사람은 오천년애 흑마늘음료에대해긍정적인평가를하였다. 맛에대한선호도를연령대별로조사한결과응답비율이높은 50대에서매우좋다가 13.3%, 좋다가 47.8% 로선호도가높아타연령층에비해부정적인반응을보인비율이낮았다. 20대에서는매우나쁘다가 42.9%, 보통이다가 28.6% 순으로조사되었다. 맛에대한선호도는 20대이하와 30대이상에서상반된결과를보였는데 30대이상에서맛에대한선호도가긍정적이었다 ( 표 14). 오천년애 흑마늘음료의향에대한선호도 오천년애 흑마늘음료음료의향에대한선호도조사결과는그림 7, 8 및표 15와같다. 매우좋다가 18.4%, 좋다가 35.6%, 보통이 32.0% 로조사되었으며부정적인반응은 14% 로낮았다. 오천년애 의긍정적인반응으로향에대한선호도가높게조사되었는데이는기존의흑마늘음료에쑥을첨가함에따라흑마늘냄새는감소되고향긋한쑥의향이부가되었기때문으로판단된다. 그림 8에나타낸쑥의향미에대한선호도조사는매우좋다가 10.5%, 좋다가 48.5% 및보통이 30.2% 로쑥향에대한선호도는매우높은것으로조사되었다. 오천년애 음료는기존의흑마늘음료에쑥을첨가함에따라진한흑마늘냄새를감소시키고거부감없이접근할수있는음료에컨셉을맞춘결과로기존의흑마늘음료보다선호도가높았다. 그림 7. 오천년애 흑마늘음료의향에대한선호도. - 222 -

그림 8. 오천년애 흑마늘음료의향에대한선호도중쑥향에대한선호도. 표 15. 오천년애 흑마늘음료의성별및연령층에따른향에대한선호도 ( 명 /(%)) 성별 연령 구분남자여자 20대미만 20대 30대 40대 50대 60대이상 오천년애 의선호도 매우좋다 좋다 보통 나쁘다 매우나쁘다 10 39 13 3 2 (14.9) (58.2) (19.4) (4.5) (3.0) 21 62 54 33 13 (11.5) (33.9) (29.5) (18.0) (7.1) 0 0 3 2 1 (0) (0.0) (50.0) (33.3) (16.6) 0 3 6 8 4 (0) (14.3) (28.6) (38.1) (19.0) 4 12 15 1 2 (11.8) (35.0) (44.1) (2.9) (5.9) 10 22 27 3 3 (15.4) (33.8) (41.5) (4.6) (4.6) 25 43 16 5 1 (27.8) (47.8) (17.2) (5.6) (1.1) 7 9 13 5 0 (20.6) (26.5) (38.2) (14.7) (0.0) 오천년애 의향에대한선호도조사결과남자는 92.5% 가긍정적으로응답한반면 에, 여자는 74.9% 가긍정적인응답을하였다. - 223 -

연령에따른선호도는 20대미만에서는 50% 가보통이며나머지는부정적이었으나연령대가높아짐에따라긍정적인선호도를보였다. 특히 40대에서는보통이 41.5%, 좋다가 33.8% 매주좋다가 15.4% 로조사되어 90.7% 의비율로 10명중 9명은긍정적인반응을보였고 50대에서도 92.8% 로긍정적인반응을보였다. 오천년애 흑마늘음료는기존의흑마늘음료에쑥을첨가하여제조함에따라기존의흑마늘음료보다맛과향이증강되고기능성이배가된개발음료로소비자의선호도가높을것으로예상된다. 오천년애 가상품화되었을때시장성에대한조사 흑마늘음료 오천년애 가상품화되었을때제품을구매하거나시장성을조사한결과그림 9와같이매우좋다가 24.4%, 좋다가 47.6% 로매우긍정적인반응으로조사되었고 (72%), 보통은 24.8% 였으며 3.2% 만이부정적으로응답하여 오천년애 의제품화에따른시장성은긍정적일것으로예상된다. 응답자중 오천년애 에대해보통이상으로긍정적인응답을한연령층의빈도는 20대가 85.7% 로타연령층에비해낮았고 30대는 100%, 40대는 95.4%, 50대는 98.9% 였고, 60대이상에서는 97% 였다 ( 표 16). 그림 9. 오천년애 흑마늘음료의상품화에따른시장성조사. - 224 -

표 16. 오천년애 흑마늘음료의상품화에따른시장성조사 ( 명 /(%)) 성별 연령 구분남자여자 20대이하 20대 30대 40대 50대 60대이상 오천년애에대한선호도 매우좋다 좋다 보통 나쁘다 매우나쁘다 10 43 14 0 0 (14.9) (64.2) (20.9) (0.0) (0.0) 31 78 54 11 9 (16.9) (42.6) (29.5) (6.0) (4.9) 0 1 5 0 0 (0) (16.7) (83.3) (0.0) (0) 5 7 6 2 1 (23.8) (33.3) (28.6) (9.5) (4.8) 16 13 5 0 0 (47.1) (38.2) (14.7) (0.0) (0.0) 10 35 17 3 0 (15.4) (53.8) (26.2) (4.6) (0.0) 25 48 16 0 1 (27.8) (53.3) (17.8) (0.0) (1.1) 5 15 13 1 0 (14.7) (44.1) (38.2) (2.9) (0.0) 4 종합결과 쑥혼합흑마늘음료 오천년애 의시제품에대해음료의맛, 향, 제품화되었을때의시장성에대하여조사한결과, 음료의맛은 78% 가긍정적인반응을보였으며, 부정적인반응은약 22% 였다. 성별에따른선호도는여성보다는남성이더높았는데, 이는남성들의경우맛이강한기존의흑마늘음료에익숙한반면상대적으로여성들은흑마늘음료에대한친밀도가낮기때문으로생각된다. 쑥을첨가하여흑마늘음료를제조할경우기존의흑마늘음료보다쑥의향미로인해마늘냄새가감소되면서제품의전체적인맛이한층더부드러워져남성뿐만아니라여성들에서도선호도가높아졌다. 제품이출시되었을때시장성에대한조사는 47.6% 가좋다는응답이었으며, 24.4% 는매우좋다로응답을하여 오천년애 흑마늘음료가출시되면기존의흑마늘음료보다선호도가높을것으로판단된다. 더욱이쑥추출물함유흑마늘음료오천년애는기존의흑마늘음료보다항산화, 면역증진등의부가적인효능이한층업그레이드된제품으로써시장성이기대된다. - 225 -

< 참고자료 - 설문지 > - 226 -

(2) 쑥혼합흑마늘음료 오천년애 흑마늘음료의제조공정도 - 227 -

(3) 쑥혼합흑마늘음료 오천년애 의상품화를위한포장디자인개발 - 228 -

5) 흑마늘, 쑥및천연식물추출물을함유한면역증진용제품의상품화 (1) 오천년애프리미엄흑마늘음료개발상품의소비자선호도조사 1 조사표본의특징 오천년애프리미엄 의조사를위한표본의특성을조사는아래와같으며성별특징은전체설문응답자 250명중남자가 90명으로전체의 36%, 여자는 160명으로 64% 로조사되었으며여성이남성보다월씬높은비율이었다. 음료의실질적인소비층은남성의피로회복을위해섭취하지만제품의구매성향에서여성의구매비율이높기때문에여성의비율이높은것은조사자료에대한긍정적인영향을미칠것으로판단된다. 연령대별특징을살펴보면 20대미만이전체의 1.5% 로가장적었고, 20대가 5.4%, 30대 28.6%, 40대 38.5%, 50대 22.1%, 60대이상이전체의 3.9% 로조사되었으며그중 40대의응답율이 38.5% 로가장높았다. < 남녀성별비 > < 연령별응답율 > 그림 10. 조사표본의남녀성별비및연령. 그림 11. 조사표본의지역별구성비율. - 229 -

지역별특징을살펴보면, 응답자중경남지역의거주자가전체의 75.8% 로가장많았고, 기타가 16.5%, 영남지역이 5.4%, 수도권이 2.3% 로가장낮았다. 봄철남해군을관광하는관광객을중심으로조사하다보니경남지역이가장많았고그외호남지역에서의방문객이늘어기타가다수있었다. 설문응답자의거주지역별특징을분석한결과, 시지역거주자가전체의 57%, 군지역거주자가전체의 43% 를차지하였다. 2 남해마늘및흑마늘에대한인지도조사결과 남해마늘에대한인지도 남해마늘의인지도에대해조사한결과는표 17과같으며남해마늘에대한인지도는들어본적이있다에응답빈도가 48% 로가장높았고, 매우잘안다가 32%, 잘모른다가 0.8%, 전혀모른다가 0% 로조사되었다. 2012년조사분석결과에서는매우잘안다가 34%, 들어본적이있다가 43%, 잘모른다가 11% 였으나이번조사에서는잘모른다가 0.8% 로조사되어지난해보다는남해마늘의인지도가향상된것으로조사되었다. 표 17. 남해마늘에대한인지도조사결과 남해마늘인지도 조사 항목 매우잘안다 안다 들어본적이있다. 조금안다 잘모른다 모른다 전혀모른다 안다 모른다 빈도 (%) 120 (48) 80 (32) 48 (19.2) 2 (0.8) 0 (0) 248 (99.2) 2 (0.8) 또한남해마늘의인지도가지난해에는응답자 10 명중 8 명이상이남해마늘에대해들 어보았거나알고있는것으로조사된반면 2013 년에는안다가 99.2% 모른다가 0.8% 로 2 명만이잘모른다고응답해남해마늘에대한인지도가한층향상된것으로조사되었다. 흑마늘에대한인지도 흑마늘에대한인지도는꾸준히증가하는경향으로조사되었다. 이번조사에서매우잘안다가 23.2%, 들어본적이있다가 39.2%, 조금안다가 28.8% 로, 안다가 92.2% 로지난해조사에서안다 (85.2%) 에비해인지도상당히높아진경향이었다. 남해마늘및흑마늘에대한다양한정보제공, 홍보효과에의해인지도가상당히증가되고있으며이에흑마늘음료의시장도한층확대될것으로기대된다. - 230 -

표 18. 흑마늘에대한인지도조사결과 흑마늘에대한인지도 조사 항목 매우잘안다 안다 들어본적이있다. 조금안다 잘모른다 모른다 전혀모른다 안다 모른다 빈도 (%) 58 (23.2) 98 (39.2) 72 (28.8) 17 (6.8) 5 (2) 228 (91.2) 22 (8.8) 3 흑마늘음료오천년애프리미엄에대한선호도조사 오천년애프리미엄음료의맛에대한선호도 오천년애프리미엄 의맛에대한선호도는좋다가 33.2% 로가장높았고, 매우좋다가 20.3% 로좋다가 53.5% 로과반수이상이었으며, 매우나쁘다가 5.5% 로낮았다. 2차년도에개발된 오천년애 는매우좋다가 16.8%, 좋다가 36.0% 로좋다가 52.8% 였으나 오천년애프리미엄 은이보다더좋은반응이었다. 그림 12. 오천년애프리미엄흑마늘음료의맛에대한선호도. 2차년도에개발된 오천년애 선호도조사시에기존의흑마늘음료에쑥추출물을함유하여마늘냄새를저감시키는효과가있어소비자의선호도가높았는데 오천년애프리미엄 은쑥이외에황금, 작약, 단삼, 뽕잎, 상황버섯의추출물을동량혼합하여제조한결과천연식물의다양한풍미에의해맛에대한선호도가더높게측정되었으며천연식물추출물을첨가해도마늘의단맛에의해쓴맛은거의없어쑥, 천연식물 5종의첨가는기능성의효과에더하여맛에도상당한영향을준것으로조사되었다. 특히나쁘다와매우나쁘다의의견은개선해야되는점으로젊은층에서의기피현상이 - 231 -

있었다. 젊은소비층은기존의맑은음료, 기능성음료, 탄산음료를선호하고한약에대한기호도가본조사결과선호도가낮은것으로나타난것으로생각된다. 이는향후개발될제품에서젊은층을공략할수있는감각적인음료의개발이필요할것으로판단된다. 표 19. 오천년애프리미엄음료의성별및연령층에따른맛에대한선호도 ( 명 /(%)) 성별 연령 구분남자여자 20대미만 20대 30대 40대 50대 60대이상 오천년애프리미엄 의선호도 매우좋다 좋다 보통 나쁘다 매우나쁘다 34 42 13 1 0 (13.6) (16.8) (5.2) (0.4) (0) 16 41 59 30 14 (6.4) (16.4) (23.6) (12) (5.6) 0 0 2 1 1 (0) (0) (0.8) (0.4) (0.4) 0 3 5 4 1 (0) (1.2) (2) (1.6) (0.4) 12 24 27 7 2 (4.8) (9.6) (10.8) (2.8) (0.8) 22 38 24 9 3 (8.8) (15.2) (9.6) (3.6) (1.2) 10 15 14 5 7 (4) (6) (5.6) (2) (2.8) 6 3 0 2 0 (2.4) (1.2) (0). (0.8) (0) 오천년애프리미엄 흑마늘음료의향에대한선호도 오천년애프리미엄 음료의향에대한선호도조사결과는그림 13 및표 20과같다. 매우좋다가 12.5%, 좋다가 41.3%, 보통이 25.8% 로조사되었으며부정적인반응은 20.4% 로낮았다. 오천년애프리미엄 의향에대해긍정적인반응으로써의선호도가높게조사되었는데이는기존의흑마늘음료에여러가지천연식물을첨가함에따라흑마늘냄새는감소되고천연식물의향이부가되어좋은반응을얻은것으로판단되었다. - 232 -

그림 13. 오천년애프리미엄흑마늘음료의향에대한선호도. 표 20. 오천년애프리미엄 음료의성별및연령층에따른향에대한선호도 ( 명 /(%)) 성별 연령 구분남자여자 20대미만 20대 30대 40대 50대 60대이상 오천년애프리미엄 의선호도 매우좋다 좋다 보통 나쁘다 매우나쁘다 18 28 15 12 7 (7.2) (15.2) (6) (4.8) (2.8) 6 67 52 29 8 (1.6) (26.8) (20.8) (11.6) (3.2) 0 0 0 2 2 (0) (0) (0) (0.8) (0.8) 0 3 3 5 2 (0) (1.2) (1.2) (2) (0.8) 8 18 31 12 3 (3.2) (7.2) (12.4) (4.8) (1.2) 5 50 30 9 2 (2) (20) (12) (3.6) (0.8) 4 30 3 12 6 (1.6) (12) (1.2) (4.8) (2.4) 5 4 0 1 0 (2) (16) (0) (0.4) (0) 오천년애프리미엄 음료는 2 차년도에출시한 오천년애 음료에천연식물이더첨 가됨에따라일반적인흑마늘음료에비해더좋은반응으로조사되었으며진한흑마늘 의향이외에다양한천연식물의향이어우러짐으로써음료의풍미가한층높아졌다. - 233 -

연령층에따라선호도를조사 ( 표 20) 를보면 40대및 50대의선호도높았는데이는젊은소비층보다연령이높은층에서식물류의향미를더선호한것으로조사되었다. 음료의향은제품의맛에중요한영향을미치는것으로제품의성분, 기능성, 효능과무관하게소비자를끄는힘이있는데 오천년애프리미엄 음료의향미는 53.8% 가좋고 25.8% 도보통으로조사되어시장성이있으리라기대된다. 오천년애프리미엄흑마늘음료가상품화되었을때시장성에대한조사 흑마늘음료 오천년애프리미엄이상품화되었을때제품을구매할의사가있거나판매가잘될것같고반응성이좋을것인지에대해질의한시장성에조사결과그림 14 와같이매우좋다가 15.5%, 좋다가 50.1% 로매우긍정적인반응으로조사되었고 (65.6%), 보통은 25.8% 였으며 8.6% 만이부정적으로응답하여 오천년애프리미엄제품화에따른시장성은매우긍정적일것으로보인다. 응답자중 오천년애프리미엄 에대해보통이상의긍정적인응답을한연령층의빈도는 40대에서 52명 (20.8%) 이좋다라고하여 50대에서선호도가가장높아중장년층을타켓팅하는것이마케팅에유리할것으로판단되며다음으로 30대에서 38(15.2%) 명이좋다고응답해건강에관심을가지는 30대에서도좋은시장이형성될것으로판단된다. 매우나쁘다고응답한사람은 20대미만으로어린학생은감미가높고칼로리가높은식품을선호하는것으로 오천년애프리미엄 에맛과향을젊은소비층이선호할수있는제품으로수정보완한다면보다우수한제품이될수있을것으로판단된다. 그림 14. 오천년애프리미엄흑마늘음료의상품성에대한기호도. - 234 -

표 21. 오천년애프리미엄 의성별및연령층에따른시장성에대한선호도 ( 명 /(%)) 성별 연령 구분남자여자 20대미만 20대 30대 40대 50대 60대이상 오천년애프리미엄 의선호도 매우좋다 좋다 보통 나쁘다 매우나쁘다 15 45 22 5 3 (6) (18) (8.8) (2). (1.2) 24 80 42 13 1 (9.6) (32) (16.8) (5.2) (0.4) 0 1 1 1 1 (0) (0.4) (0.4) (0.4) (0.4) 3 5 4 1 0 (1.2) (2) (1.6) (0.4) (0) 15 38 14 4 1 (6) (15.2) (5.6) (1.6) (0.4) 16 52 24 5 2 (6.4) (20.8) (9.6) (2) (0.8) 5 26 16 5 0 (2) (10.4) (6.4) (2) (0) 0 3 5 2 0 (0) (1.2) (2) (0.8) (0) 오천년애프리미엄 오천년애프리미엄 의전반적인기호도에대한조사 흑마늘의음료의전반적인기호도는좋다가 52.5% 로가장높고 매우좋다가 10.3%, 보통이 27.6% 로 90.4% 가긍정적으로응답했다. 이는기존의흑마늘 음료보다높은기호도이며, 2 차년도에개발한쑥을첨가한시료보다좋은반응이었다. 그림 15. 오천년애프리미엄흑마늘음료의전반적인기호도. - 235 -

표 22. 오천년애프리미엄 의성별및연령층에따른시장성에대한기호도 ( 명 /(%)) 성별 연령 구분남자여자 20대미만 20대 30대 40대 50대 60대이상 오천년애프리미엄의기호도 매우좋다 좋다 보통 나쁘다 매우나쁘다 20 40 27 5 0 (8) (16) (10.8) (2) (0) 6 91 44 15 4 (2.4) (36.4) (17.6) (6) (1.6) 0 0 0 2 2 (0) (0) (0) (0.8) (0.8) 3 6 4 0 0 (1.2) (2.4) (1.6) (0) (0) 8 44 16 4 0 (3.2) (17.6) (6.4) (1.6) (0) 5 59 22 5 0 (2) (23.6) (8.8) (3.2) (0.8) 6 22 22 5 0 (2.4) (8.8) (8.8) (2) (0) 2 0 5 3 0 (0.8) (0) (2) (1.2) (0) 여성과남성의선호도를비교해보면나쁘다가 2% 미만으로선호도가높고여성은 7.6% 가부정적이었으며그외는모두긍정적이었다. 연령대별의선호도를비교해보면 40대가선호도가높고다음으로 50대, 30대의순으로흑마늘음료가피로회복, 체력증진을위해선호되는결과로조사되었다. 흑마늘의음료의맛과향미를개선하기위하여 2차년도에는쑥을첨가시개선효과가있었으며 3차년도에서개발된 오천년애프리미엄 은맛과향미이외에면역증강기능성을부가하기위하여천연식물 5종을첨가한결과맛과향미도우수하며면역증진의효과를기대한소비자의반응이배가되어 오천년애프리미엄 은시장성에있어서 40대남성을타켓으로할때시장성이클것으로기대된다. 4 오천년애프리미엄의선호도조사종합결과 흑마늘음료제조시쑥, 천연식물 5종을첨가하여제조한 오천년애프리미엄 의맛, 향, 제품화되었을때의시장성에대하여조사한결과, 음료의맛은 82.2% 가긍정적인반응으로조사되었고 17.8% 만이부정적으로답하였다. 성별에따른선호도는남성은응답자 90명중 1명만이부정적인응답이었으며매우좋다와좋다가대부분이었으며여성은보 - 236 -

통이 59명으로가장많았다. 오천년애프리미엄 은남성의선호도가높으며여성에게서극선호도는많지는않지만대부분이맛이좋다는반응이었다. 2차년도에개발된흑마늘음료에쑥을첨가함으로써맛이부드러워졌다는반응이있었는데 3년차에개발된 오천년애프리미엄 은천연식물의향이어우러져흑마늘음료의마늘냄새를상당히저감시킬수있는음료로개발된것으로조사되었다. 오천년애프리미엄 은기존제품에천연식물을첨가함으로써면역증진효과가높아진제품으로중장년층, 스트레스과다노출인만성피로인등에효과가있을것으로기대된다. 개발제품은같은배합비라도포장방법에따라생산비의차이가발생하게되는데 2차년도에개발된 오천년애 는병음료로출시되어고품격소비층을겨냥한제품이었으며이번에천연식물을포함하여면역증진에도움이되는 오천년애프리미엄 도병음료로출시하여제품의고품격을추구하고자하였다. 병음료는제품의고급화및음료의안전성이있지만고가의물류비와운반의불편함이있어이를개선한포장방법으로스파우트파우치팩을활용하고자하였으며 오천년애프리미엄 의배합비에음료의농도를조금낮추어여성및다양한소비층을공략할수있는제품으로 오천년애골드 를개발하여다양한소비층을확보하고자하였다. (2) 오천년애파워 흑마늘타블렛제제개발및소비자선호도조사 1 흑마늘액상제품과정제제품과의비교 오천년애 의액상제품과정제제품의선호도를비교해본결과 55명중 18명은액상제품을선호했으며 37명은정제제품을선호했다. 액상제품의선호이유는정제제품은약품으로느껴진다는것과, 액상으로섭취시포만감을준다는분이가장많았고분말제품의선호이유는간편하게섭취할수있고휴대가편리한점이많았다. 그림 16. 액상제품및정제제품의선호도조사. - 237 -

2 오천년애파워 의맛에대한선호도 맛에대한선호도는씹었을때의맛과향미에대한느낌으로조사되었다. 오천년애파워 의맛에대한선호도는매우긍정적으로조사되었는데매우좋다가 15%, 좋다가 56.4% 로좋다는반응이 71.4% 로반응이좋았으며나쁘다가 3.6% 로낮게조사되었다. 그림 17. 오천년애파워 제품의맛에대한선호도. 3 오천년애파워 가상품화되었을때의시장성 오천년애파워 가상품화되었을때의시장성에대한조사는매우좋다가 21.8%, 좋다가 52.7% 로긍정적으로조사되었다. 나쁘다고응답한부분에서는액상제품의선호도가더높아부정적으로응답을한것으로조사되었다. 그림 18. 오천년애파워 제품이상품화되었을때의시장성. - 238 -

기타의견으로흑마늘음료만접하다가타블렛으로된정제품이출시된다면간편하게섭취할수있는제품으로기대된다고응답하였다. 위의조사결과를종합해볼때흑마늘음료의타블렛출시는소비자의좋은반응을일으키리라기대된다. (3) 개발제품의제조공정도 1 오천년애프리미엄 흑마늘음료의제조공정도 - 239 -

2 오천년애파워 타블렛의제조공정도 - 240 -

(4) 개발제품의유통기간설정 1 유통중인유사제품의유통기간 포장재 : 차광유리병 원재료 : 흑마늘추출액100%( 고형분 11%) 유통기간 : 제조일로부터 1년 보관방법 : 상온 포장재 : 차광유리병 원재료 : 흑마늘추출액100%( 고형분 16%) 유통기간 : 제조일로부터 1년 보관방법 : 상온 2 개발제품 오천년애프리미엄 의유통기간설정 : 제조일로부터 1년 포장재 : 차광유리병 원재료 : 흑마늘추출액 5%, 천연식물추출액 1%(7:3) 의비율로혼합 보관방법 : 상온 유통기간설정 : 차광유리병으로외부공기와접촉이없으며상기유사제품과포장및재 료가유사하므로본개발제품인 오천년애프리미엄 의유통기간을제조일로부터 1년 으로설정 - 241 -

(5) 상품화를위한포장디자인개발 1 오천년애프리미엄 및 오천년애골드 흑마늘음료의디자인 2 오천년애파워 타블렛의디자인 - 242 -

6) 개발제품의수출을위한해외시장분석 (1) 국내제형및유통채널별건강기능식품시장구조 국내건강식품은알약형제형의구입율이가장높고, 약상이나음료형태의제품이그다음을차지하는데, 구입율은 2010년대비약 2.5% 증가한상태이며, 연질켑슐도유사한범위로구입율이증가하였음. 이상에서언급한제형을제외한제형들의구입율은 10% 미만으로매우낮아국내건강식품은다양한제형으로제조가능함에도불구하고, 주요 2~3가지제형에대한선호도가매우높음을알수있음. 13가지이상의유통채널을가지고있으나 20% 이상의구입율을가지는유통채널은전문판매점과방문판매임. 다음으로약국, 다단계판매, 대형할인점에서의구입율이 10% 이상이었고, 2010년대비다단계판매점, 약국, 드록스토어를통한판매가증가하고있고, 우선순위 1, 2위에있는건강기능식품판매점과방문판매구입율은오히려감소하였음. - 243 -

(2) 국내건강관련식품시장현황및면역활성제품이차지하는비중 국내건강기능식품의시장은건강관심고조, 서구식식생활, 인구고령화등의원인에의해매년큰폭으로성장하고있다. 식품의약품안전처는 2011년건강기능식품생산실적을분석한결과총생산액은 1조 3천 682억원으로 2010년 (1조 671억원 ) 대비 28.2% 증가하였음. 이는건강기능식품연평균성장률 (27.4%) 과비슷한수준으로국내식품시장의다른업종 ( 일반식품, 기구용기포장지, 식품첨가물 ) 의평균성장률 (11.7%) 보다 2배이상의증가추세이며, 국내총생산 (GDP) 의 5.9%, 제조업 (GDP) 의 7.8% 보다높은성장률을보이고있음. 식품의약품안전처에서는면역기능향상에는면역력증진및과민면역반응완화에도움을주는원료로크게구분하여고시하였음. 그기능성이인정된원료로는게르마늄효모, 금사상황버섯, 당귀혼합추출물, 클로렐라, 표고버섯균사체, Enterococcus faecalis 가열처리건조분말, L-글루타민, 다래추출물, 소엽추출물, 피카오프레토분말등복합물, 구아바잎추출물등복합물, 스피루리나청국장균배양정제물등록되어있으며고시형원료로는인삼, 홍삼, 알콕시글리세롤함유상어간유, 알로에겔이등록되어있음. 표 23. 건강기능식품생산현황 ( 04~ 11) 구분 총생산액 ( 억원 ) 총생산량 ( 톤 ) 내수용 수출용 생산액 ( 억원 ) 생산량 ( 톤 ) 생산액 ( 억원 ) 생산량 ( 톤 ) 2004 2,506 4,764 2,263 4,250 242 514 2007 7,235 10,578 6,888 10,239 346 339 2008 8,031 13,687 7,516 12,990 514 697 2009 9,598 19,885 9,184 19,293 415 592 2010 10,671 25,361 10,211 24,994 460 367 2011 13,682 40,258 13,126 39,611 556 647 비율 (%) ('11/'10) 28.2 58.7 28.5 58.5 21.0 76.3 건강기능식품의연도별, 품목별상위품목은생산액은홍삼제품이 7,1791억원으로전체의 52.6% 를점유하며최고의생산액을달성하였고, 그다음으로비타민및무기질 (1,561 억원 ), 개별인정형제품 (1,413억원), 알로에제품 (691억원), 오메가-3제품 (509억원) 의순이였으며특히감마리놀렌산제품은 223억원의생산액을보여전년대비 139.8% 늘어나괄목할만한신장세를보였음. - 244 -

표 24. 상위 10 품목건강기능식품생산현황 ( 07~ 11) 총생산액 증가율 구분 ( 11/ 10, 2007 2008 2009 2010 2011 %) 총 액 7,235 8,031 9,598 10,671 13,682 28.2 1 홍삼 3,284 4,184 4,995 5,817 7,191 23.6 2 비타민및무기질 604 531 761 991 1,561 57.5 3 개별인정형 ( 밀크씨슬등 ) 249 416 800 1,129 1,435 27.1 4 알로에 797 639 648 584 691 18.4 5 오메가-3 지방산함유유지 142 266 334 348 509 46.2 누계 (5품목) 5,076 6,036 7,538 8,869 11,387 28.4 6 프로바이오틱스 174 190 254 317 405 27.8 7 인삼 348 413 364 341 381 11.7 8 감마리놀렌산 187 145 108 93 223 139.8 9 가르시니아캄보지아추출물 1) - - - 208 207 0.5 10 식이섬유 3 1 99 117 116 0.9 누계 (10품목) 5,788 6,785 8,363 9,945 12,719 27.9 11 기타품목 1,447 1,246 1,235 726 963 32.6 그림 19. 건강기능식품품목별시장현황 ( 11 년 / 억원 ). - 245 -

그림 20. 개별인정형제품기능성내용별현황 ( 11 년 / 억원 ). 전체개별인정형제품의기능성을분석해보면장건강을위한제품이가장많고, 다음을면역기능제품이 12% 로 2위를차지하고있음. 이와비슷한비율로관절 / 뼈건강제품에대한제품의비율도높음. 면역기능에도움을주는건강기능식품의총생산액과그구성비를살펴보면역시그중홍삼제품이대부분을차지하고있으며알로에및인삼제품이그뒤를따르고있고, 개별인정형제품은 1.1% 에그쳐국내에서인삼및홍삼제품이면역력강화제품으로절대적인생산량을차지하고있음. 표 25. 국내건강기능식품중면역활성증대제품비 ( 11년/ 억원 ) 구분 총생산액 금액구성비 (%) 총액 13,682 100 1 홍삼 7,191 52.6 2 알로에 691 5.2 3 인삼 381 2.8 4 개별인정형제품 179 1.1 5 총계 8442 61.7-246 -

표 26. 국내개별인정형면역력강화제품 소재제품제형특징 게르마늄효모캡슐, 게르마늄효모복합추출물면역력강화 금사상황버섯 당귀혼합추출물 홍삼, 녹용, 산수유및금사상황버섯을혼합한환당귀, 천궁, 백작약및정제수, 벌꿀, 비타민 B군의혼합용액 면역력강화 면역력강화 클로렐라클로렐라원말면역력강화 표고버섯균사체액상및분말형태면역력강화 스피루리나스피루리나원말면역력강화 L- 글루타민타블렛면역력강화 소엽추출물화장품원료면역과민반응개선 피카오프레토분말등복합물구아바잎추출물등복합물다래추출물구아바잎추출물등복합물 타블렛타블렛타블렛타블렛 면역과민반응개선면역과민반응개선면역과민반응개선면역과민반응개선 (3) 해외건강관련식품시장에서면역활성제품이차지하는비중 2011년세계건강기능식품시장규모는 89십억달러이며, 항후 2016년에는 120십억달러를상회할것으로예상되며, 특히개발도상국의성장률이향후 2016년까지약 12% 를유지할것으로예상됨. 국가별로보면미국이 29,242백만달러로가장높으며다음으로서유럽이 15,657백만달러임. - 247 -

<A> 그림 21. 건강기능식품세계시장규모및성장률 (A), 건강기능식품시장규모성장률추세 (B). <B> 그림 22. 국가 / 지역별건강기능식품시장규모및성장률 (2011) 1 미국시장 미국내기업들은건강기능식품연구개발역사가오래된관계로과학적수준이상당히높으며, 미국식품과학회 (IFT) 에따르면최근가장인기를끌고있는품목은프로바이오틱스, 비타민, 오메가-3 제품을들수있음. 프로바이오틱스는미국식이보충제시장의 23% 를차지하고있는데, 이는고령화추세에따른노인질병증가와질병예방의중요성인식등에따른것으로추정되며, 비타민은종합비타민이 46억불, 단일제비타민이 40억불정도의규모를형성하고그중비타민 B가가장많이판매되며비타민 C, 비타민 D가뒤를있고있음. 오메가-3 제품역시해마다 - 248 -

가파른성장세를보이고있음. 국내시장에서가장인기가높은홍삼제품의경우미국에서는그점유율이미미한것으로조사되어있음. 현재국내기업중미국에서현지판매를하고있는회사를살펴보면한국담배인삼공사, 대상, NH 한삼인이기진출하여홍삼및인삼제품을통해면역력강화제품판매를하고있음. - 249 -

2 일본시장 일본의건강기능식품시장의경우 2005년까지계속적으로증가하여 1조 9,000억엔에달하였으나이후경기침체로인해시장이정체하는경향을나타내면서 2008년기준 1조 6,800억엔의시장규모를형성하고있음. 보건용도별시장규모와특성은다음과같다. - 정장작용 : 유산균관련품목은소비자가저가격지향에따라일반상품의특별판매가증가하였고소비자의소식화및다양화에따라상품의용량이소형으로변하면서시장규모가조금축소됨. - 콜레스테롤 : 콜레스테롤제품은생활습관병과관련이깊어 2007년의시장규모를약간웃도는수준을기록함 - 혈압 : 펩타이드를주성분으로한품목이앞으로크게성장할것으로전망 - 뼈미네랄 : 미용과관절이강력한키워드로인식되며콜라겐, 히알루론산, 글루코사민의성장률이가파른추세임. 일본건강산업신문이기능성식품주문자생산방식 (OEM) 기업을대상으로 2011년상반기인기소재와하반기예상인기소재를조사한결과, 콜라겐과글루코사민이 6년연속상반기인기소재투톱체제를고수한것으로나타났음. 일본역시면역증진에대한보건용도가지정되어있지않아서국내기능성원료로인정된원료별로살펴보면인삼관련제품 0.75%, 프로바이오틱스보충제 2.7% 를차지하고있음. 국내에서의건강기능식품으로서홍삼및인삼이차지하는비율에비해일본또한그점유율이미미한것으로조사되었음. - 250 -

3 중국시장 중국의 2010년기준건강기능식품규모는 1,330억위안이며, 매해전년대비 30% 성장하여 2015년에는 4,500억위안규모가될것으로예상됨. 인구의급격한노령화와식습관및생활습관의변화, 비만, 당뇨등과관련된질병의증가가보건식품시장성장의주요요인이되고있음. - 251 -

중국의경우중국인민공화국위생부에서고시한보건식품의기능성에대해면역력강화기능이존재하며동물실험만을통해제품으로등록이가능함. 인삼관련제품 5.5%, 프로바이오틱스보충제 0.36% 를차지하고있어미국과일본에비해인삼관련제품에대한선호도가훨씬큼. - 252 -

전체보건식품중면역력강화에대한매출액이 37.3%, 혈액지질조절이 13.8%, 피로회 복기능의보건식품이 10.8% 의순으로나타났음. 혈액지질조절 13.8% 피로회복 10.8 면역력강화 37.3 기타 38.3% 표 27. 중국내주요면역활성제품 제품사진 제품표시사항 베이징벌꿀 주요기능 : 인체면역기능증강, 소화및신경계통양생 판매가격 : 198 元 간략소개 : 베이징시장에서 2위를차지하는보건식품임 완지총차오왕 ( 万基蟲草王 ) 주요성분 : 동충하초 시장가격 : 95 元 주요기능 : 면역력증강, 종양저항력및병원균저항력제고 간략소개 : 광저우시장에서 8위를차지하고있는보건식품임 - 253 -

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4 서유럽시장 서유럽의경우웰빙트랜드의꾸준한확산과영국인의 3분의 1수준이과체중인것으로조사되었으며 20% 정도가위험한비만수준인것으로나타나서비만억제효과의기능성식품이확대될가능성이높은것으로조사되었음. 독일역시비타민과무기질, 허브요법제품들이각광받고있음. 또한주로해외에서는인삼을타블렛형태로많이판매가되고있으며특히다국적제약회사베링거인겔하임의자회사인파마톤사가인삼사포닌으로만든캡슐 `진사나 (Ginsena)` 단일품목만 30 억달러이상의매출을올려세계인삼가공식품분야에서점유일 1위를기록하고있음. (4) 면역활성강화제품의주요소재 해외에서제품의면역력증진효과연구를통한산업적으로다양한형태의제품들이출시되고있으며빠른산업화를위한효능평가방법의신기술개발을위해적극적으로투자하고있음. 국내건강한면역기능유지에도움을주는대표적인건강기능식품소재로는인삼홍삼알콕시글리세롤등이고시되어있으며최근다양한면역증강소재에대한관심이높아지면서연구및기술개발의속도가증가하고있음. 표 28. 주요국내면역활성강화소재 소재 알콕시글리세롤 특징 베틸알콜 (Batyl-Alcohol), 키밀알콜 (Chimyl Alcohol), 셀라킬알콜 (Selachyl Alcohol) 등을주성분으로하며골수비장및면역기능을관 장하는조직과모유등에분포. 이를이용한다양한면역기능강화 기능성제품들이유통 해조류 해조류추출당단백질의면역증진활성을보기위해혈중백혈구수, 총복강세포수증진을확인 버섯류 버섯다당체의대식세포면역기능증진, IL-2 수용체의발현능, 세포활 성물질분비능등이확인됨 인삼및홍삼 인삼및홍삼다당체의면역기능중진작용은림프구증식능효과, LAK(lymphokine activated killer) 세포생성능효과확인 Gandoderma lucidum IY009 유래단백다당류의분자량차이에따른면역기능증진작용은항보체 활성, 혼합첨가에따른산화질소생성등에대한연구결과확인 - 255 -

표 29. 주요해외면역활성강화소재 소재 특징 MGN3 TM 면역증강복합체, T 림프구, B 림프구, 자연살해세포의활성화 키틴-키토산 (Chitin-Chitosan) 초유 (Colostrum) 에키네시아 (Echinacea) 면역글로불린생성, 보강활성, 세포활성물질생성, 폐대식세포의초회항원자극을통한면역능증진효과스태미너증강효과및항피로효과와면역증진기능감기그리고감염증을치료하기위해사용되어온북미의자생식물, 대식세포에서세포활성물질의발현증가, 면역관련세포수의증가 국내건강기능식품수출은총 42개국가에수출하고있으며수출국가별비중은 EU, 미국, 일본, 중국순으로나타났으며품목별로살펴보면인삼및홍삼이전체의 70% 이상을차지하고있으며, 이들의해외수요는주로해외거주교민들에의한구매분인것으로나타났음. 한국인삼공사는전세계홍삼거래량의 70% 가거래되는홍콩에서정관장은중국삼의 10 배, 미국삼의 5배높은가격으로판매되고있으며 2010년중국등 60개국에 765억원수출했음. 남양알로에는미국현지를비롯한, 유럽, 아프리카, 아시아기업에알로에원료를수출, 전세계수요량의 40% 를공급하고있음. - 256 -

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표 30. 연도별생산실적 10 대업체 표 31. 연도별수입실적상위 10 대업체 - 258 -

(5) 주요소재별제품개발현황 1 홍삼및인삼음료제품 노년층을위해서쌉쌀한맛을그대로살린인삼및홍삼농축액만을사용한제품이많이출시되고있으며여성소비자를위해홍삼에블루베리를첨가한제품및중장년층을위해다른기능성이함유된원료 ( 꿀, 호박, 헛개나무등 ) 를첨가시켜면역강화이외의기능성을부여한음료제품이많이출시되고있음. 홍삼의쓴맛에거부감이있는청소년및어린이를위해홍삼에감귤, 사과, 포도등감미료대신천연과일농축액을첨가함으로홍삼의쓴맛을제거한제품도출시되고있음. 해외에서는홍삼보다는인삼고유의원료를사용한제품이많이출시되고있으며주로타블렛형태의제품이많이출시되고있는데, 특히다양한식물원료를첨가함으로다양한기능성을부여한제품이생산되고있음. 한편많은종류의타블렛제품이한국인삼공사에서생산하고있으며중장년층을위한제품들이많으며, 한편어린이용으로발효홍삼에비타민및해조류를첨가한제품이생산되고있음. 주로해외에서는인삼을타블렛형태로많이판매되고있으며특히스위스파마톤사에서생산되는 Ginsana는매년 30억달러이상의매출을올려세계인삼가공식품분야에서점유율 1위를기록하고있음. 표 32. 해외홍삼및인삼음료 제품명사진첨가형태주요특징 Honey lemon ginseng green tea 꿀, 레몬인삼차 인공감미료를사용하지않으며녹차의효능에꿀, 레몬그리고인삼의효능을가미한제품항산화, 면역기능 Red Ginseng 홍삼, 대추, 및 블루베리 추출물 홍삼의쓴맛을줄이기위해대추와블루베리를첨가했으며비타민 C, 와 B 2 를더하였다항산화, 면역력증진 GREEN TEA 인삼추출물이 포함된녹차 음료 인공색소와감미료를첨가하지않은 제품 항산화및면역력증진 - 259 -

표 33. 국내홍삼및인삼음료 제품명사진첨가형태주요특징 원비디 인삼및구기자 추출물 40 년간인삼음료의대표적인제품 자양강장및육체피로 수앤비홍삼한뿌리아이키커리튠키즈홍삼플러스 홍삼, 수박및호박추출물천연 5종베리혼합물홍삼홍삼농축액및사과, 감귤, 오렌지및포도과즙홍삼농축액, 비타민, 유산균, 아미노산및딸기배농축액 GAP 인증인삼을이용저온진공건조기술로만들어유효사포닌추출의효율성을높임육체피로면역력증진혈액흐름개선 4년근홍삼을통째로갈아사포닌이외의기능성물질을다양하게포함면역력증진혈액흐름개선홍삼농축액에사과, 감귤, 오렌지, 포도과즙을첨가해소비자의취양을다양하게맞춤면역력증진홍삼농축액에비타민B1, B2가 1일일섭취기준대비 100% 들어있으며유산균, 아미노산등도골고루함유면역력증진 표 34. 해외홍삼및인삼타블렛제품 제품명사진첨가형태특징 진사나 인삼추출물 (G115) 고려인삼추출물을표준화한 피로회복제, 세계 1 위 인삼가공품 파마톤 인삼추출물 (G115), 종합비타민, 미네랄, 및미량원소 고려인삼추출물을위주로한 종합영양제 정신및육체피로회복 - 260 -

표 35. 국내홍삼및인삼타블렛제품 제품명사진첨가형태주요특징 홍삼타블렛 홍삼정타블렛골드 홍삼왕 6년근홍삼분말을타브렛형태로가공홍삼및해조류분말첨가한타브렛발효홍삼농축액및비타민, 해조류첨가 면역력증진, 피로개선, 혈소판읍집억제를통한혈액흐름개선, 기억력개선에도움면역력증진, 피로개선, 혈소판읍집억제를통한혈액흐름개선, 기억력개선에도움발효를통해유익한진세노사이드의다량생성, 면역력증진 2 알로에 알로에겔은식용알로에품종중 베라 ' 라는종의외피를걷어내면나오는것으로, 기초면역력증진에효과적이다. 최근에는알로에관련제품의성장세가눈에띔. 2010년알로에시장의총생산액은 584억원에서 2011년 691억원으로약 18.4% 증가하며커다란성장세를보였음. 알로에는 4000년전고대부터임상치료와미용제로사용됐을만큼건강에탁월한효과를주는식물이며최근에는면역력, 장건강증진등에효능이입증되어식약처로부터면역증대기능성이인정되었음. 표 36. 해외알로에음료제품 제품명사진첨가형태특징 Organic certified Aloe Vera 알로에및 과일추출물희석액 면역기능강화 Canned Aloe Vera Juice with Plus 알로에희석액, 꿀 포도추출물 면역기능강화 Aloe Vera Juice 알로에희석액, 사과추출물 면역기능강화 - 261 -

표 37. 국내알로에음료제품 제품명사진첨가형태특징 자연은 790 일알로에희석액 790 일동안키운알로에사용, 알로에음료시장 1 위 가야알로에농장 알로에및 비타민 C 희석액 알로에와비타민 C 를복합하여 만든음료 알로에겔 알로에베라겔, 배, 한천 자몽종자추출물 5 년이상숙성된유기농 알로에를사용 표 38. 해외알로에타블렛제품 제품명사진첨가형태특징 Aloe Vera Softgel Soft Capsules 알로에추출물 면역기능강화 Essential Aloe Vera 알로에추출물 면역기능강화 AloePlus 알로에추출물면역기능강화 표 39. 국내알로에타블렛제품 제품명사진첨가형태특징 애플트리알로에 100 알로에추출물 제주산알로에 면역기능및장건강증진 알로에센스정 알로에추출물 제주산알로에 면역기능및장건강증진 아보민플러스알로에추출물면역및장건강증진 - 262 -

3 흑마늘 흑마늘은아직면역활성에대한연구가충분히이루어지지않은관계로면역강화제품이많이출시되고있지않은실정이며대부분이홍삼등과같은다른면역활성을가지는제품의첨가물형태로판매되어지고있음. 한국인삼공사에서는 홍삼담은자연흑마늘후레쉬 액은홍삼과흑마늘농축액을사용하여면역활성강화제품으로출시되었음. 풀무원의그린체활력보감및다른제품들역시흑마늘과홍삼을혼합함으로효능을극대화할려는시도를보였음. 흑마늘제품의경우해외에서타블렛형태로출시되고국내에서는추출액형태의제품이출시되는경향을보였음. 표 40. 국내흑마늘음료제품 제품명사진첨가형태특징 홍삼담은 자연흑마늘후레쉬 홍삼및흑마늘농축액 면역기능강화 그린체활력보감 남해흑마늘, 홍삼및 동충하초추출액 면역기능강화 홍삼진액플러스 홍삼, 흑마늘, 둥글레, 황기, 영지추출액 면역기능강화 흑마늘 진액프리미엄 발효흑마늘, 홍삼, 헛개나무추출액 면역기능강화 표 41. 해외숙성마늘타블렛제품 제품명사진첨가형태특징 Kyolic Formular 103 숙성마늘추출물, 비타민 C, 5 종의벗섯및올리브잎 추출물 심혈관강화 - 263 -

4 쑥 쑥은우리나라의역사시작과함께등장하는오랜식물로써약용식물로알려져왔음을단군신화에서알수있음. 동의보감에는 쑥은오래된여러가지병과부인의하혈을낫게하여안태를시키며, 복통을멎게하며적리와백리를낫게한다. 오장치루로피를쏟는것과하부의의창을낫게하며살을살아나게하고풍한을헤치며임신하게한다 고기록되어있음. 쑥은폴리페놀인유파틸린 (1.2~3 mg/g) 및자세오시딘을다량함유하고있으며이를이용한위염치료제스티렌 ( 애엽에탄올추출물 ) 을출시하여연간 900억원의대형신약을탄생시킨천연물임. 이러한유파틸린, 자세오시딘등다양한폴리페놀을함유하는쑥은항산화, 항암등다양한생리활성효과를보여천연물의약품개발에많은제약회사들이관심을보이고있지만독특한향때문에음료및식품으로서개발은의약품개발에비해활발하지않은실정이며, 쑥을이용한식품의대부분이환, 차, 또는다름식품의첨가형태로사용되어지고있음. 표 42. 국내쑥음료제품 제품명사진첨가형태특징 윌 유산균및강화약쑥 농축액 강화약쑥을이용해위위 보호 3 년강화사자발쑥 강화사자발쑥추출액, 대추결명자, 숙지황 당귀, 계피, 갈근추출액 3 년숙성한쑥사용 휴럼헛개나무 헛개나무 추출액 (KTG075), 지구자, 매실, 갈근및인진쑥 헛개나무 추출액 (KTG075) 을표준화 하여만든제품 3 년강화사자발쑥 환 강화약쑥, 은행잎추출물 3 년숙성한쑥및 은행추출물을사용 5 기타면역강화천연식물류보강제품 농심은청정지역뉴질랜드산녹골에서추출한강글리오사이드를고급원두커피에접목 한제품을만들었는데이강글리오사이드는면역력을증가시키는활성물질로잘알려져 - 264 -

있음. 한국야쿠르트에서허브인앨더플라워추출물을첨가한제품을출시하였으며이는비타민이풍부하고면역력을증가시키며알러지를예방하는것으로영국에서는민간요법으로많이사용되어지고있음. 양배추와브로콜리는미국타임지선정세계 10대슈퍼푸드로십자화과채소에많은설포라판을풍부하게함유하고있음. 설포라판 (sulforaphane) 은식물이함유하고있는천연기능성물질로서면역활성, 항돌연변이등에대한효능이알려져있음. 위러브양배추 & 브로콜리한병에는설포라판이 100μg(120 ml기준 ) 이상함유돼면역및항암효과를증대시켰음. 표 43. 기타면역강화천연식물류보강제품 제품명사진첨가형태특징 강글리오커피 커피및 강글리오사이드첨가 모유와녹골의 강글리오사이드를첨가하여 면역력강화 7EVEN 유산균발효유및 앨더플라워추출물 알러지예방및비타민보강 위러브 양배추 & 브로콜리 양배추및브로콜리 추출물 면역및항암효능의 설포라판함유 - 265 -

제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 -1 차년도 세부연구목표 평가착안점 달성도 (%) 연구개발수행내용 개똥쑥의이화학적 성분, 생리활성분석및유효물질의분리 - 개똥쑥의이화학적 성분정량및유효물질의확인여부 100 개똥쑥의잎과줄기의수분, 회분, 조지방, 조 단백, 조섬유및무기물을분석하였으며, K 과 Ca 의함량이높은것으로확인됨. 개똥쑥의부위별 ( 잎과줄기 ) 로물과에탄올추출물의생리활성을항산화및항암활성측면 에서측정하였으며, 그유효물질을분석한결과잎에서생리활성이우수하였으며, 유효물질 의함량도유의적으로높았음. HPLC 로유효물질을동정한결과 phenolic acid, catechin 및 flavonoid 류가확인되었으며, 생리활성은이들물질에기인한것으로추정됨. 흑마늘및개똥쑥의최적추출조건을설정하기 흑마늘및개똥쑥 추출물의추출조건별생리활성스크리닝 - 흑마늘과개똥쑥의추출조건별생리활성 비교및생리활성의극대화를위한추출 조건의확립여부 100 위하여반응표면분석법을이용하였으며, 에탄올용매의혼합비 (0, 25, 50, 75, 100%), 추출온도 (50~90 ) 및추출시간 (6~15 시간 ) 에따른생리활성을비교분석하였음. 흑마늘은 89.68 에서 9.79 시간, 55.72% 의에탄올비, 개똥쑥은잎과줄기의혼합물에대해 89.68 에서 8.46 시간, 53.70% 의에탄올비로추출하였을때생리활성의극대화를얻을수 있었음. 개똥쑥과타품종쑥과의생리활성을비교하고자개똥쑥, 강화약쑥, 약쑥및인진쑥의항산 타품종쑥과개똥 쑥의생리활성비교 - 개똥쑥과품종별쑥의성분및생리활성비 교여부 100 화활성을시험한결과총페놀함량및플라보노이드의함량은인진쑥에서가장높았고다 음으로개똥쑥이었으며, DPPH 를비롯한 3 종의라디칼소거능및환원력도인진쑥추출물이 가장높았고다음으로는개똥쑥의순임. Pilot 규모에서흑 - 흑마늘과개똥쑥 대용량농축기를이용하여흑마늘및개똥쑥을고온 (110~130 ) 추출하여얻은추출물의생리 마늘과개똥쑥의최적추출조건설정 열수추출조건의확립여부 100 활성을측정한결과, 흑마늘은 130 에서 4 시간추출, 개똥쑥은 121.86 에서 2.80 시간추출 했을때생리활성이가장우수하였음. 흑마늘과 개똥쑥 추출혼합조성물의생리활성및면역 활성검증 - 흑마늘과개똥쑥의 혼합에따른항산화활성극대화를위한 최적의혼합비율설정여부 100 흑마늘과개똥쑥의제품개발을위한최적의혼합비율을알아보고자흑마늘과개똥쑥의 비율을달리한혼합물의항산화활성및면역활성을실험한결과 nitric oxide 라디칼소거 능과 α-glucosidase 저해활성을제외한모든실험에서흑마늘과개똥쑥을 99.3 : 0.7 의비율로 혼합하였을때항산화활성이월등히좋았음. - 266 -

세부연구목표 평가착안점 달성도 (%) 연구개발수행내용 또한혼합물의농도가높아질수록, 개똥쑥의혼합비율이증가함에따라서항산화활성도유 흑마늘과개똥쑥추출혼합조성물의 생리활성및면역활성검증 - 흑마늘과개똥쑥 추출물의혼합에따른생리활성과 면역활성의변화비교여부 - 활성증대및관능 평가를통한혼합비율설정여부 100 의적으로증가하여, 혼합물의항산화활성이개똥쑥의높은항산화력과흑마늘의갈변물질 에의한항산화능에기인한결과라고판단됨. 흰쥐의비장세포증식능을통하여면역세포 증식효과를측정한결과품종별쑥추출물중개똥쑥이가장우수하였으며, 흑마늘과혼합할 때개똥쑥추출물의첨가비율이높아질수록활성도더증가하였음. 생리활성에대한연구결과및관능평가결과를종합하여흑마늘과개똥쑥추출물의최적혼합 비율은 99.3 : 0.7 로하여농도에따른 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 와같은 cytokine 의생성량을 확인한결과대조군에비해유의적으로높은수준의 cytokine 을생성함을확인하였음. 깐마늘, 쪽분리피마늘및통마늘을시료로하 여제조공정을온도변화에따라 1 회반복싸이클을 3 회및최종숙성단계인 4 단계로나누 고품질흑마늘생산조건의최적화및 이에기초한대량생산공정확립 - 고품질흑마늘생산 을위한기초공정차이에따른성분 비교여부 - 흑마늘의유효성분의함량을최적화할 수있는공정확립여부 100 고각단계마다시료를채취하고이화학적성분의변화를비교하였음. 숙성이진행됨에따라조직감은숙성이진행됨에따라수분함량의감소와더불어증가하였 고, ph 도점차산성화되었으며, 산도, 당도, 총당및환원당등의탄수화물의함량은증가하 였음. 최종숙성 4 단계에서유효성분의함량이가장 높은통마늘로제조한흑마늘에서총페놀화합물은약 4.6 배, total pyruvate 및 thiosulfinate 의함량은각각 2.2 배및 25.1 배가증가하였음. 본연구결과를종합하여유효성분의함량이 유의적으로높은통마늘을최적의전처리형태로확정하고최적숙성온도조건을설정하였 음. 개발기술에기반한상품화추진및 지적재산권확보 - 지적재산권확보여부 100 연구결과로설정된조건에따라제조된흑마늘 을상품화하였음 흑마늘의제조및이를이용한 2 차개발상품 에대한지적재산권을확보하고자관련실험을실시한결과를활용하여특허출원하였음. - 267 -

-2 차년도 세부연구목표 평가착안점 달성도 (%) 연구개발수행내용 흑마늘을이용한제품을개발하기위해지역내시판흑마늘 4 종의특성을비교하였음. 남해산시판흑마늘의생리활성비교 분석 - 남해산시판흑마늘제품의특성및 생리활성비교여부 100 총 pyruvate, thiosulfate 함량은 B 제품, 총페놀및플라보노이드함량은 A 제품에서우수하 였음. DPPH, ABTs, hydroxyl 및 nitric oxide 라디칼 소거활성은 A 및 B 제품이유사한범위로 C, D 제품보다활성이높았음. 1 차년도결과에서설정된흑마늘과개똥쑥추 출물의혼합비율을이용하여실험동물용트레드밀에서흰쥐를운동시킴으로써생체내산화 강제운동 부하시 흑마늘과개똥쑥추출물의 in vivo 상 에서생리활성및적정섭취량분석 - 실험동물을통한 강제운동흑마늘과 부하시개똥쑥 추출물의급이에따른생리활성의비교 여부 100 적스트레스를발생시키고, 흑마늘과개똥쑥추출혼합물을급이하여시료의 in vivo 활성 을측정하였음. 4 주간동물실험수행후식이섭취량, 혈액및 간조직의지질성분변화, AST 및 ALT 활성, 항산화활성, 지질과산화물의생성, 생체내항 산화효소활성등을측정하여흑마늘과개똥쑥의각추출물과비교하였음. - 일일적정섭취량의산출여부 흑마늘과개똥쑥추출혼합물을 rat 에대해섭취량을성인체중 60 kg 을기준으로 100, 200 400 ml/ 일을섭취하도록환산하여급이한후산화적스트레스에대한이들혼합물의적 정섭취량을분석한결과 200~400 ml/ 일범위에서항산화활성및항산화효소활성이우수 하였음. 흑마늘과개똥쑥추출혼합물을바탕으로하여개발된제품을동일한조건에서산화적스트레 흑마늘과개똥쑥추출물을베이스로 한개발제품의 in vivo 생리활성평가 - 개발제품에대한생리활성의비교여부 100 스에대한생리활성을측정하였음. 성인체중 60 kg 에대해 300 ml/ 일의개발제 품급이군은대조군 ( 비섭취군 ) 에비해항산화활성, 지질과산화물함량및항산화효소활성 에유의적인증가를보였음. 흑마늘에개똥쑥을혼합함에따라흑마늘의활 성에시너지효과가있음이확인됨. 흑마늘과개똥쑥함유 - 시제품제조를위한 1 차년도연구결과를활용하여음료베이스인흑마늘과개똥쑥추출물의혼합비율을확정하 시제품의제조배합비설정 시료의배합비설정여부 100 고, 관능평가를통해음료의최종배합비를확정함 ( 흑마늘추출물 : 쑥추출물 : 배추출농축액 : 결정과당, 90.2:6.8:2:1). - 268 -

세부연구목표 평가착안점 달성도 (%) 연구개발수행내용 고형분함량, ph, 산도를측정하여개발시제품의기초품질기준을설정하였음. 개발시제품의영양성분분석 - 시제품의영양성분확인및품질기준 설정여부 100 개발된음료중총페놀화합물, 플라보노이드, 유리당및유기산함량을측정함으로써개발 음료의주요영양성분의특성을분석하였으며, 유리당은 fructose 와 glucose 가검출되었고, 유 기산은 7 종으로총 217.7 mg/100 g 이었음. 개발음료자체의진한색으로인하여직접적 인항산화활성시험이불가능하여증류수로 10% 미만의농도로희석하여항산화활성을 개발시제품의항산화활성분석 - 시제품의항산화활성평가여부 100 측정하였음. DPPH 와 ABTS 라디칼소거활성및환원력, FRAP 법에의한항산화활성, Fe +2 chelating 활 성은시료의농도가높아질수록유의적으로활 성이증가되었음. 개발음료의항산화활성이외의생리활성규명을위하여아질산염소거활성, α-glucosidase 및 xanthine oxidase 저해활성을분석하였으며, 시료의농도증가에따라활성이증가되었음. 개발시제품의생리활성및면역활성 검증 - 시제품의면역활성평가여부 100 CCK-8 assay 를통하여 Raw 264.7 세포를이용한면역활성평가를위한시료의희석농도를 1, 2, 5, 10, 20% 로설정하였음. LPS 처리된 Raw264.7 세포에서 NO 생성율 및 cytokine IL-1β 와 TNF-α 의농도측정을통하여평가한농도별음료시제품의면역활성 은시료의농도증가에따라상승하였음. 연구성과를활용한 지적재산권확보 - 지적재산권확보 여부 100 1 세부과제와 1 협동과제의연구성과를종합하 여특허출원함. 개발시제품을 2012 년 4 월중남해군관광객 개발음료의소비자 선호도조사 - 소비자선호도조사 여부 100 250 명을대상으로남해마늘과흑마늘에대한인지도, 개발음료의맛과향미에대한선호도 및상품시장성에대한설문조사를실시하였으며, 여성층의선호도가높고상품시장성좋다 는반응을얻었음. 개발음료의 생산공정개발 대량 - 대량생산공정개발 여부 100 1 차년도연구결과에따라설정된추출조건과 2 차년도연구결과를통해제 1 협동과제에서 제시한결과를종합하여기업에서활용할생산공정을개발하였음. 개발음료의상품화를 위한포장디자인개발 - 포장디자인개발여부 100 흑마늘과쑥을혼합한음료의제품명은 오천년애 로하고, 기존제품생산라인에적합한 병음료로제조하기위하여포장디자인을확정하였음. - 269 -

-3 차년도 세부연구목표 평가착안점 달성도 (%) 연구개발수행내용 흑마늘과개똥쑥의복합조성물제조를 위한천연식물류의선정 - 천연식물류의선정 여부 100 면역활성강화를위한복합조성물제조재료를 선정하기위하여 82 건의문헌조사를통해 100 여종의식물체중사용빈도가높은 11 종 ( 구기 자, 황금, 오가피, 감국, 산약, 작약, 단삼, 뽕잎, 생강, 생황버섯, 옥수수수염 ) 을선정하였음. 복합조성물을이용한개발음료의 in vitro 에서생리활성평가 - in vitro 에서생리활성평가항목의적합성 100 제 1 협동과제에서선정한 5 종의천연식물류조 성물과흑마늘과개똥쑥추출물이첨가된음료조성물을제조하여실험하였음. 페놀과플라보노이드화합물의함량, 항산화활성 (DPPH, ABTS 라디칼소거능, FRAP 법에의한환원력, Fe +2 chelating 활성을평가한결과흑마늘복합물에개똥쑥을혼합하였을때가장 활성이높았음. 트레드밀을이용하여 5 주간강제적으로간헐적인운동부하를가한흰쥐에흑마늘과천연식물 류 5 종을혼합한복합조성물을급이하고, 관련인자를분석하였음. 복합물의급이농도가높을수록혈청내총단백질함량이높았으며, 글로불린함량은정상군 복합조성물을이용한 과비슷한수준으로회복되었음. ALT 와 AST 활성은흑마늘복합물급이군이 개발음료의흰쥐에대한강제운동부하 - In vivo에서생리활성평가항목의 100 정상군보다유의적으로낮은수준까지감소되었음. 시 in vivo 에서생리활성평가 적절성 혈청내지질성분은흑마늘복합물의농도가높을수록효과적으로개선되었으며, 이는간조 직에서동일한경향이었음. 혈청지질과산화물의함량은흑마늘복합물의 급이농도에따라유의적인차이가있었으나간조직에서는유의차가적었음. 운동부하에따른 catalase, SOD, GSH-px 활성은흑마늘복합물의농도가높을때유의적으 로그활성이높았음. 제 1 세부과제에서선정한 11 종의시료를대상으로열수추출물을제조하고, 총페놀화합물과 천연식물류조성물선정을위한생리활성 - 선정식물류의활성검증및최종대상 100 플라보노이드함량을측정한결과상황버섯에서가장높은함량이었음. 스크리닝 시료선정여부 항산화활성과 Raw264.7 세포에서 NO 생성억제활성이우수한황금, 상황버섯, 단삼, 뽕잎, 작약의 5 종을선정하였음. - 270 -

세부연구목표 평가착안점 달성도 (%) 연구개발수행내용 천연식물류조성물 의품질특성분석 복합조성물함유바이오식품의품질특 성및생리활성연구 흑마늘, 개똥쑥및 천연식물추출물함유시제품의소비자 선호도조사 개발시제품의유통 기한설정및상품화추진 대량생산공정확립 - 선정식물류의주요영양성분분석여부 100 - 효율적인추출방법 선정여부 - 추출물의다양한 생리활성검증여부 - 소비자선호도조사여부 100 100 - 유통기간설정여부및상품화추진여부 100 - 대량생산공정도 확립여부 100 상품화 2 종 - 상품화여부 100 천연식물류 5 종의주요성분인유리당과유기산을분석하고항산화활성과면역활성을비교함. 유리당은 3 종이검출되었으며, 황금과작약에서 sucrose 의함량이높았으며 fructose 나 glucose 함량은시료간의차이가적었음. 천연식물류중뽕잎추출물의총유기산함량 이가장높았고, 다음으로작약추출물이었음. 5 종의천연식물류혼합물의생리활성검증결과 α-glucosidase 활성은 5 종을추출하여동량으 로혼합한시료보다혼합후추출한시료에서활성이더높았음. Xanthine oxidase 저해활성은추출방법에따른유의적인차이는없었음. DPPH, ABTS, superoxide anion 라디칼소거활성은시료를혼합하여동시추출할때더활성 이높았음. Fe +2 chelating 활성은개별추출물을혼합한 시료에서, 환원력은시료혼합물을동시추출하였을때활성이더높았음. Raw264.7 세포를이용하여 NO 생성능, cytokine 생성을통해면역활성을평가한결과 추출방법에따른활성의차이는없었음. 이상의연구결과와시료제조법의효율성을 고려할때선정된재료를모두혼합하여동시추출하는방법이더효율적임을확인하였음. 개발시제품인오천년애프리미엄을 2013 년 4 월중남해군의관광객 250 명을대상으로개발 음료의맛과향미, 제품의선호도, 시장성에대한설문조사를실시한결과 40 대남성에서선 호도가가장높았고여성은시장성이좋다에응답자가많아시장성이좋을것이라는결과를 얻었음. 개발시제품중오천년애프리미엄의유통기간은유사제품을검색한결과에기반하여차광유 리병으로외부의공기와차단이되고성상에변화가없어유통기한을제조일로부터 1 년으로 선정하였음. 주관기관및제 1 협동의연구결과에근거하여흑마늘음료오천년애프리미엄및오천년애 파워 2 종의대량생산공정도를확립하였음. 흑마늘음료는오천년애프리미엄및오천년애골드로 2 종류로네이밍하고제품디자인한후 상품화추진을하였으며, 타블렛제품으로오천년애파워에대한포장디자인을확정하여상 품화를추진하고자함. - 271 -

제 5 장연구개발성과및성과활용계획 제 1 절연구개발결과의활용방안 1. 특허, 논문등의지식재산권확보 흑마늘및저점도흑마늘고농축액제조방법 특허 1건이현재출원중에있으며, 이를근거로하여흑마늘과쑥의생리활성을분석한연구결과에따른 흑마늘과개똥쑥을이용한면역증강용음료의제조방법, 항산화효능을가진흑마늘과쑥혼합음료의제조방법 특허로특허 1건, 출원 1건이있으며, 국내연구논문 8편투고, 학계세미나발표 10건이완료된상태이며, 연구논문 1편이게재예정 (2013년 7월, 생명과학회지 ) 이며, 그외연구논문이투고준비중에있음. 2. 천연물소재를활용한기능성제품의개발생리활성이알려진흑마늘과쑥을이용하여기능성식품의제조에있어서생리활성이우수한천연식물류를첨가하므로써기능성및기호성을향상시킬수있었으며, 기존의흑마늘단일음료에비해항산화및면역활성증진효과를얻을수있을것으로예상되므로향후생리활성을발현할수있는제품으로서보다안전하고, 기능성이확보된상품으로활용할수있음. 3. 지역특화작물을활용한가공품의다변화및시장확대에기여생마늘및흑마늘의단일소재에치중하고있던기존의마늘가공품에대하여쑥을비롯한천연식물류를첨가하여, 기능성이향상된다변화된제품의개발이가능해질것으로확인하였음. 본과제를통하여건강기능식품시장개척을위한새로운마늘가공품의개발과품질및기능성을규명하였음. 나아가, 항산화활성과함께면역활성에대한연구결과를토대로현대인의만성적인스트레스를방어할수있는기능성식품으로제품의다변화가기대되며, 타켓소비층을확대할수있는새로운마늘가공품의상품화를위한자료로활용하고자함. 4. 개발기술의기업이전본연구의참여기업이가공공정개발, 대량생산공정확립, 시장성확인에적극참여함으로써기개발된기술의기업활용이용이하며, 이를기반으로기업은상품화를위한연구개발경쟁력을확보함으로써개발기술을적극적으로활용한새로운가공품의상품화가가능하며, 나아가지역경제활성화에도기여할것임. 5. 참여기업의제품개발및홍보자료로활용 참여기업은흑마늘음료제품을주로생산하는기업으로서본과제를통하여개발된제품 - 272 -

으로기능성이향상된흑마늘음료를상품화하기위한계획을가지고있으므로, 본과제의결과를상품화를위한주요자료로활용될것임. 흑마늘제품에천연식물의생리활성을부가한기능성음료로개발하여제품홍보에활용하고병음료는국내흑마늘가공품시장에신수요를창출하고, 타블렛제품은해외시장개척용중점상품으로육성하여국내외시장개척에활용함. 제 2 절기대성과 1. 여러연구결과로부터기능성과안정성이입증된흑마늘에생리활성이인지된쑥을비롯한천연식물류를첨가하여개발하므로써마늘의강한자극취를완화시켜기호성이향상되었으며, 흑마늘단일제품에비해기능성이강화된제품으로써기능성과기호측면에서확연히차별화된제품으로부각될가능성이높음. 2. 기존의생마늘과흑마늘제품에대한인지도와쑥및천연식물류 ( 황금, 상황버섯, 단삼, 뽕잎, 작약 ) 에대한인지도로인하여기존흑마늘제품에대한건강식품으로서의이미지구축이유리할것으로판단되며, 과학적연구결과에의한제품의효능규명은소비자로부터신뢰를확보할수있는주인자로작용하여신수요창출이가능한바이오푸드가될것으로기대됨. 따라서기존의흑마늘과차별화된고품질흑마늘개발과개똥쑥혼합제품의지적재산권확보로기업의기술경쟁력확보와상품화기간단축및비용절감이예상됨. 3. 흑마늘, 개똥쑥및천연식물추출물을함유한항산화및면역증진효능이있는복합조성물의제조와제품개발로출원된특허와연구보고는본과제에서개발된제품의홍보및이미지제고에기여하여기존제품과차별화된마케팅전략용자료로써의활용이가능함. 또한마늘과쑥은단군신화에서부터같이등장한식품으로두식품에기초한제품의개발은제품의효능증진뿐만아니라홍보및마케팅에서도시너지효과를창출할것으로기대됨 4. 최근지속적인유행성질환의만연으로인해면역력증진에대한관심이높아자가면역을증진시킬수있는식품의요구가증가하고있는데, 본연구과제결과는 invitro 뿐만아니라동물실험을통한 in vivo 실험결과에기초하여개발된제품으로기존의흑마늘제품과건강기능식품간의틈새시장을새로이개척하는효과뿐만아니라흑마늘개발제품의판매시홍보효과를증진시킬수있을것으로판단됨. 또한생체내유해물질에대한 1차방어기작을강화할수있는제품으로산업화함으로써국민건강증진에기여함과동시에마늘의건강증진기능성을부각시킨마케팅으로추진가능성이높으며, 국내신수요창출및해외시장개척에용이함. - 273 -

제 3 절연구성과 1. 특허성과 출원된특허의경우 특허등록의경우 출원연도특허명출원인출원국출원번호출원연도특허명출원인출원국출원번호 2011 흑마늘및저점도흑마늘고농축액제조방법 남해보물섬마늘영농조합법인 대한민국 10-2011- 0030967 2011 흑마늘과개똥쑥을이용한면역증강용음료의제조방법 ( 재 ) 남해마늘연구소 대한민국 10-1028155 2012 항산화효능을가진흑마늘과쑥혼합음료의제조방법 남해보물섬마늘영농조합법인 대한민국 10-2012- 0027252 2. 논문게재성과 게재연도 논문명 저자 주저자교신저자공동저자 학술지명 Vol.(No.) 국내외구분 SCI 구분 2011 개똥쑥의영양적특성 및생리활성 류지현성낙주 김라정이수정김인수이현주 한국식품영 양과학회지 40(2) 국내비 SCI 2011 개똥쑥의항산화및항 암활성과기능성물질의 탐색 류지현성낙주 이수정김미주신정혜강신권조계만 한국식품영 양과학회지 40(4) 국내비 SCI 2012 시판흑마늘의항산화 및 N- nitrosodimethylamine 의생성억제 차지영성낙주 이수정신정혜 농업생명 과학연구 46(2) 국내비 SCI 2012 반응표면분석을이용한흑마늘과개똥쑥혼합음료개발을위한추출조건의최적화 강재란 성낙주 이수정황초롱신정혜강민정 농업생명 과학연구 46(2) 국내비 SCI - 274 -

게재연도 논문명 저자 주저자교신저자공동저자 학술지명 Vol.(No.) 국내외구분 SCI 구분 2012 국내산품종별쑥의생 리활성 김라정신정혜 황초롱강민정정우재 생명과 학회지 22(6) 국내비 SCI 2012 반응표면분석을이용한흑마늘의항산화활성최적화를위한추출조건확립 강재란 성낙주 이수정권효진권민혜 한국식품저장유통학회지 19(4) 국내비 SCI 2013 반응표면분석에의한개똥쑥의항산화활성을위한최적추출조건확립 이수정 성낙주 강재란김정균강신권 농업생명 과학연구 47(2) 국내비 SCI 흑마늘및개똥쑥추출물 2013 의급이가강제운동시흰쥐의체내지질성분및간조직의항산화효소 강재란 성낙주 이수정황초롱김인성 한국식품영 양과학회지 42(6) 국내비 SCI 활성에미치는영향 2013 항산화및면역활성증 강을위한생약재의탐색 이수정성낙주 신정혜이혜진탁현민강민정 생명과 학회지 23(7) 국내비 SCI 3. 학술발표성과 발표날짜 논문명 저자 주저자 교신저자 공동저자 학술대회명 국내외 구분 Physicochemical properties and 강재란 biological activity of 2010-10-21 gaeddongssuk(artemisia annua 류지현 - 김라정신정혜 2010 한국생명과학회국내 L.) 성낙주 Antioxidant and acticancer 2010-10-27 activities of gaeddongssuk (Artemisia annua L.) 류지현 - 김라정황초롱이수정성낙주 한국식품영양과학회 2010 International Symposium and Annual Meeting 국내 Optimization of high temperature water extraction conditions for antioxidant 2011-06-09 properties of black garlic and Gaeddongssuk composite by response surface 강재란 - 이수정권효진신정혜강민정성낙주 2011 Annual Meeting of Korean Society of Food Science and Technology Food Bioscience: Promise&Challenges in the Future 국내 - 275 -

발표날짜 논문명 저자 주저자 교신저자 공동저자 학술대회명 국내외 구분 2011 Immune cell activities from 2011-11-01 artemisia of five species 김윤아 - 김라정신정혜강민정성낙주 한국식품영양과학회 40th Anniversary Functional Fusion and Systemic Approaches 국내 to Future Foods Optimization of the extraction condition for antioxidative components of Gaeddongssuk 2011-11-01 (Artemisia annua L.) by response surface methodology 강재란 - 이수정권효진권민혜정보영성낙주 2011 한국식품영양과학회 40th Anniversary Functional Fusion and Systemic Approaches to Future Foods 국내 Optimization of ethanol extraction conditions for 2011-11-01 high-functionality of black garlic by response surface methodology 권민혜 - 이수정강재란권효진문수경성낙주 2011 한국식품영양과학회 40th Anniversary Functional Fusion and Systemic Approaches to Future Foods 국내 Effect for supplementation of black garlic and Gaeddongssuk (Artemisia annua L.) 2012-11-02 composites on the hepatic lipid profiles and antioxidative 권효진 - 이수정강재란권민혜성낙주 2012 KFN International Symposium and Annual Meeting 국내 defense system Supplementation effect of black garlic and Gaeddongssuk 이수정 2012 KFN International 2012-11-02 (Artemisia annua l.) on blood 권민혜 - 강재란 Symposium and Annual 국내 components in rats run on 권효진 Meeting treadmill The effect of black garlic 2012-11-02 extract on lipid metabolism in immobilization stressed rats 신정혜 - 강민정정성훈김경민황초롱 2012 KFN International Symposium and Annual Meeting Effects of black garlic and 2012-11-02 mugwort extract on the restraint stress in rats 강민정 - 신정혜정성훈윤환식 2012 KFN International Symposium and Annual Meeting 국내 - 276 -

4. 학위논문성과 발표연도논문명저자학위명 2011 개똥쑥의생리활성과기능성물질의탐색류지현석사 흑마늘및개똥쑥추출물의투여가강제운 2012 동을한흰쥐의지질조성및항산화계에미 치는영향 강재란 석사 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 - 해당사항없음 제 7 장연구시설 장비현황 - 해당사항없음 제 8 장참고문헌 Ali M, Thomson M. 1995. Consumption of a garlic clove a day could be beneficial in prevention thrombosis. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 53: 211-212. Allessio HM. 1993. Exercise-induced oxidative stress. Med Sci Sports Exerc 25: 218-224. An BJ, Lee JT, Bae MJ. 1998. Isolation of a novel polyphenol from oolong tea and its effective prevention of the gout. Korean J Food Sci Technol 30: 970-975. An CS, Choi SY, Jin HL, Jeon YH, Hur SJ, Kim IH, Park GD, Jeoung YJ, Lim BO. 2009. Immunomodulatory effects of Phellinus linteus extracts on liver damage induced by carbon tetrachloride in rats. Korean J Medicinal Sci 17: 217-222. Ashok Kumar BS, Lakshman K, Nandeesh R, Arun Kumar PA, Manoj B, Kumar V, Sheshadri Shekar D. 2011. In vitro alpha-amylase inhibition and in vivo antioxidant potential of Amaranthus spinosus in alloxan-induced oxidative stress in diabetic rats. Saudi J Biol Sci 18: 1-5. Azuma K, Nasayoshi M, Koshioka M, Ippoushi K, Yamaguchi Y, Kohata K, Yamauchi Y, Ito H, Higashio H. 1999. Phenolic antioxidants from the leaves of Corchorus olitorius L. J Agric - 277 -

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