380 Kwak et al. 며, 맥주를마셨을때혈장의요산이증가한다는사실이일찍부터보고되어있었다 (Gibson et al., 1984). 또한와인등다른주류들은통풍과중간혹은낮은위험수준으로연관되어있는반면, 맥주는통풍과높은위험수준으로연관되어있다는연구결과도보고된바있다 (Lee,

Korean Journal of Microbiology (2018) Vol. 54, No. 4, pp. 379-383 pissn 0440-2413 DOI https://doi.org/10.7845/kjm.2018.8055 eissn 2383-9902 Copyright c 2018, The Microbiological Society of Korea 발효온도에따른맥주의퓨린함량분석 곽희재 김수경 이병섭 리시후이 이준희 * 부산대학교약학대학약학과미생물학연구실 Analysis of purine content in beer according to fermentation temperature Hee-Jae Kwak, Soo-Kyoung Kim, Byung-Seop Lee, Xi-Hui Li, and Joon-Hee Lee* Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Pusan National University, Busan 46241, Republic of Korea (Received August 10, 2018; Revised September 6, 2018; Accepted September 13, 2018) Beer is the most popular alcoholic fermentation product, but its high purine content has been known to be associated with hyperuricemia and gout. In this study, we examined whether the purine content of beer could be lowered by changing the fermentation temperature during beer-brewing. We brewed beers at different temperatures, 10 C and 20 C, that are two typical beer-brewing conditions for bottom- and top-fermentation, respectively, and the contents of the representative purines, adenine, guanine, and xanthine in each beer were measured by high performance liquid chromatography. As a result, the total purine content of the beer fermented at 10 C was lower than that of fermented beer at 20 C. Especially, the content of adenine was lowered significantly. Keywords: beer, fermentation, fermenting temperature, purine, yeast 통풍 (gout) 은체내요산 (uric acid; 2,6,8-trioxypurine; C 5H 4N 4O 3) 의축적으로인해발생하는관절염의한형태로, 심한통증을유발하는질병이다 (Chen and Schumacher, 2008). 요산, 보통 monosodium urate 결정이축적된관절부위가붓고, 발적되며, 급성의경우가장흔하게엄지발가락의발허리발가락관절 (first metatarsophalangeal joint; 1 st MTP) 에발생하고, 발목이나무릎에서도발생할수있다 (Jun et al., 2010; Rymal and Rizzolo, 2014; Ragab et al., 2017). 요산은동물에서퓨린의마 *For correspondence. E-mail: joonhee@pusan.ac.kr; Tel.: +82-51-510-2821; Fax: +82-51-513-6754 지막대사산물로생성된다. 퓨린은 C 5H 4N 4 의헤테로고리형태의방향족유기화합물로, 자연계에퓨린분자자체는많이존재하지않으나그유도체는매우풍부하게존재하며생명체에서매우중요한역할을한다. 특히핵산은퓨린계열염기와피리미딘계열염기로나누어지며, adenine과 guanine이퓨린계열염기이다. 또한퓨린유도체는 NAD, FAD 등의조효소의구성성분으로도존재한다. 퓨린은몸밖으로배출되기위해요산으로변환되는데, 이때생성된요산은대부분동물에서는 uricase (urate oxidase) 에의해다시요산보다수용성이강한 allantoin으로변환되어신장을통해배출된다 (de Oliveira and Burini, 2012). 그러나사람은 uricase 결핍때문에다른동물에비해요산농도가높다 (de Oliveira and Burini, 2012). 생성된요산의 2/3는신장을통해서, 나머지는장을통해배설된다고알려져있다 (Ragab et al., 2017). 요산이축적되는원인에는유전적혹은식습관적요인에의해체내에서요산이과다생성되는것도있지만, 생성된요산이잘배출되지않아서생기는경우가더많다 (Chen and Schumacher, 2008; de Oliveira and Burini, 2012). 따라서유전적인요인이없는일반인의경우요산을과다생성시키거나, 요산배출을억제하는성분의음식을섭취하였을때통풍에잘걸릴수있는데, 알코올은체내에서이러한작용을하여통풍을악화시키는대표적성분으로알려져있다 (de Oliveira and Burini, 2012). 많은알코올음료중에서도가장대중적인술인맥주는알코올을함유하고있으면서퓨린함량또한높아고요산혈증과통풍을발생시킬수있다고생각되어왔으

380 Kwak et al. 며, 맥주를마셨을때혈장의요산이증가한다는사실이일찍부터보고되어있었다 (Gibson et al., 1984). 또한와인등다른주류들은통풍과중간혹은낮은위험수준으로연관되어있는반면, 맥주는통풍과높은위험수준으로연관되어있다는연구결과도보고된바있다 (Lee, 2011; Rymal and Rizzolo, 2014). 맥주는 Saccharomyces cerevisiae 효모의발효를이용하여만드는발효주중하나로, 그제조방식은크게두가지로나눌수있다. 첫번째는 15~25 C에서발효하는상면발효방식을이용한에일맥주이고두번째는 5~15 C에서발효하는하면발효방식을이용한라거맥주이다. 이렇게발효온도에따라맥주의맛과풍미, 알코올함량등이달라지기때문에, 발효온도는맥주제조시매우중요하면서도조절가능한요소이다. 따라서같은원료와효모를사용해만든맥주라도발효온도에따라고요산혈증및통풍과관련된퓨린의함량에차이가날수있다. 본연구에서는이러한맥주발효의가장중요한조건중의하나인온도를달리함으로써맥주의퓨린화합물함량을낮출수있는지를조사하였다. 재료및방법 맥주제조미스터비어사의아메리칸에일비어리필원액을사용하여, 제조사에서제공하는맥주발효방법에따라독립적으로 2회맥주를제조하였다. 맥주제조는크게알코올발효가일어나는 1차발효, 탄산을생성하기위한 2차발효, 저온숙성과정인라거링 (largering) 의 3단계로진행되었다. 첫번째맥주제조에서는미스터비어해당제품에서제공하는에일용효모 (Safale s-04) 를사용하여각각 20 C, 10 C에서 1, 2차발효를진행하였는데, 20 C에서는발효가빠르게진행되어총 2주간발효를진행하였고, 10 C에서는발효가느려총 5주간발효를진행하였다. 이후라거링은동일하게수행하였다. 두번째맥주제조에서는라거맥주발효용으로쓰이는효모인 Saflager s-189를사용하였으며, 다른모든조건은첫번째맥주제조때와동일하게진행하였다. 기성맥주로는국산맥주 3종과외산맥주 1종을구매하여동일한방법으로시료를준비하였다. 맥주시료준비맥주시료는크게 gas dissolving, hydrolysis, neutralization 의세단계를거쳐준비되었다. 먼저정확한채취를위해맥주용기를열고곧바로 8 mol/l KOH를넣어 gas를 dissolving 시켰다. 여기서맥주 4.5 ml을채취한후 70% perchloric acid (PCA) 500 µl를넣고 100 C에서 1시간가열하여맥주에들어있는 nucleoside, nucleotide, nucleic acid들을각각해당퓨린으로 hydrolysis 시켰다. 여기에다시 8 mol/l KOH 1,000 µl를넣고 5분간얼음에서중화시킨후, 0.2 µm 필터로여과하였다. 이렇게얻어진시료를동결건조를통해농축하였다. High performance liquid chromatography (HPLC) 를이용한퓨린함량분석 위에서준비된시료 20 µl를취하여 HPLC 에주입하였다. HPLC 펌프와 detector는각각 Shimadzu사의 LC-20AT와 SPD-20A 를사용하였으며, 분리를위한 column으로는 ThermoFisher Scientific 사의 Hypersil ODS C18 HPLC column [4.6 mm diameter (metric) 200 mm length (metric)] 을사용하였다. 퓨린분석을위한 HPLC에서는 flow rate이 0.5 ml/min, detection을위한파장은 270 nm, 이동상으로는 methanol을사용하였다. 퓨린에대한 standard 로는 adenine (DAEJUNG; www.daejungchem. co.kr), guanine (Sigma-Aldrich; https://www.sigmaaldrich.com), xanthine (ACROS ORGANICS; https://www.acros.com) 을사용하였으며, 정량을위해각기다른양을 HPLC에주입하여 peak을얻고, 주입한양과 peak 영역의면적으로부터상관관계를구하는외부표준법 (External standard method) 을사용하였다. 유의성분석 통계적유의성을위해서데이터는마이크로소프트사의 MS office Excel을사용하여 student s t-test (two-sample assuming equal variances) 방법으로분석되었다. P-value가 0.05보다낮으면유의한것으로판단하였다. 맥주발효 결과및고찰 맥주를제조하는대표적방식인하면발효와상면발효를위한두온도인 10 C와 20 C에서각각맥주를직접발효하였다. 일반적으로는상면발효와하면발효에서다른종의효모를사용하지만, 본연구에서는발효온도이외의조건은모두동일하게하기위하여발효를위한효모도동일한종을사용하였다. 미생물학회지제 54 권제 4 호

Fermentation temperature and purine content in beer 381 첫번째맥주제조에서는에일제조용으로사용되는효모 (Safale s-04) 를사용하였는데, 이효모종은 18~24 C 정도가최적발효온도로알려져있으나, 10 C에서도발효가가능하였다. 다만저온으로인해발효기간은훨씬길어서 1, 2차발효를통틀어 20 C 발효의경우 2주가소요되었으나, 10 C 발효의경우 5주가소요되었다. 효모종에의한차이를배제하기위하여두번째맥주제조에서는저온발효에서주로사용되는효모 (Saflager S-189) 를사용하였다. 이효모종은다양한종류의라거및필스너맥주의발효에사용되며, 9~22 C 정도의온도범위에서발효에이용될수있고, 12~15 C 범위에서가장잘발효를하는것으로알려져있다 (https://www.northernbrewer.com/ products/saflager-s-189). 두번에걸친맥주제조에서맥주원액, 발효양, 발효조등기타조건은모두동일하였으며, 제조된맥주는발효온도에따른풍미의차이는있었으나, 두번의시행에서의차이는미미하여, 식품으로써시음을했을때일반적으로인식될수있는수준에서빛깔, 도수, 탄산의양에큰차이가없이유사하게제조되었다. 에서발효한맥주의경우 110.4 ± 17.1, 108.2 ± 4.7, 15.35 ± 14.1 μmol/l로측정되었다 (Fig. 3). 이는낮은온도에서발효시킨맥주에서전체적으로적은양의퓨린화합물이검출되었음을의미하는것으로, 특히 adenine의양이많이감소하였음을나타내는결과이다 (41.2% 감소 )(Fig. 3). 총퓨린양은 20 C 발효에서는 328.7 ± 9.8 μmol/l로, 10 C 발효에서는 233.9 ± 1.6 μmol/l로측정되어, 저온발효에서총 28.8% 가감소함을알수있었다 (Fig. 3). 본연구에서는 1차맥주제조와 2차맥주제조때사용효모를달리하였는데, 효모의차이에의한퓨린함량의변화는크지않았다 (Table 1). (A) 수제맥주속퓨린화합물들의정량 먼저 HPLC 방법을이용하여주요퓨린성분인 adenine, guanine, 그리고 xanthine의 peak 위치를확인하였다 (Fig. 1A). 다음두가지다른온도에서제조한수제맥주로부터일정량의시료를취하여 gas dissolving, hydrolysis, neutralization 등세단계의전처리를수행하고농축하였는데, 이때 PCA를이용한 hydrolysis 과정에서맥주에들어있는 nucleoside, nucleotide, 그리고 nucleic acid 등으로부터각염기들이해당퓨린으로유리된다 (Kaneko et al., 2009). 이렇게얻어진맥주농축시료를 HPLC에주입하여분리한후, 앞에서얻어진 adenine, guanine, 그리고 xanthine의기준 peak과위치를비교하여분리된각 purine 화합물의 peak을확인하였다 (Fig. 1B and C). 10 C와 20 C에서발효된맥주시료에서이들퓨린 peak들을비교해보았을때, 특히 10 C 발효맥주에서일부퓨린 peak들이감소해있음을알수있었다 (Fig. 1C). 이를보다정량적으로측정하기위해서외부표준법 (External standard method) 을수행하였다. 먼저일정한양의 adenine, guanine, xanthine을 HPLC에주입하여, 각물질의 peak 면적과주입한양사이의상관관계를보여주는신뢰할만한기준직선을얻은후 (Fig. 2), 이를이용해맥주시료속의 adenine, guanine, xanthine의양을각각구하였다. 두차례제조한맥주시료들로부터이를반복하여평균을구하였을때, 20 C로발효한맥주의 adenine, guanine, 그리고 xanthine의양은각각 187.8 ± 0.6, 117.0 ± 3.4, 23.9 ± 5.8 μmol/l로측정되었고, 10 C (B) (C) Fig. 1. HPLC profile of standard purines and beer samples. (A) peaks for standard purines are indicated by arrows. Adenine (a) guanine (g) and xanthine (x). (B and C) the HPLC profiles of beer samples that were fermented at 20 C (B) and at 10 C (C). Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 4

382 Kwak et al. (A) (B) Table 1. Purine contents in the laboratory-brewed beers at two different temperature and commercial beers Adenine Guanine Xanthine Total 1 st, 20 C 187.4 114.6 19.8 321.8 1 st, 10 C 98.3 111.5 25.3 235.1 2 nd, 20 C 188.2 119.4 28.0 335.6 2 nd, 10 C 122.5 104.9 5.4 232.8 Domestic 1 145.1 77.2 1.0 223.3 Domestic 2 190.3 95.1 8.4 293.8 Domestic 3 171.4 93.2 44.5 309.1 Imported 155.9 84.1 32.9 272.9 (µmol/l) 수제맥주와시중맥주의 Purine 함량비교 (C) 이렇게얻어진수제맥주의퓨린함량을시중에판매되는기성맥주들과비교하기위해시중맥주들로부터동일한방법으로퓨린함량을측정하여보았다. 국산맥주 3종과외산맥주 1종에서퓨린양을측정해보았을때, 10 C 발효맥주는시중맥주들보다도 adenine의함량이의미있게낮았다. 그러나 guanine의양은약간높아서, 전체적으로총퓨린함량이낮기는하였으나통계적으로유의한차이는아니었다 (Table 1 and Fig. 4). 그러나이는기성맥주들이매우다양한방법과재료를가지고제조되기때문에편차가커서생기는문제라고판단되며, 직접맥주를제조할경우낮은온도에서발효시킬때퓨린함량을낮출수있다는결과와배치되지는않는다. 오히려본연구에서제조된수제맥주가기성맥주들과비슷한품질로제조되었음을확인해주는결과이며, 이러한조건에서온도에따라퓨린의함량이달라졌음을보여주었기때문에의미가있다. Fig. 2. Standards for purine quantification. (A) adenine, (B) xanthine, and (C) guanine. Fig. 3. Contents of purines in the beers fermented at two different temperatures. P-values, * < 0.05; ** < 0.001. Fig. 4. Comparison of purine contents with commercial beers. 4 commercial beers (3 domestic and 1 imported beers) were quantified for purine contents by HPLC in the same manner and the average was compared with the lab-brewed beers. P-values, * < 0.05; ** < 0.001. 미생물학회지제 54 권제 4 호

Fermentation temperature and purine content in beer 383 본연구에서얻어진결과를이전연구에서얻어진결과와비교해보면, 시중맥주를대상으로퓨린함량을조사한국내의한연구에서는 adenine이 10~30 μmol/l, guanine이 10~85 μmol/l, xanthine이 10~50 μmol/l 정도로조사된바가있었다 (Jun et al., 2010). 이연구에서는수입맥주와국산맥주사이에, 혹은브랜드간에의미있는차이는없었다고하였으며, 퓨린총량으로볼때국내맥주 77.6 ± 22.1 μmol/l, 외산맥주 78.3 ± 39.4 μmol/l로, 본연구에서측정한것에비해다소낮았다 (Jun et al., 2010). 그러나보다광범위하게다양한맥주에서퓨린의양을조사한외국의연구사례를보면, 맥주종에따라퓨린함량에큰차이가있긴하지만, adenine이대략 15~340 μmol/l, guanine이 60~500 μmol/l, xanthine이 20~500 μmol/l, 총퓨린양이 200~1,150 μmol/l 수준으로측정되어, 국내연구진의결과보다다소높게나왔는데 (Kaneko et al., 2009), 이는본연구에서의측정결과와비슷한수준이었다. 본연구에서는맥주의퓨린함량이발효온도에따라달라질수있고, 10 C와같이저온에서발효시킨맥주가 20 C에서발효시킨맥주보다더적은양은퓨린을함유하고있음을확인하였다. 그러나왜저온에서발효시키면맥주의퓨린함량이낮아지는지는분명하지않다. 여러주류들중에서특히맥주가통풍과가장강한연관을보이기때문에, 여러그룹에서는맥주의퓨린양을정량한바있고, 그결과다른알코올음료에비해맥주의퓨린함량이높게측정된바있다 ( 맥주, 42.3~ 146.4 μm; 약주, 8.2~40.4 μm; 막걸리, 11.7~24.7 μm; 소주, 미검출 )(Jun et al., 2010). 따라서고요산혈증과통풍위험이있는사람들은가급적맥주를마시지않는것이좋겠으나, 가정에서직접맥주를만들어마신다면저온에서발효시킨맥주를마시는것이도움이될것이라생각된다. 앞으로맥주를보다다양한온도조건에서발효시킨후퓨린성분의함량을조사해본다면, 맥주의풍미이외에도퓨린화합물의양을낮추어고요산혈증과통풍관리에도움을줄수있는기능성맥주를생산할수있는데도움이될수있을것이다. 최근수제맥주제조가많은관심을받고있는상황에서, 이러한연구는보다경쟁력있는새로운상품을만드는데도움이될것이라사료된다. 적요 맥주는가장대중적인알코올발효주이지만퓨린 (purine) 함량이높아고요산혈증및통풍발생과연관이있다고알려져있다. 본연구에서는맥주발효온도를달리함으로써맥주의퓨린함량을낮출수있는지알아보았다. 맥주제조의주된발효법인상면발효와하면발효에서주로사용되는 20 C와 10 C 온도에서맥주를발효한후, 각각에서대표적퓨린화합물인 adenine, guanine 그리고 xanthine들의함량을 high performance liquid chromatography 방법으로측정하였다. 그결과, 10 C 발효맥주가 20 C 발효맥주에비해총퓨린함량이낮았으며, 특히 adenine의함량이의미있게낮아져있음을확인하였다. 감사의말 이과제는부산대학교기본연구지원사업 (2년) 에의하여연구되었음. References Chen LX and Schumacher HR. 2008. Gout: an evidence-based review. J. Clin. Rheumatol. 14, S55 62. de Oliveira EP and Burini RC. 2012. High plasma uric acid concentration: causes and consequences. Diabetol. Metab. Syndr. 4, 12. Gibson T, Rodgers AV, Simmonds HA, and Toseland P. 1984. Beer drinking and its effect on uric acid. Br. J. Rheumatol. 23, 203 209. Jun JB, Na YI, Kim HJ, Kim SH, Park YS, and Kang J. 2010. Measurement of purine contents in Korean alcoholic beverages. J. Korean Rheum. Assoc. 17, 368 375. Kaneko K, Yamanobe T, and Fujimori S. 2009. Determination of purine contents of alcoholic beverages using high performance liquid chromatography. Biomed. Chromatogr. 23, 858 864. Lee YH. 2011. Measurement of purine contents in Korean alcoholic beverages. J. Rheum. Dis. 18, 1 2. Ragab G, Elshahaly M, and Bardin T. 2017. Gout: An old disease in new perspective - A review. J. Adv. Res. 8, 495 511. Rymal E and Rizzolo D. 2014. Gout: a comprehensive review. JAAPA 27, 26 31. Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 4