ISSN(print) 1226-512 23(1):11-18, March 218 < 초청논문 > http://dx.doi.org/1.14479/jkoos.218.23.1.11 A Evaluation of Biological Safety in Risk Management of Conventional Contact Lens Containing Phosphorylcholine Seung-Kwon Cho 1,2, *, Ji-Hoon Park 1, and Gyun-Tack Lim 1 1 Dept. of Polymer Engineering, Chonnam National University, Gwang-Ju 61186, Korea 2 Photo Newmaterial Research Center, Geo Medical Co., Ltd, Gwang-Ju 617, Korea (Received February 5, 218: Revised March 9, 218: Accepted March 14, 218) Purpose: The aim of this study is to evaluate the degree of cytotoxic response in terms of risk management by conducting in vitro cytotoxicity test as a part of securing the biological safety of soft contact lens containing phosphorylcholine (PC). Methods: A hydrogel-type soft contact lens was prepared from 2-HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate) as a representative of the basic skeleton of soft contact lenses, and PC as a derivative of phospholipid. As part of ensuring biological safety, the packaging and sterilization process was performed to evaluate the cytotoxicity test, and the test was conducted in the state of the finished product. The cytotoxicity tests were evaluated by extraction method (direct contact), growth inhibition test and agar diffusion test method. Results: In the extraction test method, The reagent control and negative control did not show cytotoxicity (Grade ) and the positive control showed cytotoxicity more than medium (>Grade 2). In qualitative analysis, 1% of Confluent monolayer, 1% of Growth inhibition, 1% of Cells without intracellular granulation, 1% of Rounding, 1% of Lysis and Reactivity of Slight were observed with Grade 1. The effluent of the substance may be said to have very weak reactivity to cultured cells. Cell viability was 16.8% for MTT, 1% for blank test, 2.4% for positive control, and 16.5% for negative control. No cell death or morphological changes were observed in the test group treated with the test substance after 24 hours of incubation by microscopic observation. In the agar diffusion test method, no discoloration zone was observed on the middle layer of the cells to which the test substance was administered, and no cell lysis was observed in the lower part of the specimen. Reactivity zone was not observed in the middle layer of the solvent control and negative control, and the positive control group had a reactivity zone of.5 cm or more as expected. Conclusions: The biological stability of hydrogel-type soft contact lenses consisting of PC and 2-HEMA was evaluated in terms of risk management in order to achieve the intended performance in the design development process. In addition, no cytotoxic substances have been eluted in the production of corneal epithelium, and no adverse effects due to irritation or immune response on the corneal surface are expected. Key words: Cytotoxicity, Phosphorylcholine, Soft contact lens 서론최근시력교정, 패션, 치료용그리고진단용등다양한목적으로사용되어지고있는콘택트렌즈는그사용인구가늘어나면서 [1] 상용화를위한시장진입전제품제조업자측면에서는그에대한안전성확보가가장우선적으로해결해야할과제이며이를위해국내외적으로관련규격에부합되도록해야한다. [2] 콘택트렌즈는국내외적으로의료기기 (Medical devices) 로분류되어있어서해당국의규정이나고시에따라인허가를득해야제품을시장에판매할수있다. [3] 의도된사 용을위해적절하게설계되어진의료기기인콘택트렌즈는사용하기위해안전 (Safe) 해야한다고규정되어있다. [3] 즉, 의료기기를사용할때사용자에게부작용을야기하는그어떠한해로운 (Harmful) 물질도노출되어서는안된다는의미이다. 제품을제조하는제조업자를포함하여일부사람들은직접첨가제든지혹은간접첨가제든지 FDA(USA) 같은관리기관에승인된소재 (Materials) 나의학적등급 (Medical grade) 의소재들로만들어진제품들은관리용액을포함해서 [4] 생체적합성이충분하다는잘못된인식을가지고있다. 여기서의학적등급이라것은합법적이고또는규제적 *Corresponding author: Seung-Kwon Cho, TEL: +82-62-973-74, E-mail: skcho917@hanmail.net 11
12 Seung-Kwon Cho, Ji-Hoon Park, and Gyun-Tack Lim 인정의는아니므로생물학적안전성평가와같은생체적합성시험결과가확보되어있지않으면오해의소지를가져올수있다. 콘택트렌즈는생체조직인각막표면에접촉하여사용하는것으로국제적인규격인 ISO1993( 혹은준하는기준 ) [5] 에따라신체접촉의특성분류는표면접촉의료기기이며, 접촉부위는점막, 그리고접촉지속기간에따라 24시간이하인경우에는세포독성시험, 감작성시험, 자극또는피내반응시험을실시하여야한다. 만일 24시간초과 3일까지접촉또는 3일초과영구적으로삽입및이식한경우에는추가적으로전신독성시험 ( 급성시험 ), 아만성독성 ( 아급성독성 ) 시험, 유전독성시험그리고이식시험을하여야한다. [6,7] 최근콘택트렌즈착용자들은하루종일착용해도안전하고편안한착용감이유지되기를원한다. 그러나착용자에따라서는중도에콘택트렌즈착용을포기하는상황들이발생하며그이후로는콘택트렌즈착용을두려워하는경우들도발생한다. 많은임상연구자들은이러한가장큰이유는각막표면과콘택트렌즈와의표면습윤성때문일것이라고주장하고있다. [8] 콘택트렌즈표면에라이조자임을포함한단백질같은침착물들이생겨서표면습윤성이감소될수있고, 렌즈표면의수분과의친화력이낮아상대적으로렌즈표면에건조감을야기시키는요인들로인해표면습윤성이낮아질것이라고보고되고있다. [9] 그래서최근에는콘택트렌즈물성거동, [1] 생체재료의표면개질화관점에서적용및응용되고있는소재로서생체세포막과유사한분자구조를갖고있는포스포릴콜린 (Phosphorylcholine, PC) 성분이관심의대상이되고있다. 이는친수성을지니면서동시에전기적으로중성인성질로, 생체의학분야에서혈전생성억제기능, 단백질흡착억제기능, 다양한생체적합성특성등에우수한효과로알려지면서다양한표면처리기술로응용되어왔다. 더나아가화장품의기능성향상, 콘택트렌즈케어등그사용범위가넓어지면서많은연구자들에게연구개발의대상이되어왔다. [11-13] 본연구에서는친수성이높고전기적으로중성인성질을지닌포스포릴콜린첨가제를 2-HEMA(2-Hydroxyethyl methacrylate) 과가교된하이드로겔형태의콘택트렌즈시료를제작하였다. 제작된시료를용출시켜검체액으로하고용출법, 한천확산시험 (Agar diffusion test), 그리고세포의성장저해시험인증식저해시험 (MTT test) 을식품의약품안전처고시인의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격에따라 in vitro 세포독성시험평가를통해세포독성반응의정도를파악하여생물학적안전성을확보하고 자하는데그목적이있다. 대상및방법 1. 시약및재료시험물질로수용성망상구조를지닌하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈시료를제조하기위해 HEMA(2- Hydroxyethyl Methacrylate) 는고순도제품인 BX-HEMA- PC(BIMAX,USA) 를구매하여정제과정없이그대로사용하였으며, 열중합반응에필요한개시제로는 AIBN(2,2 - Azobisisobutyronitrile) 을 JUNSEI(JAPAN) 에서구입하여사용하였다. 고분자간에가교역할을하는가교제로는가장일반적인 EGDMA(Ethylene Gylcol Dimethacrylate) 를 TCI (JAPAN) 에서구입하여그대로사용하였다. 하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈시료에표면습윤성을강화하고, 수분과친화력이높으며중성적성질을지니며콘택트렌즈물성의개질화를위해첨가한포스포릴콜린소재는 Sigma aldrich(usa) 에서구입하여시료를제작하였다. 용출법에사용되는배지및부형제 (Medium and vehicle) 는 1% serum( 제조사 :Gibco) 으로구성된 1 MEM (Minimum essential medium) 과혈청 (Serum) House serum( 제조사Gibco) 을사용하였다. 음성대조물질 (Negative control) 은 High Density Polyethylene Film ( 제조사 :Hatano Research Institute) 이고, 양성대조물질 (Positive control) 은 ZDEC PolyurethanFilm ( 제조사 :Hatano Research Institute) 으로사용하였다. 시험계에서시험세포주는 NCTC Clone 929 (L-929)( 공급원 :ATCC,USA) 를사용하였으며, 시험계의선택사유는이세포는세포독성시험에있어서화학물질에대한감수성이높은것으로알려져있으며세포독성시험과관련된자료가풍부하기때문에선정하였다. MTT방식에서부형제 (Vehicle) 는멸균생리식염수 ( 제조사 : 대한약품공업 ( 주 )) 를사용하였으며, 배지 I(Medium I) 는 2% horse serum( 제조사 :Gibco) 으로구성된 2 MEM 이며, 배지 II(Medium II) 는 1% serum( 제조사 :Gibco) 으로구성된 1 MEM를사용하였다. 혈청은 Horse serum( 제조사 :Gibco) 으로보관조건 15 ~ 2 o C에서보관하였다. 음성대조물질명칭은 High Density Polyethylene Film ( 제조사 :Hatano Research Institute), 양성대조물질은 ZDEC Polyurethan Film( 제조사 : Hatano Research Institute) 을사용하였다. 그리고한천확산시험에서배지 I(Medium I) 은 2% horse serum으로구성된 2 MEM, powder( 제조사 :Gibco), 배지 II(Medium II) 는 1% horse serum( 제조사 :Gibco) 으로구성된 1 MEM이며, 혈청은 Horse serum( 제조사 :Gibco) 이며보관조건 15 ~ 2 o C에서보관하여사용하였다.
A Evaluation of Biological Safety in Risk Management of Conventional Contact Lens Containing Phosphorylcholine 13 2. 실험방법 1) 하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈시료제작 콘택트렌즈시료를제작하기위해 HEMA, PC 및개시제와가교제를몰비로구성하여혼합한후상온에서 2시간동안교반한후열중합을이용하여곡률형태의시료를제작하였다. 본연구에서사용하는하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈는소프트상태까지수화되고멸균까지수행된완제품상태로평가하였다. 하이드로겔형태의콘택트렌즈형상을위해 Male과 Female로구성된플라스틱캐비티를사용하여일정한두께가형상되도록열중합으로고분자반응및성형시켰다. 중합이완료된콘택트렌즈시료는.9% 생리식염수에 24 시간동안하이드레이션시켰으며, 미반응물질제거를위해추출과정을걸쳤다. 추출과정이완료된시료를가지고외관및형상, 지름, 두께, 곡률반경등기본적인규격검 사, 엣지형상을포함한외관검사를수행한후제품의위험관리측면에서리스크를최소화하기위해포장후멸균공정을거친완제품으로세포독성시험을평가하였다. 2) 평가방법 (1) 용출법고형의시험물질 ( 하이드로겔콘택트렌즈 ) 을세포에적용하기위하여 1% 혈청이첨가된 MEM배지를이용하여용출하는방식으로검액을조제하였다. 시험물질 4g 당 1% 혈청이첨가된 MEM배지 2 ml의비율로무균적으로조작후, (37±1) o C에서 (24±2) 시간동안 (5±1)% CO 2 인큐베이터내에서용출하고이액을검액으로사용하였다. 이검액을직접세포에접촉시킴으로써시험물질의용출액이세포에나타내는영향을현미경상에서관찰하였다. 용매대조군의경우시험물질을제외한 MEM배지를시험물질과동일한용출조건으로용출하였다. 용출용매로사용된 1% 혈청이첨가된 MEM배지는시험물질이인체에적용되는상황과가장유사한생리적상황을유지하기위하여선정하였다. 음성대조군및양성대조군은제조사 (Hatano Research Institute) 의세포독성시험방법에근거하여 1 g 당 1 MEM배지 1 ml의비율로 (37±1) o C에서 (24±2) 시간동안 (5±1)% CO 2 인큐베이터에서용출하여사용하였다. 시험물질은조제후 24시간내에시험에사용하였다. 시험계에서시험세포주는 NCTC Clone 929(L-929) ( 공급원 :ATCC (American Type Culture Collection, USA) 를사용하였으며, 배양조건으로는배양액 :1% Horse serum 및항생제 [Penicillin (1 Units/mL)/Streptomycin (1 µg/ ml)] 를포함하는 Minimum Essential Medium (ph 7.4), 조건 : (5±1)% CO 2, (37±1) o C에서배양하여 3~4일마다계대하였다. 시험방법으로먼저정성분석이있는데단층배양된세포에트립신 (Trypsin/EDTA) 을처리하여세포농도가 1mL 당 1 5 개가되도록조정하고약 1 cm² 의 6 well plate (35 mm/well) 에 2 ml 씩접종하였다. 24시간동안배양하여단층배양이된 well을선택하고각각의시험군및대조군으로표기한다음배지를제거하였다. 이후시험물질용출액, 용매대조군, 음성대조군및양성대조군을 3개의선택한 well에 2 ml씩투여하고 (5±1)% CO 2, (37±1) o C에서 48시간동안배양하였다. 배양후, 현미경상으로 (1 ) 세포의용해나형태를관찰하였다. 다음으로는정량분석으로세포의용해나형태를관찰한후, 트립신 (Trypsin/EDTA) 을처리하여세포를플레이트에서떼어낸후각시험군에서의생세포를계수하였다. 세포독성의판단은다음과같이진행하였다. 세포의균일한단층 (Confluent monolayer) 이존재하는경우에는 (+), 존재하지않는경우에는 ( ) 로표현하였다. 배양된각 well의세포용해도와세포의형태적변화정도를기록하였다. 또한음성대조군과시험군의배지의색도비교하여관찰하였다. 배지의색이노란색으로변하는경우배지가용출물에의해산성으로변하였다고판단하고, 심홍색이나보라색으로변하는경우배지가염기성으로변하였다고판단하였다. Table 1. Qualitative morphological grading of cytotoxicity of extracts Grade Reactivity Conditions of all cultures 1 Discrete intracytoplasmatic granules, no cell lysis, no reduction of cell growth. 2 Slight 3 Mild Not more than 2% of the cells are round, loosely attached and without intracytoplasmatic granules, or show changes in morphology; occasional lysed cells are present; only slight growth inhibition observable. Not more than 5% of the cells are round, devoid of intracytoplasmatic granules, no extensive cell lysis; not more than 5% growth inhibition observable. 4 Moderate Not more than 7% of the cell layers contain rounded cells or are lysed; cell layers not completly destroyed, but more than 5% growth inhibition observable. 5 Severe Nearly complete or complete destruction of the cell layers.
14 Seung-Kwon Cho, Ji-Hoon Park, and Gyun-Tack Lim 세포독성시험의최종적결과판독은다음의식품의약품안전처고시제214-115호, 의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격, ISO 1993-5에서제시한 Table 1에따라실시하였다. (2) 증식저해시험 (MTT cytotoxicity test) 고형의시험물질을세포에적용하기위해시험물질 4g 당생리식염수 2 ml의비율로 (7±2) o C에서 (24±2) 시간동안용출하였다. 이후혈청이첨가된 2 MEM 배지와동량섞은다음이액을검액으로사용하였다. 용매대조군 (Blank) 의경우시험물질을제외한생리식염수를시험물질과동일한용출조건으로용출한후혈청이첨가된 2 MEM 배지와동량섞어사용하였다. 음성대조군, 양성대조군은제조사 (Hatano Research Institute) 의세포독성시험방법에근거하여 1 g 당 1 MEM배지 1 ml의비율로 (37±1) o C에서 24시간동안 (5±1)% CO 2 인큐베이터에서용출하여사용하였다. 검액들은조제후 24시간내에시험에사용하였다. 이검액을직접세포에접촉시킴으로써시험물질의용출액이세포에어떤영향을미치는지 MTT 방식으로관찰하였다. 시험계의시험세포주는 NCTC Clone 929(L-929)( 공급원 ATCC(American Type Culture Collection, USA) 사용하였다. 배양조건으로배양액 :1% horse serum 및항생제 [Penicillin (1 Units/mL/Streptomycin (1 µg/ml)] 를포함하는 MEM(pH7.4), 조건 :(5±1)% CO 2, (37±1) o C에서배양하여 3~4일마다계대하였다. 시험방법으로단층배양된세포에트립신 (Trypsin/ EDTA) 을처리하여세포농도가 1 ml당 1 5 개가되도록조정하고 96 well plate에 1 µl 씩 (1. 1⁴ cells/well) 접종하였다. 접종후 24시간동안배양하여단층배양이된 well을선택하고각각의시험군및대조군으로표기한다음배지를제거하였다. 각각의검액을 6개의선택된 well 에 1 µl 씩처리하고 (5±1)% CO 2, (37±1) o C에서 24시간동안배양하였다. 음성대조군, 양성대조군, 용매대조군 (Blank) 또한동일한방법으로처리하여배양하였다. 배양후, 배지를제거하고 MTT 1 mg/ml이포함된배양액을 5 µl/well씩처리한후다시 2시간동안배양하였다. 이후배양액을제거하고 isopropanol을각각의 well에 1 µl 씩넣어 formazan을용해한후 micoroplate reader를이용하여 57 nm (Reference 65 nm) 에서흡광도를측정하여대조군과비교조사하였다. 세포독성의판단은다음과같다. MTT cytotoxicity로부터얻은시험물질을처리한군의 optical density(od) 값과용매대조군의 OD값을비교하여세포의생존율 (Cell viability) 을구하고세포생존율이용매대조군대비 7% 미만으로감소한경우세포독성이있다고판단한다. 세포독성시험의세포생존율 (%) 은다음의식품의약품안전처고시제214-115호, MTT cytotoxicity test, 다음식에따라계산하였다. 1 O Viability (%) = ----------------- OD 5 OD 57e : 시험물질을처리한군의 OD값 OD 576b : 용매대조군으로배양액만처리한군 (Blank) 의 OD값 시험의유효성입증을위해, 용매대조군의 OD값은최소.2 이상이어야하며, 음성대조군에서는세포독성을나타내지않아야한다. 양성대조군은세포생존율이용매대조군의 7% 이하이어야하고중간이상의세포독성을나타내어야한다. 또한대조액이예상했던결과를나타내지 않을경우재시험을실시한다. (3) 한천확산시험 (Agar diffusion test) 시험물질은무균적으로준비하여바로사용하였다. 음성대조군및양성대조군은 1. cm 1. cm의크기로잘라서사용하였다. 시험계에서시험세포주는 NCTC Clone 929 (L-929)( 공급원 :ATCC) 를사용하였다. 배양조건으로배양액 :1% horse serum 및항생제 [Penicillin (1 Units/mL)/Streptomycin (1 µg/ml)] 를포함하는 MEM(pH 7.4), 조건 :(5±1)% CO 2, (37±1) o C에서배양하여 3~4일마다계대하였다. 시험방법은단층배양된세포에트립신 (Trypsin/EDTA) 을처리하여세포농도가 1 ml당 1 5 개가되도록조정하고약 1 cm 2 의 6 well plate (35 mm/well) 에 2 ml 씩접종하였다. 24시간동안배양하여단층배양이된 well을선택하고각각의시험군및대조군으로표기한다음배지를제거하고 2 MEM 배양액과 3% 한천을 1:1로혼합하여 2 ml 씩배양접시에중층하였다. 고형화된평판에시험물질과양성및음성대조를각각 3개의 well에올려놓았다. 이평판을 (5±1)% CO 2, (37±1) o C에서 48시간배양후현미경으로세포를관찰하였다. 이후검체를제거하고 Table 2. Reactivity grades for agar and filter diffusion test and direct contact test Grade Reactivity Description of reactivity zone No detectable zone around or under specimen 1 Slight Some malformed or degenerated cells under specimen 2 Mild Zone limited to area under specimen 3 Moderate Zone extending specimen size up to 1. cm 4 Severe Zone extending farther than 1. cm beyond specimen
A Evaluation of Biological Safety in Risk Management of Conventional Contact Lens Containing Phosphorylcholine 15 Neutral red를사용하여염색성의저하를관찰하였다. 세포독성시험의최종적결과판독은다음의식품의약품안전처고시제214-115호, 의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격, ISO 1993-5에서제시한다음의 Table 2에따라실시하였다. 시험의유효성입증을위해용매대조군과음성대조군은세포독성을나타내지않아야하고 ( 세포독성등급 ), 양성대조군은중간이상의세포독성을나타내야한다 (> 세포독성등급 2). 각대조군이예상했던결과를나타내지않거나 3개의시험군에서서로다른결과가관찰되었을때에는재시험을실시한다. 결과및고찰 1. 용출법시험의유효성입증을위해, 용매대조군과음성대조군은세포독성을나타내지않아야하고 (Grade ), 양성대조군은중간이상의세포독성을나타내어야한다 (>Grade 2). 각대조군이예상했던결과를나타내지않거나 3개의시험군에서서로다른결과가관찰되었을때에는재시험을실시한다. 세포의형태적변화나용해정도를나타낸정성분석결과는 Table 3에나타냈다. 시험물질의용출물이투여된세포에서배양후균일한단층은유지되었으나약 1% 의증식저해가관찰되었다. 따라서시험물질의용출물은배양세포에대해아주미약한반응성이있다고볼수있다. 또한생세포의계수를통해정량분석을실시해본결과, 시 험물질의용출물이살아있는세포수에아주미약하게영향을미치는것을확인할수있었다 (Table 4). 용매대조군및음성대조군역시배양세포에대해독성을나타내지않았으며, 양성대조군은예상했던대로전체세포의 75% 이상에서세포독성을야기하였다. 본시험의시험조건하에서시험물질의 MEM 용출물은배양배지의산성도를변화시키지않는것으로판단되지만마우스섬유아세포에아주미약한증식저해를나타내는것으로보인다 (Table 3, 4). 따라서본시험에사용된시험물질의용출물은아주미약한세포독성이있는것으로사료되고, 식품의약품안전처고시제214-115호, 의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격의세포독성판단기준에따라세포독성등급 1(Slightly cytotoxic) 로판단된다. 또한 Grade 2(Mild) 이하 Table 4. Results of quantitative analysis Test group Result of cell counting (cells/ml) Reagent control Negative control Positive control 1 6.1 1 5 7.3 1 5 7.1 1 5 2 6.5 1 5 6.8 1 5 7. 1 5 3 5.9 1 5 7.1 1 5 6.8 1 5 Average 6.2 1 5 7.1 1 5 7. 1 5 RCC * (%) 87.3 1. 98.6. RCC(Relative cell counting, %) = ---------------------------------------------------------------------------------------- Cell number of testgroup 1 Cell number reagent control group Table 3. Results of qualitative analysis Well Confluent monolayer % Growth inhibition % Cells without intracellular granulation % Rounding % Lysis Reactivity Test(1) (+) 1 1 1 1 Slight 1 Test(2) (+) 1 1 1 1 Slight 1 Test(3) (+) 1 1 1 1 Slight 1 Negative control(1) (+) Negative control(2) (+) Negative control(3) (+) Reagent control(1) (+) Reagent control(2) (+) Reagent control(3) (+) Positive control(1) (-) 1 1 1 1 Severe 4 Positive control(2) (-) 1 1 1 1 Severe 4 Positive control(3) (-) 1 1 1 1 Severe 4 (+):present, ( ):absent Grade
16 Seung-Kwon Cho, Ji-Hoon Park, and Gyun-Tack Lim Table 5. Results of cytotoxicity test Treatment OD 57 nm (Reference 65 nm) Relative cell Mean 1 2 3 4 5 6 viability (%) Blank.629.64.639.543.567.532.5857 1. Test article.66.63.64.636.58.68.6257 16.8 Positive control.9.14.18.18.16.1.142 2.4 Negative control.629.625.649.626.583.632.624 16.5 이어야하는일반적의료기기의세포독성시험기준에도시험물질은부합하는것으로보인다. 용매대조군, 음성대조군및양성대조군의시험결과는예상했던바와같아본시험결과의유효성을입증하였다. 2. 증식저해시험 (MTT cytotoxicity test) 본시험의결과로 MTT test에의한세포생존율은 Table 5에나타내었다. 시험물질의검액조제시특이한사항은관찰되지않았으며, 시험물질이투여된배지의 ph 변화도관찰되지않았다. 24시간배양후시험물질이처리된시험군에서의현미경관찰시세포의사멸및세포의형태적변화는관찰되지않았다. 용매대조군및음성대조군역시현미경관찰시배양세포에대해독성을나타내지않았으며, 양성대조군은예상했던대로심한세포독성을야기하였다. MTT test는세포의대사활성능을통하여세포의생존율을측정하는방식으로용해가능한황색 MTT(3-(4,5-dimethylthiazon-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) 가 Mitochondria 내에서 succinate dehydrogenase에의해불용성의청색 MTT formazan으로환원되는정도를흡광도로측정하는방법으로일반적인세포독성의정량적시험에쓰이는보편적인시험방법중의하나이다. 본시험조건하에서시험물질의용출액은용매대조군대비 1% 의세포생존율 (Cell viability) 을나타내는것으로확인되었으며, 식품의약품안전처고시제214-115호, 의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격에서제시하는세포독성판단기준 ( 세포생존율 7% 이상 ) 에부합하는것으로보인다. 용매대조군, 음성대조군및양성대조군의시험결과는예상했던바와같아본시험결과의유효성을입증하였다. 3. 한천확산시험 (Agar diffusion test) 한천확산시험에의한세포독성시험의최종적결과판독은다음의식품의약품안전처고시제214-115호, 의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격, ISO 1993-5에서제시한다음의 Table 2에따라실시하였다. Table 6. Results of cytotoxicity (Agar) test Test article /Control Test (1) article (2) (3) Negative (1) control (2) (3) Blank (1) (2) (3) Positive (1) control (2) (3) Reactivity zone (mm) 6 6 6 Reactivity Moderate Moderate Moderate Cytotoxicity grade 시험의유효성입증을위해용매대조군과음성대조군은세포독성을나타내지않아야하고 ( 세포독성등급 ), 양성대조군은중간이상의세포독성을나타내야한다 (> 세포독성등급 2). 각대조군이예상했던결과를나타내지않거나 3개의시험군에서서로다른결과가관찰되었을때에는재시험을실시한다. 결과는시험에있어서탈색 zone의상태와용해의정도는 Table 6에나타내었다. 3개의시험물질이투여된세포의중층상에서탈색 zone은관찰되지않았으며, 검체아 래부분에서의세포용해정도도관찰되지않았다. 따라서시험물질은본시험환경상에서배양세포에대한반응성이없다고볼수있다. 용매대조군과음성대조군은중층상으로 Reactivity zone이관찰되지않았으며, 양성대조군은예상했던대로.5 cm 이상의 Reactivity zone이관찰되었다. 본시험의시험조건하에서시험물질은마우스섬유아세포의어떠한용해나독성을나타내지않는것으로보인다. 따라서본시험에사용된시험물질은세포독성이없는것으로사료되고, 식품의약품안전처고시제214-115 호의세포독성시험판단기준에따라세포독성등급 (Noncytotoxic) 으로판단된다. 또한세포독성등급 2(Mildly cytotoxic) 이하이 3 3 3
A Evaluation of Biological Safety in Risk Management of Conventional Contact Lens Containing Phosphorylcholine 17 어야하는일반적의료기기의세포독성시험기준에도시험물질은부합하는것으로보인다. 용매대조군, 음성대조군, 및양성대조군의시험결과는예상했던바와같아본시험결과의유효성을입증하였다. 결론 본연구에서는친수성이높고전기적으로중성의성질을지닌포스포릴콜린소재를 2-HEMA에첨가하여하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈를포장후멸균공정까지마친완제품상태로제작하였으며이를시험물질로하였다. 제작한소프트콘택트렌즈는의료기기로서위험관리측면의생물학적안전성확보차원에서용출법, 증식저해시험그리고한천확산시험법으로세포독성시험을실시하였다. 용출법에서는본시험의시험조건하에서시험물질의 MEM 용출물은배양배지의산성도를변화시키지않는것으로판단되지만마우스섬유아세포에아주미약한증식저해를나타내는것으로보였다. 따라서본시험에사용된시험물질의용출물은아주미약한세포독성이있는것으로사료되고, 식품의약품안전처고시제214-115호, 의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격의세포독성판단기준에따라세포독성등급 1(Slightly cytotoxic) 로판단된다. 또한 Grade 2(Mild) 이하이어야하는일반적의료기기의세포독성시험기준에도시험물질은부합하는것으로보인다. 용매대조군, 음성대조군및양성대조군의시험결과는예상했던바와같아본시험결과의유효성을입증하였다. 증식저해시험에서는시험물질의용출액은용매대조군대비 1% 의세포생존율 (Cell viability) 을나타내는것으로확인되었으며, 식품의약품안전처고시제214-115호, 의료기기의생물학적안전에관한공통기준규격에서제시하는세포독성판단기준 ( 세포생존율 7% 이상 ) 에부합하는것으로확인되었다. 한천확산시험법으로는시험물질은마우스섬유아세포의어떠한용해나독성을나타내지않는것으로보였다. 따라서본시험에사용된시험물질은세포독성이없는것으로사료되고, 식품의약품안전처고시제214-115호의세포독성시험판단기준에따라세포독성등급 (Noncytotoxic) 으로판단된다. 또한세포독성등급 2 (Mildly cytotoxic) 이하이어야하는일반적의료기기의세포독성시험기준에도시험물질은부합하는것으로확인되었다. 이상의결과를종합해볼때설계개발과정에서의도된성능을구현하기위해포스포릴콜린소재와 2-HEMA로이루어진하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈의생물학적안전성은위험관리측면에서검토시그리고이를제품화하는데있어서세포독성을유발하는물질이용출되지 않았으며각막표면에자극성이나면역반응에따른부작용은발생하지않을것으로사료된다. REFERENCES [1] Kim TH, Sung AY. Study on the current standardization status in contact lens field. 26;11(4):351-355. [2] Tsuchiya T, Arai T, Ohhashi J, Imai K, Kojima H, Miyamoto S. Rabbit eye irritation caused by wearing toxic contact lenses and their cytotoxicities: in vivo/in vitro correlation study using standard reference materials. J Biomed Mater Res. 1993;27(7):885-893. [3] Official Journal of the European Union. Regulation of the European Parliament and of the Council, 217. http://eurlex.europa.eu/legal-content/eng/txt/pdf/?uri=celex: 3217R745&from=EN(2 March 218). [4] Ko EG, Na MS, Lee JB. Cytotoxicity of clone 1-5C-4 cell lines and effect on rabbit cornea by soft contact lens multi-purpose solution (MPS). J Korean Ophthalmic Opt Soc. 27;12(3):19-25. [5] ISO(International Organization for Standardization). ISO 1993-1:29, Biological evaluation of medical devices- Part 1: Evaluation and testing within a risk management process, 29. https://www.iso.org/standard/4498.html(2 March 218). [6] MFDS(Ministry of Food and Drug Safety, Korea). General Standard for Biological Safety of Medical Devices No.214-115, 214. http://www.mfds.go.kr/index.do?mid=113&seq= 8299&cmd=v(2 March 218). [7] ISO(International Organization for Standardization). ISO 1993-5:29, Biological evaluation of medical devices- Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity, 29. https://www. iso.org/standard/3646.html(2 March 218). [8] Chalmers RL, Begley CG. Use Your Ears to Identify Lens Related Dryness, 25. https://www.clspectrum.com/issues/ 25/august-25/use-your-ears-to-identify-lens-relateddryness(2 March 218). [9] Lee KJ, Kang YS. The amounts of protein deposits influenced by contact lens material and evaluation of the cleaning efficacy by care solution. Korean J Vis Sci. 25;7(1):85-94. [1] Cho SK. Physical properties variation mobilities related to monomer concentration percent between P(2-hydroxyethyl methacrylate) used in the materials of soft contact lens and hydrophilic/hydrophobic materials. MS Thesis. Chonnam National University, Gwangju. 22;8. [11] Hayward JA, Lee DC, Chapman D. Recent studies of biomembranes and phospholipid polymers. Front Membr Res Agric. 1985. [12] Lewis AL, Stratford PW. A versatile phosphorylcholinebased coating for enhancement of medical devices. UKSB First Annual Conference. [13] Yianni JP. Making PVC more biocompatible. Med Device Technol. 1995;6(7):2-26.
18 Seung-Kwon Cho, Ji-Hoon Park, and Gyun-Tack Lim 포스포릴콜린소재가첨가된컨벤셔널콘택트렌즈의위험관리측면에서의생물학적안전성평가 조승권 1,2, *, 박지훈 1, 임균택 1 1 전남대학교고분자공학과, 광주광역시 61186 2 지오메디칼광신소재기술연구소, 광주광역시 617 투고일 (218 년 2 월 5 일 ), 수정일 (218 년 3 월 9 일 ), 게재확정일 (218 년 3 월 14 일 ) 목적 : 본연구에서는포스포릴콜린소재가첨가된소프트콘택트렌즈의생물학적안전성확보일환으로 in vitro 세포독성시험을수행하여위험관리측면에서세포독성반응의정도를평가하여안전성을확보하고자하는데목적이있다. 방법 : 2-HEMA(2-Hydroxy ethyl methacrylate) 성분과포스포리피드의유도체인포스포릴콜린 (PC) 로하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈를제작하였다. 생물학적안전성확보일환으로세포독성시험을평가하기위해포장및멸균공정까지수행하여완제품상태에서시험을실시하였다. 세포독성시험은용출법, 증식저해시험및한천확산시험법으로평가하였다. 결과 : 용출법시험에서는용매대조군 (Reagent control) 과음성대조군 (Negative control) 은세포독성을나타내지아니하였으며 (Grade ), 양성대조군 (Positive control) 도중간이상의세포독성을나타냈다 (>Grade 2). 정성분석결과에서는 Confluent monolayer 는 (+), Growth inhibitions 는 1%, intracellular granulation 이없는 Cells 은 1%, Rounding 은 1%, Lysis 는 1%, Reactivity 는 Slight 로관찰되었으며, Grade 는 1 로관찰됨으로써시험물질의용출물은배양세포에대해아주미약한반응성이있다고할수있다. MTT 방법에서는세포생존율이시험물질에서는 16.8%, 공시험액은 1%, 양성대조군은 2.4%, 그리고음성대조군은 16.5% 로확인되었다. 24 시간배양후시험물질이처리된시험군에서의현미경관찰시세포의사멸및세포의형태적변화는관찰되지않았다. 한천확산시험법에서는시험물질이투여된세포의중층상에서탈색 zone 은관찰되지않았으며, 검체아래부분에서의세포용해정도도관찰되지않았다. 용매대조군과음성대조군은중층상으로 Reactivity zone 이관찰되지않았으며, 양성대조군은예상했던대로.5 cm 이상의 Reactivity zone 이관찰되었다. 결론 : 본연구과정에서도출했던이상의결과를종합해볼때설계개발과정에서의도된성능을구현하기위해포스포릴콜린소재와 2-HEMA 로이루어진하이드로겔형태의소프트콘택트렌즈의생물학적안전성은위험관리측면에서검토시그리고이를제품화하는데있어서세포독성을유발하는물질이용출되지않았으며각막표면에자극성이나면역반응에따른부작용은발생하지않을것으로사료된다. 주제어 : 세포독성시험, 포스포릴콜린, 소프트콘택트렌즈