Appl. Chem. Eng., Vol. 27, No. 2, April 2016, 185-189 http://dx.doi.org/10.14478/ace.2016.1009 Article 이승준 조지아대학교 (2016 년 1 월 29 일접수, 2016 년 2 월 16 일심사, 2016 년 3 월 10 일채택 ) A Study on Surface Modification of Nanorod Electrodes for Highly Sensitive Nano-biosensor Seung Jun Lee Micro/Nano Bioengineering Laboratory, Department of Biological and Agricultural Engineering, The University of Georgia, Athens, GA 30602, USA (Received January 29, 2016; Revised February 16, 2016; Accepted March 10, 2016) 초록많은생체친화적인센서들중에서 avidin-biotin system은높은상호특이적인친화성으로인하여많은생물학적인응용연구에이용되어왔다. 효과적인 avidin-biotin 바이오센서개발을위해 avidin-biotin 간의상호반응성을증대시키기위해서는높은표면적을가지는전극이필요하다. 본연구에서는이러한목적을위해 gold nanorods electrode를사용하였다. 전기화학적인특성은 cyclic voltammetry (CV) 와 electrochemical impedance spectroscopy (EIS) 를가지고 redox couple [Fe(CN) 6] 3-/4- 를사용하여다양한 biotin의농도에따라분석되었다. 결론적으로 nanorod의전극은 1 ng/ml보다낮은 biotin의농도도감지할수있음을보였다. Abstract Among many kinds of bioaffinity sensors, the avidin-biotin system has been widely used in a variety of biological applications due to the specific and high affinity interaction of the system. In this work, gold nanorods with high surface area were explored as electrodes in order to amplify the signal response from the avidin-biotin interaction which can be further utilized for avidin-biotin biosensors. Electrochemical performance of electrodes modified with nanorods and functionalized with avidin in response to interactions with biotin at various concentrations using [Fe(CN) 6] 3-/4- couple as the redox probe were investigated using cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). A very low biotin concentration of less than 1 ng/ml could be detected using the electrodes modified with nanorods. Keywords: nano/biosensor, avidin/biotin, surface modification 1)1. 서론 초소형나노- 바이오센서소자는생명현상의이해및공학적응용을위해서는미량으로존재하는생체분자를측정할수있어야한다. 생물학적검출기술은다량의바이오정보를일차적으로획득하는수단으로서그리고, 질병의예방, 진단등산업적응용이라는측면에서도매우중요하다. 시스템적생물학연구가진행되기위해서도다량의시료를동시에상호비교분석할수있는도구가있어야한다. 최근바이오산업에서미세바이오분석시스템개발의필요성은유전체및단백질체연구와신약개발등에있어큰의미를갖고있다. 분석, 진단및신약 Author (current address): Samsung Electronics, Samsung-Ro, Suwon 16677, Republic of Korea Tel: +82-70-8699-6720 e-mail: profsamlee@gmail.com *This research was mainly conducted while Seung Jun Lee was working at the University of Georgia. pissn: 1225-0112 eissn: 2288-4505 @ 2016 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 개발시소요되는비용의절감과대량검색의고효율성이라는장점을제공해줄수있기때문이다. 최근의바이오분석시스템은다량의시료를처리할수있도록어레이 (array) 화및소형화 (miniaturization) 되어가고있는것이지금의큰흐름이다 [1-3]. 기존바이오센서의한계를극복하여현장진단, 실시간분석이가능한개선된나노- 바이오센서의개발을실현하기위해서는센서매트릭스 (sensor matrix) 가되는나노구조화된기능성지지체 (substrate) 매트릭스 (matrix) 의연구개발이요구되어진다. 나노구조화된나노제작기술로는 MEMS(micro electro mechanical system), 자기조립 (self-assembly) 기술, DPN(dip-pen nanolithography), 스마트나노입자 (smart nanoparticles), 나노임프린트 (nano-imprinting) 기술, 그리고 nanocarpet, nanopillar, nanorod와같은 nano-array 제작기술등이대표적이다. 특히, 소형화된초소형나노 -바이오센서는정확한분석을위해극미량의물질에도높은민감성을가져야한다. 이러한목적으로바이오센서의민감도를증가시키기위해센서전극을 nanopillar 또는 nanorod와같은 nanostructure array로제작하여많은연구가진행되어왔다 [4-8]. 특히, gold nanorod 전극구조에따른민감도및 gold flat 전극과의민감도비교에대한것은 185
186 이승준 Figure 2. The schematic diagram for stepwise formation of multilayer on the gold nanorods electrode surface. Figure 1. The morphology of gold nanorods using SEM. 이전의연구에서설명하였듯이 gold nanorod 전극은 gold flat 전극보다높은민감도를가진다 [9-11]. 본연구에서는고감도나노- 바이오센서의응용을위한나노구조의전극의제작공정및실험적검증에관한연구로 electro-chemical deposition 방법을이용하여수마이크로의크기를가지는 gold-nanorods를제작하고, gold-nanorods의표면을카르복실기말단과알킬사실구조를가지는물질을이용하여 gold-nanorod의표면에고정화한이후, protein 를그위에재고정화하여개질된 gold-nanorod protein 전극을제작하고, 초미량의 protein-ligand가인식되는지를확인하였고, 제작된 gold-nanorod 전극의높은감도 (sensitivity) 를실험적으로검증함과동시에감도 (sensitivity) 증가에기인한이유에관하여연구를진행하였다. 2. 실험 2.1. 시약및기구표면개질되지않은 bare gold nanorod 전극시편은 University of Georgia의 Micro/Nano Bioengineering Lab. 으로부터제공받아사용하였다 (GA, USA). 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA), 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), Biotin, 그리고 Avidin 등은 Sigma-Aldrich로부터구입하여사용하였다. avidin과 biotin 용액을제조하기위해 Phosphate buffered saline (PBS, 0.01 M ph 7.4) 이사용되었다. 2.2. Gold nanorod 전극제조및표면개질수용액상에서 electro-chemical deposition 방법을통하여 4 µm-5 µm 높이를가지는 bare gold nanorod가제작되었다. 간략히설명하면 commercial porous anodic alumina disc (PAA, d = 25 mm; Whatman Inc, Maidstone, England) 를 gold plate 수용액상에 immerse한이후 three-electrode system (gold-coated PAA (working 전극 ), platinum wire gauze (counter 전극 ), Ag/AgCl (reference 전극 )) 를통해 5 ma/cm 2 의 current density와, 65 환경하에서전기화학적인방법을통해일정하게배열된 bare gold nanorods를제작하였다. 자세한제작방법은이전의연구에서설명되었고, 제작된 bare gold nanorod를 scanning electron microscopy (SEM) 으로측정한형상을 Figure 1에나타내었다 [9-10]. 특히, 이전의연구에서설명되었듯이 nanorods로인한표면적의증가를평가하기위해 cyclic voltammetry (CV) 를통해 flat 전극과 nanorods 전극을비교하였고, 그결과 0.7 V와 1.1 V 사이에서 reduction peak이관찰되었고, flat 전극보다 nanorods 전극에서 더높은 reduction peak 값을보여 nanorods 전극의표면적이더증가하여나타난현상으로설명하였다 [10]. 표면이개질된 nanorod 전극을제작하게위해 nano size로제조된 bare gold nanorods 표면위에 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) monolayers를고정화한이후, N-hydroxysuccinimice esters (NHS) 를통해 MUA의말단카르복실기를 NHS로치환하고이후, avidin protein의아민과반응하여 avidin를전극에고정화하여 avidin-immobilized 전극을만든다 (Figure 2). 우선, 표면개질전에 inorganic과 organic 오염물을제거하기위해 gold nanorod modified 전극 (1.2 mm 1.2 mm) 이 0.1 M H 2SO 4 제하에서 Cyclic voltammetry (CV) 에의해 cleaning한후, ethanol 과 DI water를통해수차례세정단계를거친다. 이후, nanorod modified 전극이 10 mm MUA 용액에 12 h 동안상온하 (under constant stirring) 에서담가져 SAM layer를형성한다. 그런후, MUA-modified gold nanorod의미반응 MUA 제거와세정을위해 ethanol과 DI-water를가지고세정한다. 결론적으로 gold nanorod 전극표면에 MUA가고정화된다 (i.e., turning the COOH groups of the MUA into reactive N-hydroxysuccinimice esters). 또한, MUA-modified gold nanorod는 30 mm EDC와 15 mm NHS가포함된 PBS (0.01 M, ph 7.4) 용액에 3 h 동안상온하에서담가져 activation되고, 200 µg/ml avidin (in PBS) 의 300 µl solution이첨가되어 avidin-functionalized gold nanorod modified 전극을제작한다. 이후, biotin이농도에따라첨가되어 avidin-biotin system의센싱분석이수행되었다. 2.3. 전기화학적분석표면전기화학적인특성분석은 cyclic voltammetry (CV) 와 electrochemical impedance spectroscopy (EIS) 의 three-electrode probe를가지고 redox couple [Fe(CN) 6] 3-/4- 를사용하여분석되었으며, 또한, 전형적인 three-electrode electrochemical cell system인 counter electrode (CE) 인 platinum (Pt) wire와 reference electrode (RE) 인 Ag/AgCl 그리고 working electrode (WE) 인 modified-gold nanorods electrode를사용하여 multistat 1480와 SI 1260 (Solartron Corp, Houston TX, USA) 를가지고수행되었다. 단계별공정을통해각단계에따른 cyclic voltammetry (CV) 와 electrochemical impedance spectroscopy (EIS) 를측정하여분석진행하였다. Cyclic voltammetry는산화환원의 formal potential과반응에관련된전자의수를결정하는데있어기본적으로가장많이사용되는전기화학적인 technique이며, 시간에비례하여전위를변화시킬때에흐르는전류를전류-전위곡선으로기록하는방법을전위주사법 (potential sweep method) 이라고하는데, 이것을계속반복해서전위주사하는경우를 Cyclic voltammetry라고부른다. 또한, electrochemical impedance spectroscopy (EIS) 는작은진폭의교류신호에대한부식전극의반응을여러범위의주파수에걸쳐전기화학적스펙트럼분광법 (EIS, Electrochemical Impedance Spectroscopy) 에의해분석하고그결과를 Nyquist Plot 또는 Bode Plot으로나타내어분 공업화학, 제 27 권제 2 호, 2016
187 3e-5 (a) Bare gold-nanorod (b) MUA gold-nanorod (c) MUA + Avidin gold-nanorod (d) MUA + Avidin + Biotin gold-nanorod 2e-5 (a) (c) (d) 1e-5 (b) Current (A) 0-1e-5-2e-5-3e-5-0.4-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Potential (V) Figure 3. Cyclic voltamogramms of the bared gold nanorods electrode (a) following modification of MUA (b), MUA+ avidin (c), and MUA+ avidin + biotin (50 ng/ml) (d). The supporting electrolyte is PBS (0.01 M ph7.4) solution containing [Fe(CN) 6] 3-/4- couple. 극저항값을측정하여분석하는기술이다. CV 측정은 PBS (0.01 M, ph 7.0) 에서 2.5 mm K 4[Fe(CN) 6] + 2.5 mm K 3[Fe(CN) 6] 가 mixing된상에서진행하였으며, potential은 -0.3 V 에서 0.6 V, 50 mv/s rate에서진행하였다. 또한, EIS 측정은 frequency range 0.5 Hz-100 khz, PBS (0.01 M, ph 7.0) 에서 2.5 mm K 4[Fe(CN) 6] + 2.5 mm K 3[Fe(CN) 6] 가 mixing된상에서진행하였다. 또한, 모든측정은상온하의 nitrogen flow condition에서진행되었다. 3. 결과및고찰 3.1. 표면개질된 nanorod 전극의전기화학적특성 Surface modification와 functionalization process의각단계별 electrode/electrolyte interface에대한 electrochemical characteristics를조사하기위해 Cyclic voltammetry 분석이수행되었다. Figure 3에서처럼 bare gold nanorod-electrode는 reversible CV curve를보이고있으며, Figure 4에서처럼전극표면에 molecules (i.e., MUA, avidin, and biotin) 이단계별로 bounded됨에따라 CV curve에서단계별 redox couple 의 peck current가감소하고, peak-to-peak separation에서의증가경향을보이고있다. 이는명확하게 multilayer molecular structures가전극표면 (electrode surface) 에형성되어두께 (thickness) 의증감이이루어져 [Fe(CN) 6] 3-/4- 의 redox activity에대한전자의전달비율 (electron transfer rate) 이감소되어이러한현상이나타난것으로판단된다. 또한, Ding group은이전연구발표에서전극표면위에 MUA가자기조립됨으로써자기조립층에의해전자의전달이억제되어 electron transfer resistance (R et) 값이증가함을설명하였다 [15]. 또한, MUA, avidin, biotin를가지고 electrode surface의 sequential modification동안의 electrode/electrolyte interfaces 특성이 EIS에의해측정되었다. Figure 4는얻어진 Nyquist plots이다. 명확하게얻어진반원 (semicircle) 의지름 (diameter) 이분자의층 (layer) 이증가함에따라증가하였다. 이러한현상은분자 (molecules) 의층 (layer) 이증가함에 Figure 4. Nyquist plots (Z im vs. Z re) of the bared gold nanorods electrode (a) following modification of MUA (b), MUA+ avidin (c), and MUA+ avidin + biotin (50 ng/ml) (d) in the PBS (0.01 M ph7.4) solution containing a redox probe of [Fe(CN) 6] 3-/4- couple. The insert figure is curve (a). 따라 electrode/electrolyte interface에서의 electron-transfer resistance가증가되었고, 높은 electron-transfer resistance은 [Fe(CN) 6] 3-/4- 의 redox reaction를감소시키기때문이다. 이는 CV measurement와비교할때, EIS 측정 (measurements) 은 surface modification 단계에따라명확히각단계별효과가구별이된다. 일반적으로 electrode/electrolyte interface의 electrical 거동은 resistors와 capacitor 사이에 equivalent circuit에의해나타낼수있다. 이전의연구에서처럼단계별 surface modification 동안 electrode/electrolyte interfaces을위한 equivalent circuits을특성분석하기위해 Zplot/Zview (Scibner Associates Inc.) 를이용하여 impedance data를가지고 statistical curve fitting하였다 [10]. Multi-layer molecular structure의단계별형성에대한 fitted values가 Table 1에나타내었다. 여기서 Rs는 the resistance of the electrolyte, Ret은 the electron transfer resistance (at the electrode/electrolyte interface), 그리고 CPE는 a constant phase element이다. CPE의 physical origin는많은문헌 [10-14] 에명시되어있으며, 문헌을참조하여 CPE의 impedance는 Z CPE = 1/[T(i*w) P ] 이고여기서 i는 imaginary number이고, w는 angular frequency이고, P는상수이며 (0 P 1), T는 CPE의 inverse impedance로단위는 F (rad/s)1-p이다[10,12,15]. 이연구에서의 CPE는 modified layer capacitance (Cm) 와 double layer capacitance (Cdl) 를포함한다. 그러므로, equivalent capacitance는 1/CPE = 1/Cm + 1/Cdl로표현될수있으며, 동일하게 R et 도 R et = R m + R dl 로표현될수있다 [10-12,16]. Table 1에서보이듯이, P는 0.94-0.96의범위이며, 이는 ideal capacitive response (P = 1) 에근접하여, electrode/electrolyte interface에대한 equivalent circuit분석에서 CPE가 pure capacitance을대신할수있음을의미한다. 또한, electrolyte resistance, R s, 은일정하며, nanorod 전극표면에다른분자들이 deposition되어짐에따라 electron transfer resistance (R et) 의증가와 capacitance (CPE) 의감소가나타남을확인할수있다. 즉, bare gold electrode의 R et value는 (ca. 7137 Ω) 단계별반응진행후와비교할때아주작은값을가지며, 이는표면에 MUA의 self-as- Appl. Chem. Eng., Vol. 27, No. 2, 2016
188 이승준 Table 1. Fitted Impedance Values for the Gold Nanorods Electrode After Multiplayer Modification and the Addition of Biotin Ret (Ω) Rs (Ω) CPE-T (nf(rad/s)1-p) P Step 1 : Modified-MUA 19358 ± 246 246.7 ± 1.9 2803.7 ± 37.5 0.94 Step 2 : Avidin 24435 ± 277 244.6 ± 1.6 2615.7 ± 25.7 0.96 Step 3 : Biotin concentration (ng/ml) 0.2 24484 ± 279 243.3 ± 1.6 2607.7 ± 25.6 0.96 0.5 25649 ± 298 243.6 ± 1.6 2477.7 ± 26.4 0.95 2 26835 ± 338 242.2 ± 1.7 2365.8 ± 28.1 0.95 6 28140 ± 331 242.4 ± 1.8 2295.8 ± 29.6 0.95 10 29741 ± 344 241.3 ± 2.1 2065.8 ± 33.8 0.95 30 31531 ± 359 242.6 ± 2.1 1815.8 ± 32.1 0.94 50 32973 ± 347 243.5 ± 2.2 1665.8 ± 29.8 0.94 100 34201 ± 367 243.8 ± 2.4 1484.5 ± 44.2 0.94 200 35474 ± 393 243.4 ± 2.6 1301.6 ± 49.9 0.94 300 35517 ± 394 243.2 ± 2.5 1298.6 ± 49.1 0.94 Figure 5. Cyclic voltammgrams of the avidin-immobilized gold nanorods electrode in the PBS (0.01 M ph 7.4) solution containing a redox probe of [Fe(CN) 6] 3-/4- couple with the addition of biotin at different concentrations. Biotin concentration 0 ng/ml (a), 0.2 ng/ml (b), 0.5 ng/ml (c), 2 ng/ml (d), 6 ng/ml (e), 10 ng/ml (f), 30 ng/ml (g), 50 ng/ml (h), 100 ng/ml (i), 200 ng/ml (j), 300 ng/ml (k). The curve (a) is avidin-immobilized gold nanorods electrode. Figure 6. Nyquist plots of the avidin-immobilized gold nanorods electrode in the PBS (0.01 M ph 7.4) solution containing a redox probe of [Fe(CN) 6] 3-/4- couple with the addition of biotin at different concentrations. Biotin concentration 0 ng/ml (a), 0.2 ng/ml (b), 0.5 ng/ml (c), 2 ng/ml (d), 6 ng/ml (e), 10 ng/ml (f), 30 ng/ml (g), 50 ng/ml (h), 100 ng/ml (i), 200 ng/ml (j), 300 ng/ml (k). The curve (a) is avidin-immobilized gold nanorods electrode. sembly가진행됨에따라 R et 는 self-assembled layer에의해 electron-transfer의 inhibition으로인하여증가된것으로판단된다. 또한, avidin immobilization 이후, R et value는 24435 Ω로증가하였고, capacitance는 2803.7 nf에서 2615.7 nf로 nanorod 전극위의코팅 layers가증가함에따라감소하였다. 이는 CV의결과와일치함을알수가있다. 3.2. Avidin-Biotin 고감도센서의전기적특성 CV와 EIS을이용하여 avidin-immobilized gold nanorod 전극과 biotin 사이의상호관계를분석하였다. Figure 5는 avidin-immobilized gold nanorod electrode가있는 PBS 용액상으로 biotin이저농도에서 고농도까지농도 (0.2, 0.5, 2, 6, 10, 30, 50, 100, 200, 300 ng/ml) 에따라첨가될때 CV의변화를나타내었다. 하지만, CV 측정으로는농도에따른차이가쉽게구별되게어렵다. 이는농도가낮을때는 Faradic current가쉽게구별되기가어렵고, current response가 avidin 과 biotin사이의 high affinity에따른전기적인변화에민감도가크지않기때문이다. 그러므로, Figure 6에서처럼, EIS에대한분석이동시에수행되어비교분석되었다. 0.2 ng/ml-300 ng/ml로농도에따라 biotin이첨가되었을때, avidin-immobilized nanorod electrode surface 에 biotin의 binding으로인하여 electron-transfer resistance이증가하여 impedance에서의큰차이가보였다. 이러한결과는이전의연구에서 공업화학, 제 27 권제 2 호, 2016
189 측정되었던현상과유사하며, 더많은 biotin이전극표면에 bounded 됨에따라서더높은 impedance value를가짐을의미한다. 이전의연구에서는 1 ng/ml 미만의농도를감지할수없었으나 [10], 본연구에서는 biotin농도 1 ng/ml 미만의낮은농도까지도감지할수있음을알수가있었다. 이는초기제작된 bare gold nanorod 전극의길이에영향이있을것으로판단된다. 이전의연구에서는 nanorod의높이가 2 µm-3 µm이었으나, 본연구에서사용된것은 nanorod의높이가 4 µm-6 µm로기존보다더높은길이로인하여전체적인표면적의증가로인한현상으로설명될수있다 [10]. Zhang group은이전의연구발표에서 cyclic voltammetry (CV) 를통해 nanorod의높이에따른감도 (sensitivity) 를비교하였고, nanorods의길이가높은전극에서의감도 (sensitivity) 가더증가하였음을나타내었다 [9]. Avidin-immobilized gold nanorod 전극에 biotin 농도에따라첨가후, equivalent circuit를통해 experimental curves를 fitting 한결과가 Table 1에나타내었다. avidin-immobilized gold nanorod 전극에 biotin 0.5 ng/ml가첨가된전후의값을비교하여볼때, Ret values는 24.435 kω에서 25.649 kω로증가하였다. 그리고 0.2 ng/ml-300 ng/ml의농도의범위에서는 24484 Ω에서 35517 Ω로증가하였다. 반면, CPE 는 2607.7 nf에서 1298.6 nf로감소하였다. 즉, avidin-immobilized 전극에 biotin이 binding된후, redox couple의 access가 biotin의존재보다도더 hindered되었기때문에 Ret는증가하였고, capacitance는감소하였다. 4. 결론 본연구를통해수마이크로의크기를가지는 gold-nanorods를제작하고, gold-nanorods의표면을개질하여 Avidin-modified된 gold-nanorod 전극을제작하고, 초미량의 protein-ligand인 biotin이인식되는지를확인하였고, 전기화학적인특성은 cyclic voltammetry (CV) 와 electrochemical impedance spectroscopy (EIS) 를가지고 redox couple [Fe(CN) 6] 3-/4- 를사용하여다양한 biotin의농도에따라분석되었다. 결론적으로 nanorod의전극은 1 ng/ml보다낮은 biotin의농도도감지할수있음을보였다. 또한 nanorod의높이가증가됨에따라전체적인표면적의증가로인한더높은감도 (sensitivity) 를가질수있음을확인할수가있었다. 감사 본논문연구에도움을주신 University of Georgia의 Guigen Zhang 박사와 Venkataramani Anandan 박사에게감사를드립니다. References 1. J. Kim and D. Ahn, Nanostructured Polydiacetylene Sensor, Polymer Science and Technology, 14, 266-273 (2003). 2. K. S. Ha and J. S. Yuk, Nano-biotechnology and protein chip, Trends Med. Res., 11(5), 9-16 (2004). 3. U. Kim, Biosensors, Korean J. Biotechnol. Bioeng., 15, 423-427 (2000). 4. R. D. Piner, J. Zhu, F. Xu, S. Hong, and C. A. Mirkin, Dip-Pen Nanolithography, Science, 283, 661-663 (1999). 5. T. G. Drummond, M. G. Hill, and J. K. Barton, Electrochemical DNA sensors, Nature Biotechnol., 21, 1192-1199 (2003). 6. J. W. Hong and S. R. Quake, Integrated nanoliter systems, Nature Biotechnol., 21, 1179-1183 (2003). 7. S. Zhang, Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly, Nature Biotechnol., 21, 1171-1178 (2003). 8. J. G. Fan, D. Dyer, G. Zhang, and Y. P. Zhao, Nanocarpet Effect: Pattern Formation during the Wetting of Vertically Aligned Nanorod Arrays, Nano Lett., 4, 2133-2138 (2004). 9. V. Anandan, X. Yang, E. Kim, Y. Rao, and G. Zhang, Role of reaction kinetics and mass transport in glucose sensing with nanopillar array electrodes, J. Biol. Eng., 1:5, doi:10.1186/1754-1611-1-5 (2007). 10. S. Lee, V. Anandan, and G. Zhang, Electrochemical fabrication and evaluation of highly sensitive nanorod-modified electrodes for a biotin/avidin system avidin, Biosens. Bioelectron., 23, 1117-1124 (2008). 11. V. Anandan, R. Gangadharan, and G. Zhang, Role of SAM chain length in enhancing the sensitivity of nanopillar modified electrodes for glucose detection, Sensors, 9, 1295-1305 (2009). 12. A. Norlin, J. Pan, and C. Leygraf, Investigation of interfacial capacitance of Pt, Ti and TiN coated electrodes by electrochemical impedance spectroscopy, Biomol. Eng., 19, 67-71 (2002). 14. P. Zoltowski, On the electrical capacitance of interfaces exhibiting constant phase element behavior, J. Electroanal. Chem., 443, 149-154 (1998). 15. G. Lang and K. Heusler, Remarks on the energetics of interfaces exhibiting constant phase element behavior, J. Electroanal. Chem., 457, 257-260 (1998). 16. S. Ding, B. Chang, C. Wu, M. Lai, and H. Chang, Electrochemical evaluation of avidin-biotin interaction on self-assembled gold electrodes, Electrochim. Acta, 50, 3660-3666 (2005). 17. S. Ding, B. Chang, C. Wu, M. Lai, and H. Chang, Impedance spectral studies of self-assembly of alkanethiols with different chain lengths using different immobilization strategies on Au electrodes, Anal. Chim. Acta, 554, 43-51 (2005). Appl. Chem. Eng., Vol. 27, No. 2, 2016