제 1 기비소세포폐암환자에서 p53 과발현과예후의관계 성균관대학교의과대학 1 내과학교실, 삼성서울병원호흡기내과, 2 병리과학교실, 3 흉부외과학교실엄상원 1, 김호중 1, 권오정 1, 한정호 2, 심영목 3 Prognostic Value of p53 Overexpression in Patients with Pathologic Stage I Non-small Cell Lung Cancer Sang-Won Um, M.D. 1, Hojoong Kim, M.D. 1, O Jung Kwon, M.D. 1, Joungho Han, M.D. 2, Young Mog Shim, M.D. 3 1 Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Departments of Medicine, 2 Pathology, 3 Thoracic Surgery, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea Background: Chromosome 17p allele losses and mutations of p53 gene are the most common genetic abnormalities in lung cancer. The purposes of this study were to evaluate the factors associated with p53 protein overexpression and to evaluate its prognostic value in patients with pathologic stage I non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: This is a retrospective review for the patients who underwent surgical resection at Samsung Medical Center between Jan 2003 and Jun 2004. Immunohistochemical staining for p53 protein was performed on tumor tissues from patients with lung cancer. The p53 overexpression was evaluated in relation to age, sex, smoking history, histology and pathologic stage by univariate and multivariate analyses. The disease-free survival (DFS), disease-specific survival (DSS) and overall survival (OS) were analyzed using the Kaplan-Meier methods and the differences in DFS, DSS and OS were assessed by using the log-rank tests. Results: A total of 125 patients were included in the analysis and a median frequency of p53 expression in tumor tissue was 10%. The p53 overexpression ( 10%) was more common in squamous cell carcinoma (66%) than in adenocarcinoma (38%, p=0.002). The p53 overexpression was more common in pathologic stage IB (59%) than in IA (38%, p=0.002). Patients with p53-overexpressing tumor (27 years) smoked more years compared with those without it (20 years, p=0.032). Smoking history 25 pack-years was more common in patients with p53 overexpression (58%) than in those without it (38%, p=0.024). In the multivariate analysis, only histology was significantly associated with p53 overexpression. However, there were no significant differences of DFS, DSS and OS in relation to p53 status. Conclusion: The p53 overexpression was associated with histology, pathologic stage and smoking history in patients with pathologic stage I NSCLC. However, the p53 overexpression was not associated with patient's survival. (Tuberc Respir Dis 2008;65:487-494) Key Words: p53, Smoking, Non-small cell lung cancer, Survival 서 비소세포폐암은전세계적으로보아서남녀모두암과관련된사망의주요원인이다 1. 최근분자유전학의발전 Address for correspondence: Hojoong Kim, M.D. Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Medicine, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, 50, Irwon-dong, Gangnamgu, Seoul 135-710, Korea Phone: 82-2-3410-3429, Fax: 82-2-3410-6956 E-mail: hjk3425@skku.edu Received: Sep. 20, 2008 Accepted: Oct. 8, 2008 론 을통해서인간의발암과정에다양한종류의암억제유전자들이관여함을알게되었다 2. 폐암에서는염색체 17 번단완의대립유전자소실 (chromosome 17p allele loss) 과 17번염색체 (17p13.1) 에위치하는 p53 유전자의돌연변이가모든조직형의폐암에서가장흔한유전적이상으로알려져있다 3,4. p53 유전자의산물은 53-kD 크기의인산단백질로서체내에서전사인자로작용하여, 표적 (target) 유전자의 promoter 또는인트론 (intron) 의 consensus binding sequence 에결합하여그하부에위치하는표적유전자를활성화시키는것으로알려져있다 5. 주된 p53 단백질의 487
SW Um et al: p53 overexpression in pathologic stage I NSCLC 작용은 G1/S 와 G2/M check point 에서세포주기를조절하고, 세포의아포프토시스 (apoptosis) 를유도하며유전체 (genome) 를안정화시키는것이다 6. 폐암에서대부분의 p53 돌연변이는과오돌연변이 (missense mutation) 이며, 이러한경우종양세포내에변형된 p53 단백질 (aberrant p53 protein) 이축적될수있다 7. 이러한변형된 p53 단백질은인체내에서반감기가 4시간에서 12시간정도로길어서, 세포내축적을면역조직화학염색 (immunohistochemical staining) 으로확인할수있다 7. 한편, wild-type p53 단백질은생물학적반감기가 15 20분정도로매우짧아서면역조직화학염색방법으로검출할수없는것으로알려져있다 7,8. 이전연구에의하면면역조직화학염색에의한 p53 단백질의과발현 (overexpression) 은 p53 유전자의돌연변이와 66% 에서일치하는것으로알려져있다 9. 비소세포폐암에서 p53 과발현및돌연변이는종양의조직형 10,11, 종양의조직분화정도 9, 병기 12 및흡연력과관련이있는것으로알려져있다 13,14. 이전의연구에도불구하고, 폐암에서 p53 단백질의과발현과생존과의관계에대해서는아직도논란이있다. 이전의 p53 단백질과발현과폐암환자의생존에관한연구는다양한병기의환자를포함한이질적인환자군을포함한연구라는제한점을가지고있다. 본연구의목적은수술로절제한병리학적병기 (pathologic stage) 1기인비소세포폐암환자를대상으로 p53 단백질과발현과흡연력을포함한여러임상적특징의관계를평가하고, p53 단백질과발현과예후와의관계를평가하는것이다. 대상및방법 1. 대상환자본연구는삼성서울병원에서 2003년 1월부터 2004년 6 월까지폐암으로치료받은환자를대상으로한후향적연구이다. 모든환자는수술전흉부및상복부 CT (computed tomography) 및 PET (positron emission tomography) 를시행하였으며, 임상적으로적응이되는경우뇌 MRI (magnetic resonance imaging), 단순방사선촬영및골주사검사를시행하였다. 2003년 1월부터 2004년 6월까지삼성서울병원에서 217명의환자가병리학적병기 1 기비소세포폐암으로수술을받았으며, 이환자들의나이, 성별, 흡연력, 조직형 ( 편평세포암, 선암, 대세포암, 세기관지폐포암, 다형암 ), 조직분화정도 (well, moderately 또 는 poorly differentiated), 종양의크기 ( 병변의장경을병리소견에서판단 ), tumor-node-metastasis (TNM) classification of the International System for Staging Lung Cancer 에근거한병리학적병기등을평가하였다 15. 병리학적병기제 1기인비소세포폐암환자중에서다음의조건을만족하는경우연구분석에포함하기로하였다 : (1) 편평세포암또는선암 ( 세기관지폐포암은제외 ), (2) 근치적절제술을시행받은경우 (R0), (3) 엽절제술또는전폐절제술과함께종격동림프절절제술을같이시행한경우, (4) 이전에폐암으로치료받은적이없는경우, (5) 폐암진단 6개월이전에다른악성질환으로진단받은적이없는경우, (6) 수술후 3개월이상증상, 징후및방사선학적검사로추적관찰한경우, (7) 수술직후사망하지않은경우. 본연구는삼성서울병원의 Institutional Review Board 의승인을받았으며, 후향적연구의특징으로인해서개개의환자로부터의동의서는면제할수있다는승인을받았다. 2. 면역조직화학염색환자의종양조직을이용한면역조직화학염색은 avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex (DAKO LSAB kit, USA) 를이용한 immunoperoxidase 방법으로시행하였다. 1차항체로 mouse anti-p53 monoclonal antibody (Clone: BP53.12, Invitrogen & Zymed Technologies, USA) 를이용하였고 1:20으로희석한용액을 1시간동안반응시켰다. 이후 PBS (phosphate buffered saline, ph 7.4) 로 10분간 3회세척한후 2차항체 (biotinylated anti-mouse IgG) 로 30분간다시반응시킨후 PBS 로 10분간 3회세척하였다. Streptavidin-biotin complex peroxidase 와 30분간반응시킨후 PBS로다시 10분간 3회세척하고 diaminobenzidine 과 5분간반응시켜발색반응을일으킨뒤 PBS로 5분간세척후 p53 단백질발현을관찰하였다. 3. 면역조직화학염색의판정종양주변의 non-neoplastic stroma를 internal control 로이용하여, p53 면역조직화학염색양성을보이는종양세포의수를전체종양세포의수로나누어서분율 (%) 을기술하였다. p53 단백질의암조직내발현비율은전체환자군의중앙값을기준으로하여 p53 과발현양성군과음성군으로이분하였다. 488
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 65. No. 6, Dec. 2008 4. 수술후추적관찰모든환자는수술당일로부터이후추적관찰하였다. 수술후첫 1년간은 3개월마다흉부방사선촬영및 CT 검사를시행하였고, 이후 3년까지는 6개월마다상기검사를시행하였다. 3년이후에는 1년마다상기검사를시행하였다. 환자의증상및징후에변화가있는경우, 임상적적응에따라서뇌 CT 또는 MRI, 척추 MRI, 골주사검사, 복부 CT 및조직검사를통해재발여부를확인하려하였다. 암의재발 (recurrence) 은수술후새로운암병소 (cancer foci) 의발생으로정의하였다. 이경우병의재발부위와수술후재발까지의기간을평가하였다. 무병생존기간 (duration of disease free survival, DFS) 은수술일로부터처음암의재발을인지하기까지의기간, 병의재발없이다른이유로사망하기까지의기간, 또는병의재발없이마지막으로임상관찰한날까지의기간으로정의하였다. 질병특이생존기간 (duration of disease specific survival, DSS) 은폐암에의한사망까지의기간으로하였고, 전체생존기간 (duration of overall survival, OS) 은수술후모든원인에의한사망 (all-cause mortality) 까지의기간으로하였으며, 마지막임상관찰에서생존해있는환자는 censored case 로분류하였다. 임상적추적관찰은 2007 년 6월 30일을기준으로분석하였다. 5. 통계분석모든자료는달리언급하지않으면숫자 (%) 또는중앙값 ( 범위 ) 으로기술하였다. 성별, 연령, 흡연력, 조직형등의임상적특징들에따른 p53 발현의차이를평가하기위해서연속변수에대해서는 independent sample T-test 를비연속변수에대해서는 chi-square test가이용되었다. 상기단변량분석에서 p<0.10 인인자와성별및연령을포함하여다변량분석을시행하여폐암조직내에서 p53 단백질과발현과관련된독립된인자를찾고자하였다. 한편, p53 면역조직화학염색과예후와의관계를평가하기위해서 p53의과발현여부에따른 DFS, DSS 및 OS은 Kaplan-Meier 방법으로평가하였고, 군간비교는 logrank test를이용하였다. 폐암의조직형에따른 p53 과발현의임상적의미를평가하기위해각각의폐암조직형에서 p53 과발현여부에따른생존의차이를분석하였다. 모든통계분석은 p<0.05 인경우통계적으로의미가있는것으로판단하였다. 1. 대상환자의특징 Table 1. Clinical characteristics of 125 study patients Characteristics 결 125 명의연구대상환자의특징은 Table 1과같다. 환자군의연령의중앙값은 62세, 남녀성비는각각 74% 와 26% 였다. 비흡연자, 과거흡연자및현재흡연자는각각 30%, 22% 및 48% 였다. 하루흡연량의중앙값은 1갑이었고, 흡연기간의중앙값은 26년이었다. 환자의병리학적병기는 IA와 IB가각각 36% 와 64% 였다. 조직형은편평세포암과선암이각각 47% 와 53% 였다. 조직분화의정도는 well differentiated가 18%, moderately differentiated가 62%, poorly differentiated 가 14% 였으며알수없는경우는 5% 였다. 수술의종류는엽절제술이 94%, 양엽절제술 (bilobectomy) 이 4%, 전폐절제술이 2% 의순이었다. 병리 Number (%) or median (range) Age 62 (38 83) Male / female 92 (73.6%) / 33 (26.4%) Nonsmoker / ex-smoker 38 (30.4%) / 27 (21.6%) / current smoker / 60 (48.0%) Smoking, pack per day 1.0 (0 3.0) Smoking, years 26.0 (0 60.0) Smoking, pack-years 25.0 (0 120.0) Pathologic stage IA 45 (36%) IB 80 (64%) Histology Squamous cell carcinoma 59 (47.2%) Adenocarcinoma 66 (52.8%) Histologic grade of differentiation Well 23 (18.4%) Moderately 78 (62.4%) Poorly 18 (14.4%) Not available 6 (4.8%) Surgery Lobectomy 117 (93.6%) Bilobecomy 5 (4.0%) Pneumonectomy 3 (2.4%) Tumor long diameter, cm 3.0 (0.9 10.0) P53 expression, percent 10.0 (0 100) Median follow-up duration, months 40 (6 52) Disease relapse 29 (23.2%) Local recurrence 22 (17.6%) Distant metastasis 7 (5.6%) Time to disease relapse, months 13 (1 40) Death due to lung cancer 14 (11.2%) Death due to any cause 20 (16.0%) 과 489
SW Um et al: p53 overexpression in pathologic stage I NSCLC 조직에서확인한종양크기의중앙값은 3 cm이었다. 종양조직에서 p53 면역염색양성종양세포빈도의중앙값은 10% 였다. 환자의추적관찰기간의중앙값은 40개월이었으며, 종양이재발한경우는 23% 였다. 재발까지기간의중앙값은 13개월이었으며, 수술후경과관찰중폐암에의한사망은 11%, 모든이유에의한사망은 16% 였다. 2. 종양조직내 p53 과발현종양조직내의 p53 면역조직화학염색에양성인세포빈도의중앙값인 10% 를기준으로그이상인경우에는 p53 과발현이양성인것으로정의하였고, 그미만인경우에는음성인것으로정의하였다. p53 발현의양상을각각의임상양상에따라단변량분석을시행하였다 (Table 2). 단변량분석에서 p53 과발현은조직형, 해부학적병기및흡연력과관련이있었다. 흡연과관련이있다고알려진편평세포암에서 p53 과발현의빈도가 66% (39/59) 로선암의 38% (25/66) 보다통계적으로유의하게증가되어있었다 (p=0.002). 병리학적병기가 IB인경우 p53 과발현의빈도가 59% (47/80) 로 IA의 38% (17/45) 보다증가되어있었다 (p=0.024). p53 과발현된경우와그렇지않은경우에하루흡연량 (pack per day) 으로평가된흡연의강도 에는차이가없었다 (p=0.160). 하지만, 흡연의기간은 p53이과발현된경우 (27년 ) 에그렇지않은경우 (20년 ) 보다통계적으로유의하게길었다 (p=0.032). 25갑년이상의흡연력도 p53이과발현된경우 (58%) 에그렇지않은경우 (38%) 보다더흔하게관찰되었다 (p=0.024). 그러나, 나이, 성별및조직의분화정도와 p53 과발현은관련이없었다. 이상의단변량분석에서종양세포의 p53 과발현과관련이있는것으로평가된인자인조직형, 병기및 25갑년이상의흡연력과함께연령및성별을다변량분석에포함하였다. 다변량분석에서 p53 과발현과관련된인자는조직형뿐인것으로평가되었다. 선암과비교한편평세포암의 p53 과발현의 odds ratio는 3.2 (95% 신뢰구간, 1.5 6.7) 인것으로평가되었다 (p=0.002). 3. 종양조직내 p53 발현과생존의관계전체 125명의환자군의평균 DFS, DSS 및 OS 기간은각각 43.3개월, 48.4 개월및 46.8개월이었다. 전체환자군의 3년 DFS, DSS 및 OS의비율은각각 76.4%, 89.8% 및 85.3% 였다. 전체 125명의환자군에서종양조직의 p53이과발현된경우 (n=64) 와그렇지않은경우 (n=61) 에서평균 DFS, Table 2. Characteristics of patients and biologic features of tumor: comparison according to p53 status Aberrant expression of p53 Negative (<10%) Positive ( 10%) n=61 n=64 p-value Age 61.8±9.0 61.7±9.2 0.912 Sex, male 41 (67.2%) 51 (79.7%) 0.114 Histology 0.002 Squamous cell carcinoma 20 (32.8%) 39 (60.9%) Adenocarcinoma 41 (67.2%) 25 (39.1%) Pathologic stage 0.024 IA 28 (45.9%) 17 (26.6%) IB 33 (54.1%) 47 (73.4%) Histologic grade of differentiation* 0.339 Well 14 (24.6%) 9 (14.5%) Moderately 34 (59.6%) 44 (71.0%) Poorly 9 (15.8%) 9 (14.5%) Non-smoker / smoker 23 (37.7%) / 38 (62.3%) 15 (23.4%) / 49 (76.6%) 0.083 Smoking intensity, PPD 0.74±0.73 0.92±0.68 0.160 Smoking duration, years 19.9±18.4 27.0±18.2 0.032 Smoking 25 pack-years 23 (37.7%) 37 (57.8%) 0.024 Smoking, pack-years 23.6±26.0 32.9±27.3 0.053 Data are presented as mean±standard deviation or number (%). *Six cases are missing due to unavailability for the histologic grade of differentiation, pack per day. 490
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 65. No. 6, Dec. 2008 Figure 1. Disease-free survival (DFS), disease-specific survival (DSS) and overall survival (OS) of patients with lung cancer in relation to p53 overexpression ( 10%). DSS 및 OS 기간은각각 42.6개월과 43.8개월, 48.4개월과 48.5개월, 그리고 45.8개월과 47.9개월로모두통계적으로유의한차이가없었다 (Figure 1). 59명의편평세포암환자에서종양조직의 p53이과발현된경우 (n=39) 와그렇지않은경우 (n=20) 에서평균 DFS, DSS 및 OS 기간은각각 45.3개월과 42.5개월, 50.1개월과 48.2개월, 그리고 46.7개월과 48.2개월로모두통계적으로유의한차이가없었다. 또한, 66명의선암환자에서종양조직의 p53이과발현된경우 (n=25) 와그렇지않은경우 (n=41) 에서평균 DFS, DSS 및 OS 기간은각각 39.9개월과 42.7개월, 44.7개월과 47.7개월, 그리고 43.6개월과 46.8개월로모두통계적으로유의한차이가없었다. 고찰폐암의발생에다수의위험인자가관여함은이미잘알려져있다. 종양억제유전자인 p53 또는 Rb의억제또는돌연변이및발암유전자의항진에의해서폐암이 발생하는것으로이해되고있다. 이러한여러가지폐암발생관련인자중에서 p53 은가장많이연구된분야중의한가지이다. p53의주된작용은 G1/S와 G2/M check point 에서세포주기를조절하고, 세포의아포프토시스를유도하며유전체를안정화시키는것이다 6. p53 단백질의세포내수명은특징적으로매우짧아서정상세포내에서는매우낮은정도로만존재하는것으로알려져있다. 하지만, 종양세포는 wild-type뿐아니라, mutant form의 p53을축적하는것으로알려져있다 7,8. 이전연구결과에의하면비소세포폐암에서 p53 과발현및돌연변이는종양의조직형 10,11, 종양의조직분화정도 9, 병기 12 및흡연력과관련이있는것으로알려져있다 13,14. 종양조직내 p53 과발현또는돌연변이는흡연과관련이있는편평세포암과대세포암에서선암보다흔한것으로알려져있다 9-11. 본연구에서도 p53이과발현 ( 10%) 된경우가편평세포암에서 66%, 선암에서 38% 로 p53 과발현이편평세포암에서선암보다더흔하다는이전의연구결과와부합한다. 한편이전연구에서 p53 과 491
SW Um et al: p53 overexpression in pathologic stage I NSCLC 발현또는돌연변이는진행된병기와관련이있었으며 9,12, 본연구에서도 p53 과발현은 IA 병기에서는 38%, IB 병기에서는 59% 로역시진행된병기와관련이있었다. 하지만, 남성에서여성보다 p53 유전적변이의빈도가흔하고, 조직분화정도와 p53 변이가관련이있음이보고되었으나 9, 본연구에서는그러한결과를확인할수없었다. 흡연과 p53 의변이에관한연구도이미여러차례보고된바가있다. 이전연구에의하면, 흡연량의증가와폐암조직내 p53 과발현및돌연변이가관련이있었다 16-19. 하지만, 다른연구에서는흡연과 p53 과발현이관련이없음이보고된바도있다 12,20. 또한, 흡연량 (pack-years) 및흡연기간과 p53 발현이음의상관관계가있음이보고된바도있다 13. 본연구에서흡연기간과 25갑년이상의흡연력이 p53 과발현과관련이있었으며, 흡연력, 조직형, 병기및성별, 연령을포함하여다변량분석을시행한결과제 1기의수술로절제한비소세포폐암에서조직내 p53 과발현은단지조직형과관련이있었다. 이전의연구에서폐암조직에서 p53 과발현과관련된독립적인자는국내외에보고된바가없다. 한편, 이전의다양한연구에서조직내 p53 과발현또는돌연변이와생존과의관계에대해서분석하였지만서로상이한결과만을보고하고있다 21. 이러한 p53과예후와의관계에대한상이한결과의일부는이전연구들에포함된다양한병기의환자와 p53 돌연변이및과발현에대한연구방법의차이에의해서일부분설명될수있을것이다. 제1기의비소세포폐암을대상으로한이전연구에서도면역조직화학염색으로평가된 p53 과발현은짧은생존과관련된좋지않은예후인자라는보고들과 22-24, 예후와관련이없다는보고가엇갈리고있다 25-27. 본연구에서는면역조직화학염색으로평가한 p53 과발현과예후와는관련이없었다. 한편, 이전의메타분석에의하면 p53 은편평세포암에서는예후인자가아니고, 선암에서만예후인자가될가능성을제시하고있다 10. 하지만, 본연구에서편평세포암과선암환자만을포함한각각의세부군분석 (subgroup analysis) 에서모두 p53 과발현과예후와는관련이없었다. 이상을요약하면, 수술로절제한제1기비소세포폐암조직에서면역조직화학염색으로평가한 p53 과발현은조직형, 병기및흡연력과관련이있었고, 다변량분석에서조직형만이 p53 과발현과관련된독립적인자였다. 하지만, p53 과발현과환자의생존과는관련이없었다. 요약연구배경 : p53 유전자의돌연변이가모든조직형의폐암에서가장흔한유전적이상으로알려져있다. 이전의연구에도불구하고, 폐암조직에서 p53 단백질의과발현과생존과의관계에대해서는아직도논란이있다. 본연구의목적은수술로절제한병리학적병기 1기인비소세포폐암환자에서 p53 단백질과발현과관련된임상적특징을평가하고, p53 단백질과발현과예후와의관계를평가하는것이다. 방법 : 본연구는삼성서울병원에서 2003년 1월부터 2004 년 6월까지폐암으로치료받은환자중병리학적병기제 1기의비소세포폐암환자를대상으로한후향적연구이다. 폐암환자의종양조직을이용하여 p53 단백질에대한면역조직화학염색이시행되었다. 성별, 연령, 흡연력, 조직형및병기등의임상적특징들에따른 p53 과발현여부를단변량및다변량분석으로평가하였다. 한편, p53의과발현여부에따른 DFS, DSS 및 OS은 Kaplan- Meier 방법으로평가하였고, 군간비교는 log-rank test를이용하였다결과 : 125명의연구대상환자에서 p53 면역염색양성종양세포빈도의중앙값은 10% 였다. 편평세포암에서 p53 과발현 ( 10%) 의빈도가 66% 로선암의 38% 보다통계적으로유의하게증가되어있었다 (p=0.002). 병리학적병기가 IB인경우 p53 과발현의빈도가 59% 로 IA의 38% 보다증가되어있었다 (p=0.024). 흡연의기간은 p53 이과발현된경우 (27년) 에그렇지않은경우 (20년) 보다통계적으로유의하게길었다 (p=0.032). 25갑년이상의흡연력도 p53이과발현된경우 (58%) 에그렇지않은경우 (38%) 보다더흔하게관찰되었다 (p=0.024). 다변량분석에서 p53 과발현과관련된인자는편평세포암의조직형뿐인것으로평가되었다 (p=0.002). 한편, p53 과발현여부에따른 DFS, DSS 및 OS의차이는없었으며, 편평세포암과선암의세부군분석에서도생존의차이는없었다. 결론 : 수술로절제한제 1기비소세포폐암조직에서면역조직화학염색으로평가한 p53 과발현은조직형, 병기및흡연력과관련이있었고, 다변량분석에서조직형만이 p53 과발현과관련된독립적인자였다. 하지만, p53 과발현과환자의생존과는관련이없었다. 492
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