ORIGINAL ARTICLE http://dx.doi.org/10.4047/jkap.2014.52.3.211 박진철 1a 김주현 2a 강은숙 3 류재준 4 * 허중보 2 * 1 고려대학교임상치의학대학원심미보철과, 2 부산대학교치의학전문대학원치과보철학교실, 3 인제대학교해운대백병원보철과, 4 고려대학교안암병원치과보철과 Effects of SLA surface treated with NaOH on surface characteristics and response of osteoblast-like cell Jin-Chul Park 1a, Joo-Hyeun Kim 2a, Eun-Sook Kang 3, Jae-Jun Ryu 4 *, Jung-Bo Huh 2 * 1 Graduate School of Clinical Dental Medicine, Korea University, Seoul, Republic of Korea 2 Department of Prosthodontics, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan, Republic of Korea 3 Department of Prosthodontics, In-Je University Haeundae Paik Hospital, Busan, Republic of Korea 4 Division of Prosthodontics, Department of Dentistry, Korea University Anam Hospital,Medical Center, Seoul, Republic of Korea Purpose: The purpose of this study was to evaluate the surface characteristics and response of osteoblast-like cell at SLA surface treated with NaOH. Materials and methods: Three kinds of specimens were fabricated for the experiment groups. Control group was a machined surface, SLA group was a conventionally SLA treated surface, and SLA/NaOH gorup was SLA surface treated with NaOH. To evaluate the surface characteristics, the surface elemental composition (XPS), surface roughness and surface contact angle were evaluated in each group. And the cytotoxicity, cell adhesion, cell proliferation and ATP activity of osteoblast-like cells (MG-63 cells) were compared in each group for evaluatation of the cell responses. Statistical comparisons between groups were carried out via one-way ANOVA using the SPSS software (SPSS Inc., Chicago, USA), and then performed multiple comparisons. The differences were considered statistically significant at P<.05. Results: SLA surface treated with NaOH (SLA / NaOH group) was changed to hydrophilic surface. All groups did not show the cytotoxicity to the MG-63. In cell adhesion studies, SLA / NaOH group showed the higher degree of adhesion than anothers (P<.05), Up to 7 days of incubation, the proliferation was showed the increasing tendency in all groups but SLA / NaOH group showed the highest cell proliferation between the three groups (P<.05). At 7 days of incubation, there was no difference in ALP activities between the three groups, but at 14 days, SLA / NaOH group showed significant increase in ALP activities (P<.05). Conclusion: In this study, SLA surface treated with NaOH promoted cell adhesion, proliferation and differentiation. It means that SLA/NaOH group is possible to promote osseointegration of implants. (J Korean Acad Prosthodont 2014;52:211-21) Key words: SLA surface; NaOH; hydrophilic; MG-63 cell; Cell culture 서론 임플란트는 Bra nemark 1 에의해서처음소개된이후, 많은임상연구 2-6 에서장기간의높은성공률이보고되었으며, 현재는완전무치악및부분무치악뿐만아니라상실된단일치아를회 복하는예측가능한보철치료의한가지방법으로널리이용되고있다. Albrektsson 등 7 은골유착이란광학현미경하에서임플란트가섬유성결합조직의개재없이골조직과직접접촉하여임상적으로움직임이없는상태라고정의하였으며, 골유착을얻 *Corresponding Author: Jae-Jun Ryu Department of Dentistry, Korea University Anam Hospital, 73, Inchon-ro, Seomgbuk-gu, Seoul, 136-705, Republic of Korea +82 29205423: e-mail, koprosth@unitel.co.kr *Corresponding Author: Jung-Bo Huh Department of Prosthodontics, School of Dentistry, Pusan National University, Beomeo-ri, Mulgeumeup, Yangsan, 626-870, Republic of Korea +82 55 360 5130: e-mail, neoplasia96@hanmail.net Article history: Received June 2, 2014 / Last Revision June 30, 2014 / Accepted July 1, 2014 c cc 2014 The Korean Academy of Prosthodontics This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. a These authors contributed equally to this work. pissn 0301-2875, eissn 2005-3789 211
기위해서는임플란트의재질, 디자인, 표면처리방법, 골의상태, 수술기법, 그리고임플란트의부하조건등이중요하다고하였다. 초기에는절삭가공된표면을가진임플란트가주로사용되었으나, 골질이좋지않은상악의경우낮은성공률이보고되었으며, 8-10 골질이좋지않은부위에서도높은성공률을얻고치유기간을단축시키기위해표면거칠기를변화시키거나표면의성질을개선하는여러연구들이진행되었다. 11 표면처리방법으로티타늄플라즈마분사 (Titanium plasma spraying surface), 수산화인회석플라즈마분사 (HA plasma sprayed surface), 분사처리 (Blasted surface), 산부식 (Acid etched surface), 분사처리와산부식의병용 (Sandblasted, Large-grit, Acid etched surface), 다공성소결처리 (Porous sintered surface), 양극산화법 (Anodic Oxidation) 등이개발되어사용되고있다. 12 티타늄임플란트의표면에수산화인회석분말을플라즈마분사하여코팅하거나, 고온용융된티타늄입자를빠른속도로분사하는방식의표면처리법은수산화인회석계면의문제나티타늄입자들의조직내유리의문제점이보고되었다. 11,13 알루미나입자를이용한분사처리법은입자들이임플란트표면에자주박히기때문에이를제거하기위하여초음파세척과산부식같은세척과정을거쳐야한다. 그러나세척후에도일부입자가임플란트표면에잔존하며, 식립후조직내로유리되어골융합을방해하는단점이있다. 11,14 이런문제를해결하기위해체내에서흡수될수있는수산화인회석입자나인산칼슘을임플란트표면에분사하는 RBM(resorbable blasting media) 표면처리법이소개되었다. 15-17 Buser 등 18 은큰입자 (250-500 μm) 를분사하여 macro-roughness 를부여하고산부식 (HCl/H2SO4) 에의해 micro-roughness 를부여하는 SLA 표면이조직형태계측학적연구에서골침착을향상시켰고, 생역학적실험에서더높은제거토크값 (removal torque value) 을얻었다고보고하였으며, 19 식립 6 주만에 SLA 임플란트에부하를가하는임상연구를시작하여, 5 년까지의실험결과는 99% 의성공률을보고하였다. 20 양극산화법은고온의전해질용매에임플란트를담그고이를양극으로하여전기화학적자극을가하여표면의산화막의두께와형태를조절하는빙법이다. Sul 등 21,22 은양극산화법과그응용에관한일련의연구를통하여결정도가높고, 산화막이두꺼울수록골반응이양호했으며칼슘이함유된군에서더나은골반응을보였다고보고하였다. 최근에는티타늄을수산화나트륨 (NaOH) 용액에침적시킨후열처리하여나노구조의나트륨티탄산염 (sodium titanate) 을형성시키는방법이보고되었다. 이렇게처리된티타늄을유사체액 (SBF: simulated body fluid) 에침적시키면 Na + 와 H3O + 이온간의이온교환을통하여 Ti-OH 군을형성함으로써임플란트표면이전기적으로음의전하를가지게된다. 따라서 SBF 용액내의 Ca 2+ 이온들이임플란트표면에빠르게흡착되어칼슘티탄산염 (calcium titanate) 를형성하게되고이것들이점차적으로결정 질아파타이트 (crystalline apatite) 로전환되기때문에임플란트의생체활성도가크게증가하게된다. 14,23 표면의젖음성은표면에너지에크게의존하며, 임플란트표면과생물학적환경사이의상호작용을개선시킨다. 24 MacDonald 등 25 과 Rupp 등 26 은임플란트의젖음성이좋으면골유착이유리하다고하였다. 임플란트는식립후초기에조직액과반응하여임플란트표면에서 fibronectin 같은세포부착단백질의흡착이일어난다. 거친표면을갖고표면에너지가높은임플란트는초기단백질흡착이더많이일어나고결과적으로골모세포들의부착을증가시키기때문에골유착에유리하다. 표면거칠기 (Ra) 는임플란트표면의거칠기를나타내기위해널리사용되는 height parameter 이다. 하지만비슷한거칠기 (Ra) 를가지는임플란트표면이라도매우다른표면형태를가지며표면에너지에따라초기흡착량에많은차이가나타난다. 27 이런흡착량은정적접촉각측정방법인 Sessile drop method 로측정가능하다. Yanagisawa 등 28 은접촉각이세포의부착과확산속도에영향을미친다고하였다. 접촉각이작으면, 즉높은젖음성을가지면세포의부착정도가높고, 접촉각이크면세포부착정도가낮다. Smith 등 29 은여러다른표면처리를한 Ti-6Al-4V 합금, Co-Cr-Mo 합금, alumina, 합성 hydroxyapatite 의젖음성을연구하였다. detergent-cleaning 후두합금의표면에서젖음성이개선되는효과를나타냈으며, 그후 plasma 처리를한것이가장큰젖음성개선효과를나타냈다. MacDonald 등 30 은 Ti-6Al-4V 합금을열처리하거나과산화수소처리시아무런처치를하지않은합금보다친수성이증가한다고보고하였다. Rupp 등 31 은 sandblasting 과산부식후 N2 의보호하에서세척되고등장성의 NaCl 용액에보관되는 modified SLA surface (SLActive) 가공기와의접촉을통해오염되지않으므로젖음성이증가한다는가정하에 dynamic wettability measurements 를실행하였고, 그결과 modified SLA surface 는 surface free energy (SFE) 가증가하고친수성이증가하였다고보고하였다. Kim 등 32 은알칼리처리된티타늄표면의젖음성이접촉각측정을통해연구되었고, 5 M NaOH 또는 5 M KOH 용액에침적된티타늄이친수성표면을가진다고보고되었다. 친수성표면을만드는여러방법중에알칼리처리된티타늄에대해세포반응을알아본연구는많지않다. 따라서본연구에서는기존의 SLA 표면을높은친수성을가지는표면으로개질하고자 NaOH 에침적하는방법이 SLA 표면형상및특성에어떤영향을미치는지알아보고, 골모유사세포의증식, 부착및분화에어떤영향을미치는지알아보고자계획되었다. 재료및방법 1. 연구재료및시편준비 지름 10 mm, 두께 3 mm 인 Grade IV 치과용티타늄 (FORT WAYNE METALS, Fort Wayne, Indiana, USA) 디스크를제작하여 212 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월
모든분석과세포실험을진행하였다. 실험군은모두 3 군으로나누어실시하였다. 제 1 군은대조군으로표면처리를하지않은 machined surface 이다. 절삭유제거를위해에칠알콜을사용하여 10 분간초음파세척을 3 회실시한후 70 에서건조하였다. 첫번째실험군은 SLA surface 로 HA powder 를 2 atom 의압력으로 10 초동안 150 mm 거리에서분사하였다. 그이후 H2SO4 : HCl : H2O 를 3.5 : 3.5 : valance 로상온에서 1 분간산처리하였다. 두번째실험군은 SLA surface 와동일처치후 5% NaOH 로 1 시간처치한후세척하였다. 모든시편의제작및표면처리는 ( 주 ) 네오바이오텍에서시행하였고, SLA 표면제작을위한일부과정은공개를원치않았다. 2. 표면특성평가 표면처치후티타늄시편의표면구성성분은 X-ray photoelectron spectroscopy (K-Alpha spectrometer, Thermo Electron, Austin, Texas, USA) 를이용하여분석하였다. 본연구에서는칼슘 (Ca), 인 (P), 탄소 (C), 산소 (O), 질소 (N) 그리고티타늄 (Ti) 을포함한여섯가지원소를측정하여각시편의표면성분변화를비교평가하였다. 각시편의거칠기분석을위하여비접촉식 3 차원측정기 (Non-Contact 3D Video Measuring Machine, Video Check IP600, Werth Messtechnik GmbH, Giessen, Hesse, German) 를이용하였다. 측정조건은 scan range 20 μm, probe 의주파수는 0.5 Hz 이하로설정하였다. 시편의표면을 9 등분 ( 상좌, 상중, 상우, 중좌, 중중, 중우, 하좌, 하중, 하우 ) 한다음각면에대하여표면거칠기 (Ra) 를측정하였고그평균을구하였다. 각군당 9 개씩의시편을평가하였다각시편의표면형상은주사전자현미경 (Hitachi S-4700 SEM, Hitachi, Tokyo, Japan) 을이용하였고 2000 배의확대비율로각시편을관찰하였다. 친수성평가는각시편의접촉각을 Phoenix 300(SEO, Suwon, Gyeonggi-do, Korea) 을이용하여측정하였고, 시편당 3 μl 의멸균생리식염수 (JW Pharmaceutical, Seoul, Korea) 를시험용액으로하였다. 접촉각의측정범위 (Measurement range for contact) 는 0-180 도, 측정정확도 (measurement accuracy) 는 ± 0.1 도이었다. 각시편당 5 개씩측정하였다. 3. 세포반응평가 (1) 세포배양 100% 습도가유지되는 37, 95% 의공기와 5% CO2 조건하에서 MG-63 세포 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) 를기본배양하였다. 이때사용한배지는 10% Fetal bovine serum (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) 과 1% penicillin-streptomycin (PAA) 이첨가된 Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM) 이다. 모든 in vitro 실험에서, 골모유사세포는분화유도배지 [50 μg/ml ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 mm β-glycerophosphate (Sigma-Aldrich), 100 nm dexamethasone (Sigma-Aldrich), 10% FBS 그리고 1% penicillin-streptomycin 을포함하는 DMEM] 에서배양하였다. (2) 세포독성평가 24-transwell culture plate 에 machined surface (control group), SLA surface (SLA group), SLA 에 NaOH 처리한표면 (SLA/NaOH group) 의각시편을넣고, MG-63 세포를 5 10 4 개의세포수가되도록분주하였다. 각각 24 시간동안 37 에서배양한후시료에대한세포독성을평가하기위해 CCK-8 (Dojindo, Tokyo, Japan) 시약을각각 10 μl 처리하고 1 시간동안 37 에서반응시켰다. 시약을주의하여 96-well plate 에옮기고 microplate reader 를사용하여흡광도 450 nm 에서값을측정하였다. 각그룹에서 3 번배양및독성평가를시행하였다. (3) 세포부착평가각시편에서의세포의부착을평가하기위해 crystal violet assay 를시행하였다. MG-63 세포를각시편이들어있는 24-well plate 에 4 10 4 개의세포수가되도록분주하여 3 시간동안 37 에서배양하였다. 그후 PBS (Phosphate buffer saline ph 7.2) 200 μl 사용하여부착되지않은세포들을제거하였다. 부착된세포들은 10% 에탄올에서 0.2% crystal violet (Sigma-Aldrich, wt/vol) 으로염색하고 5 분동안실온에서보관하였다. 남아있는염색약은 PBS (ph 7.2) 로 4 번세척하여제거하였다. 염색된세포들은실온에서 15 분동안용해시켜 96-well plate 로조심스럽게옮겼다. enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) analyzer (Quant, Bio-Tek, Highland Park, USA) 를사용하여 590 nm 에서의흡광도를측정하였다. (4) F-actin 염색각시편위에서성장한골모유사세포의세포형태를 F-actin 염색으로평가하였다. 세포를 1 10 4 세포수가되도록분주하여 24 시간동안배양후, 각시편은 PBS (ph 7.2) 로세척하였다. 각시편위에서성장한세포들을 10 분동안 PBS (ph 7.2) 에서 4% paraformaldehyde 로고정후, 각시편을 PBS (ph 7.2) 로세척하였다. 고정후, 각시편에서성장한세포들을 37 에서 10 분동안은 0.1% Triton X-100 에그리고 30 분동안은 blocking solution (ImageiT FX signal enhancer, Invitrogen, Eugene, OR, USA) 에침지하였다. 그후, 30 분동안 37, 3% Bovine serum albumin (BSA) 에서 rhodamine phalloidin (Invitrogen) 로세포를염색하였다. 37 에서 24 시간동안각티타늄시편은 mounting solution (ProLong gold antifade reagent with DAPI, Invitrogen) 과함께 microscope slide 에마운팅하였고, confocal laser scanning microscope (LSM700, Zeiss, Oberkochen, Germany) 으로관찰하였다. (5) 세포증식측정 MG-63 세포를각시편에 1 10 4 개의세포수가되도록 200 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월 213
μl/well 분주하였다. 배양 3 일과 7 일에각샘플을 PBS (ph 7.2) 로세척하였다. Water soluble Tetrazolium salt (WST) assay kit reagents 를 10 μl/well 처리하고추가로 2 시간동안 CO2 incubation 에서배양하였다. 그후용액을 96-well plate 에조심스럽게옮기고, assay solution (EZ-cytox) 10 μl/well 첨가하여 30 분 incubation 시킨후 ELISA analyzer (Sunrise, Tecan, Salzburg, Austria) 를사용하여 450 nm 에서광학밀도를측정하였다. (6) 염기성인산분해효소 (ALP) 활성도측정세포를각시편의표면에 5 10 3 개의세포수가되도록분주하고, 골모유사세포의초기분화를평가하기위해 ALP 활성도를배양 7 일과 14 일에측정하였다. 배양 7 일과 14 일에세포를 PBS (ph 7.2) 로세척하고, lysis buffer[10 mm Tris/HCl, (ph 7.2), 1% Triton X-100, 150 nm NaCl, 5 mm Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 2 mm Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 2 μg/ml aprotinin and 2 μg/ml leupeptin] 를첨가하였다. Cell lysis buffer 500 μl 에서세포를 Vibra Cell TM instrument (Sonics & Materials INC., Danbury, CT, USA) 로얼음에서초음파분쇄하였다. 그후, 세포잔해를제거하기위해세포용해물을 10 분동안 4 에서 15,000 rpm 로원심분리하였다. 37 에서 15 분동안 p-nitrophenyl phosphate 용액과함께상층액을배양하였다. 0.5 N NaOH 을첨가하여반응을중지시켰다. ALP 활성도는 p-nitrophenyl phosphate 가 p-nitrophenol 변환되는것을측정함으로써결정된다. ELISA analyzer (Sunrise) 를이용하여 405 nm 에서광학밀도를측정하였다. (7) 통계분석모든자료는표준 ± 표준편차로표기하였다. 모든실험은 3 번반복하였다. 그룹간의통계학적비교는 SPSS software (SPSS Inc., Chicago, USA) 를사용하여 one-way ANOVA 통해이루어졌고, ANOVA 후다중비교를시행하였다 (P<.05). Table 1. The surface elemental compositions of each group analyzed by X-ray photoelectron spectroscopy Group C (%) N (%) O (%) P (%) Ca (%) Ti (%) Machined 6.10 0.83 58.85 0.21-34.02 SLA 14.10 1.06 57.96 - - 26.85 SLA/NaOH 23.23 0.89 51.79-5.73 18.35 A B C 결과 1. 표면특성평가 (1) XPS 표면성분분석세군의시편에서 XPS 분석을통해칼슘 (Ca), 인 (P), 탄소 (C), 산소 (O), 질소 (N) 그리고티타늄 (Ti) 의성분비를측정하였다. 각군의성분비는 Table 1 과같다. Machined 군과비교하여 SLA 군은탄소성분이많이검출되었고 SLA/NaOH 군은탄소와칼슘의함량이증대되는반면산소와티타늄의비율이감소하는것을알수있었다. (2) 표면거칠기평가각시편의거칠기분석을위하여비접촉식 3 차원측정기 (Non-Contact 3D Video Measuring Machine, Video Check IP600, Werth Messtechnik GmbH, Giessen, Hesse, German) 를이용하였고, 표 Fig. 1. Non-Contact 3D Video Measuring images of each group. (A) Machined, (B) SLA, (C) SLA/NaOH group. 면거칠기 (Ra, arithmetic average of the deviation of peaks and valleys on the profile from the mean line) 를측정하였다. 각그룹의거칠기는 machined 군에서 0.183 ± 0.029 μm, SLA 군에서 2.570 ± 0.182 μm 그리고 SLA/NaOH 군에서 2.114 ± 0.216 μm 의 Ra 값을보였다. SLA 처치후 NaOH 처리를함으로써 18% 가량의거칠기감소를보였다 (Fig. 1). 214 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월
A B C Fig. 2. scanning electron microscope (Hitachi S-4700 SEM, Japan) images of each group ( 2000 magnification). (A) Machined, (B) SLA, (C) SLA/NaOH group. A B C Fig. 3. Contact angle of each group. (A) machined group, (B) SLA group, (C) SLA/NaOH group. (3) 표면형상관찰각군의표면형상은주사전자현미경 (Hitachi S-4700 SEM, Hitachi, Tokyo, Japan) 을이용하여 2000 배의확대비율로관찰하였을때 Fig. 2 와같이실험군에서거친면을확인할수있었다. SLA 군과 SLA/NaOH 군은큰차이를보이지않았으나 SLA/NaOH 군에서거친면의 peak 가 SLA 군보다더둥근형태를보여 NaOH 에의한부식을관찰할수있었다. (4) 친수성평가각시편을 5 개씩측정하여구한접촉각의평균 ( 표준편차 ) 는 machined 군이 113.44 ± 9.85 도, SLA 군이 120.66 ± 6.71 도, SLA/NaOH 군이 5.59 ± 1.13 도이었다. NaOH 처치를통해완전한친수성표면이됨을알수있었고, SLA/NaOH 군의경우접촉각을구하긴하였지만그측정이어려울정도로표면전체로물이퍼져정확한측정은불가능하였다 (Fig. 3). 2. 세포반응평가 (1) 세포독성평가 Fig. 4 에서처럼, machined 군, SLA 군그리고 SLA/NaOH 군에서의세포의생활력이 24 시간동안간접법에의해평가되었다. 대조군과비교할때모든군에서세포생활력이 98% 이상유지되 Cell viability (% of control) 98.6 98.4 98.2 98.0 97.8 97.6 97.4 97.2 97.0 96.8 96.6 Control Machined SLA SLA/NaOH Fig. 4. Cytotoxicity test of machined group, SLA group and SLA/NaOH group against osteoblasts (MG-63 cells). 었다. 모든군들은 MG-63 세포에대해세포독성을가지지않았다. 또한대부분의 MG-63 세포는 machined 군, SLA 군그리고 SLA/NaOH 군에서배양 24 시간후살아있었다 (Fig. 5). (2) 세포부착평가모든시편에부착된 MG-63 세포의세포형태및세포골격을 confocal laser scanning microscope 로관찰하였다 (Fig. 6). 이이미지 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월 215
A B C Fig. 5. Live/dead assay for machined group, SLA group and SLA/NaOH group against osteoblasts (MG-63 cells). A B C Fig. 6. Cells adhesion and spread of MG-63 cells on machined group, SLA group and SLA/NaOH group after 1 day. Cell adhesion (OD at 590 nm) 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 Cell proliferation (OD at 450 nm) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Machined SLA SLA/NaOH 0 Machined SLA SLA/NaOH Fig. 7. Cells adhesion of MG-63 cells on machined group, SLA group and SLA/NaOH group after 3 h. 0 3 days 7 days Fig. 8. Cell proliferation of osteoblast-like cells (MG-63 cells) grown on machined group, SLA group and SLA/NaOH group after day 3, and day 7. 들은 SLA 군과 SLA/NaOH 군에서의 MG-63 세포가 machined 군에서보다더많이부착되어있고넓게퍼져있다는것을보여준다. Crystal violet assay 를통한세포부착평가에서도 Fig. 7 과같이 SLA/NaOH 군에서가장높은부착정도를보였고 (P<.05), Machined 군과 SLA 군에서도표면거칠기가높은 SLA 군에서더높은세포부착정도를확인할수있었다 (P<.05). (3) 세포증식 3 일그리고 7 일에각군에서 MG-63 세포의증식을평가하였다 (Fig. 8). 배양 7 일까지모든군에서 MG-63 세포의증식이점차증가하였다. 모든군에서 3 일과 7 일에세포의증식에서유의할만한차이가보였고 SLA/NaOH 군에서가장높은세포증식을보였다. 216 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월
Cell proliferation (OD at 405 nm) Fig. 9. ALP activity of osteoblast-like cells (MG-63 cells) cultured on machined group, SLA group and SLA/NaOH group after 7 and 14 day. (4) ALP 활성골모유사세포의초기분화를평가하기위해, 7 일과 14 일에 ALP 활성도를평가하였다. Fig. 9 에서처럼, 7 일에서는세군사이에차이가없었다. 하지만 14 일에는 SLA/NaOH 군이유의성있는증대를보였다 (P<.05). 하지만 SLA 군과 machined 군사이에는기간별유의성을관찰할수없었다 (P>.05). 고찰 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 7 days 14 days Machined SLA SLA/NaOH 임플란트가상실된치아를대신하여기능과심미를회복하기위해서는임플란트가섬유성결합조직의개재없이골조직과직접접촉하여임상적으로움직임이없는골유착을이루어야한다. Albrektsson 등 7 은골유착을얻기위해서는임플란트의재질, 디자인, 표면처리방법, 골의상태, 수술기법, 그리고임플란트의부하조건등이중요하다고하였다. 임플란트의표면거칠기를변화시켜표면적을증가시키거나임플란트표면의물리화학적성질을개선하여티타늄의생체활성도를증진시켜, 임플란트매식직후골과임플란트사이에더나은기계적안정성을얻고, 19,33,34 혈병을더잘유지할수있는표면형태를제공하며, 35 세포의부착과성장에영향을주어골치유를촉진시키는방법들이제시되고있다. 36 이중알칼리와열처리를통한표면처리방법으로쉽고저렴하게티타늄의생체활성도를증진시킬수있다고보고되고있다. Kokubo 등 23 의연구에따르면티타늄금속은얇고화학적으로안정한 TiO2 층으로둘러쌓여있다. 이 TiO2 층이 NaOH 용액과반응하여나트륨티탄산염겔 (sodium titanate gel) 을형성하는데, 이겔층은적절한열처리를통해무정형의나트륨티탄산염층으로안정화된다. 이나트륨티탄산염층은생체에서표면의 Na + 이온과주위의조직액에서의 H3O + 이온의교환을통해표면에많은 Ti-OH 그룹을형성한다. NaOH 처리와열처리한티타늄을유사체액 (SBF: simulated body fluid) 에침적시키면 Ca 2+ 이온과결합하여무정형의칼슘티탄산염 (calcium titanate) 을형성하고, 골과유사한아파타이트 (bone-like apatite) 로전환된다고보고하였다. 그리고이골과유사한아파타이트층에서세포의 ALP 활성이증가되고골과직접적으로결합한다고보고하였다. 10 본연구를통하여기존에상용화되고있는 SLA 표면에 NaOH 를처리함으로써높은친수성표면을만들고이러한방법으로만들어진친수성표면이골모유사세포의증식, 부착및분화에어떤영향을미치는지알아보고자하였다. Machined surface (control group), SLA surface (SLA group), SLA 에 NaOH 처리한표면 (SLA/NaOH group) 의각시편을제조하여친수성을극대화한 SLA/NaOH 군의표면특성을평가하기위해표면성분 (XPS), 표면거칠기, 표면접촉각등을평가하였다. 표면성분분석에서 Kokubo 등 23 은 NaOH 처리와열처리의결과로표면층에서아무런처리도하지않은티타늄보다나트륨과산소가증가하고티타늄의비율이감소하였다고보고하였고, SBF 에침지하는시간이증가할수록빠르게 Na + 을방출하고 Ti-OH 를형성하면서산소의비율이증가한다하였다. 본실험에서는 Machined 군과비교하여 SLA/NaOH 군은산소와티타늄의비율이감소하였고탄소함량은증가하였다. 산소와티타늄비율의감소는임플란트표면의산화막이감소하고나트륨티탄산염이형성된결과로생각되고탄소의증가는임플란트표면처리과정에서높은압력과상승된온도로인해대기중에존재하는다량의탄소가표면에흡착되었기때문인것으로생각된다. Kokubo 등 23 의실험결과와의차이를보이는것은표면개질방법의차이로기인된것이라생각된다. 이번연구에서는 NaOH 처치후열처리를시행하지않았으며 NaOH 처치시간도 1 시간으로 24 시간을처치한이전연구보다짧았다. 이번연구에서는 NaOH 처치를통해표면형상개질을하고자한것이아니라단순히친수성표면만만들고자하였기에그처리시간을최소화하였다. Wennerberg 등 37 은표면거칠기측정시 optical profiling instrument 만이나사형태의임플란트디자인을적절히평가할수있는유일한방법이라고하였다. 임플란트표면에직접측정팁을접촉시켜표면거칠기를측정하는 mechanical contact profilometer 를사용시임플란트표면이손상될뿐아니라, 좁고깊은틈에는측정팁의적용이제한되므로정확한거칠기값을측정할수없다. 따라서본실험에서는실험시편을제작한후표면거칠기를측정하기위해비접촉식 3 차원측정기 (Non- Contact 3D Video Measuring Machine, Video Check IP600, Werth Messtechnik GmbH, Giessen, Hesse, Germany) 를이용하였다. 또한주사전자현미경사진을비교하여표면처리에따른표면구조의현미경적변화를관찰하였다. SLA 군에서 2.570 ± 0.182 μm 그리고 SLA/NaOH 군에서 2.114 ± 0.216 μm 의 Ra 값을보였다. SLA 처치후 NaOH 처리를함으로써 18% 가량의거칠기감소를보였다. 마찬가지로 SLA 군과 SLA/NaOH 군은주사전자현미경상에서큰차이를보이지않았으나 SLA/NaOH 군에서거친면 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월 217
의 peak 가 SLA 군보다더둥근형태를보여 NaOH 에의한부식을관찰할수있었다. 표면의젖음성은표면에너지에크게의존하며, 임플란트표면과생물학적환경사이의상호작용을개선시킨다. 38 MacDonald 등 39 과 Rupp 등 40 은임플란트의젖음성이좋으면골유착이유리하다고하였다. 임플란트는식립후초기에조직액과반응하여임플란트표면에서 fibronectin 같은세포부착단백질의흡착이일어난다. 거친표면을갖고표면에너지가높은임플란트는초기단백질흡착이더많이일어나고결과적으로골모세포들의부착을증가시키기때문에골유착에유리하다. 하지만비슷한거칠기를가지는표면구조라도표면에너지에의해서초기흡착량에많은차이가나타난다. 이런흡착량은정적접촉각측정방법인 Sessile drop method 로측정가능하다. 본연구의결과에서 SLA 표면에 NaOH 처치를통해얻은 SLA/NaOH 군은완전한친수성표면이되었음을알수있었고, 접촉각을구하긴하였지만그측정이어려울정도로표면전체로물이퍼져정확한측정은불가능하였다본연구에서는 Machined surface ( 대조군 ), SLA surface (SLA 군 ), SLA 에 NaOH 처리한표면 (SLA/NaOH 군 ) 의각시편을디스크형태로제작하여골모유사세포의반응을알아보았다. 쥐유래 MG-63 세포는골모세포의특성을가지고있다. 이세포들은티타늄표면과의반응에서골형성기능을연구하기위한대표적인세포배양모델로간주된다. 하지만 MG-63 세포의증식이나 ALP 활성도는골형성기능연구에적합하지는않다. 41 본연구에서는표면에따른세포반응을평가하고자하였고골형성기능연구는아니었으므로 MG-63 세포를채택하였다. 더높은임플란트표면에너지는젖음성때문에표면에더많은세포들이결합함으로써세포부착을향상시킨다고보고하였다. 25 Lai 등 42 은 SLA 와표면에너지를극대화한 modsla 에서의세포부착율은 1 시간과 3 시간에만통계학적으로유의미한차이가있다고보고되었다. 이것은세포부착이초기 3 시간안에표면에너지와관계가있다는것을의미한다. 표면젖음성은표면에너지에의존하고임플란트의표면과생물학적환경과의관계를향상시키고, 따라서세포의부착, 세포의분화, 기질형성과광화에영향을미친다. 24 본실험의결과를보면 SLA 군과 SLA/NaOH 군에서 Machined 군에서보다 MG-63 세포가더많이부착되어있고넓게퍼져있다는것을보여준다. SLA 군과 SLA/NaOH 군에서 MG-63 세포의형태는다각형의형태를가지고있으며, 두군간의차이는별로없어보인다. 이것은세포의형태가표면에너지보다는표면형태에더많이영향을받기때문이다. 42 Machined 군의경우납작한세포의형태를가지고있다. 세포부착평가에서 SLA/NaOH 군에서가장높은부착정도를보였고, 이것은표면에너지가높고친수성인표면에서세포부착이더잘이루어짐을의미한다. Machined 군과 SLA 군에서도표면거칠기가높은 SLA 군에서더높은세포부착정도를확인할수있었다. 이것은큰입자 (250-500 μm) 를분사하여 macro-roughness 를부여하고산부식 (HCl/H2SO4) 에의해 microroughness 를부여한 SLA 는중등도의표면거칠기 (moderately rough surface, Sa 1.0-2.0 μm) 를가지고있어골반응에적합한거칠기를가진것으로생각된다. 본실험에서배양 7 일까지모든군에서 MG-63 세포의증식이점차증가하였다. 모든군에서 3, 7 일에세포의증식에서유의할만한차이가보였고 SLA/NaOH 군에서가장높은세포증식을보였다. 골모세포의초기분화를평가하기위한 ALP 활성도평가에서 7 일에서는세군사이에차이가없지만, 14 일에는 SLA/NaOH 군이유의성있는증대를보였다 (P<.05). 하지만 SLA 군과 machined 군사이에는기간별유의성을관찰할수없었다 (P>.05). 결론 친수성표면이골유착에긍정적이라는연구들이많이있어왔으나기존의 SLA 표면에 NaOH 염기처리를통한수화방식에대해연구된바는거의없었다. 본연구를통하여이런수화방식을통해 SLA 표면을변형시킴으로서세포의부착, 증식및분화를더욱촉진시켜임플란트의골유착을증진시킬수있는가능성을확인하였으며향후이와같은표면을개발하는기초자료로활용할수있으리라사료된다. References 1. Bra nemark PI, Adell R, Breine U, Hansson BO, Lindström J, Ohlsson A. Intra-osseous anchorage of dental prostheses. I. Experimental studies. Scand J Plast Reconstr Surg 1969;3:81-100. 2. Adell R, Lekholm U, Rockler B, Bra nemark PI. A 15-year study of osseointegrated implants in the treatment of the edentulous jaw. Int J Oral Surg 1981;10:387-416. 3. Lindquist LW, Carlsson GE, Jemt T. A prospective 15-year follow-up study of mandibular fixed prostheses supported by osseointegrated implants. Clinical results and marginal bone loss. Clin Oral Implants Res 1996;7:329-36. 4. Lekholm U, Gunne J, Henry P, Higuchi K, Linde n U, Bergström C, van Steenberghe D. Survival of the Bra nemark implant in partially edentulous jaws: a 10-year prospective multicenter study. Int J Oral Maxillofac Implants 1999;14:639-45. 5. Brocard D, Barthet P, Baysse E, Duffort JF, Eller P, Justumus P, Marin P, Oscaby F, Simonet T, Benque E, Brunel G. A multicenter report on 1,022 consecutively placed ITI implants: a 7-year longitudinal study. Int J Oral Maxillofac Implants 2000;15:691-700. 6. Jemt T, Johansson J. Implant treatment in the edentulous maxillae: a 15-year follow-up study on 76 consecutive patients provided with fixed prostheses. Clin Implant Dent Relat Res 2006;8:61-9. 7. Albrektsson T, Bra nemark PI, Hansson HA, Lindström J. Osseointegrated titanium implants. Requirements for ensuring a long-lasting, direct bone-to-implant anchorage in man. Acta Orthop 218 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월
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ORIGINAL ARTICLE 박진철 1a 김주현 2a 강은숙 3 류재준 4 * 허중보 2 * 1 고려대학교임상치의학대학원심미보철과, 2 부산대학교치의학전문대학원치과보철학교실, 3 인제대학교해운대백병원보철과, 4 고려대학교안암병원치과보철과 목적 : 기존의 SLA 표면을높은친수성을가지는표면으로개질하고자 NaOH 에침적하는방법이 SLA 표면형상및특성에어떤영향을미치는지알아보고, 골모유사세포의증식, 부착및분화에어떤영향을미치는지알아보고자계획되었다. 재료및방법 : Machined surface ( 대조군 ), SLA surface (SLA 군 ), SLA 에 NaOH 처리한표면 (SLA/NaOH 군 ) 의각시편을제조하고친수성을극대화한 SLA/NaOH 군의표면특성을평가하기위해표면성분 (XPS), 표면거칠기, 표면접촉각등을평가하였다. 그이후 MG-63 세포배양후이번실험에서만든표면들이세포독성을가지는지를평가하고, WST assay 를통하여세포증식, F-actin 염색을통하여세포의부착형태를관찰하였다. 이후 ALP assay 를통하여세포분화를평가하였다. 각군간통계측정을위해 ANOVA 후다중비교를하였다 (P<.05). 결과 : SLA/NaOH 군의접촉각은 5.59 ± 1.13 도였다. 모든군들은 MG-63 세포에대해세포독성을가지지않았다. 세포부착평가에서 SLA/NaOH 군에서가장높은부착정도를보였고 (P<.05), Machined 군과 SLA 군에서도표면거칠기가높은 SLA 군에서더높은세포부착정도를확인할수있었다 (P<.05). 배양 7 일까지모든군에서 MG-63 세포의증식이점차증가하였다. 모든군에서 3 일과 7 일에세포의증식에서유의할만한차이가보였고, SLA/NaOH 군에서가장높은세포증식을보였다. ALP 활성도는 7 일에서는세군사이에차이가없었다. 하지만 14 일에는 SLA/NaOH 군이유의성있는증대를보였다 (P<.05). 결론 : 본연구를통하여 NaOH 를처리하는수화방식을통해 SLA 표면을변형시킴으로서세포의부착, 증식및분화를촉진시켜임플란트의골유착을증진시킬수있는가능성을확인하였다. ( 대한치과보철학회지 2014;52:211-21) 주요단어 : SLA 표면 ; 수산화나트륨 ; 친수성 ; MG-63 세포 ; 세포배양 * 교신저자 : 류재준 136-705 서울시성북구안암동 5 가, 고려대학교안암병원치과보철과 02-920-5423: e-mail, koprosth@unitel.co.kr * 교신저자 : 허중보 626-870 경남양산시물금읍범어리부산대학교치의학전문대학원치과보철학교실 055-360-5130: e-mail, neoplasia96@hanmail.net 원고접수일 : 2014 년 6 월 2 일 / 원고최종수정일 : 2014 년 6 월 30 일 / 원고채택일 : 2014 년 7 월 1 일 c 2014 대한치과보철학회 cc 이글은크리에이티브커먼즈코리아저작자표시-비영리 3.0 대한민국라이선스에따라이용하실수있습니다. a 두저자는본연구에동일한기여를하였음. 대한치과보철학회지 52 권 3 호, 2014 년 7 월 221