J Korean Soc Transplant 2012;26:92-100 http://dx.doi.org/10.4285/jkstn.2012.26.2.92 Original Article 장기이식환자에서유세포교차시험결과와 Luminex-PRA 검사로검출되는공여자 - 특이항체의비교평가 서울대학교의과대학검사의학교실 1, 한림대학교성심병원진단검사의학과 2, 인제대학교의과대학서울백병원진단검사의학과 3 김선영 1 ㆍ한복연 1 ㆍ현정원 2 ㆍ주신영 3 ㆍ송은영 1 ㆍ박명희 1 Evaluation of Flow Cytometric Crossmatch Results in Comparison with Donor-specific Antibodies Detected by Luminex-PRA Tests in Organ Transplantation Patients Seon Young Kim, M.D. 1, Bok Youn Han, M.T. 1, Jungwon Hyun, M.D. 2, Shin Young Joo, M.D. 3, Eun Young Song, M.D. 1 and Myoung Hee Park, M.D. 1 Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine 1, Seoul, Department of Laboratory Medicine, Hallym University Sacred Heart Hospital 2, Anyang, Department of Laboratory Medicine, Seoul Paik Hospital, Inje University College of Medicine 3, Seoul, Korea Background: Two of the most sensitive methods for detecting donor-specific HLA antibodies (DSAs) are solid phase panel reactive antibody (PRA) assay using Luminex platform (Luminex-PRA), and a cell-based flow cytometric crossmatch (FCXM) test. We evaluated FCXM results in relation to DSAs detected by the Luminex-PRA method in solid organ transplantation candidates or post-transplant follow-up patients. Methods: A total of 171 donor-recipient pairs were evaluated by Luminex-PRA (LIFECODES Class I and Class II ID kits; Gen-Probe, USA) and FCXM (T- and B-cells) tests. DSA levels were analyzed using a sum of median fluorescence intensity (MFI) values, and FCXM results were analyzed using MFI ratios. Results: Class I and II DSAs were detected in 11.7% (20/171) and 11.1% (19/171) of tested sera, respectively. T-FCXM was negative in 97.4% (147/151) of Class I DSA negative sera, and B-FCXM was negative in 99.3% (137/138) of Class I and II DSA negative sera. T-FCXM was positive in 91.7% (11/12) of sera with moderate to strong Class I DSAs and B-FCXM was positive in 88.9% (16/18) of sera with moderate to strong Class II and/or Class I DSAs in the evaluation of sensitivities of FCXM in relation to DSA. There were significant correlations between FCXM ratios and DSA levels for both T-FCXM (P=0.008) and B-FCXM (P<0.001). Conclusions: The FCXM results correlated well with the DSAs detected by the Luminex-PRA method. The specificities of T- and B-FCXM in relation to DSAs were high (>97%) and the sensitivities of T- and B-FCXM were satisfactory (>88%) in detecting moderate to strong DSAs. Key Words: HLA antigens, Panel reactive antibody, Histocompatibility testing, Flow cytometry, Crossmatching 중심단어 : HLA 항원, 패널반응항체, 조직적합성검사, 유세포분석법, 교차시험 서론 장기이식환자들이이식을받기전에수혈, 임신, 과거 책임저자 : 박명희, 서울시종로구대학로 101 서울대학교의과대학검사의학교실, 110-744 Tel: 02-2072-3388, Fax: 02-3672-3337 E-mail: parkmhee@snu.ac.kr 접수일 : 2011 년 10 월 31 일, 심사일 : 2012 년 3 월 7 일게재승인일 : 2012 년 5 월 2 일 2010 년대한이식학회추계학술대회에서구연발표한내용임. 장기이식등을통해다른사람의 HLA 항원 (human leukocyte antigen) 에노출되는경우일부환자에서항 HLA 항체를보유하게된다. 공여자의 HLA 항원에반응하는공여자-특이항체 (donor-specific antibody, DSA) 의경우고형장기이식시항체매개성거부반응 (antibody-mediated rejection) 의원인이되며 (1,2), 이식장기의장기생존율을저하시킨다고보고되고있다 (3-6). 따라서장기이식, 특히고형장기이식환자에서 DSA 유무의검출은성공적인이식을위하여매우중요하다. 아직어느정도까지낮은수준의 DSA가임상적으로중요성을가지는지 J Korean Soc Transplant www.ksot.org 92 June 2012 Volume 26 Issue 2
에대해서는명확히정해진기준이없으나 (7), 낮은역가의 DSA도이식장기의거부반응과연관이있다는보고들이있다 (8,9). 따라서탈감작치료후좀더민감도가좋은방법으로항체변화를추적하기위하여 HLA 항체를검출하기위한검사의민감도를높이고자하는노력이지속되어왔다. HLA 항체의검출에는크게두가지방법이사용되는데, 환자의혈청과공여자의림프구를반응시켜양성여부를판정하는 HLA 교차시험과림프구패널과환자의혈청을반응시켜서 HLA 항체유무를선별하고특이성을동정하는 panel reactive antibody (PRA) 검사가있다. HLA 교차시험방법으로는 1968년 Terasaki 등에의해개발된보체의존성림프구독성 (complement dependent cytotoxicity, CDC) 방법 (10) 이 40여년간표준검사법으로이용되고있는데, 기본적인 CDC 방법외에검사의민감도를높이기위해항온시간을연장하거나항인글로불린을추가하는방법 (anti-human immunoglobulin-cdc, AHG-CDC) 등의변형된 CDC 방법도이용되고있다. 유세포교차시험 (flow cytometry crossmatch, FCXM) 방법은 1980년대에개발되어최근에사용이증가되고있는데, 기존의 CDC 방법보다최대 50배민감하여 CDC 방법으로검출하지못하는낮은역가의 HLA 항체도검출이가능하다 (11). PRA 검사방법으로는살아있는림프구를이용하는 CDC 방법과 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) plate의 well이나 bead의표면에추출된 HLA 항원을부착하여환자혈청내항체를검출하는 solid phase 방법이있다 (11). 최근에개발된 Luminex-PRA 는 solid phase 방법중하나로, Luminex bead에 HLA 항원을부착시켜환자혈청내의 HLA 항체와반응시키고 Luminex 장비를이용하여 HLA 항체를검출하는방법이다 (12). Luminex-PRA 는살아있는림프구를이용하는 CDC-PRA나 solid phase 법인 ELISA-PRA 등과비교하였을때민감도가가장우수한방법으로보고되어있다 (12). 최근국내에서도고형장기이식전후에환자의 HLA 감작상태를평가하기위해민감도가높은 Luminex-PRA와 FCXM 검사의이용이증가되고있지만, DSA 검출에있어서 Luminex-PRA와 FCXM 검사간의상관관계에대한연구결과는보고된바없다. 본연구에서는장기이식환자를대상으로 Luminex-PRA 검사로검출한 DSA 결과와 FCXM 결과간의상관관계를비교평가해보았다. 대상및방법 1) 연구대상연구대상은서울대학교병원에서 2009년 10월부터 2010 년 9월까지 12개월간고형장기이식전혹은이식후추적관찰을위하여 Luminex-PRA와 FCXM 검사를모두시행한 141명의환자를대상으로하였다. 이두가지검사에는동시에채취한검체를사용하거나, 혹은 3개월이내의간격으로채취한검체를사용하되그사이에수혈, 감염, 이식, 탈감작치료등항체가의변화를일으킬수있는병력이나치료력이없는것을확인하였다. Luminex-PRA 검사를실시하여 HLA 항체가동정되었으나공여자의 HLA 형을알지못하거나 PRA% 가높아 DSA 여부를명확하게규명하지못한 8명의검체는본연구의대상군에서제외하였다. 환자는남자 83명, 여자 58명이었고, 평균연령은 44세 ( 범위 9 72세 ) 이었다. 이식장기는신장 120명 (85%), 심장 13명 (9%), 간 5명 (4%), 폐 3명 (2%) 이었다. 검체로는 141명의환자로부터얻은 156개의혈청검체 ( 추적검체 15개포함 ) 를대상으로하여 Luminex-PRA 검사를시행하였고, 이들 156개의환자혈청과 171개의공여자림프구를이용하여 FCXM 법으로교차시험을실시하였다. 환자의혈청검체중장기이식이시행되기이전에채취된것이 136개, 장기이식후에채취된것이 18 개였다. 2) 연구방법 (1) FCXM 검사 1 FCXM 검사방법 : 한튜브내에서환자혈청과공여자림프구를반응시켜 3색면역형광염색방법을이용하여염색함으로써 T 세포와 B 세포에대한 FCXM을동시에시행하였다 (single tube T/B FCXM). 이때환자혈청과함께양성대조혈청과음성대조 (AB형정상인 ) 혈청에대한검사도나란히실시하였다. 공여자의림프구는말초혈액으로부터 Ficoll-Hypaque 법으로분리하여이전에기술된방법에따라 pronase를처리하였다 (13). Pronase 처리에대해간략히기술하면, 1.0 mg/ml 농도의 pronase (type XIV; Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) 1.0 ml을공여자림프구침사에가하고 37 o C에서 30분간반응시킨후상층액을버리고세척액 (washing solution, 0.1% NaN 3-PBS) 으로 2회세척한후다음과정의검사를진행하였다. 면역형광염색에는 T 세포표지자로 CD3-PerCP (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 를, B 세포표지자로 CD19-PE (Becton Dickinson) 를, 공여자림프구에반응하는 IgG 항체표지자로 goat F(ab ) 2 an- J Korean Soc Transplant www.ksot.org 93 June 2012 Volume 26 Issue 2
ti-human IgG-FITC (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) 를사용하였다. 각 tube에환자혈청, 음성대조, 양성대조혈청을 25 μl씩넣고세포수를 5 10 6 /ml로맞춘 pronase 처리된공여자의림프구를 100 μl씩분주하고실온암소에서 30분간반응시켰다. 세척액으로 3회세척후 anti-human IgG-FITC ( 적절히희석 ), CD3-PerCP, CD19-PE 혼합액 100 μl를넣고 4 o C 암소에서 20분간반응시켰다. 다시세척액으로 3회세척후최종적으로 300 μl의세척액을넣고재부유시켜 FACSCalibur (Becton Dickinson) 로측정하여 Cellquest 프로그램 (Becton Dickinson) 으로분석하였다. 2 FCXM 결과의해석 : T 세포와 B 세포를각각 gating 한다음공여자림프구에대한환자혈청의중앙형광강도 (median fluorescence intensity, MFI) 값을음성대조혈청결과와비교하였다. T 세포와 B 세포모두에서 MFI ratio ( 환자혈청 / 음성대조혈청 ) 가 2.0 이상인경우에양성으로판정하였다. (2) Luminex-PRA 검사 1 Luminex-PRA 선별및동정검사방법 : HLA Class I 과 Class II 항체유무를선별하기위한 Luminex-PRA 선별검사는 LIFECODES LifeScreen Deluxe kit (Gen-Probe, Stamford, CT, USA) 를이용하여실시하였고, 검사결과의양성여부를판정하였다. Class I 또는 Class II 선별검사에서양성결과가나온모든검체에대하여 LIFECODES Class I 또는 Class II ID kit (Gen-Probe) 를이용하여 PRA 동정검사를실시하였다. 동정검사에서는 PRA% 를산정하고, 양성인경우 HLA 항체의특이성을동정하고항체강도 (MFI 값 ) 를분석하였다. 선별및동정검사의구체적인실험방법은제조회사의지침에따라시행하였고, 반응이끝난 bead 부유액을 LABScan 200 flow cytometer (Luminex, Austin, TX, USA) 장비를이용하여각종 bead에대한검사결과 (MFI 값 ) 를측정하였다. 2 Luminex-PRA 결과의해석 : PRA 검사결과의해석을위해 LABScan 200 flow cytometer에서얻은각종 bead에대한검사결과 (MFI 값 ) 를 Quick Type Version 2.4 User s Manual RUO 프로그램을사용하여분석하였다. Luminex-PRA 선별검사의경우시약구성이 Class I 및 Class II 항체를동시에검사하도록되어있다. 각 well에분주하는반응시약내에는 Class I HLA 항원이코팅된 7가지의 bead (pool 1종, 교차반응그룹 [cross-reactive group, CREG] 6종 ) 와 Class II HLA 항원이코팅된 5가지의 bead (pool 1종, DR CREG 3종, DQ CREG 1 종 ), 및 3종류의음성대조 bead와양성대조 bead를합해서총 16가지의 bead가들어있다. 결과판독을위하여 각각의 bead와환자의혈청을반응시켜얻은 MFI 값을 3종류의음성대조 bead (CON1, CON2, CON3) 의 MFI 값으로각각나눈후제조회사에서시약의 lot 별로제공하는 background adjustment factor (BAF) 를빼서계산된 adjusted ratio 값 3개를얻게된다. 3개의값중 pool bead의경우 1개이상, CREG bead의경우 2개이상이양의값 (>0) 을가질경우에해당 bead에대한환자혈청의반응을양성으로판정하였다. Class I 및 Class II 선별검사에서각각 7가지 bead 및 5가지 bead 중 1가지이상에양성결과를보이는경우양성으로판정하였다. 동정검사의경우 Class I과 Class II 항체를별도의 kit 로검사하는데, Class I ID kit의경우총 50가지 (50명패널 ) 의항원 bead가, Class II ID kit의경우총 42가지 (DR 30명패널+enriched DQ 항원 12종 ) 의항원 bead가각각포함되어있으며, 선별검사와마찬가지로 3종류의음성대조 bead와양성대조 bead가포함되어있다. 결과판독을위해서는각각의 bead와환자의혈청을반응시켜얻은 MFI 값에대해선별검사에서와동일한방법으로계산된 3개의 adjusted ratio 값을얻고, 여기에추가로 CalcCON 값 ( 항원 bead 중에가장낮은 MFI 값+20) 을이용하여계산된 4번째 adjusted ratio 값을얻게된다. 이들 4개의 adjusted ratio 값중 2개이상이양의값을갖는경우에해당 bead ( 패널 ) 에대한환자혈청의반응을양성으로판정하도록되어있다. 그러나, 개별환자결과의해석시에판독자가 adjusted ratio 값을 2개대신 3개또는 4개로조정하여판정할수도있고, cutoff MFI 값을정하여판정할수도있다. 동정검사에서각 bead ( 패널 ) 에대한양성여부를판정후 PRA% ( 검사한패널수중에양성을보인패널의백분율 ) 를산정하였고, 1개또는그이상의패널에서양성반응이관찰되는경우 HLA 항체특이성을분석하였다. HLA 항체특이성은꼬리분석 (tail analysis) 방법을이용하여분석하게되는데결과분석프로그램에서필요한통계자료 ( 해당 HLA 항원유무와양성반응유무에따른 2 2 table, chi-square 값및상관계수 r 값등 ) 를제공하여준다. HLA 항체특이성의분석에는기본적으로환자자신이가지고있는항원에대한항체는가지고있지않다는가정하에환자자신의 HLA-A, B 형별을고려하여판정하였다. 개별항원에대한반응과함께 CREG 항원에대한반응도고려하여분석하였다 (14,15). 일반적으로 HLA 항체특이성에대해결과분석프로그램에서자동으로제공되는 automated 분석결과는부적절한경우가많아대부분의환자에서 manual 분석을실시하였다. J Korean Soc Transplant www.ksot.org 94 June 2012 Volume 26 Issue 2
DSA는 PRA에서양성으로동정된 HLA 항체의정보와공여자의 HLA-A, B, DR 형별정보를이용하여양성여부를판단하였다. DSA의강도는 MFI 값을이용하여분석하였고, 한검체에서두개이상의 DSA가존재할경우 MFI 값총합을계산하였다. DSA의강도는 MFI 값에따라 very weak (<1,000), weak (1,000 2,999), moderate (3,000 9,999), strong (10,000 ) 으로판정하였다. Class II 항체의경우 HLA-DQ 항체에대한결과는환자와공여자의 HLA-DQ 자료가없어서결과분석에포함하지않았다. (3) 통계분석 : Luminex-PRA로동정된 DSA를중심으로 FCXM의민감도와특이도를분석하였다. T 세포에는 HLA Class I 항원만표현되고 B 세포에는 HLA Class I, II 항원이모두표현되므로 T-FCXM 결과는 Class I DSA 결과를중심으로분석하였고, B-FCXM 결과는 Class I과 Class II DSA를모두고려하여분석하였다. FCXM의강도는 MFI ratio로, Luminex-PRA로구한 DSA 강도는 MFI 값으로판정하되 2개이상의 DSA가있는경우각 DSA의 MFI 총합으로판정하였다. FCXM의강도와 DSA 의강도간에상관관계를분석하기위해서는 T-FCXM의경우 Class I DSA의 MFI 총합과비교하였고, B-FCXM의경우양성이나온 Class I DSA와 Class II DSA의 MFI 총합과비교하였다. FCXM의 MFI ratio와 DSA의 MFI 총합의상관관계는 Pearson s correlation coefficient로, DSA 강도의각구간 (very weak strong) 과 FCXM의 MFI ratio 평균값의비교는 Kruskal Wallis ANOVA test로분석하였다. ROC (receiver operating characteristic) 곡선을이용하여 FCXM 양성여부에대한 DSA의 MFI 총합의경계값 (cutoff value) 및곡선의아래영역 (area under the curve, AUC) 을구하였다. 통계프로그램은 SPSS (version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 와 Excel (Microsoft Office 2007) 를사용하였고통계적유의성은 P<0.05로판정하였다. 결과 1) Luminex-PRA와 FCXM 검사결과의비교전체 156개의환자검체중에서 HLA Class I 및 Class II 항체는각각 26.3% (41/156) 와 25.0% (39/156) 에서검출되었다 (Table 1). 공여자와환자의 HLA 형별을고려하여 171 공여자-환자조합에대한 DSA를분석해보면 Class I DSA는 11.7% (20/171), Class II DSA는 11.1% (19/171) 에서검출되었다. PRA 양성인혈청중에 DSA 양성인비율은 Class I 및 Class II에서각각 48.8% (20/41) 와 48.7% (19/39) 이었다. 두개이상의 DSA가검출된경우는 Class I DSA만검출된 14건중 9건, Class II DSA만검출된 13건중 3건이었다. Class I과 Class II DSA가동시에검출된검체는 6개였다. 전체 171 공여자-환자조합에서시행된 FCXM 검사중 T-FCXM 양성률은 10.5% (18/171), B-FCXM 양성률은 11.7% (20/171) 이었다. DSA를중심으로 FCXM의민감도와특이도를분석하였다 (Table 2). Class I DSA와 T-FCXM 결과를비교하여보았을때, Class I DSA 양성인 20 검체중 T-FCXM 양성검체는 14개로민감도는 70.0% 이었고, Class I DSA 음성인 151 검체중 T-FCXM 음성검체는 147개로 97.4% 의높은특이도를보였다. Class I과 Class II DSA 가모두음성일경우 B-FCXM의음성률은 99.3% (137/138) 로나타나매우높은특이도를보였으나, Class I 혹은 Class II DSA가양성일경우 B-FCXM의민감도는 57.6% (19/33) 로낮은결과를보였다. 전체적으로 Class I DSA와 T-FCXM의양성 / 음성일치율은 94.2% (161/171), Class I 및 Class II DSA와 B-FCXM의일치율은 91.2% (156/171) 로높았다. 신장이식검체 137건을별도로분석한결과도 DSA와 FCXM의일치율이각각 94.6%, 91.3% 로전체검체 171건분석결과와유사한결 Table 1. Results of Luminex-PRA and flow cytometric crossmatch (FCXM) tests Test No. of positive results/total tests a (%) Luminex-PRA b Class I Class II Class I only Class II only Class I and Class II Class I or Class II DSA c Class I Class II Class I only Class II only Class I and Class II Class I or Class II FCXM T-cell B-cell 41/156 (26.3%) 39/156 (25.0%) 13/156 (8.3%) 11/156 (7.1%) 28/156 (17.9%) 52/156 (33.3%) 20/171 (11.7%) 19/171 (11.1%) 14/171 (8.2%) 13/171 (7.6%) 6/171 (3.5%) 33/171 (19.3%) 18/171 (10.5%) 20/171 (11.7%) Abbreviations: PRA, panel reactive antibody; DSA, donor-specific antibody. a Luminex-PRA results in 156 samples from 141 patients, and DSA and FCXM results in 171 donor-recipient pairs; b Results of Luminex-PRA screening test for HLA Class I and Class II antibodies; c DSA detected by Luminex-PRA test. J Korean Soc Transplant www.ksot.org 95 June 2012 Volume 26 Issue 2
Table 2. Comparison between the results of Luminex-PRA and flow cytometric crossmatch (FCXM) tests T-FCXM B-FCXM Positive (n=18) Negative (n=153) Concordance Kappa Positive (n=20) Negative (n=151) Concordance Kappa Class I DSA Positive (n=20) Negative (n=151) Class I &/or II DSA Positive (n=33) Negative (n=138) 14 (70.0%) 4 (2.6%) 15 (45.5%) 3 (2.2%) 6 (30.0%) 147 (97.4%) 18 (54.5%) 135 (97.8%) 161/171 (94.2%) 150/171 (87.7%) 0.660 0.523 14 (70.0%) 6 (4.0%) 19 (57.6%) 1 (0.7%) 6 (30.0%) 145 (96.0%) 14 (42.4%) 137 (99.3%) 159/171 (93.0%) 156/171 (91.2%) 0.660 0.669 Abbreviations: PRA, panel reactive antibody; DSA, donor-specific antibody. Fig. 1. Relationship between DSA intensity (MFI sum) and FCXM strength (MFI ratio). (A) T-FCXM results in patients with Class I DSA (n=20), and (B) B-FCXM results in patients with Class I or Class II DSA (n=33). Abbreviations: DSA, donor-specific antibody; FCXM, flow cytometric crossmatch; MFI, median fluorescence intensity. 과를보였다. 2) Luminex-PRA로검출한 DSA 강도와 FCXM 강도의상관관계 MFI sum으로나타낸 DSA 강도와 MFI ratio 값으로나타낸 FCXM 강도를비교하여보았다 (Fig. 1). 그결과 Class I DSA의 MFI sum 값과 T-FCXM MFI ratio 간에그리고 Class I과 Class II MFI sum 값과 B-FCXM MFI ratio 간에유의한상관관계가관찰되었다 ( 각각 r=0.717, P<0.001; r=0.773, P<0.001). Class I과 Class II DSA가모두양성인경우에는 Class I 혹은 Class II 단독으로나온경우에비하여 DSA 강도및 FCXM 강도가모두현저히높은경향을보였다. MFI sum 값의구간을 1,000, 3,000, 10,000을기준으로하여 DSA 강도를 4개군 (very weak, weak, moderate, strong) 으로분류하였을때, DSA 강도가강한군에서 T-FCXM 및 B-FCXM의강도 (MFI ratio) 가유의하게증가하는경향을볼수있었다 ( 각각 P=0.008, P<0.001; Table 3). 또한 T-FCXM과 B-FCXM의 MFI ratio 값을비교하여보면, DSA 강도가강한군에서 T-FCXM이 B-FCXM에비해현저히높은 MFI ratio 값을보이는경향을관찰할수있었다 (Fig. 1, Table 3). 3) Luminex-PRA로검출한 DSA 강도에따른 FCXM 양성률 DSA의강도에따른 FCXM의양성률 ( 민감도 ) 을분석하여보았다 (Fig. 2). T-FCXM 양성률은 Class I DSA의강도에따라, 그리고 B-FCXM의양성률은 Class I 및 Class II DSA의강도에따라분석하였다. T-FCXM 양성률은 Class I DSA 강도가 weak, moderate, strong 군에서각 J Korean Soc Transplant www.ksot.org 96 June 2012 Volume 26 Issue 2
Table 3. Flow cytometric crossmatch (FCXM) results according to DSA intensity T-FCXM B-FCXM DSA intensity (MFI value) a n=20 MFI ratio n=33 MFI ratio Very weak (<1,000) Weak (1,000 2,999) Moderate (3,000 9,999) Strong (10,000 ) P value c n=3 n=5 n=7 n=5 1.48 (0.95 1.55) b 2.89 (1.31 4.70) 2.62 (0.78 14.18) 52.46 (9.92 96.34) 0.008 n=8 n=7 n=10 n=8 1.43 (1.03 2.13) 1.75 (1.33 3.37) 3.02 (1.37 3.82) 12.72 (1.69 24.80) <0.001 Abbreviations: DSA, donor-specific antibody; MFI, median fluorescence intensity; n, number. a Sum of MFI of Class I DSA was calculated for T-FCXM, and sum of MFI of Class I and ClassII DSA was calculated for B-FCXM; b Median value with ranges in parentheses; c P values by Kruskal-Wallis ANOVA test. Fig. 2. Relationship between DSA intensity and flow cytometric crossmatch (FCXM) results. Sensitivities of FCXM tests detecting DSA-positive samples of different intensities are shown. Abbreviations: DSA, donor-specific antibody; MFI, median fluorescence intensity. Fig. 3. Receiver operating characteristics (ROC) curve analysis of DSA intensity (MFI sum) for FCXM positivity. MFI sum values of Class I DSAs were used for T-FCXM (A), and those of Class I and Class II were used for B-FCXM (B). Abbreviations: AUC, area under the curve; DSA, donor-specific antibody; FCXM, flow cytometric crossmatch; MFI, median fluorescence intensity. 각 60% (3/5), 85.7% (6/7), 100% (5/5) 로나타났다. B-FCXM 양성률은 Class I 및 Class II DSA 강도가 weak, moderate, strong 군에서각각 28.6% (2/7), 90.0% (9/10), 87.5% (7/8) 로나타났다. 따라서 DSA 강도가 weak 군에서는 T-FCXM에비해 B-FCXM의양성률이낮게나왔다. DSA 강도가 moderate/strong 군에서는 T-FCXM과 B-FCXM의양성률이각각 91.7% (11/12) 와 88.9% (16/18) 로비교적높은것으로나타났다. J Korean Soc Transplant www.ksot.org 97 June 2012 Volume 26 Issue 2
FCXM 양성검출을위한 DSA MFI 값의 ROC 곡선분석을실시하여보았다 (Fig. 3). T-FCXM 양성검출을위해서는 Class I DSA의 MFI 총합 1,250을경계값으로하였을때민감도가 77.8%, 특이도가 98.7% 로가장좋은결과를보였다. 또한 B-FCXM에대해서는 Class I과 Class II DSA의 MFI 총합 1,971을경계값으로하였을때민감도가 90.0%, 특이도가 98.0% 로상당히높은민감도와특이도를나타내었다. 이때 ROC 곡선의 AUC는 T-FCXM의경우 0.881, B-FCXM의경우 0.960으로나타났다. 고찰 HLA 항체를검출하기위한매우민감한검사법인 FCXM법과 Luminex-PRA가이식검사에도입됨에따라전통적인방법으로는검출할수없었던낮은수준의 DSA까지검출할수있게되었고, 따라서이러한새로운검사법으로얻은결과를적절히해석하고장기이식환자의치료성적향상을위하여적용하는것의중요성이더욱더커지고있다 (16-19). Luminex-PRA는 CDC, ELISA, Flow cytometry 등의다른 PRA 방법과비교하여민감도가가장우수한것으로보고되고있다 (20). 또한, Luminex-PRA는검사자가사용하기에편리하며데이터분석이좀더용이하고, 소량의시료로도항체동정검사가가능한장점이있다 (12). 최근에는실제공여자의림프구를이용하는교차시험대신이러한민감도가증가된 PRA 검사를통하여동정된 HLA 항체결과를토대로공여자의 HLA 형별에대한 DSA 유무를결정하는방법인 virtual crossmatch의개념도도입되어이용되고있다 (21,22). 혈청과공여자림프구를반응시켜유세포분석기를이용하여형광광도를측정하는 FCXM법은기존의 CDC 방법에비하여민감도를높이고 IgM 자가항체에의한위양성을방지할수있는교차시험방법이다. 또한 T 세포와 B 세포에대한검사가한튜브내에서가능하며, 결과판정시더객관적이고정량적인판단이가능하다는장점이있다 (11,23). 본연구에서는단일기관에서시행된 171건의 Luminex- PRA로검출한 DSA와 FCXM 결과를비교하여본결과두검사사이에상당히좋은상관관계가있음을확인할수있었다. Luminex-PRA로검출되는 DSA와 FCXM의양성률을비교하여보았을때, 두가지검사결과의일치도가 T-FCXM과 B-FCXM에서모두 90% 이상으로높았으나, Luminex-PRA로검출되는 DSA가 FCXM 결과보다다소높은양성률을보였다. 이러한결과는 Luminex-PRA 검사로구한 DSA의 FCXM에대한음성예측도 (negative predictive value) 를 90% 이상으로보고한이전의연구들과합치되는결과이다 (21,22). 본연구에서 DSA 음성이고 FCXM만양성이나온경우는드물었다. 다양한검사및지표를이용한이전의연구들에서 DSA 강도는 HLA 항체양을반영하는것으로보고하였고, 또한몇몇연구들에서는 DSA 강도가이식후이식장기의생존율과상관관계를보인다고보고하였다 (23,24). 본연구에서는 DSA 강도를반영하는지표로 FCXM의경우 MFI ratio를사용하였고, Luminex-PRA로검출되는 DSA의경우 MFI 값을사용하되 2개이상의 DSA가있는경우 MFI 총합으로비교하였다. Luminex-PRA 검사로검출한 DSA 강도와 FCXM의강도를정량적으로비교하여보았을때둘사이에상당히좋은상관관계를볼수있었다 (T-FCXM, B-FCXM 각각 P<0.001; Fig. 1). Luminex-PRA 에서검출되는 HLA 항체 (DSA) 강도를분류하는 MFI 값의기준은연구마다다양하나, 본연구에서는 MFI 1,000, 3,000, 10,000을기준으로강도를나누어비교해보았다. DSA의강도에따라 T-FCXM과 B-FCXM의민감도 ( 양성률 ) 를비교하여보았을때 DSA 강도가중등도혹은강양성일경우 T-FCXM과 B-FCXM의민감도가모두만족할만한수준이었다 (>88%, Fig. 2). 따라서 DSA 강도가중등도이상일경우에는 FCXM 양성결과와비교적잘일치하는것으로생각된다. 약한강도의 DSA의경우 T-FCXM에비해 B-FCXM의민감도는더낮은것으로나타났다 (60% vs. 28.6%). 본연구결과 ROC 곡선분석에서가장좋은민감도와특이도를보이는 DSA MFI 값의경계값이 T-FCXM에대해서는 1,250 ( 민감도 77.8%, 특이도 98.7%), B-FCXM에대해서는 1,971 ( 민감도 90%, 특이도 98%) 로나타났다 (Fig. 3). 이는항체매개성거부반응을예측하는 Class I DSA 경계값으로 MFI 값 900을제시한연구결과와유사하였다 (25). 그러나같은제조사에서생산된 Luminex-PRA 검사키트의경우 MFI 값이재현성이있음이알려져있으나, 다른제조사에서생산된제품의경우 MFI 값에차이가있음이알려져있으므로 MFI 값을해석함에있어주의가필요하다 (8,25). Luminex-PRA로만검출되는약한강도의 DSA의경우아직임상적의미가명확하지않다. 낮은역가의 DSA도임상적으로거부반응의발생및이식장기의예후와연관이있다는보고도있다 (8,9,25). 그러나몇몇연구에서는 Luminex-PRA로만검출되는약한 DSA는환자경과와연관성이낮고임상적인의미가떨어지는것으로보고하면서지나치게민감한검사로인하여환자가이식을받을수있는기회가줄어들고 PRA 양성결과로인해고위험 J Korean Soc Transplant www.ksot.org 98 June 2012 Volume 26 Issue 2
군으로간주되어불필요한치료와검사를동반하게되는문제점에대한우려를제기하고있다 (26,27). 따라서향후약한 DSA와장기이식환자의임상경과사이의상관관계에대한연구가더필요할것으로생각된다. DSA를정량적으로측정하는것은 DSA 강도에따른임상적위험성을평가하는데유용할뿐아니라이미 DSA를가지고있는환자의추적관찰에도도움이될수있다. 이전에는 DSA의존재및 HLA 교차시험양성은신장이식의금기로간주되어왔으나, 최근에는 DSA가존재하는경우에도혈장교환술및 rituximab 투여등다양한탈감작치료를시행하여성공적인신장이식을시행하고있다. 이러한탈감작치료후추적관찰을할때 FCXM의 MFI ratio 및 Luminex-PRA의 MFI 값은혈중 DSA의역가를반영하는지표가될수있으리라생각된다. 두가지중어떤지표가더욱환자의상태를민감하게반영할수있을지여부는향후더연구가필요하겠으나 FCXM은생존도가좋은공여자림프구가필요하다는제한점이있다. Luminex-PRA 검사의한계점으로패널구성을들수있다. CDC-PRA 검사법에서는림프구패널을자가제조가능하므로한국인의 HLA 형별분포에맞는림프구패널을구성할수있다. 그러나 Luminex-PRA 검사의경우외국제조사에서제공하는패널을사용하게되므로한국인에있는 HLA 항원중에패널구성에포함되지않은항원에대한항체를검출하지못하는문제점이있다. 또한본연구에서사용한다항원을이용한 Luminex-PRA의경우 PRA% 가매우높은경우 DSA를정확히동정할수없는어려움이있다. 따라서 Luminex-PRA 검사가 FCXM 검사보다다소민감한결과를보였지만, 이식전검사로 Luminex-PRA가 FCXM를대체하기에는부족하며이식전검사로두검사를모두시행할필요가있을것이다. 결론 Luminex-PRA와 FCXM 검사는기존의검사에비하여 HLA 항체를검출하는데있어민감도가높고편리한검사이다. 본연구에서두가지검사는서로비교적높은일치율을나타내었고, 특히 Luminex-PRA로검출되는 DSA의강도가중등도이상 (MFI 3,000) 의강도인경우 FCXM 결과가비교적높은민감도와특이도를보였다. Luminex-PRA 검사로검출되는 DSA의임상적의의및추적관찰지표로서의유용성에대해향후더연구가필요하다고생각된다. REFERENCES 1) Patel R, Terasaki PI. Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation. N Engl J Med 1969;280:735-9. 2) Süsal C, Döhler B, Sadeghi M, Ovens J, Opelz G. HLA antibodies and the occurrence of early adverse events in the modern era of transplantation: a collaborative transplant study report. Transplantation 2009;87:1367-71. Erratum in Transplantation. 2009;88(2):293. 3) Fernández-Fresnedo G, Pastor JM, López-Hoyos M, Ruiz JC, Zubimendi JA, Gonzalez-Cotorruelo J, et al. ELISA after kidney transplantation on the development of acute rejection and graft survival. Nephrol Dial Transplant 2003;18:990-5. 4) Gebel HM, Bray RA, Nickerson P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant 2003;3:1488-500. 5) Worthington JE, Martin S, Al-Husseini DM, Dyer PA, Johnson RW. Posttransplantation production of donor HLA-specific antibodies as a predictor of renal transplant outcome. Transplantation 2003;75:1034-40. 6) Cardarelli F, Pascual M, Tolkoff-Rubin N, Delmonico FL, Wong W, Schoenfeld DA, et al. Prevalence and significance of anti-hla and donor-specific antibodies long-term after renal transplantation. Transpl Int 2005;18: 532-40. 7) Leffell MS, Zachary AA. Antiallograft antibodies: relevance, detection, and monitoring. Curr Opin Organ Transplant 2010;15:2-7. 8) Eng HS, Bennett G, Bardy P, Coghlan P, Russ GR, Coates PT. Clinical significance of anti-hla antibodies detected by Luminex: enhancing the interpretation of CDC-BXM and important post-transplantation monitoring tools. Hum Immunol 2009;70:595-9. 9) Zeevi A, Lunz JG 3rd, Shapiro R, Randhawa P, Mazariegos G, Webber S, et al. Emerging role of donor-specific anti-human leukocyte antigen antibody determination for clinical management after solid organ transplantation. Hum Immunol 2009;70:645-50. 10) Terasaki PI, McClelland JD. Microdroplet assay of human serum cytotoxins. Nature 1964;204:998-1000. 11) Zachary AA, Houp JA, et al. Evaluation of the humoral response in transplantation. In: Detrick B, Hamilton RG, et al., ed. Manuals of molecular and clinical laboratory immunology. 7th ed. Washington, D.C.: ASM Press; 2006:1215-27. 12) Colombo MB, Haworth SE, Poli F, Nocco A, Puglisi G, Innocente A, et al. Luminex technology for anti-hla antibody screening: evaluation of performance and of impact on laboratory routine. Cytometry B Clin Cytom 2007;72:465-71. 13) Vaidya S, Cooper TY, Avandsalehi J, Barnes T, Brooks K, Hymel P, et al. Improved flow cytometric detection J Korean Soc Transplant www.ksot.org 99 June 2012 Volume 26 Issue 2
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