46 원동일 적인판정이가능하다. 5) 검사시간이단축되어뇌사자장기에대한수여자를신속히선정하는데도움을준다. 6) 광산란특성 (light scatter characteristics) 으로죽은세포를제외할수있으므로세포의생존도가 50% 이하에서도분석이가능하다 [3]. 이런여러가지장

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민성 설
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1 대한진단검사의학회지제 26 권제 1 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26:45-51 원저 진단면역학 신장이식을위한 HLA 교차시험에서전혈유세포분석법의실험적적용 원동일 경북대학교의과대학임상병리학교실 Experimental Application of Whole Blood Flow Cytometry to HLA Crossmatch for Renal Transplantation Dong Il Won, M.D. Department of Clinical Pathology, Kyungpook National University School of Medicine, Daegu, Korea Background : The lymphocytes separated from whole blood are used in HLA flow cytometry crossmatch (FCXM) for renal transplantation. In this study, the methodology of whole blood flow cytometry was applied to FCXM, omitting lymphocyte separation step. Methods : In the 20 cases (including positive 5 cases) of T cell FCXM for renal transplantation, the standard assay using the separated mononuclear cells (MNC) was compared with the two variant assays using whole blood. In the latter assay, the donor whole blood was incubated with the excessive recipient serum. The red cells were lysed (lysed whole blood, LWB). Otherwise, instead of red cell lysis, the signals of T cells among whole blood (WB) were acquired using fluorescence triggering. The sample/negative control mean fluorescence intensity (MFI) ratio was calculated for the interpretation. Results : The MFI ratio of the 20 cases by MNC, LWB and WB assay were 4.9±8.1, 5.4±9.7 and 4.8±7.8, respectively. Both LWB and WB assay were not significantly different from MNC assay (P= 0.313, 0.831, respectively, paired t-test). The qualitative determinations were concordant in all cases, except for one case which was weakly positive with MFI ratio 2.2 by LWB assay. Conclusions : The assays using whole blood were comparable to the standard assay in FCXM for renal transplantation. This study indirectly supports that the variant methods can be used reliably in the case of the MNC preparation erroneously mixed with other blood cells. (Korean J Lab Med 2006; 26:45-51) Key Words : HLA crossmatch, Flow cytometry, Whole blood 서 최근조사에의하면국내 8개의조직적합성검사실이 HLA 교차시험에서유세포분석법 (flow cytometry crossmatch, FCXM) 을사용하고있다 [1]. HLA 교차시험에서 FCXM 방법은보체의 접 수 : 2005년 8월 10일 접수번호 : KJLM1874 수정본접수 : 2005년 11월 4일 게재승인일 : 2005년 11월 7일 교신저자 : 원동일 우 대구광역시중구삼덕동2가 50 경북대학교병원진단검사의학과 전화 : , Fax : wondi@knu.ac.kr 론 존성림프구독성 (complement dependent lymphocytotoxicity, CDC) 방법에비하여다음과같은여러가지장점이있다 : 1) 민감도가매우높아서 CDC 방법으로검출하지못하는낮은농도의항HLA항체 (anti-hla antibody) 도검출이가능한데, CDC 방법에비하여최대약 50배민감하다고한다 [2]. 2) 급성및가속성 (accelerated) 거부반응에관계하는 IgG isotype의항hla항체만을검출할수있으므로, 수여자혈청중림프구와반응하는 IgM 항체를불활성화하기위한 dithiothreitol 처리가필요없다. 3) 표지자항체를사용하여 T 세포와 B 세포구별하므로각세포를물리적으로분리할필요가없다. 4) 결과판정에있어서 mean fluorescence intensity (MFI) 로판정하므로더객관적이고정량 45

2 46 원동일 적인판정이가능하다. 5) 검사시간이단축되어뇌사자장기에대한수여자를신속히선정하는데도움을준다. 6) 광산란특성 (light scatter characteristics) 으로죽은세포를제외할수있으므로세포의생존도가 50% 이하에서도분석이가능하다 [3]. 이런여러가지장점들때문에국내에서도 HLA 교차시험에 FCXM 방법을도입하는검사실이점차늘고있다. 임상검사실에서시행되는검사중수기로시행되는검사들의술기를살펴보면, 관행으로굳어진, 필요없는단계가포함된경우를드물지않게볼수있다. 대표적인예를들면, 유세포분석을이용한항혈소판항체검사에서비특이형광을없애거나 [4, 5] 혈소판내알파과립의 IgG 분비를막기위해혈소판을 paraformaldehyde로고정하는단계이다. 그러나이단계는반드시필요한단계가아니고, 오히려혈소판응집을일으키거나혈소판막의주름에 IgG가갇히게되어그검출이방해된다고하므로 [6], 최근의국제적인합의술식 (consensus protocol)[7] 을보면이과정이생략되어있음을알수있다. FCXM 방법은아직표준화된술식이국제적으로합의되지는않았고, 여러문헌상제시된술식의과정중에는생략하여도결과에큰영향을미치지않는단계가있을수있다. 대부분의검사실에서 FCXM에서공여자세포로말초혈액에서분리한림프구가사용된다. 그러나, 최근 HLA 형별검사방법이림프구분리가필요없는 DNA 법으로교체되고있고, 신장이식에서공여자와수여자간 ABO 혈구형에관한주불일치인예가없어서수여자혈청에의한공여자적혈구의응집이일어나지않으며, 유세포분석법은기본적으로전혈중림프구식별이가능하다. 따라서, 신장이식을위한 FCXM에서번거로운림프구분리과정을생략하고전혈을그대로이용하여신속히교차시험을수행하는것이가능할것으로생각된다. 유세포분석시전혈에서다른세포를분리하지않고 fluorescence signal triggering 기법을이용하여관심대상세포의신호만을분석하는방법은다른많은술식들에서이미사용되고있다. 예를들면, 전혈에서혈소판표지자와 thiazole orange로염색하여망상혈소판 (reticulated platelets) 을측정 [8] 이나, 전혈에서세포자멸사세포측정 [9], 조혈모세포측정 [10], 혈소판 -백혈구응집체측정 [11] 방법등이보고된바있다. 장기를기증할뇌사자가발생하면이식대기중인환자들중에서신속하게수여자가선정되어야하나, HLA 교차시험을위한림프구를순수분리하는데시간과수고가필요하다. 또한뇌사자로부터채취한전혈이충분하지않은상황에서림프구분리과정에서일부림프구가유실되기도한다. 혹은림프구분리과정에서실수로다른세포들이과다하게혼입되는경우에도그대로교차시험을진행할수밖에없는경우도있다. 본연구에서는신장이식을위한 T 세포 FCXM에서검사과정단축을위해림프구분리없이전혈을이용하는방법을시도하여보고, 또한전혈은분리된림프구의순도가아주낮은극한상황으로볼수있으므로, 전혈을이용하는경우가림프구를순수분리한경우와결과에차이를보이는지조사하였다. 대상및방법 1. 대상신장이식을위한 T 세포 FCXM 20예 ( 통상적인방법으로음성 15예와양성 5예 ) 를대상으로하였다. 단핵구 (mononuclear cells, MNC) 와혈청을얻기위하여각각말초혈액을헤파린과단순 (plain) 시험관에채혈하여당일검사하였다. 음성대조혈청은혈액형이 AB이고수혈경력이없는건강한남자들로부터얻어섞지않고개별적으로 -20 에서냉동보관하다가각각매검사시한건의음성대조시험관에사용되었다. 2. 방법림프구를분리하여검사하는통상적인 FCXM 방법인 표준법 을기준으로전혈을이용하는두가지변법즉, 공여자전혈과과량의수여자혈청을항온후적혈구를용혈시키거나 ( 전혈용혈법 ), 용혈과정없이 fluorescence signal triggering을이용하여림프구를식별하는 전혈법 에대하여정량결과 (MFI 비 ), 정성판정및검사소요시간을비교하였다. 또한 30예에서단핵구분리효율을조사하였다. 1) 통상적인 FCXM 방법 ( 표준법 ) (1) 단핵구분리밀도구배원심분리 (density gradient centrifugation) 방법으로분리하였다. 시험관에 5 ml Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 을넣고그위에전혈 5 ml를중첩시킨후실온 700 g로 30분간원심분리하였다. MNC 층을분리하여 phosphate buffered saline (PBS) 10 ml로 2회세척하였다. PBS 1 ml를넣어 MNC를재부유시킨후새시험관으로옮기고, 혈소판을제거하기위하여 100 L thrombin (100 U/mL) 을가하고 1,000 g로 3초간원심분리하여상층의 MNC를취하였다. 이를 RPMI로 3회세척하고 RPMI 700 L를넣어재부유시킨후자동혈기계산기 Advia 120 (Bayer, Tarrytown, NY, USA) 로측정하여부유액의림프구농도가 3,000/ L가되도록 RPMI로희석하였다. (2) Flow cytometry crossmatch (FCXM) Anti-human IgG FITC, Fc specific, F(ab ) 2 fragments, catalog No (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) 를증류수 700 L로재구성한후동량의 glycerol 과혼합하여 -20 에서냉동보관하며사용하였다. 이전실험에서최적 working dilution을구하기위하여 chessboard titration을응용하여음성과양성대조의분별력이최대가되는, 즉양성대조의 MFI 비가최대인희석배수를구하였는데, glycerol 혼합원액 1.0 L를 PBS 20 L로희석한약 1:40희석으로결정되었다.

3 전혈 HLA 유세포분석교차시험 47 T 세포표지자로는 CD3-PE (DiNona, Seoul, Korea) 를사용하였다. 매검사시음성대조혈청 2개와양성대조혈청 1개를사용하였다. 양성대조혈청은이전에항HLA항체가고농도인것으로확인된혈청을 -70 에서보관하다가중등도양성반응이되도록희석해서사용하였다. 각시험관에혈청 100 L와 MNC 부유액 20 L를분주하고 37 에서 30분간반응시켰다. PBS 2 ml로 4회세척한후 CD3- PE 3 L와 anti-igg-fitc 희석액 20 L를가하고 4 암실에서 30분간반응시켰다. PBS 2 ml로 1회세척한후 PBS 130 L를첨가하고재부유시켜, 유세포분석기로분석하였다. 유세포분석기는 FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 를사용하였고 Cellquest 프로그램으로수집 (acqusition) 및분석하였다. 검사전 Calibrite bead와 Facscomp 프로그램으로장비를조정하였다 ( 모두 Becton Dickinson). 전방및측방광산란 gate로림프구 gate를정하여, 시험관당림프구 5,000 개의신호를수집하였다. 광산란및형광신호는각각선형 (linear) 및대수형 (logarithmic) 증폭하여수집하였다. 결과판정에서, gating한 T 세포의 anti-igg FITC 히스토그램에서 peak의평가를위하여검체 / 대조 MFI 비 (sample/control MFI ratio) 를구한후이값이이미정해진 cutoff 2.0보다큰경우양성으로판정하였다. 대조 MFI는두음성대조의평균으로하였다 (Fig. 1). 2) 전혈을이용하는방법 (1) 전혈용혈법공여자전혈 20 L와수여자혈청 100 L를반응시킨후표준법과같은과정을거친후단클론항체염색직후 FACS Lysing Solution (Becton Dickinson) 1 ml를가하여실온에서 10 분간반응시켜적혈구를용혈시킨후원심분리하여용혈액을제거하고 PBS 2 ml로 1회더세척한후 PBS 130 L를첨가하고재부유시켜, 유세포분석기로분석하였다. (2) 전혈법공여자전혈 20 L와수여자혈청 100 L를반응시킨후표 준법과같은과정을거쳐단클론항체염색후용혈과정없이 1회세척후 PBS 1 ml에재부유시켜유세포분석기로분석하였다. 수집시 fluorescence signal triggering 기법으로 CD3-PE가부착된세포의신호만수집하였다. 즉, 적혈구의 FL2 형광이상의 FL2 수준으로 acquisition threshold로설정하여 T 세포의신호만을효과적으로수집하였다 (Fig. 2). 3) 통계 두군간비교에서 paired t-test와상관분석을사용하였다. 통계프로그램은 Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) 을사용하였다. 자료는평균 ± 표준편차로나타내었다. P<0.05이면유의한것으로판정하였다. 1. 단핵구분리효율 결 30예에서최종 MNC 부유액 700 L의백혈구수는 5.88± / L이고혈소판수는 3.50± / L이었다. 백혈구분별 Acquisition gate Cytometer Events Plot gate 과 Data plot FCS file Storage gate Fig. 2. Event flow through gates during acquisition. By a technique of fluorescence signal triggering, only events with parameter values above a trigger signal are acquired and unwanted events eliminated. This increases the efficiency of the flow cytometric analysis when the number of unwanted cells overwhelms that of cells of interest likewise whole blood flow cytometry. SSC-Height ,000 SSC-Height ,000 R ,000 FSC-Height R2 A CD3PE B Counts Control M1 M2 Sample Marker Geo Mean M M MFI ratio= Anti-igG FITC C Fig. 1. Analysis of T cell flow cytometry crossmatch. (A) Lymphocyte scatter gate (R1) in FSC/SSC plot. (B) T cell gate (R2) in CD 3PE/ SSC plot of gated lymphocytes. (C) Anti-IgG FITC histogram of gated T cells. This overlay histogram shows a representative example of the calculation of MFI ratio. Abbreviations: FSC, forward scatter characteristics; SSC, side scatter characteristics; MFI, mean fluorescence intensity.

4 48 원동일 계산은호중구 5.0±5.9%, 림프구 87.6±10.6%, 단구 2.9±3.9%, 호산구 1.4±2.5%, 호염구 0.1±0.1%, LUC 2.8±2.9% 이었다. 원래 5 ml 전혈에존재하던총림프구수는 9.55± 개이었고, 이중 3.74± 개가분리되었으므로림프구회수율은 37±11% 이었다. 3) 방법간검사소요시간비교표준법은 MNC 분리에 1시간, MNC와혈청반응시간 30분, 세척 4회 30분, 염색 30분, 세척후분석에 30분, 총 3시간이소요되었다. 표준법에비하여전혈용혈법은약 30분이, 전혈법도약 30분이단축되었다. 2. 검사방법간비교 1) 정량결과 ( 검체 / 대조 MFI 비 ) 비교 20예의세방법간 MFI 비를비교하면, 표준법 x대전혈용혈법 y의비교에서 y=1.162x-0.277, r=0.985, (P= ), 표준법 x대전혈법 y의비교에서 y=0.937x+0.193, r=0.962, (P= ) 으로상관성이우수하였다. 두방법간 MFI 비의비교에서, 표준법, 전혈용혈법및전혈법의평균형광강도비는각각 4.9±8.1, 5.4±9.7 및 4.8±7.8로, 전혈용혈법과전혈법둘다표준법과비교하여유의한차이가없었다 ( 각각 P=0.313, 0.831, paired t-test). 양성 5예만의통계는각각 15.6±10.6, 17.4±13.4 및 15.6± 9.6이었다 (Fig. 3). 2) 정성판정비교 Cutoff MFI 비를 2.0으로한정상판정의비교에서한예를제외한나머지 14 음성예와 5 양성예에서세방법모두일치하였다. 불일치한 1예에서 MFI 비는표준법 1.5, 전혈법 1.2로음성이었지만전혈용혈법은 2.2로약양성이었다. 본 20예에서의정량결과및정성판정비교를종합하면, 전혈을이용하는방법도표준법과비교하여대등한결과를보였다. 고찰밀도구배원심분리방법으로림프구분리시회수율은 Histopaque 제조원설명서에약 68% 라고되어있으나 [12] 본연구에서는실제로이에미치지못하는 37% 이었다. 이 37% 를기준으로공여자말초혈액이백혈구수 7,800/ L, 림프구백분율 33.5% 일경우필요한전혈의양을계산하여보면, CDC 방법에서 Terasaki plate 한 well에 3,000개의림프구를준비하기위해서전혈 3.1 L, 신장이식대기자 10명에서각각 6개의 well을사용한다면 186 L 가필요하다. FCXM에서는시험관당 3,000/ L 20 L=60,000 개의 MNC를넣으므로이식대기자 1명당 62 L, 10명이면 620 L가필요하다. 이외에도림프구농도를조정하기위하여자동혈구계산기측정에필요한양, 혹은 HLA 형별검사에소모되는양도있다. 따라서뇌사자공여자로얻은말초혈액의양이제한된경우 MNC 를분리하는것이부적절할수도있다. 또한 Histopaque- 1077로분리한 MNC가응집하는경향이있을수있어서, 부유액의림프구농도를정확히조정하기가어렵고, 시험관마다균등한분배가이루어지지않을수있다. 이에비하여, 전혈을이용하면, MNC 분리에드는노력과시간을절약할수있고, 림프구가혈액에응집이없이균등하게분포하고, 림프구농도가건강한공여자 Negative cases, N=15 40 Positive cases, N= MFI ratio 1 MFI ratio MNC LWB WB Methods A 0 MNC LWB WB Methods B Fig. 3. The correlations of sample/control MFI ratio among the three assays: MNC, LWB and WB. Panel A shows 15 negative cases and panel B 5 positive cases. The MNC assay was a standard assay using separated mononuclear cells. The LWB and WB assay were variant assays using whole blood. Red cells were lysed in the LWB assay. In the WB assay, the signals of T cells among whole blood cells were acquired using fluorescence triggering instead of red cell lysis. The resutss were concordant in all cases, except for one case which was weakly positive with MFI ratio 2.2 by LWB assay. Abbreviations: MNC, mononuclear cells; LWB, lysed whole blood; WB, whole blood.

5 전혈 HLA 유세포분석교차시험 49 간큰차이없이그대로사용하기에적절하여농도를조정할필요가거의없고, 검사과정에서세포부유액이눈에보이므로검사가수월해지는등여러장점이있었다. 본연구에서는검체 / 대조 MFI 비를구하여결과를판정하였는데, 이값은선형증폭으로회수하여구하는 sample-control channel displacement 값보다항HLA항체의수준을더잘반영한다고한다 [13]. 실제로본검사실에서신장이식을위한 FCXM 2 회에서 MFI 비 3.2 및 2.9로양성이었던환자를 1 혈장량을 5% 알부민으로대체하는혈장교환술을하였는데, 1회시행후 MFI 비 1.9로감소하였고이후추가혈장교환술시행으로 1.2로음전되었으므로 [14] MFI 비는혈중항HLA항체의역가를잘반영하는것을알수있었다. 본연구에서도 3가지다른방법에의한측정에서도서로잘일치하였으므로이값이방법에따른차이에도불구하고항HLA항체의수준을일관되게반영하는값임을시사하였다. 뿐만아니라, 신장이식후환자의혈청과공여자의림프구와반응시켜얻은 MFI 비값을추적관찰하면급성거부반응진단에도움이될것으로추측된다. 신장이식후공여자특이 HLA 항원에대한항HLA항체 (donor specific antibody, DSA) 가발생하는것은급성거부반응과관계가있으므로 [15], 이의진단을위하여 ELISA 법으로 DSA를감시할수있는상용키트 [16] 가판매되고있는데, 해당공여자의림프구를사용한 FCXM의 MFI 비도같은원리로공여자항원에특이한항HLA항체의출현유무및그수준을반영할것으로생각된다. MFI 비계산에사용되는음성대조의 MFI의평균치는표준법, 전혈용혈법및전혈법각각 11.9, 10.4 및 8.4로전혈용혈법이표준법에비하여높지않았으나, 양성 5예의 MFI 비평균치는각각 15.6, 17.4 및 15.6으로전혈용혈법이가장높았다. 이는전혈용혈법의음성과양성분별력이가장우수함을시사하는소견이다. 전혈용혈법에서만양성이었던불일치 1예가있었는데, 수여자는임신및수혈경력이없는 20세 Alport 증후군및말기신부전여자환자이었고수여자는친모이었으며 3 HLA-ABDR 불일치이었으나 AHG-CDC 방법교차시험은음성이었고이식후면역억제제투여받으며거부반응의소견은보이지않고있다. 본예의불일치원인은전혈용혈법의위양성경향때문이라기보다수기법에의한검사과정상있을수있을수있는무작위실수때문인것으로생각되었다. 참고로, AHG-CDC 방법음성이고 FCXM 방법양성인경우 : 1) 항HLA항체가저농도 (sublytic concentration) 이거나, 2) 항HLA항체가보체비고정항체 (noncomplement-fixing antibody) 이거나, 3) 수여자혈청내응집혹은복합형태의면역글로불린에의한위양성반응등으로해석할수있다 [17]. 본연구에서 cutoff MFI 비는이전실험에서임신이나수혈경력이없는건강인혈청 20개에서각각측정한검체 / 대조 MFI 비들의평균 +3 표준편차로구하였다. 그값은실제로 1.4이었으나편의상 2.0으로정하였다. MFI 비의 cutoff는매일괄 (batch) 검사마다충분한수의음성대조를병행하여이의통계로써매번새로정하는것이이상적이다. 그러나 MFI 비가해당일괄의음성 대조값으로나눈값이어서그자체로써해당일괄에서발생한변이가일부보상될것이므로, 본연구에서와같이고정 cutoff를사용하더라도신뢰성있는결과판정을할수있고검사편이성면에서도더좋을것같다. 실제로외국의한보고 [18] 를보면, cutoff MFI 비는 T 세포 FCXM에서 2.0, B 세포 FCXM에서 3.0으로고정 cutoff를사용하고있었다. 교차시험에서전혈을이용한다면문제가될것으로추정되는것중하나는림프구이외의세포에의한위음성현상이다. 백혈구와혈소판은 HLA class I 항원을표현하므로항HLA항체에대하여림프구와경쟁하여위음성결과를초래할수있다. 이런현상은본연구에서와같이반응시킬혈청을과량 (100 L) 으로사용함으로써방지할수있을것으로생각된다. 교차시험에서혈청량 / 세포수비가검사의민감도에큰영향을미치는데, 반응시킬혈청량을높이거나림프구수를낮추면검사의민감도가높아진다 [13]. 방법별로반응하는혈청량 ( L)/ 림프구수를보면, CDC 방법은 1/2,000 이고, FCXM에서는 50/50,000[2], 50/250,000[13], 20/100,000[3] 으로문헌마다다양하였고, 본연구에서약 100/40,000으로과량의혈청을사용함으로써 HLA 항원을표현하는다른세포혼입에의한위음성이나 MFI 비의감소를방지할수있었던것으로해석된다. 전혈을이용할경우다른혈구의 HLA 항원이외위음성의다른원인으로, 공여자적혈구와반응하는적혈구비예기동종항체이다. 이항체가적혈구에부착되면 anti-igg FITC를소모시켜위음성을초래할것으로생각된다. 이문제는단클론항체염색전에먼저적혈구용혈액을사용하여적혈구를용혈시켜제거하면해결될것으로생각된다. 이때적혈구용혈액에는고정액이포함되지않아야염색전에림프구가고정되지않는다. 특이도가높은매우정제된 anti-igg FITC를과량사용하여적혈구에부착된 IgG 에소모되어도림프구에부착된 IgG 검출에영향을받지않도록하는방법을생각할수도있으나, anti-igg FITC는음성과양성대조의분별력, 즉양성대조의 MFI 비가최대가되도록희석비율을이전에결정해서사용해야하므로적절하지않을것이다. 수집시적혈구가그대로있는전혈법에서 gating 적용방법에따라분석효율에영향이크다. 평상시대로 forward scatter characteristics (FSC) threshold로설정하여모든세포의신호를수집한다면 T 세포신호수집효율이떨어지고컴퓨터에저장된파일의크기가상당히커지게된다. 본연구에서와같이 FL2 threshold로써 fluorescence signal triggering 기법을이용하면적혈구의신호를수집에서제외할수있어서 T 세포신호의수집효율이높아지고저장되는파일의크기도작아진다. 이기법은검체조작을최소화하면서 light scatter triggering보다수집효율을약 5배높인다고한다 [11]. 검사소요시간면에서전혈법의소요시간이크게단축될것으로기대되었으나, 실제로는적혈구수에비하여극소수인 T 세포를감별하기위해최종 pellet을 PBS 1 ml로재부유시켜측정하였는데, 충분한수 ( 적어도 3,000개 ) 의 T 세포신호를모으기위해

6 50 원동일 수집시간이한시험관당약 5분으로길어지게되어전체검사소요시간을크게단축시키지는않았다. 신장이식을위한 FCXM에서림프구분리없이전혈을이용한방법도표준법과비교하여만족할만한결과를보였다. 전혈이용으로인한위음성가능성에대한해결방법이추가된다면이간편방법도검사실에서실제사용될수있을것으로생각된다. 전혈을이용하는방법이표준법을대체하지는못하더라도, 최소한불가피하게림프구외다른혈구가혼입된경우차선책으로적혈구를용혈시킨다거나, FL2 threshold를설정하여 fluorescence signal triggering 기법으로측정하더라도다른혈구에대한자가항체가없다는전제하에올바른결과를얻을수있다는것에대한근거자료가될수있을것으로생각된다. 결론적으로, 신장이식을위한 FCXM에서림프구분리없이전혈을이용한방법도표준법과비교하여만족할만한결과를보였다. 이연구는또한불가피하게림프구외다른혈구가혼입된경우, 본연구의변형된방법으로측정이가능하다는것에대한근거가될수있을것으로생각된다. 요약서론 : 신장이식을위한유세포분석법에의한 HLA 교차시험 (flow cytometry crossmatch, FCXM) 에서공여자말초혈액에서분리한림프구가사용된다. 본연구에서는 FCXM에서림프구분리과정없이전혈을이용하는방법을시도하여보았다. 방법 : 신장이식을위한 T 세포 FCXM에서 20예 ( 양성 5예포함 ) 를대상으로, 단핵구를분리하여검사하는방법 ( 표준법 ) 을기준으로전혈을이용한두가지변법을비교하였다. 전혈을이용하는경우, 공여자전혈과과량의수여자혈청을반응시킨후적혈구를용혈 ( 전혈용혈법 ) 시키거나, 용혈시키지않고 fluorescence signal triggering 기법으로 T 세포의신호를수집 ( 전혈법 ) 하였다. 결과판정을위하여시험혈청의측정치를음성대조로나눈값, 즉평균형광강도비 (MFI ratio) 를구하였다. 결과 : 표준법, 전혈용혈법, 전혈법에의한 20예의 MFI 비는각각 4.9±8.1, 5.4±9.7, 4.8±7.8로, 전혈용혈법과전혈법둘다표준법과비교하여유의한차이가없었다 ( 각각 P=0.313, 0.831, paired t-test). 정성판정은 1예를제외한모든예에서일치하였다. 불일치한 1예는전혈용혈법에서만 MFI 비 2.2의약양성이었다. 결론 : 신장이식을위한 FCXM에서전혈을이용한방법은표준법과비교하여만족할만한결과를보였다. 이연구는또한불가피하게림프구외다른혈구가혼입된경우, 본연구의변형된방법으로측정이가능하다는것에대한근거가될수있을것으로생각된다. 참고문헌 1. 대한진단검사의학회 ( 정도관리분과위원회 ). 제13차 HLA 검사신빙도조사분석결과 Hoy T, Garner S, Shenton BK, Bell AE, Lowdell MW, Farrant J, North M, Sewell C. Further clinical applications. In: Ormerod MG, editor. Flow cytometry Third Edition. New York: Oxford University Press, 2000: Robert AB. Flow Cytometry Crossmatching for solid organ transplantation. In: Darzynkiewicz Z, Robinson JP, et al. eds. Method in cell biology: volume 41 flow cytometry part A. 2nd ed. San Diego: Academic Press, 1994: von dem Borne AE, Verheugt FW, Oosterhof F, von Riesz E, de la Riviere AB, Engelfriet CP. A simple immunofluorescence test for the detection of platelet antibodies. Br J Haematol 1978;39: Oh WI, Park MH, Han KS. Detection of serum platelet antibodies using microplate platelet suspension immunofluorescence test. Korean J Clin Pathol 1990;10: ( 오원일, 박명희, 한규섭. Microplate를이용한면역형광법에의한혈청내혈소판항체검색. 대한임상병리학회지 1990;10: ) 6. De Caterina M, Grimaldi E, Ungaro B, Fratellanza G, Varriale V, Ciarnelli M, et al. Effect of paraformaldehyde on platelet size and on measurement of surface IgG. Platelets 2002;13: National Institute for Biological Standards and Control. Platelet immunofluorescence test. asp?id=28 8. Robinson MS, MacKie IJ, Machin SJ, Harrison P. Two colour analysis of reticulated platelets. Clin Lab Haematol 2000;22: Tait JF, Smith C, Wood BL. Measurement of phosphatidylserine exposure in leukocytes and platelets by whole-blood flow cytometry with annexin V. Blood Cells Mol Dis 1999;25: Alvarez-Larran A, Jover L, Marin P, Petriz J. A multicolor, no-lyse no-wash assay for the absolute counting of CD34+ cells by flow cytometry. Cytometry 2002;50: Li N, Goodall AH, Hjemdahl P. Efficient flow cytometric assay for platelet-leukocyte aggregates in whole blood using fluorescence signal triggering. Cytometry 1999;35: Sigma-Aldrich, Inc. Histopaque-1077 package insert. St. Louis: Sigma-Aldrich Inc.; Robert AB and Howard MG. Clinical utility of flow cytometry in allogeneic transplantation. In: Keren FD, McCoy JP Jr, et al. eds. Flow cytometry in clinical diagnosis. 3rd ed. Chicago: ASCP Press, 2001: 김유경, 허운보, 원동일, 서장수. 유세포분석교차시험에서양성을보인신장이식예정환자에서혈장교환술을시행한 1예. 대한진단검사의학회지2004;24(S2):S422.

7 전혈 HLA 유세포분석교차시험 Zhang Q, Liang LW, Gjertson DW, Lassman C, Wilkinson AH, Kendrick E, et al. Development of posttransplant antidonor HLA antibodies is associated with acute humoral rejection and early graft dysfunction. Transplantation 2005;79: GTI, Inc. Antibody Monitoring System (AMS): HLA Class I/II package insert. Waukesha: GTI, Inc.; Wahrmann M, Exner M, Regele H, Derfler K, Kormoczi GF, Lhotta K, et al. Flow cytometry based detection of HLA alloantibody mediated classical complement activation. J Immunol Methods 2003;275: Ta M and Scornik JC. Improved flow cytometric detection of donorspecific HLA class II antibodies by heat inactivation. Transplantation 2002;73:

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석사논문.PDF ABO Rh A study on the importance of ABO and Rh blood groups information in Public Health 2000 2 1 ABO Rh A study on the importance of ABO and Rh blood groups information in Public Health 2000 2 2 ABO Rh