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[ 별지제 8 호서식 ] 연구개발보고서초록 과제명 ( 국문 ) 약쑥의간암과유방암억제기작규명및암예방식품소재개발 ( 영문 ) Chemopreventive mechanisms of mugwort against liver and breast cancer, and development of functional food materials 주관연구기관서울대학교 ( 소속 ) 서울대학교총괄연구책임자참여기업 ( 성명 ) 이형주 계 240,000 총연구기간 2004. 5.~ 2007. 5.(3 년 ) 총연구개발비 정부출연금 총인원 22 (240,000 천원 ) 총참여기업부담금내부인원 2 연구원수 연구기관부담금외부인원 20 연구개발목표및내용 1 차년도 ( 04-05) 약쑥의 in vitro 항산화, 항염증활성및암세포증식억제활성탐색 약쑥의 in vitro 항산화, 항염증활성탐색 약쑥의인간유방암세포와간암세포에대한약쑥추출물의세포증식억제및항염증효과탐색 2 차년도 ( 05-06) 약쑥의간암, 유방암및위암세포에대한세포사멸기작과세포간신호전달조절기작탐색 약쑥의유방암과 간암세포및위암세포에 대한사멸기작및효과탐색 약쑥의간암과유방암세포에대한 세포간 신호전달조절활성탐색 3 차년도 ( 06-07) 약쑥의 in vitro 간암과유방암모델을이용한침투및전이억제활성탐색및 in vivo 동물모델을이용한대장암종양증식억제활성탐색및암예방식품소재개발 약쑥의간암세포, 유방암세포에대한이동및전이억제활성탐색 In vivo 동물모델을이용한약쑥의종양증식억제활성탐색 약쑥의암예방식품소재의산업적응용을위한기능성식품소재의생산조건확립

연구결과 1. 약쑥의 in vitro 항산화, 항염증활성및암세포증식억제활성탐색약쑥을채취한뒤세척, 분쇄후메탄올을이용하여추출물 ( 약쑥추출물 ) 을제조하였다. 약쑥추출물로부터활성성분을분리하기위하여메탄올추출물로부터에틸아세틸분획물을분리한뒤 silica gel chromatography를수행하여분획물들을제조하였다. TLC 분석을통해분획물들을유사한성분으로조성된분획물로구분하였고, 그중활성을갖는분획물을 ODS-18 resin으로분리하였고 70% 메탄올로 eluttion된분획물에서최종활성분획을분리하였다. 이활성분획으로부터플라보노이드인 eupatilin, jaceosidin 그리고 TMH flavone이동정되었으며 (Figure 1), 각성분들을이용하여암예방활성을규명하였다. 약쑥추출물은 1 g의추출물당 14.54 mg의 gallic acid에해당하는페놀성화합물을포함하고있는것으로분석되었으며, 약 50 mg/ml에서 50% DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 그러나약쑥플라보노이드의구조에따른항산화활성의차이는나타나지않아 2번탄소위치에있는주로 -OH 기가각플라보노이드항산화활성에기여하는것으로추정할수있었다. 약쑥추출물의간암세포에대한항염증활성을분석하기위해쥐의간정상세포에발암유전자인 ras를도입하여암화를유도한 WB-F344-ras 세포주모델을이용하였다. 약쑥추출물은농도의존적으로염증의대표적인지표인 cyclooxygenase-2 (COX-2) 의발현을저해하였다약쑥의유방암세포에대한증식억제활성및관련조절기작을밝히기위해 MCF-10A 인체유방상피세포에 ras 종양유전자를도입한 MCF-10A-ras 세포주모델을이용하였다. Jaceosidin 과 eupatilin은농도의존적으로유방암세포의증식을억제하였으며, jaceosidin의증식억제활성이 eupatilin보다높았다. 이와같은세포증식억제활성차이는 eupatilin보다 hydroxyl 잔기를하나더가지고있는 jaceosidin만이 ROS를더많이생성함으로써일어나는것으로추정된다. Jaceosidin에의한 MCF10A-ras 세포의증식억제는세포사멸및세포의생존을조절하는단백질들인 Bcl-2/Bax 비를감소시키고 PARP과 caspase-3의 cleavage를일으킴으로써미토콘드리아를매개하는자가사멸을촉진하는것으로나타났다. 또한 jaceosidin은 ROS를매개하는 apoptotic signal인 p53과 p21의발현을증가시킴으로써세포증식을억제하는것으로보인다. 아울러세포증식과관련된 ERK/MAPK 와 JNK의인산화를저해함으로써세포의증식을억제하는기작도관여하는것으로나타났다. 2. 약쑥의간암, 유방암과위암세포에대한세포사멸기작과세포간신호전달조절기작탐색약쑥추출물의주요활성성분인 eupatilin을유방암증식억제활성및조절기작을규명하였다. Eupatilin은농도의존적으로유방암세포의증식을억제하였으며, 이는 G1/S 세포주기의억제를통해이뤄지는것으로나타났다. Eupatilin은세포주기과정중 G1기에서 S기세포주기조절에있어서중요한역할을하는단백질인 cyclin D1, cyclin B1, Cdk2 와 Cdc2 의발현을저해하였다. 또한 eupatilin은 Raf/MEK/ERK 신호전달경로를통해전사인자인 AP-1의활성을감소시켜 cyclin D1의발현을저해하는것으로나타났다. 또한다른인체유방암세포인 MCF-7 세포모델에있어서도 eupatilin은 Cdk2의발현을억제하고, p53, p21의발현은증가시킴으로써암세포증식으로억제하는것으로나타났다. 약쑥의위암세포에대한증식억제활성및관련조절기작을밝히기위해 AGS 인간위암세포모델을이용하여쑥추출물의주요활성성분인 eupatilin을증식억제활성을측정하였다.

Eupatilin은 AGS 위암세포의성장을농도의존적으로하였으며마이토콘리아손상을매개하는자가사멸을유도하는것으로나타났다. Eupatilin은 p53의발현을증가시킴으로써 Bcl-2/Bax 비를감소키고순차적으로 caspase-3와 PARP의 cleavage를일으키는것을확인하였다. 또한 eupatilin은세포주기에관련된 p21의발현을증가시켜세포주기조절을저해함으로써부분적으로세포증식을억제하는것으로나타났다. 이에더하여 eupatilin은세포증식과관련된 ERK/MAPK 경로와생존에관련된 Akt 신호전달경로를저해하는것을확인하였다. 약쑥의세포간신호전달 (GJIC) 조절활성을규명하기위해 eupatilin (Eupa), jaceosidin (Jace), 그리고 TMH flavone (TMH) 을이용하여활성산소생성물질인 PMS로억제한쥐간정상세포의세포간신호전달에대한조절효과를규명하였다. Eupatilin은농도의존적으로 PMS로억제한 GJIC을회복하였으며, jaceosidin, TMH flavone 또한 PMS로억제한 GJIC를회복하였으나농도의존적인경향은나타나지않았다. 이중 eupatilin은 ERK/MAPK 의활성화경로가아닌 PMS에의해증가된세포내활성산소의농도를조절함으로써과인산화된 connexin-43을탈인산화시키는것으로나타났다. 따라서 eupatilin 은세포내증가된 ROS에의해과인산화된 connexin-43의탈인산화를통해억제된 GJIC를회복시키는것으로나타났다. 3. 약쑥의 in vitro 간암과유방암모델을이용한침투및전이억제활성탐색및 in vivo 동물모델을이용한대장암종양증식억제활성탐색및암예방식품소재개발인체유방상피 (MCF-10A) 세포에서 TNF-α에의해유도된전이와관련하여 upa의조절기작에있어서 eupatilin의저해효과에대하여알아보았다. Eupatilin 은 TNF-α로유도한 MCF-10A 세포의침윤과 upa의발현을저해하였다. 또한 eupatilin은전이와 upa의발현을조절하는 β-catenin의발현과핵내로의이동성을저해하였고 β-catenin이매개하는전사인자인 TCF-4의 DNA 결합능을저해하는것으로확인하였다. 또한 jaceosidin의유방암억제효과를탐색하기위해서인간정상유방세포인 MCF-10A 세포에서잘알려진암촉진제인 TPA 또는 RAS 유전자도입에의해유도된전이지표에대한약쑥플라보노이드의조절활성을규명하였다. Jaceosidin은 TPA로유도한 MCF-10A의침윤및이동능을억제하였으며이는 ERK를매개로한전이단백질인 MMP-9 활성화및전이관련염증지표인 COX-2 발현의저해를통해이뤄지는것으로나타났다. 약쑥의플라보노이드인 eupatilin, jaceosidin, TMH flavone 모두 MCF-10A-ras 세포의 MMP-2 활성및침윤성과이동을저해하는활성을나타내었다. 약쑥의생리활성성분들이간암세포의전이및촉진에대한효과를확인하기위해 MMP-2/9 의활성과침윤성, 이동성에대한실험을수행하였다. 그결과 eupatilin, jaceosidin, TMH flavone 모두 MMPs의활성과간암세포의이동능을저해하지못하였으나 jaceosidin은간암세포의침윤성을저해함으로써전이억제의가능성을제시해주었다. 발암물질인 azoxymethane (AOM) 과염증유발물질인 dextran sulfate sodium (DSS) 를처리한결과염증의유발이대장암발생과정을 promotion한다고알려져있다. 따라서 AOM과 DSS 로유도한대장암모델에서약쑥추출물이지니는암예방효과를알아보고자하였다. 그결과약쑥추출물을 DSS 투여시부터 15주간지속적으로사료를공급한후 16주이후에 colon 조직을적출해본결과 polyp의수가감소하는것을관찰할수있었다. 약쑥추출물은대표적인염증인자인 COX-2와 inos의발현을감소시켰으며이는 ERK 신호경로와 COX-2의전사과정을조절하는대표적전사인자인 NF-kappaB의 DNA binding activity의저해를매개하여나타나는것으로규명되었다. 따라서이와같은일련의결과를볼때, 약쑥추출물은 AOM과 DSS에의해유도된 colon 발암모델에서 COX-2와 inos의발현저해를통해대장암의증식을저해

하는것으로나타났다. 연구성과활용실적및계획 가. 국내특허등록 1건 1) 테트라메톡시하이드록시플라본을포함하는유방암억제용조성물 등록번호 : 제 10-0700358 (2007. 3. 21) 나. 국내특허출원 6건 1) 테트라메톡시하이드록시플라본을포함하는유방암억제용조성물 ( 출원번호 : 제 10-2005-0043888, 등록번호 : 제 10-0700358) 2) 자시오시딘을포함하는유방암억제용조성물 ( 출원번호 : 제 10-2005-0043889) 3) 유파틸린을유효성분으로함유함을특징으로하는세포간갭결합장애매개질환의예방용조성물 ( 출원번호 : 제 10-2005-0043890) 4) 유파틸린을포함하는유방암억제용조성물 ( 출원번호 : 제 10-2005-0043891) 5) 자시오시딘을포함하는유방암전이억제용식품조성물 ( 출원번호 : 제 10-2007-0023923) 6) 유파틸린을포함하는유방암전이억제용식품조성물 ( 출원번호 : 제 10-2007-0025950) 다. 국외학술지논문게재 3건 1) Kim DH, Na HK, Oh TY, Shin CY, and Surh YJ. Eupatilin inhibits proliferation of ras-transformed human breast epithelial (MCF-10A-ras) cells. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol., 2005, 24(4), 251-259 2) Kim MJ, Kim DH, Lee KW, Yoon DY, and Surh YJ. Jaceosidin, a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants, induces apoptosis in ras-transformed human breast epithelial (MCF10A-ras) cells. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2007, 1095, 483-295 3) Jeong, Min A, Ki Won Lee, Do-Young Yoon, and Hyong Joo Lee. Jaceosidin, a pharmacologically active flavone derived from Artemisia argyi, inhibits phorbol-ester-induced upregulation of COX-2 and MMP-9 by blocking phosphorylation of ERK-1 and -2 in cultured human mammary epithelial cells. Ann. New York Acad. Sci. 1095: 458-466 (2007) 라. 국외학술지논문게재준비중 1) Potent antimetastatic effects of 5,7-dihydroxy-3',4',6-trimethoxy flavone (eupatilin) isolated from Artemisia plants on H-ras MCF10A human breast epithelial cells 2) Inhibitory effects of 5,7,4'-trihydroxy-6,3'-dimethoxy flavone (jaceosidin) on

H-ras-induced invasion and migration of human breast epithelial cells 3) 5,6,3',5'-tetramethoxy-7,4'-hydroxy (TMH) flavone inhibits H-ras-induced invasion and migration in MCF10A human breast epithelial cells 4) Effects of 5,7-dihydroxy-3',4',6-trimethoxy flavone (eupatilin) on phorbol ester-induced invasion and migration of MCF10A human breast epithelial cells 5) 5,7,4'-trihydroxy-6,3'-dimethoxy flavone (jaceosidin) inhibits phorbol ester-induced invasion and migration in MCF10A cells 6) Chemopreventive effects of 5,6,3,5 -tetramethoxy 7,4 -hydroxyflavone isolated from Artemisia plants on breast epithelial cells 마. 국내학술대회포스터발표 1건 1) Kim MJ, Kim DH, and Surh YJ. TNF-α induces invasion by stimulating urokinase-type plasminogen activator and β-catenin signaling in human breast epithelial(mcf-10a) cells through generation of reactive oxygen species. 대한약학회, 2005. Nov. 바. 국외학술대회포스터발표 4건 1)Jeong, Min A, Ki Won Lee, Haeng Jeon Hur, Young-Joon Surh, and Hyong Joo Lee. Eupatilin, a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants, inhibits both H-ras- and TPA-induced upregulation of MMPs in human mammary epithelial cells: ERK1/2 and p38 MAPK as potential molecular targets. "Targeting Carcinogenesis" Symposium. Hormel Institute. Oct. 6-7, 2005. Kahler Grand Hotel. Rochester, MN. 2) Kim MJ, Kim DH, and Surh YJ. Eupatilin inhibits TNF-α-induced invasion by blocking urokinase-type plasminogen activator and β-catenin signaling in human breast epithelial (MCF-10A) cells. Signal Transduction Pathways as Therapeutic Targets, 2006. Jan. 3) Kim MJ, Kim DH, and Surh YJ. Eupatilin inhibits TNF-α-induced invasion by blocking urokinase-type plasminogen activator and β-catenin signaling in human breast epithelial (MCF-10A) cells. The 99th Annual Meeting of American Association for Cancer Research, U.S.A, 2006. April 4) Jeong, Min A, Ki Won Lee, Haeng Jeon Hur, Nam Joo Kang, Bong Jik Shin, Bo Hyun Kim, Do-Young Yoon, Young-Joon Surh, and Hyong Joo Lee. Polyphenols isolated from Artemisia plants, inhibit both H-ras- and phorbol ester-induced upregulation of MMPs in human mammary epithelial cells by blocking phosphorylation of MAP kinases. Nov. 5-8, 2006. Worldnutra 2006. Reno, Nevada. U.S.A. ( 우수포스터발표상 )

2. 연구결과의활용계획 가. 추가연구의필요성 1) 연구범위의확대본과제를통해전통적으로음식, 생약, 뜸등의민간요법으로이용되던약쑥의건강기능성을간암및유방암모델을통해암예방효능및메커니즘의기초데이터를확보함으로써전통식품의건강기능성에관한과학적근거를마련하였다. 간암및유방암의억제에있어관련생화학적생체지표는피부노화, 동맥경화, 치매의병변지표와도밀접한관련이있으므로약쑥추출물의발암분자지표의저해를통한암예방활성은성인병예방, 기능성화장품으로의응용을위한연구에도그효능을기대할수있다. 2) 기능성제품의상품화연구본연구를통하여 in vitro 와 in vivo 효능평가및관련조절기작에관한기초결과는확보되었으나, 기능성식품신소재개발을위해서추가적으로임상실험이진행된다면제품의상품화가보다용이할것으로사료되며이로인해농민소득증대에기여할수있으리라판단된다. 3) 신소재의대량생산연구본과제를통하여약쑥및약쑥플라보노이드의새로운기능성소재성공가능성을제시하고있으나, 이를상업화하기위해서는추가적인대량생산및최적화공정에관한연구가필요하다. 나. 타연구에의응용 1) 핵심기술활용분야가 ) 약쑥성분의분석데이타베이스화나 ) 기능성소재의 in vitro 암예방활성검색기술다 ) 기능성소재의체내대사및기작연구기법활용 2) 핵심기술활용유형및산업가 ) 개발소재조성물의용도에대한특허화및소재화나 ) Nutraceutical, Pharmaceutical, Cosmeceutical 소재응용 3) 식품소재가 ) 암예방식품및병원 ( 치료 ) 식의원료로사용나 ) 건강보조식품의원료및제품으로사용 다. 기업화추진방안 1) Scale-up 연구를통한상업화추진가 ) 대량생산설비및공장적용검토나 ) 수율증대를통한제조비용의절감추진다 ) 생산경제성평가및시장조사평가를통한상용화시점조절

2) 건강기능식품으로적용모색가 ) 2004년하반기부터실시된, 건강기능식품법에따라소재의기능성홍보및표시를위해서는건강기능식품인증절차가필요함. 나 ) 본과제의소재는건강기능식품개별인정형제품으로응용이필요함. 다 ) 건강기능식품개별인정을위해서는전임상이상의기능성평가결과와안전성 ( 독성 ) 평가데이터의추가적인확보에노력하여야함. 3) 확보된기술에대한기술이전모색가 ) 본과제를통하여 6건의특허를출원하였으며이중 1건의특허가등록되었음나 ) 특허를통하여지적소유권을확보후, 기반기술로서기술이전추진이가능함.