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준서 복
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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): (2017) ISSN / eissn Research Paper 감마오리자놀의위암세포증식억제및세포사멸유도효능 신은주 1,2, 정상원 1, 황진택 1,2 * Effect of γ-oryzanol on Proliferation and Apoptosis of AGS Human Gastric Carcinoma Cell Eun Ju Shin 1,2, Sangwon Chung 1, and Jin-Taek Hwang 1,2 * Received: 2 February 2017 / Revised: 29 March 2017 / Accepted: 4 April The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Gamma (γ)-oryzanol is a substance abundant in rice, which is widely cultivated in Asian countries. In this study, we evaluated the effect of γ-oryzanol treatment on proliferation and apoptosis of AGS human gastric carcinoma cells. AGS cells were treated with γ-oryzanol for 72 h in a dose dependent manner. Treatment of γ-oryzanol (50, 100, and 200 μg/ml) resulted in decreased AGS cell proliferation and increased number of cells in the sub-g1 population. Additionally, apoptotic cells were investigated by annexin V staining and mitochondrial membrane potential assays. Our results indicated that γ-oryzanol treatment increased the number of annexin V-positive cells and depolarized cells. This demonstrated that γ-oryzanol is effective for the induction of apoptosis in AGS cells. We next examined the expression of promising anticancer drug target molecules, including PTEN and HSP90. We found that treatment of γ-oryzanol induced the expression of PTEN in AGS cells. Under the same treatment conditions, γ-oryzanol reduced the expression of HSP90 in AGS cells. These results suggest that γ-oryzanol-induced apoptosis was accompanied by changes in regulation of PTEN and HSP90 in AGS cells. Taken together, γ-oryzanol could be used as a functional substance for the prevention of gastric cancer. 1 한국식품연구원 1 Korea Food Research Institute, Seongnam 13539, Korea Tel: , Fax: address: jthwang@kfri.re.kr 2 과학기술연합대학원식품생명공학과 2 Department of Food Biotechnology, University of Science & Technology, Daejeon 34113, Korea Keywords: Gamma oryzanol, AGS human gastric carcinoma cell, Cell proliferation, Apoptosis, PTEN 1. INTRODUCTION 암은전세계적인사망률의주요원인으로, 한국인의사망률에서도 1 위를차지하고있는데 [1], 특히위암은동아시아에서발병률이높고, 우리나라의위암발생률은일본, 중국보다높은것으로알려져있다. 실제로 2014 년우리나라암발생현황에따르면, 위암발생률은갑상선암다음으로발생률이높았고, 남자는암발생률중위암발생률이가장높은것으로나타났다 [2]. 이로인해경제사회적손실이매우크며개인뿐만아니라국가차원의비용도막대하게지불되고있어체계적인위암예방및관리가절실하다. 아직까지위암의치료방법으로는주로위절제술이시행되고있지만, 위암 2 기혹은 3 기인경우, 위절제이후에재발하기도하기때문에이를예방하기위해항암화학요법 (chemotherapy) 이시행되기도하는데, 동아시아에서의기준이되는위절제술에적합한항암화학요법은아직밝혀진바가없다 [3,4]. 그러므로단순히위암치료에만집중하기보다는체계적인예방조치가선행되어야한다. 이러한예방전략중식품또는식품유래성분을통해치료가까다로운암을발병하기전에미리차단하고속도를지연시켜암을예방하는화학적암예방개념은 Sporn 등에의해 1976 년에처음으로제안되어진이후현재까지활발한연구가진행중에있다 [5]. 이들화학적암예방식품소재는암치료에쓰이는약물과유사하게암세포의증식, 세포주기, 전이등을차단하고이와관련된유전자의발현을억제하여항암작용을나타내는것으로보고

2 84 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): (2017) 되고있다 [6-9]. 대표적인예로, 녹차는 catechin 이라는생리활성물질이풍부한데, 그중 epigallocatechin gallate (EGCG) 는지난 10 년간많은연구자들에의해항암효과가높은것으로밝혀졌다 [6]. Yang 에의하면, EGCG 는 Wnt/β-catenin 신호를억제하여위암세포의증식을억제하였고 [7], Onoda 의연구에서도 EGCG 가 p73 활성의 survivin 발현을하향조절함으로써위암세포사멸을유도하는것으로밝혀졌다 [8]. 또한콩에많이함유되어있는 genistein 이라는 isoflavone 의일종인성분도위암세포의세포주기 G2 와 M 를억제하고, PTEN 의발현을촉진시키는것으로밝혀져위암예방효능을나타냄을보고하였다 [9]. PTEN (Phosphatase and tensin homolog) 은종양억제유전자로잘알려져있으며다양한암의발생과진행을막는데중요한역할을한다고알려져있는데이는암세포의증식에관여하는단백질의인산기를 PTEN 이제거함으로서활성을억제하기때문이다 [10]. 잘알려진바와같이세포의증식에중요한역할을하는기전인 PI3 kinase/akt 신호전달경로는인산화에의해활성화되는데 PTEN 은이들의인산화를억제함으로서신호전달경로의활성을차단하고그결과세포의증식을억제하게된다 [10]. 이러한특징으로인해 PTEN 을타겟으로하는다양한항암제가개발되어지고있고 PTEN 을제어할수있는식품천연물성분은암예방효능을나타낼수있다 [11]. PTEN 과더불어 HSP90 단백질은최근에암세포에서그중요성이부각되고있는데 HSP90 단백질의발현을억제하는성분은비소세포폐암및유방암등여러암세포성장과증식을억제한다고보고되어지고있다 [12]. 따라서 PTEN 의발현을증가시키고 HSP90 의발현을억제하는것이암세포의증식과성장을억제하는중요한기전이된다. 한국을포함한동양에서주로섭취하는쌀은많은연구를통해그영양학적우수성이알려져있으며, 특히쌀의미강층은 γ-oryzanol ( 감마오리자놀 ), ferulic acid, tricin, phytic acid, tocotrienols, tocopherols 등의활성성분들을함유하고있다고알려져있다 [13]. 감마오리자놀은 triterpene alcohol 의 ferulic acid ester 와 sterol 혼합체로서 [14], 비타민 E 군에속하는토코트리에놀 (tocotrienols), 토코페롤 (tocopherols) 등과함께다양한생리활성을나타내는지용성성분이다. 특히강력한항산화활성으로불포화지방산의산화를억제하여세포의손상을막아주는역할을하고 [15], 항염증효과도나타낸다고알려져있으며, 세포사멸유도, 세포증식억제, 그리고암세포의세포주기진행을변화시킴으로써항암효과도갖는것으로보고되어있다 [13,16,17]. 예를들어감마오리자놀은전립선암세포주에서 caveolin-1 의발현억제를통해세포의사멸을유도하였고, 대장암세포에서는 cyclooxygenase-2 (COX-2) 의발현을억제함으로항암효과를나타낸다고밝혀냈다 [18,19]. 더나아가, 감마오리자놀은콜레스테롤개선및당뇨예방효과를가지고있다고밝혀져영양학적으로관심을받고있고, 임상적효과에대한연구가증가하고있는추세이다 [20]. 한편선행연구에의한쌀품종별감마오리자놀함량은금종현미쌀에서 100 g 당 9.9 mg, 추청백미쌀에서 100 g 당 0.8 mg, 그리고추청현미쌀에서 100 g 당 5.9 mg 을나타냈다 [21]. 또다른연구에서국내쌀품종별 ( 삼광, 설갱, 화선찰, 큰눈, 홍진주, 흑광벼, 일품, 하이아미, 녹미 ) 감마오리자놀의함량을측정한결과현미에서는 g 당 ug 에서 ug 의함량분포를보였고, 백미에서는 g 당 ug 에서 ug 의함량을보여 [22] 일반적인국내산쌀에감마오리자놀은풍부하게포함되어있음을알수있다. 이상과같이감마오리자놀을포함한다양한식품천연물성분은암세포의성장과증식을억제하고이는특정종양억제유전자등을통하여이루어질수있음이보고되어지고있는데감마오리자놀의위암예방효과및명확한기전에대한연구는진행된바가없다. 쌀은한국인의주식으로섭취량도높기때문에, 한국인에게높은발병률을보이는위암에대한감마오리자놀의항암효과에대한연구는필수적이다. 따라서본연구에서는 AGS human gastric adenocarcinoma cell 을사용하여감마오리자놀의위암세포성장억제효능및세포사멸유도효과실험을통해감마오리자놀의위암예방효과에대해알아보고자하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 실험재료및시약본연구에사용된감마오리자놀은 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., (Japan) 로부터구입하여 Ethanol 에녹여실험에이용하였다. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 시약은 Sigma (MO, USA) 에서구입하여이용하였다. Cell cycle assay kit, Annexin V/Dead kit, Mitopotential assay kit 는 Milipore 사 (Darmstadt, Germany) 것을구입하여사용하였다. 연구에사용된 1 차항체 PTEN 과 HSP 90 은 Milipore (Darmstadt, Germany) 사에서구입하고 Actin 은 Bethyl Laboratories, Inc. (TX, USA) 에서구입하여이용하였다 세포배양본연구에사용된위암세포 AGS (Human gastic adenocarcinoma cells) 는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) 에서세포를구입하여사용하였다. AGS 세포는 10% FBS, 항생제가들어있는 RPMI 1640 배지 (Welgene, Daegu, Korea) 를이용하여 37 o C, 5% CO 2 조건의세포배양기에서배양하였다 세포생존능측정세포증식억제능을확인하기위하여세포를 24 well plate 에배양하였고, 감마오리자놀을농도별 (50, 100, 200 μg/ml) 로 72 시간을처리하였다. 그후 10 μl 의 MTT 시약 (5 mg/ml) 을넣어 37 o C incubator 에 2 시간배양한다. 살아있는세포의미토콘드리아내의 dehydrogenase 를이용한방법으로노란색의 MTT 시약이보라색으로염색된다. 이때배지를제거하

3 감마오리자놀의위암세포증식억제및세포사멸유도효능 85 고살아있는세포에염색된보라색 dye 를 DMSO 용액에용해시켜 100 μl 씩 96well plate 에옮겨 microplate reader (Molecular Device Co., CA, USA) 를이용하여 540 nm 에서흡광도를측정하였다 통계처리모든값은평균 ± 표준편차로나타낸것이며통계처리는 IBM SPSS statistics (ver. 20) 을이용하였고 Student's t-test 를시행하였다. 확률적유의성은 p<0.05 수준에서검정하였다 Cell cycle 측정 MUSE cell cycle assay kit 를이용하여제공된프로토콜대로실험을진행하였다. 세포는 24 well plate 에배양하였고, 감마오리자놀을농도별 (50, 100, 200 μg/ml) 로 24 시간을처리한후세포를 70% ethanol 에고정한다. 고정한세포를 centrifugation 하여 PBS 로세척한후 Cell cycle reagent 용액에 30 분 incubation 하며세포를염색한다. 염색후, Muse 세포분석기 (Millipore, Darmstadt, Germany) 를이용하여 cell cycle 을분석하여 SubG-1 population 을측정한다 Annexin V 활성측정 Apoptotic 세포는 Annexin V/Dead kit 를이용하여측정하였다. 세포를배양하여감마오리자놀을농도별로 24 시간을처리한후배지와세포를모아원심분리하여 PBS 로세척한다. 원심분리하여모아진세포에 Muse Annexin V cell reagent 를세포에넣어 20 분어두운상태로염색한다. 그후염색된세포를 Muse 세포분석기 (Milipore) 를이용하여측정한다 Mitochondrial membrane potential assay 측정세포는 24 well plate 에배양하였고, 감마오리자놀을농도별 (50, 100, 200 μg/ml) 로 24 시간을처리한후세포에 Mitopotential working 용액을넣고 37 o C 에서 20 분 incubation 한다. 추가로 Muse 7-AAD 시약을넣어실온에 5 분후, 세포내미토콘드리가기능장애로유도되는 Total depolarized cells 은 Muse 세포분석기 (Millipore) 를사용하여측정하였다 Western blot Apoptosis에영향을미치는관련단백질의발현정도변화를확인하기위해세포를배양한후감마오리자놀을농도별 (50, 100, 200 μg/ml) 로 6시간을처리한후 RIPA buffer (Elpis, 50 mm Tris-HCl, ph 8, 5 mm EDTA, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail) 를이용하여샘플 (Whole cell lysate) 을준비한다. WCL용액을 Bradford방법으로단백질을정량한후동량의단백질을 SDS sample buffer와섞고 5분간 heating하여단백질을 denature시킨후실험에이용한다. 샘플을 10% SDSpolyacrylamide gel에전기영동을실시한다. gel의단백질을 Nitrocellulose (NC) membrane으로 transfer한후, 5% skim milk를이용하여멤브레인을 1시간실온에서 blocking한다. 그후 PTEN, HSP90과 Actin의 1차항체를 4 o C 조건에서 overnight incubation을하고 HRP가붙어있는적절한 2차항체 (Enzo Life Sciences; NY, USA) 를붙여 ECL용액을이용한 chemiluminescent detection 방법으로각각의단백질발현을측정한다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 감마오리자놀의위암세포증식억제효과 AGS 위암세포주를사용하여감마오리자놀이암세포증식억제효능이있는지를 MTT assay 를통하여알아보았다. 감마오리자놀을각각의농도별 50, 100, 200 μg/ml 의농도로 72 시간처리후흡광도를측정하였다. Fig. 1 에서보는바와같이감마오리자놀처리농도 100 및 200 μg/ml 에서세포의증식을유의적으로억제하는것으로나타났다. 감마오리자놀은곡류에함유되어있는성분으로곡류중특히쌀겨에풍부하게함유되어있다. 최근연구에의하면다양한생리활성을가지고있으며, 갱년기장애의개선에도도움이된다고알려져있다 [13,16,18-20,23]. 본연구에서는한국인의암중에서가장발병률이높다고알려진위암을타겟으로세포모델을이용하여감마오리자놀의효능을평가하였고위암세포증식억제효능이탁월함을밝혀내었다. 이미감마오리자놀, 베타시토스테롤, 토코트리엔놀, 토코페롤및피티산등다양한성분을함유하고있는쌀겨는암예방효능이뛰어남이보고되어져있다 [13-16]. 이들은암세포의세포사멸유도, 세포주기진행의억제및세포증식억제를통해암세포의성장을억제한다 [13-16]. 예를들어쌀겨는동물모델에서 AOM 유도된대장암의성장을억제한다고알려져있고, 또다른보고에의하면쌀겨의펩타이드들은대장암, 유방암및간암의성장을억제한다고알려져있다 [24,25]. 따라서본연구도이들다른암종과유사하게위암또한성장을억제하였고, 선행논문에서제시한쌀겨또는쌀겨유래펩타이드들의암억제효능은감마오리자놀성분이적어도한부분에서중요한역할을할것이라예측된다. Fig. 1. The effect of γ-oryzanol on AGS cell proliferation. MTT assay in AGS cells treated with vehicle (Con) or γ-oryzanol for 72 h. Cell viability is presented as mean±sd. *p<0.05 vs. Con.

4 86 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): (2017) Fig. 2. Effects of γ-oryzanol on Sub-G1 population in AGS cells. Cell cycle analysis of AGS cells after 24h γ-oryzanol treatment (A). Histograms represented percentage distribution of cells in sub-g1 phase (B). Data are indicative of 3 individual experiments and are presented as mean±sd. *p<0.05 vs. Con Sub G1 phage 에대한감마오리자놀의효능암세포성장에있어세포주기의제어는연관된유전자들의발현을제어할수있어중요한전략이되며많은항암제또는천연물소재암세포치료제등이이들을타겟으로개발되어지고있다 [6-9]. 이들항암제또는천연물소재암세포치료제들은세포주기를정지시키며암세포가자살단계로가는 Sub G1 의 population 을증가시키게된다 [6-9]. 따라서본연구에서도감마오리자놀이위암세포증식억제에있어 Sub G1 phage 에대한영향이어떠한지를 flow cytometry 로측정하였다. Fig. 2A 에서보는바와같이대조군 (Con) 에비해감마오리자놀은농도의존적으로위암세포의 Sub G1 population 을증가시키는것으로나타났다. 이들의결과를그림 2B 에서그래프로나타내었다. Cisplatin 및 5-fluorouracil 은널리알려진항암제로서특히위암에쓰이고있고다양한연구를통해암세포주기의정지를유도하고세포주기와관련된단백질들의발현을조절하여암세포의사멸을유도한다고보고되어지고있다 [26]. 본연구에서도이들항암제와유사하게위암의성장을억제하는데있어세포주기의변화특히 Sub G1 phage 의증가를감마오리자놀이유도하는것을확인하여, 감마오리자놀의위암세포증식효과는기존항암제들과유사하게세포주기의변화를수반할것으로예측된다 감마오리자놀의위암세포사멸유도효능세포사멸 (apoptosis) 은세포내부에서일어나는현상으로주변의세포에영향을주지않고스스로사멸하기때문에암세 포치료에쓰이는항암제들이이를표적으로개발되었거나개발되어지고있다 [26]. Apoptosis 를측정하기위하여다양한방법이사용되어지고있는데그중대표적인것인 Annexin V staining 이다. 이에 AGS 위암세포주에감마오리자놀을농도의존적으로처리한후 Annexin V staining 을 flow cytometry 로측정한결과 Fig. 3A 및이를그래프화한 Fig. 3D 에서보는바와같이 total apoptotic 세포수가증가하는것을관찰할수있었다. 다음으로세포사멸시발생하는미토콘드리아전위차변화를측정하였는데 Fig. 3C 및이를그래프화한 Fig. 3B 에서보는바와같이감마오리자놀은농도의존적으로미토콘드리아전위차를증가시키는것으로확인되었다. 미토콘드리아는세포사멸에있어서중요한역할을하는데스스로자살로접어드는세포는이러한경로를활성화시키기위해에너지즉 ATP 가필요하게되고미토콘드리아에서공급받게된다 [27]. 아울러미토콘드리아는세포사멸이시작되면 intermembrane space 에서분리된 proapoptotic protein 들을 cytosol 로방출하고이들은전형적인 apoptotic signaling pathway 를활성화하게된다 [27]. 따라서미토콘드리아전위차변화는이들의신호체계가작동되고있음을예측할수있다. 이로서감마오리자놀은위암세포증식억제효능과더불어위암세포의사멸을유도함으로서궁극적으로항암효과를나타내는것으로사료되고이는미토콘드리아의전위차의변화에의한 proapoptotic protein 의 cytosol 로의분비및관련 signaling pathway 를활성화함으로써이루어질수있음을예측할수있었다.

5 감마오리자놀의위암세포증식억제및세포사멸유도효능 87 Fig. 3. Induction of apoptosis by γ-oryzanol in AGS cells. Annexin-V staining shows that treatment with γ-oryzanol for 24 h (A), Graphs represented percentage distribution of Annexin-V positive cells (B). Treatment with γ-oryzanol for 24 h significantly reduced depolarization of the mitochondrial membrane of AGS cells (C). Data are indicative of 3 individual experiments and are presented as mean±sd (D). *p<0.05 vs. Con 종양억제유전자 PTEN 및 HSP90 발현에감마오리자놀이미치는영향마지막으로대표적인종양억제유전자로알려진 PTEN 과최근항암제의타겟이된다고보고되어지고있는 HSP90 단백질의발현에있어감마오리자놀이어떠한효능을나타내는지를보고자하였다. PTEN 은발현이증가되면종양을억제한다고알려져있고 HSP90 은발현이억제되면종양을억제하는것으로알려져있다 [10,11]. 이를위하여감마오리자놀 을처리한후웨스턴블롯법을사용하여 PTEN 과 HSP90 단백질발현을분석한결과 Fig. 4 에서보는바와같이감마오리자놀은 PTEN 의발현을대조군에비해증가시키는것으로확인되었다. 같은조건에서 HSP90 은대조군에비해감마오리자놀이발현을억제하는것으로확인되어감마오리자놀의항암효과는 PTEN 발현의증가및 HSP90 의발현억제능에의해나타나는것으로예측되었다. PTEN 은 protein phosphatase 로서이단백질의 Mutation 은많은암세포에서발견되어

88 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): 83-89 (2017) Fig. 4. The effect of γ-oryzanol on the expressions of PTEN and HSP90 in AGS cells.

6 88 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): (2017) Fig. 4. The effect of γ-oryzanol on the expressions of PTEN and HSP90 in AGS cells. The expressions of PTEN and HSP90 were measured by Western blot analysis after 6 h γ-oryzanol treatment. 지고있으며이로인해세포증식에중요한신호전달경로인 PI3 kinase/akt 경로가지속적으로활성화되게되고암세포는무한증식을하게된다. 따라서 PTEN 은종양억제유전자로잘알려져있고, PTEN 의활성을증진시키는것이암성장을억제하는데중요한전략이되고있는데 rapamycin 이대표적인 PTEN 의증진제이다 [10,28]. 본연구에서감마오리자놀이 PTEN 의발현을증진시켰는데이는감마오리자놀이 PI3 kinase/akt 경로를 PTEN 의 Phosphatase 기능을활성화시켜차단할것으로예상되었다. 한편 HSP90 는암세포에서세포생존의안정화를돕는단백질로알려져있고 Geldanamycin 및 radicicol 등의다양한 HSP90 억제제가암억제로서개발되어지고있다 [11,29]. 최근연구에의하면식도편평상피암세포모델에서 HSP90 억제제로개발되어진 NVP-AUY922 의암억제효능을나타내는데있어 PTEN 이중요한역할을한다는보고가있었다 [30]. PTEN 이결손된세포에서 AKT 와 ERK 의활성화가증가되어있고 HSP90 억제제 NVP-AUY922 를처리시암세포의감수성이떨어지게된다 [30]. 즉 PTEN 과 HSP90 그리고 PI3 kinase/akt 경로의상호작용이암억제제의감수성을높일수있을것으로예상된다. 본연구에서감마오리자놀은 PTEN 의발현은증진시키고, HSP90 의발현은억제시켜결과적으로종양억제단백질의발현은증가시키고종양유도단백질의발현은억제시키는효과를나타내는것으로이전의결과와유사하게감마오리자놀은 HSP90 과 PTEN 의상호작용에의한강력한암억제효능을나타내는것으로사료된다. 이상과같이감마오리자놀을포함한다양한식품성분들이암예방또는항암활성을가지고있고이는특정단백질의조절, 세포주기의조절, 세포사멸유도및전이억제등다양한기전을통해이루어질수있음을본연구와선행연구들로알수있다 [6-9]. 다만식품에는단일성분의약품과는다르게다양한성분들이복합적으로존재하고있기때문에, 감마오리자놀같은단일성분의생리활성을찾아내는연구와더불어향후특정식품의다양한성분들간의상호작용에의한효능의상승또는하락에대한기작연구가필요할것이다. 4. CONCLUSION 본연구에서는쌀을포함한곡류에주로들어있는감마오리자놀의위암성장억제및위암세포사멸효능을 AGS 인체유래 위암세포주를사용하여증명하였다. 감마오리자놀은또한종양억제유전자로알려진 PTEN 의발현을증가시키고, HSP 90 발현은감소시켜항암효능을나타냄을찾아내었다. 이들결과로감마오리자놀은위암을억제할수있고, 더나아가감마오리자놀이풍부한곡류를섭취하는것이위암을예방할수있을것으로판단된다. Acknowledgements 이논문은 2017 년도미래창조과학부재원으로한국식품연구원의지원 (E ) 을받아수행된연구성과입니다. REFERENCES 1. Mortality Data. Statistics Korea. (2015). 2. Jung, K. W., Y. J. Won, H. J. Kong, C. M. Oh, H. Cho, D. H. Lee, and K. H. Lee (2015) Cancer statistics in Korea: incidence, mortality, survival, and prevalence in Cancer Res. Treat. 47: Sasako, M., S. Sakuramoto, H. Katai, T. Kinoshita, H. Furukawa, T. Yamaguchi, A. Nashimoto, M. Fujii, T. Nakajima, and Y. Ohashi (2011) Five-year outcomes of a randomized phase III trial comparing adjuvant chemotherapy with S-1 versus surgery alone in stage II or III gastric cancer. J. Clin. Oncol. 29: Noh, S. H., S. R. Park, H. K. Yang, H. C. Chung, I. J. Chung, S. W. Kim, H. H. Kim, J. H. Choi, H. K. Kim, W. Yu, J. L. Lee, D. B. Shin, J. Ji, J. S. Chen, Y. Lim, S. Ha, and Y. J. Bang (2014) CLAS- SIC trial investigators. Adjuvant capecitabine plus oxaliplatin for gastric cancer after D2 gastrectomy (CLASSIC): 5-year follow-up of an open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 15: Cazzaniga, M. and B. Bonanni (2012) Breast cancer chemoprevention: Old and new approaches. J. Biomed. Biotechnol. 2012: Gan, R.Y., H. B. Li, Z. Q. Sui, and H. Corke (2016) Absorption, metabolism, anti-cancer effect and molecular targets of epigallocatechin gallate (EGCG): An updated review. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. in press. 7. Yang, C., W. Du, and D. Yang (2016) Inhibition of green tea polyphenol EGCG(()-epigallocatechin-3-gallate) on the proliferation of gastric cancer cells by suppressing canonical wnt/b-catenin signalling pathway. Int. J. Food Sci. Nutr. 67: Onoda, C., K. Kuribayashi, S. Nirasawa, N. Tsuji, M. Tanaka, D. Kobayashi, and N. Watanabe (2011) (-)-Epigallocatechin-3-gallate induces apoptosis in gastric cancer cell lines by down-regulating survivin expression. Int. J. Oncol. 38: Liu, Y. L., G. Q. Zhang, Y. Yang, C. Y. Zhang, R. X. Fu, and Y. M. Yang (2013) Genistein induces G2/M arrest in gastric cancer cells by increasing the tumor suppressor PTEN expression. Nutr. Cancer 65: Leslie, N. R., N. Kriplani, M. A. Hermida, V. Alvarez-Garcia, and

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