기관고유연구사업결과보고

Transcription

1 기관고유연구사업결과보고

2

3

4

5

6

7

8 암유전자특이적발암기전규명을통해암발생과정의이해와치료방법의검증및개발 제 1 세부 : 암유전자에의한발암및전이기전을규명하고항암타겟으로유용한인자의발굴제 2 세부 : 암유전자및 IGF-1R 특이적암세포증식및사멸조절인자발굴및기전규명제 3 세부 : 암유전자특이적발현세포에서탐색된 DNA 손상반응저해제를검증하고기전연구 제1세부 1 Oncogeninc c-met을추가적으로발현하는형질전환된세포주들의확립 Ras 계열, EGFR 계열세포들을대상으로 c-met 암유전자를 lentiviral method로전입하고이를확인함. 2 mouse xenograft 를이용한 tumorigenecity 및 metastatic potential 검증 1. tumorigenecity 확인을위한 mouse xenograft. Ÿ Ras, EGFR 계열세포들을대상으로 nude mice에서 tumorigenecity 확인하였음. 2. metastatic potential 확인을위한 mouse xenograft. Ÿ Ras 계열세포들을대상으로한암전이능력확인실험은종료되었으며현재 EGFR 계열세포들의암전이능력확인실험이진행중임. 3 종양형성및암전이과정에서중요한역할을하는유전자들의기능연구각종양단계와세포단계에서분리된 RNA를대상으로 Affymatrix GeneChip Human Gene chip set 를이용하여 Gene array를시행하였음. 현보고서를작성하는기간에는아직결과를보지못하였지만구두발표시에는결과를정리하여발표할수있을것임. 제2세부 1 화합물스크리닝을통해도출된화합물의세포증식억제, 사멸유도기전분석및항암효과조사 2 IGF-1R 결합단백질 GIPC 의수용체조절에대한상세기전규명및항암효과조사 제 3 세부 1. 제 1 세부과제에서확립된암유전자특이적발현세포주를이용하여 DNA 손상반응비교 암유전자특이적발현세포주에각종항암제를처리하여 DNA 손상을기반으로한항암제에대한 감수성이증가하는것을확인.

9 암유전자특이적발현세포주에서항암제를처리하였을때손상된 DNA 복구가지연되고 cell cycle arrest 의결핍이관찰됨. 이러한 DNA 손상반응의저해는결국손상된 DNA 축적으로이어져세포 사멸증가의윈인이될것으로생각됨. 2. 선행연구결과로선택된 DNA 손상반응저해제 DDRI-18 과 DDRI-9 의작용기전과표적단백질을 조사함. 기존의항암제와병행처리시항암효과를증가시키는효과가있는 DDRI-18 은 DNA 손상후 repair 과정을억제한다는것을확인하였음. DNA 손상반응저해제 (DDRI-18) 는암유전자특이적발현세포주에서도세포사멸, 항암제에대한감 수성증가시키는것을확인. DNA 손상초기반응저해제인 DDRI-9 은 mitotic arrest 기능이있으며 taxol 과마찬가지로세포사 멸효과를관찰할수있었음. DNA 손상반응기전과 mitotic 기전을동시에저해할수있는표적단 백질을후보로연구를진행중임 /31 Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ 사람의정상세포를대상으로암유전자의기능을연구하는시스템을확입하였음. 이를이용한연구들이 활발하게진행되고있으므로향후많은연구결과들을도출할수있음 기존확립되어있는암세포가 p53 암유전자의정상, 돌연변이, 또는발현손실등의상태에따라 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식여부가변화될수있음을일부암세포에서확인하였음. 암세포증식에있 어서의일부암유전자와의연관성에대한이해를넓힘. 암세포에서발현이증가되는 IGF-1R 이 IGF-1 에의한세포증식에서 IGF-1R 의결합단백질 GIPC 의역할에 대한자료를얻음으로서효소기능억제이외의기전에의해 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식조절기전에 대한이해도움. 발암기전에서또는항암제에대한내성이생기는과정에서 IGF-1에의해유도되는유전자들이수행하는역할을조사함으로써보다효율적인 IGF-1R 항암제활용전략에도움이될것임. 암유전자특이적암세포주에증식저해를유도하는소분자들의구조분석을통해항암제개발에효과적인표적을발굴하고, 효과적인소분자구조정보를제공할수있음. 암유전자특이적발현세포에서항암제에대한감수성증가하는데이것이 DNA 복구의지연과 cell cycle arrest 에결핍때문이라는것을규명.

10

11

12 [ 제1세부과제 ] 암유전자에의한발암및전이기전을규명하고항암타겟으로유용한인자의발굴 [ 제2세부과제 ] 암유전자활성에따른암발달단계에서 IGF-1R 관련새로운항암표적분자의도출 [ 제3세부과제 ] DNA 손상반응기전탐색을통하여항암치료에효과적인항암제도출및제어기전연구 Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ

13

14 w w w w w

15

16 γ

17 γ [ 제 1 세부과제 ] [ 제2세부과제 ] The type III transforming growth factor-beta receptor negatively regulates nuclear factor kappa B signaling through its interaction with beta-arrestin2. GIPC mediates the generation of reactive oxygen species and the regulation of cancer

18 cell proliferation by insulin-like growth factor-1/igf-1r signaling. IGF-1 induces expression of zinc-finger protein 143 in colon cancer cells through phosphatidylinositide-3-kinase and reactive oxygen species. [ 제 3 세부과제 ] [ 제 2 세부과제 ] Insulin-like growth factor receptor induces cell proliferation in a p53-dependent manner in cancer cells A Study on the regulatory mechanism of IGF-1R in cell proliferation A Study on the regulatory mechanism of IGF-1R in cell proliferation The type III transforming growth factor-beta receptor negatively regulates nuclear factor kappa B signaling through its interaction with beta-arrestin2. The type III transforming growth factor-beta receptor negatively regulates nuclear factor kappa B signaling through its interaction with beta-arrestin2. Role of IGF-1/IGF-1R in the expression of zinc-finger protein 143 in colon cancer cells A study on the regulatory mechanism for zinc-finger protein 143 expression in colon cancer cells A regulatory mechanism of insulin-like growth factor-1 and its receptor, IGF-1R for cancer cell proliferation and survival

19 [ 제 3 세부과제 ] [ 제 2 세부과제 ] 발명특허 암세포에서의케라틴리모델링유도방법및이를 이용한항암제스크리닝방법 이창훈 / 김수열 / 오승현 / 유혜진 / 정경채 / 이병일 대한민국

20 [ 제 1 세부과제 ] [ 제 2 세부과제 ] 암유전자 활 성에따른암 발달단계에 1차서 IGF-1R 관년도 l 련새로운항 암표적분자 의도출 l 암유전자에의한 세포 변형시 IGF-1R 신호계활 성화여부고찰 암유전자발현및 활성화에따른암 발달에서 IGF-1R 신호전달경로조절 가능성 l 기존의확립된암세포내에서 l IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식이 p53 암 유전자의활성과상관성이있음이확인됨. Ras 암유전자의돌연변이를가지는세포 들에서 IGF-1R 의발현이증가됨이확인 됨. IGF-1R의결합단백질이지만아직그역 할이명확하지않은 GIPC 의유전자발현 억제시 IGF-1에의한암세포증식이감소 함을확인하였고, GIPC 과다발현유도시 세포내 IGF-1R 의발현이증가함으로확 인하여 IGF-1R 의발현양조절및세포증 식에 GIPC 가관련성이있음을확인하였 음. l 암세포내에서 l GIPC의항체를이용하여암세포내 GIPC

21 l 2차 l 년도 l 3차년도 GIPC 의 변형 (ubiquitination, sumolyation 등 ) 확 인및역할규명암유전자특이적암세포주 ( 세부1과제 ) 에서 IGF-1R의활성또는발현억제에따른발암기전가능성확인및기전연구 암세포주에서 IGF-1에의한세포증식조절분자발굴및확인 암세포주의암발 l 달과정에서 IGF-1R의조절에있어서 GIPC의역할규명연구 l 화합물 l 스크리닝을통해도출된화합물의세포증식억제, 사멸유도기전분석및항암효과조사 l l IGF-1R 결합단백질GIPC 의수용체조절에대한상세기전규명및항암효과조사 를침전시켜면역염색을통해 GIPC 변형 여부를확인하였으나확인에어려움이있 었음 l 암유전자특이적암세포주내 IGF-1/IGF-1R 관련단백질들의발현확인및상세연구를하기위한일부화합물 스크리닝을시작. 부분적달성완료 l microarray 분석에서발현차이를보이는유전자들의양상을 mrnalevel 에서분석, 일부는 protein level 분석완료및기전연구시작하였음달성완료 IGF-1 에의한세포증식에서 GIPC 가수용체활성에따른 ROS 의생성에관여하는것을확인하였고, 다양한암세포주에서확인하였음, 달성완료 암유전자과발현세포주에서 4000 여개 화합물스크리닝완료및 2, 3 차스크리 닝실시로최종 2 개화합물발굴완료. myc 과발현특이적증식저해현상확인 및세포사멸현상관찰하였음. 면역침전법을이용하여인산화된 IGF-1R 의결합단백질들을조사하였고, 일부단 백질들이실제세포내결합함을확인하였 으며암발달과정에서의특이적현상이 발견되어현재심도있는연구가진행중 임. [ 제 3 세부과제 ]

22 [ 제1세부과제 ] [ 제2세부과제 ] l 기존의확립된암세포 HCT116은 K-ras mutation을가지고있었고, l 기존 암세포네 p53 의발현은특이적으로유전자제거를통해이루어진것이라 IGF-1/IGF-1R에의한암세포증식과 p53발현간의연계성을찾기위 IGF-1/IGF-1R신호계와암유전자활성화연계성고찰여부 한적당한접근이었고, 기존의유전적배경은다르지만같은대장암세포들인 HT29, LoVo세포의경우에는 p53이돌연변이거나정상이이미확인된상태에서 HCT116에서의결과와유사한현상이확 인됨에따라더자세한실험을이루어져야하겠지만, 현재까지의미있는고찰이이루어졌다고보임. l IGF-1/IGF-1R 신호전 l IGF-1R의발현과 GIPC의발현이높은 MCF7세포에서 GIPC에의한 달경로조절가능성규명 IGF-1R의조절가능성을세포증식과 ERK/AKT등의신호전달계측면에서확인하였고, 세포내수용체와 GIPC간의단백질상호작용이

23 l GIPC 변형 (modification) 여부확 인 l IGF-1 에의존성을보임을확인하였으므로적절히연구가진행되었 다고생각됨. 단백질변형을직접적으로확인하기에앞서서면역침전을통해농 축한뒤에이들의변형여부를항체로확인하고자하였고, IGF-1 에 의한특이적변형이확인되지않음. 또한세포내많이발현되는단 백질이긴하지만보다정확한실험을위해과다발현을유도하여 수행하고자함. 이에좀더시간을두고진행하고자하므로 80% 정 도단계에도달했다고여겨짐. l 암유전자특이적암세 포주모델과확립된 암세포주간의 IGF-1 /IGF-1R 신호계비교여 부 l 암유전자세포주들을이용, IGF-1/IGF-1R 관련단백질들의발현양 l 암유전자특이적암세포주모델에서 IGF-1에 조사하였음. 기본적인증식주기에차이를보이나 IGF-1에의한증식은현재조사중임. 의한세포증식조사여 l 보다효율적인연구를위해암유전자특이적증식억제소분자스 부 크리닝을수행중. l 암유전자와 IGF-1R 수용체및관련유전 자발현변화조사여 부 l IGF-1에의한발현양 l microarray를통해 IGF-1에의해발현유도, 저해되는유전자군들의차이를보이는유의분류완료전자스크리닝여부 l 발굴된유전자들의발현차이를 RT-PCR, realtime-pcr 또는 l 발굴된유전자의발현 western blotting으로규명완료차이규명여부 l 일부유전자들의암세포사멸및항암제저항성관련성이보고되어 l 암유전자와의연관성자료확인및연구실에서연구진행중. 조사여부 l GIPC에의한 IGF-1R 안정성조사여부 l GIPC 발현억제된 stable세포주에서 IGF-1R발현양의차이없음을확 l IGF-1R변형과 GIPC의인하였고, 세포증식에미치는영향및그기전에활성산소의관련연계성조사여부성을조사및규명하였음. l IGF-1R 세포내도메인 l 결합단백질발굴을위해과발현세포주를이용한연구진행중을이용한결합단백 질조사여부 l 암유전자특이적세포 l 세차례에걸친스크리닝을통해 c-myc과발현세포주특이적증식주별증식저해화합물을발굴하였는가억제화합물을 2종도출하였음-완료. l 특정암유전자에대 l 세포증식억제현상을 검증하였고, 사멸기전을 분석하기 위해 해증식저해를유도 caspase3, caspase7 등의절단현상을확인하였음. 더자세한기전 하는분자들을이용을조사하기위해후속과제에서다양한연구를수행할계획임. 하여그사멸기전을 l EGFR, K-Ras, Bcl-XL 등다른암유전자과발현세포에서는이두조사하였는가 l 분자적특징을이용하여표적가능분자에 화합물이세포사멸을유도하지않을뿐아니라세포내 myc의상위신호계로알려진일부신호계가거의활성화되어있지않음을 대한자료를도출하확인하여보다깊이있는분석을위해후속과제에서 protein array 였는가를수행하려고계획중임. l 세포주내암유전자

24 특이적 IGF-1R 신호계활성여부와특정항암제반응성에대한조사를하였는가 l GIPC가 IGF-1 신호계 l 에미치는영향을다양한관점 ( 증식과생존, 사멸, 항암제저항성 ) 에서조사하였는가 l IGF-1R와 GIPC의상 l 호작용에연관된세포내단백질을조사하였는가 [ 제 3 세부과제 ] GIPC가암세포에서 IGF-1/IGF-1R 신호계를통해세포증식을유도하는과정에서활성산소의역할을명확하게규명하였음. 이것은수용체가활성화되는직후의현상으로서수용체의세포내유입등과의연관성을규명중에있으나세포에따라변이가보임을확인. GIPC과발현에의해 IGF-1R과의결합이유도되는단백질을찾기위해과발현시킨세포에서인산화된 IGF-1R에특이적으로결합하는단백질을면역침전법과 mass spectrum 분석을통해도출하였고, 일부단백질은세포내실제결합여부를확인하였음. 1 대한민국, 항암제용약학조성물특허출원

25

26

27 세부과제명 : 암발생및전이와화학적항암요법에대한암유전자특이적 역할규명에관한연구 세부과제책임자 ( 성명 / 소속 ) : 김석현 / 발암원연구과

28 사람의정상세포에암유전자의전입을통한암유전자특이암세포주들제조하고암발생및전이에있어서각암유전자의역할을확인하며새로운항암타겟으로유용한인자의발굴함. 암유전자에의한발암및전이기전을규명하고항암타겟으로유용한인자의발굴 [1 차년도 ] 1Lentivirus 를이용한유전자전입시스템의확립 새로우면서효과적인 lentiviral 유전자전입시스템을확립하여실험의편의성과유전자발현을효율적으 로증가시킴. 2 사람의정상세포배양과불멸화과정 (STLF 세포제조 ) 사람의정상 fibroblast 를배양하여 lentivirus 를이용 SV40LT 와 htert 를전입불멸화시킴. 3STLF 세포에암유전자의전입 본연구에서사용하고자하는암유전자들 (mutant Ras, EGFR, c-myc) 을전입하였음. [2 차년도 ] 1 Oncogeninc Ras, EGFR, Akt, b-catenin을근간으로하는형질전환된세포주들의확립 Ras 계열, EGFR 계열, Akt 계열, b-catenin 계열로발현하는암유전자들을정립하였으며이들의성상을 soft agar assay를이용한 anchorage independent growth 측정및 cell migration ability 측정으로확인하였음. 2 mouse xenograft 를이용한 tumorigenecity 및 metastatic potential 검증 1. tumorigenecity 확인을위한 mouse xenograft. Ÿ Ras 계열세포들의 tumorigenecity 확인하였으며현재 EGFR 계열세포의 tumorigenecity 확인진행중임 2. metastatic potential 확인을위한 mouse xenograft. Ÿ 4 mouse/group 으로 1.5 Million cells/200 ul of PBS의조건으로 Tail vein를통해정맥주사한후 1주간격으로 Xenogen IVIS system을이용하여종양의성장을추적중이며현재주입후약 6주경과한상태임. 3 종양형성및암전이과정에서중요한역할을하는유전자들의기능연구각종양단계와세포단계에서분리된 RNA를대상으로 Affymatrix GeneChip Human Gene 1.0 ST 를이용하여 Gene array를시행하였음.

29 [3 차년도 ] 1 Oncogeninc c-met을추가적으로발현하는형질전환된세포주들의확립 Ras 계열, EGFR 계열세포들을대상으로 c-met 암유전자를 lentiviral method로전입하고이를확인함. 2 mouse xenograft 를이용한 tumorigenecity 및 metastatic potential 검증 1. tumorigenecity 확인을위한 mouse xenograft. Ÿ Ras, EGFR 계열세포들을대상으로 nude mice에서 tumorigenecity 확인하였음. 2. metastatic potential 확인을위한 mouse xenograft. Ÿ Ras 계열세포들을대상으로한암전이능력확인실험은종료되었으며현재 EGFR 계열세포들의암전이능력확인실험이진행중임. 3 종양형성및암전이과정에서중요한역할을하는유전자들의기능연구각종양단계와세포단계에서분리된 RNA를대상으로 Affymatrix GeneChip Human Gene chip set 를이용하여 Gene array를시행하였음. 현보고서를작성하는기간에는아직결과를보지못하였지만구두발표시에는결과를정리하여발표할수있을것임.

30

31 암유전자에의한발암및전이기전을규명하고항암타겟으로유용한인자의발굴 1. Mouse Xenograft 및 metastasis 연구암유전자에의한발암및전이기전을규명하고항 2. RNA와 Protein expression analysis 암타겟으로유용한인자의발굴 3. 발굴된유전자의억제와과발현을통한기능연구

32 사람의정상섬유아세포 (fibroblast) 로부터특정암유전자에의한형질전환세포의제조. 사람의정상세포로부터암유전자특이발암모델의제조 이상과같은배경을가지고사람의정상섬유아세포로부터 lentiviral gene transfer 를통하여 다음과같은세포들을제조함.

33 Ras, EGFR 및 Met oncogene 에의한발암및전이모델제조. 1 Oncogeninc Ras, EGFR(L858R)000 에의해형질전환된세포주들의확립 1. Ras 계열및 EGFR 계열세포주의제조 : SV40 T antigen과 htert로 immortalized된세포에 oncogenic K-Ras 또는 mutant EGFR를전입하고여기에차례로 c-myc, BclXL을전입하였다. 2 mouse xenograft 를이용한 tumorigenecity 및 metastatic potential 검증 Ras 계열세포의 tumorigenecity 확인 EGFR 계열세포의 tumorigenecity 확인 Ÿ Ras 계열세포들과 EGFR 계열세포들의 tumorigenecity 차이를확인하였음.

34 Ÿ Ras-Myc (RM) 의경우약 3주후부터확인되는종양을확인하였으며모든세포주입부위에서종양을확인하였음. 매우빠르게자라며조직학적으로도부적절한혈관형성, 상당한정도의 central necrosis가발견되어매우 aggressive 한것으로나타났음. 세포주입후약 7주후부터 Ras-Myc-BclXL (RMB) 에서종양이관찰되었으며 10개의세포주입후 6군데에서종양이발생하였으나 Ras의경우는 1군데에서만종양이발생하였음. EGFR 계열에서는전반적으로 Ras 계열에서보다덜 aggressive하게종양이형성되었으며특징적으로 Ras 계열과는다르게 EGFR-Myc-B치Xl (EMB) 에서가장 tumorigenecity가높게나타났음. 본연구자의경험에의하면 mitochonrial apoptotic pathway를억제하지않은상태에서의 Myc 과발현은오히려종야의발생을억제하는형태로보여져야하는데 Ras 계열의경우는본연구자의추정과는다르게 Myc에의해 tumorigenecity가매우급격하게증가하였으나 EGFR 계열에서는 BclXL을과발현시킨경우에 Myc에의한 tumorigenecity가증가함을확인하였다. 이는 Ras oncogene에의한 Myc induced apoptosis inhibition 과정이존재함을나타내는것으로여겨짐. 2. metastatic potential 확인을위한 mouse xenograft. Ÿ Ÿ 4 mouse/group 으로 1.5 Million cells/200 ul of PBS의조건으로 Tail vein를통해정맥주사한후 1주간격으로 Xenogen IVIS system을이용하여종양의성장을추적한결과 RM cell 에서만단한마리에서종양형성을볼수있었음. 매우미약한결과이기는하나이는암유전자전입을통하여인공적으로제작한세포에서처음으로보고하는 metastasis 예이므로그의의는상당하다고할수있음. Ÿ 이를확인하기위하여동일한방법으로 15 마리의 nude mice 를대상으로실시하여 다음그림과같이총 4 마리에서 metastasis 를확인하였으며전이장소는주로 lung 과 bone 임을확인하였음.

35 3 c-met 암유전자의전입을통한 tumorigenecity 와 metastatic potential의증가. HGF receptor인 c-met 유전자의변이는광범위한암종에서발견되며암세포의전이와 EMT에밀접한연관이있는것으로알려져있으며현재 c-met pathway에작용하는암치료제들이많이개발되고있음. 위에서본 Ras, EGFR 계열세포들에 c-met 암유전자를추가하였을경우나타나는현상을확인한결과 Ras 세포의경우는 Met에의한 tumorigenecity 증가가전혀없었으나 EGFR의경우는 Met의발현이세포의 aggressiveness 증가에상당히영향을미치는것을알수있었음. 표에서보는바와같이 EGFR-Met cell 의경우거의모든 injection site 에서종양이발생하

36 여 EGFR alone인경우하나도종양이발생하지않았던경우에비교해서그 tumorigenecity 증가가매우높았다. 또한다음표와그림들에서보이는바와같이 Met의발현을추가하였을경우 RM cell의 metastatic potential이매우증가함을알수있었고 RMB cell에서도강력한 metastasis를발견할수있었다.

37 현재전혀전이능력을보이지않았던 EGFR 계열세포들을대상으로동일실험을진행중에 있으며이결과들을대상으로현재논문작성중에있음.

38

39

40

41

42 세부과제명 : IGF-1R 표적항암분자개발연구 세부과제책임자 ( 성명 / 소속 ) : 유혜진 / 발암원연구과

43 암유전자활성에따른암발달단계에서 IGF-1R 관련새로운항암표적분자의도출 암유전자및 IGF-1R 특이적암세포증식및사멸조절인자발굴및기전규명 [1 차년도 ] 1 기존에확립된암세포주의암유전자들의돌연변이에대한내용을조사하여 2008 년도 p53 과 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식간의연관성에대한연구를수행하였음. 2 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식이활발한암세포주에서 IGF-1R 결합단백질중하나인 GIPC 의 sirna 를 [2 차년도 ] 이용하여세포증식과이에중요한신호전달계에미치는 GIPC 의역할에대한연구를수행하였음. 1 암유전자특이적암세포주 ( 세부 1 과제 ) 에서 IGF-1R 의활성또는발현억제에따른발암기전가능성 확인및기전연구 - 제 1 세부과제수행으로확립된암유전자특이적암세포주 4 종 (STF-EGFR, STF-K-ras, STF-Bcl-XL, STF-cMyc) 과 immortalized parental STF 세포주를이용하여각암유전자들의특이적과발현을확인 - IGF-1R 의과발현은 EGFR- 특이적세포주에서확인되었으나다른암유전자특이적세포주에서는확 인되지않음. - 확보된 small molecule library 를이용하여암유전자특이적증식억제화합물탐색을시도하였음. EZ-cytox assay 를이용하여현재까지약 2000 여종의화합물의증식억제효과를확인. 2 암세포주에서 IGF-1 에의해유도되는분자발굴및확인 - 마크로젠사의 illumina array chip (24K) 를이용해 HCT116-p53(+/+) 세포와 HCT116-p53(-/-) 세포에 서 IGF-1 에의한발현양상분석 - 분류된약이십여종의유전자들의발현차이를 RT-PCR 및 real-time PCR 로결과를확인 - 현재유전자두가지 (GR2, Z143) 를집중적으로연구중임. 3 IGF-1R 결합단백질이암세포주의증식에미치는효과및그기전연구 - GIPC 에의한수용체조절기전을연구하기위해 lentivirus 를이용하여 stable GIPC knockdown 을유

44 도하여연구수행 - IGF-1/IGF-1R 신호계에서활성산소 (reactive oxygen species) 의생성에 GIPC 가관련됨을규명. - GIPC 에의한세포증식저해기전에서활성산소의역할을다른암세포주에서확인하였음. ==> 이연구를통해 IGF-1 insulin-receptor 와의상호작용의문제점이우려되는다른 IGF-1R 표적소분 자물질들의단점을보완할수있는항암제개발전략에대한이해를높일것으로여겨짐. [3 차년도 ] 1 화합물스크리닝을통해도출된화합물의세포증식억제, 사멸유도기전분석및항암효과조사 - 1, 2, 3 차스크리닝을통해 myc 특이적증식저해효과를보이는화합물 2 종도출 - 사멸기전분석을위해 caspase3 와 caspase7 조사 -myc 특이적세포사멸현상확인 2 IGF-1R 결합단백질 GIPC 의수용체조절에대한상세기전규명및항암효과조사 - IGF-1/IGF-1R 에의한활성산소의생성이암세포에서증식유도에중요함을검증 - IGF-1R/GIPC 에의한활성산소생성및 IGF-1 신호계조절에관여하는결합단백질발굴을위해면역 침전후침전된단백질의 mass spec 분석및확인실험수행 -정량적성과 구분 달성치 / 목표치 1) 달성도 (%) SCI 논문편수 3/4 75 IF 합 / 기타성과 1) 총연구기간내목표연구성과로기제출한값 - 정성적성과 - 기존확립되어있는암세포가 p53 암유전자의정상, 돌연변이, 또는발현손실등의상태에따라 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식여부가변화될수있음을일부암세포에서확인하였음. 암세포증식에있어 서의일부암유전자와의연관성에대한이해를넓힘. - 암세포에서발현이증가되는 IGF-1R 이 IGF-1 에의한세포증식에서 IGF-1R 의결합단백질 GIPC 의역할에 대한자료를얻음으로서효소기능억제이외의기전에의해 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식조절기전에대 한이해도움. - 발암기전에서또는항암제에대한내성이생기는과정에서 IGF-1 에의해유도되는유전자들이수행하는역할을조사함으로써보다효율적인 IGF-1R 항암제활용전략에도움이될것임. - 암유전자특이적암세포주에증식저해를유도하는소분자들의구조분석을통해항암제개발에효과적인표적을발굴하고, 효과적인소분자구조정보를제공할수있음.

45 Title of Project Key Words Project Leader idenfication and characterization of a regulating mechanism for IGF-1/IGF-1R signaling in cancer cells IGF-1, IGF-1R, binding protein, reactive oxygen species, oncogene Hye Jin You A Rome Paek, Ji Seung Choi, Chang Youp Ok, Seok Hyun Kim, Associated Company Sun Shin Kim, Chang Hun Lee In the past few years, the type I insulin-like growth factor receptor (IGF-1R) has been emerged as a new therapeutic target for cancer because of its increased expression in a wide range of tumors and its crucial role for the cell transformation. Binding IGF-1 to IGF-1R results in the activation of the canonical phosphatidyl inositol-3 kinase (PI3K)/Akt and MAPK/ERK pathways through insulin-like receptor substrate (IRS) and /or Adaptor proteins such as Grb2, Shc, CrkII, etc. Although the regulation of IGF-1R by tyrosine kinase inhibitors or antibodies masking its binding to its ligand has been studied extensively, there remains a lot of questions about the detail mechanism how IGF-1R regulates cell proliferation and cell survival via PI3-kinase/Akt and/or other signaling pathways. Our research goal is to identify new, potent therapeutic target for developing anticancer drug based on IGF-1 signaling. To do that, we have focused on the IGF-1R and its interacting proteins which can regulate cancer cell proliferation and apoptosis. As one of approaches, we are exploring the role of GIPC, a GAIP-interacting protein, C-terminus which has PDZ domain in the regulation of IGF-1/IGF-1R signaling leading to cell proliferation and apoptosis. We reported that sirna mediated silencing of GIPC expression decreased IGF-1-mediated cancer cell proliferation in breast cancer models as well as panreatic cancer cells by regulating reactive oxygen species (ROS) generation. In addion, we identified ZNF143 as a downstream gene which might be important for IGF-1 signaling in cancer cells and reported a way to induce ZNF143 in response IGF-1 in cancer cell. To understand more about IGF-1R signaling in terms of interacting GIPC, we have identified a few binding proteins for IGF-1R in the presence of GIPC in cancer cells. As another approach to identify a molecule to regulate cancer cell proliferation in oncogene-overexpressing manner.we have investigated the effect of about 4000 chemicals on oncogene-specific cell proliferation and survival by MTS assay and identified two chemicals to induce cell death in c-myc-overexpressing cell lines.

46 암유전자활성에따른암발달단계에서 IGF-1R 관련새로운항암표적분자의도출 [2008년도계획및결과 ] 2008년도연구목표 : 대장암등고형암세포주에서암유전자활성에따른암발달단계에서 IGF-1R 결합분자의암발달조절효과규명및암유전자특이적세포주모델구축 -암유전자에의한세포변형시 IGF-1R 신호계활성화여부고찰 -암유전자발현및활성화에따른암발달에서 IGF-1R 신호전달경로의역할규명 -암유전자특이적세포모델내암발달과정에서 GIPC의 ubiquitination, sumoylation 등 modification 의역할규명 1암유전자와 IGF-1R의신호계연관성연구 -췌장암(AsPC-1, Panc-1) 대장암 (HT29, LoVo), 간암세포 (HepG2, HepG3B), 유방암세포 (MCF7) 등기존암세포및조직에서 IGF-1R 및결합단백질 GIPC의발현양분석항암표적분자로서의 IGF-1R에대한연구를위해 IGF-1/IGF-1R에의한세포증식이이루어지는세포군을확보하고자하였음. 먼저다양한암세포에서 IGF-1R와 GIPC의발현양간의연관성을보기위해 RT-PCR과 Western blotting을수행하였으나다양한암세포세트에서특정한연관성을찾기가어려웠음 ( 그림1). 한 IGF-1에의한세포증식이예상보다적은세포에서관찰되었고, 그정도도두배를넘지않는경우가대부분이었기에, 여러암세포종류에서연관성을찾고자하는시도대신, 각암유전자별발현양및활성을비교할수있는세포들에서 IGF-1/IGF-1R에의한증식이유도되는세포로보다자세한신호체계를연구하고자하였음.

47 1996년 cell지에 Kinzler와 Vogelstein이발표한자료와다른논문들에의하면, 대장암발달에있어서Apc 와 K-ras는매우이른단계에이미대부분돌연변이가일어나기때문에대부분의대장암세포들도이미 K-ras 돌연변이를지니는경우가대부분임. 전이성을띠는말기암으로전환되기전 p53암억제유전자의기능이상실되는것이보고되어있음. 이에대부분의대장암세포는 K-ras 유전자를가지고있지만, p53 암유전자의돌연변이는세포마다다양하므로여기에서착안, IGF-1/IGF-1R의활성에의한암세포증식과 p53유전자와의연관성을규명하고자 Vogelstein이고안한방식으로 p53유전자가특이적으로상실된 (loss) HCT116-p53(-/-) 대장암세포와이에대조군인정상 p53유전자를발현하고있는 HCT116 대장암세포를이용하여 IGF-1에의한암세포증식을측정하였음. IGF-1은 HCT116-p53(+/+) 에서세포증식을약두배증가시켰지만, p53유전자가특이적으로상실된세포에서는증식이일어나지않았음. p53 상실에의해세포주기가느려지는세포들이존재하므로세포주기를 FACS를이용하여측정하였고, MTT assay에서와유사한결과를얻음 ( 자료공개안함 ). 이에두세포에있어서 IGF-1R의발현양과신호계차이를확인하고자시간별 (0, 5, 15, 30, 60분 ) 신호계물질들의활성을확인하였음 ( 자료공개안함 ). 각세포내 IGF-1R의발현양에차이가없음을확인하였으므로, p53 특이적하위분자조절에의한세포증식변형이예상됨. 이에 12시간별 IGF-1 에의한세포내증식관련단백질들의발현을확인하였고둘간의차이를확인하였음. 이현상이다른세포에서도보이는가를확인하기위해서 LoVo (p53- 정상 ) 세포와 HT-29 (p53 돌연변이 ) 세포에서 IGF-1 에의한세포증식을측정함 ( 그림 3).

48 보다직접적인실험적증거를도출하기위해 p53 정상유전자를 p53 이상실된세포내주 입하여그효과를확인하는실험과, 정상세포에 p53 유전자를상실시키는 shrna 를발현 시켜그효과를확인중에있음. 암발달정도에따른 IGF 신호계및결합분자발현및신호계활성비교분석 =>1 차결론도 출 => 아직결론을도출하기엔실험이더요구되는상황이지만, IGF-1/IGF-1R 에의한암세 포증식과 p53 이라는암유전자의기능에따른이해를넓힐수있는연구로기대됨. 2IGF-1R 조절효과분석 IGF-1R의발현이높은것으로보고된 MCF7 세포는, 현재대표적인성장인자수용체로서암조직에서과다발현과활성화가보고되어표적항암제까지개발되어있는 EGFR의발현이낮기때문에 EGFR과의상호작용에대한효과를무시하고 IGF-1R조절기전을연구할수있는세포임. 우선이세포에서 IGF-1에의한세포증식을측정, MTTassay 결과약 3배까지증가하는것을확인하였고, 항암제인 Doxorubicin 에대해저항성이생긴 MCF7-Dox 세포의경우에는이러한 IGF-1R의발현이낮아지면서 IGF-1에의한세포증식이감소하는것이확인되었음 ( 그림4). 이에 MCF7-Dox에서저항성과세포사멸관련연구 ( 자료공개안함 ) 와 MCF7에서 IGF-1R의조절기전에관한연구를수행함. IGF-1/IGF-1R에의한암세포의증식에서 insulin receptor와는결합하지않고 IGF-1R와특이적으로결합하는것이보고되었으나그자세한역할이보고되지않은 GIPC의역할이 IGF-1 신호계에서의미가있는지확인하기위해발현양을유전자특이적 sirna를이용하여줄인뒤 IGF-1에의한세포증식을측정하였음. GIPC의발현을감소시킨경우 IGF-1에의한유방암세포의증식이약 15%-20% 정도감소하였으며 GIPC의발현양도감소하였음 ( 그림5). 또한 IGF-1에의한활성화되는 ERK와 Akt의인산화도감소하는것이확인되었음. 실제 GIPC 에의한수용체조절기전을연구하기위해 IGF-1R 와 GIPC 로각각

49 immunoprecipitatioin 을수행하여단백질들간상호작용여부를확인하였고, 이에두단백질 의상호작용에 IGF-1 에의한활성이중요함을증명하였음 ( 자료공개안함 ). 현재 GIPC 유전자 를과다발현시켜수용체의활성화와, 안정성의변화를확인하고자하는연구를수행중임. ==> 이연구를통해 insulin-receptor 와의상호작용의문제점이우려되는다른 IGF-1R 표적소 분자물질들의단점을보완할수있는항암제개발전략에대한이해를높일것으로여겨짐. 3암유전자특이적세포모델에서 IGF-1R결합단백질의 ubiquitination, sumoylation 등의변형에의한암발달조절효과연구 GIPC의유전자도메인연구를통해 sumoylation이될가능성이있는부분을확인하였으나실제 GIPC를면역침전시켜 GIPC 항체로확인하였을때다른크기의단백질이관찰되지않아현재과다발현시켜다시한번시도중임. 또한 GIPC의중요성을확인하고자하는연구와더불어 IGF-1R와결합하는다른수용체결합단백질들을발굴하는것도보다다양한 IGF-1R 표적항암분자개발에필요하다고생각되어 beta-chain의 cytoplasmic domain을이용한결합단백질발굴연구를계획중에있음. [2009 년도계획및결과 ] 2009년도목표 : 암세포주에서암유전자특이적 IGF-1R 조절효과확인 -암유전자특이적암세포주 ( 세부1과제 ) 에서 IGF-1R의활성또는발현억제에따른발암기전가능성확인및기전연구 -암세포주에서 IGF-1에의해유도되는분자발굴및확인 -IGF-1R 결합단백질이암세포주의증식에미치는효과및그기전연구 1 암유전자특이적암세포주 ( 세부1과제 ) 에서 IGF-1R의활성또는발현억제에따른발암기전가능성확인및기전연구 - 제1세부과제수행으로확립된암유전자특이적암세포주 4종 (STF-EGFR, STF-K-ras, STF-Bcl-XL, STF-cMyc) 과 immortalized parental STF 세포주에서각암유전자들의특이적과발현을확인하였음 ( 그림1).

50 - IGF-1R 의과발현은 EGFR- 특이적세포주에서확인되 었으나다른암유전자특이적세포주에서는확인되 지않음 ( 그림 1). - 확보된 small molecule library를이용하여암유전자특이적증식억제화합물탐색을시도하였음. EZ-cytox assay를이용하여현재까지약 2000여종의화합물의증식억제효과를확인하였음 ( 그림2). - 화합물검색이마무리되면, 암유전자특이적활성을보이는일부화합물의기전연구를통해암유전자특이적증식조절기전을규명할것임. - 또한각암유전자특이적세포주와 IGF-1R 관련신호계간상호연계성을연구할것임. 암세포주에서 IGF-1에의해유도되는분자발굴및확인 - K-ras mutation을가진 HCT116 세포에서 IGF-1에의한세포증식이 p53 유전자발현에의해영향을받음을 2차년도에확인하였음. 이에 IGF-1에의한 PI3-kinase/Akt 신호계와 ERK/MAPK 신호계활성을단시간내 (~1시간) 확인하였으나큰차이가없었고, 세포주기조절단백질의발현에는차이가있었음 ( 자료공개안함 ). - 위의결과를토대로, IGF-1에의해발현차이를보이는유전자군을발굴하여, 이들이암세포증식및생존과정에서수행하는역할을연구하고, p53 유전자발현과의상관성을조사하기위해 HCT116-p53(+/+) 세포와 HCT116-p53(-/-) 세포에 IGF-1을 0, 12, 24시간동안처리하고, RNA를추출, 마크로젠사의 illumina chip array (24K) 를이용해발현양상을분석하였음 ( 그림3). IGF-1 처리로발현차이를보이는유전자는생물학적기능별, 분자기능별로구별되어그림3에서와같이도출되었음.

51 - 로그스케일로두배이상발현차이를보이는유전자들, 즉, 감소한 173 개의유전자와증가 한 61 개의유전자들을각각 p53 의존성을가지는것과, IGF-1 의존성을가지는것등으로 분류하였음. - 분류된유전자들약이십여종의유전자들의발현차이를 RT-PCR 및 real-time PCR 로결과를확인하였음 ( 그림4). - 현재유전자두가지 (GR2, Z143) 를집중적으로연구중임. - GR2 ( 그림5) 과 Z143 ( 그림6) 은모두그림에서와같이 cancer cell apoptosis 및항암제저항성과관련성이보고된유전자들로서 IGF-1에의한유도현상이여러암세포주에서 RT-PCR, real-time PCR, Western blotting 등으로 mrna 및 protein level에서확인되었음.

52 - 현재두유전자의증가메카니즘에대한연구를진행중에있고, 암조직내특이적발현여부를 확인하고자계획하고있음. 3 IGF-1R 결합단백질이암세포주의증식에미치는효과및그기전연구 - MCF7 세포주는 IGF-1에의한증식효과가크고, 특히 IGF-1R의발현이높고, EGFR의발현이낮기때문에 IGF-1과 IGF-1R 조절기전을연구하기에적합한세포임. 또한 IGF-1R에결합하는단백질로서세포증식에연관성이보고된 GIPC의발현이높아그기전연구에적합함. - 실제 GIPC에의한수용체조절기전을연구하기위해 lentivirus를이용하여 stable GIPC knockdown을유도하였음. 이 stable cell line ( 이하 MCF7-shGIPC) 는 control 에비해 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식이 sirna 에의한 transient knockdown 과유사한효과를보였음 ( 그림 7). - GIPC는 IGF-1/IGF-1R 에의한 PI3-kinase/Akt, ERK/MAPK 활성에영향을미치지만, 그정도는세포주에따라차이를보임. - GIPC에의한세포증식저해기전에서활성산소의역할을다른암세포주에서확인하기위해췌장암세포와편평상피세포암에서유래한암세포에서 GIPC의발현저하를유도하고그효과를확인하였음.

53 - GIPC가 IGF-1/ IGF-1R에의한활성산소 (reactive oxygen species) 생성에크게관여하는것을 MCF7-shGIPC 세포주에서의 IGF-1에의한활성산소의생성이감소와, NAC 등의저해제를사용한실험결과로확인하였음 ( 그림8). - 더자세한기전연구를위해 GIPC-overexpressing 세포주를이용, 제3 의결합단백질을유추하고자연구기획중에있음. ==> 이연구를통해 insulin-receptor와의상호작용의문제점이우려되는다른 IGF-1R표적소분자물질들의단점을보완할수있는항암제개발전략에대한이해를높일것으로여겨짐. [2010 년연구계획및결과 ] 2010 년도연구목표 : 암유전자및 IGF-1R 특이적암세포증식및사멸조절인자발굴및기전규명 - 화합물스크리닝을통해도출된화합물의세포증식억제, 사멸유도기전분석및항암효과조사 -IGF-1R 결합단백질 GIPC 의수용체조절에대한상세기전규명및항암효과조사 1 화합물스크리닝을통해도출된화합물의세포증식억제, 사멸유도기전분석및항암효과조사 -2 차년도하반기에시작된화합물스크리닝완료. - 총 4000 여종의화합물을일차적으로스크리닝완료하였고각암유전자특이적세포증식억 제효과를보이는화합물 30 여종을 2 차, 3 차스크리닝실시하여이중 2 종화합물을도 출하였음 ( 그림 1) 및 2777 번째화합물이최종적으로암유전자특이적세포주모델에서암유전자특이적세 포증식억제효과를가지는것으로확인되었음 ( 그림 2). - 스크리닝에사용되었던 k-ras, EGFR858R, Bcl-XL 등을과발현시키는암유전자특이적세포주 들과대조군세포주 (control STF cell), c-myc 과발현세포주에서다시한번검증하여 48h 에서의 c-myc 특이적증식억제효과확인 ( 그림 2).

54 c-myc 과발현세포특이적세포사멸현상을확인하기위해서 caspase-3 와 caspase-7 의절 단 (cleavage) 를 western blotting 을이용해조사하여 c-myc 과발현세포에서만이들사멸관 련단백질들이절단되는것을관찰하였음. 암세포에서의검증이필요함. 2IGF-1R 결합단백질 GIPC 의수용체조절에대한상세기전규명및항암효과조사 - IGF-1R와 GIPC의상호작용에연관된세포내단백질조사를위하여우선 GIPC와 IGF-1R 의상호작용을확인하였음 ( 그림 3 좌, 이미보고, cancer letters(2010), 294: ). IGF-1 처리에의해 IGF-1R의인산화가이루어지면 IGF-1R와 GIPC의상호작용이더욱강해짐을확인하였음 ( 그림 3 우 ). 면역침전법 (immunoprecipitation) 을이용하여인산화된 IGF-1R 와결합하는단백질들을분리하여 mass spectrum을분석하였고, 가능한결합후보분자들을약 20 여종발굴. 이중기존에결합단백질로보고된바있는 Clathrin heavy chain 1 단백질과, GIPC, myosin 6 등이확인됨으로서실험이제대로이루어졌음을확인. 발굴된단

55 백질항체들를이용하여침전시켜서로세포내에서결합하는지확인하는과정에있음. 약 15 종에이르는단백질들크기가너무크거나작은단백질들, 또는막단백질들을제외하고 현재 2 종에대한검증실험을수행하고있음 ( 결과는논문준비중이라미공개하겠음 ). - 2 차년도에 IGF-1 에의해유도되는유전자군을조사하여검증된유전자중 ZNF143 의유도기 전에대한자세한연구가이루어졌음 - IGF-1 에의해전사인자로알려진 ZNF143 가유도되면암세포내 Rad51 등 DNA 손상복구반응 에중요한단백질의발현을유도함을증명하고, ZNF143 이유도되는과정에활성산소의생 성이중요함을다시한번증명하여보고하였음 - 또한 ZNF143 의발현을억제하면 cisplatin 등의항암제에대한민감도가증가하여암세포의

56 생존이떨어짐을확인하여보고하였음 ( 그림 4-6, EMM (2010), 42: ). -제2세부과제는 2년 10개월간의연구기간동안 IGF-1R 표적항암분자개발연구라는주제로 IGF-1R 의결합단백질 GIPC가다양한암세포에서 IGF-1에의한세포활성화과정에활성산소의생성에기여함으로서암세포의증식및생존에중요한역할을수행함을발견, 이를보고하였음 -또한암세포에서 IGF-1/IGF-1R에의해유도되는유전자들을발현변이조사를통해도출하였고이들주 ZNF143의발현기전에역시활성산소가관여함을확인, 암세포내 IGF-1 신호계에활성산소생성의중요성을검증하였음. -GIPC가 IGF-1/IGF-1R 신호계에기여하는기전분석을위하여면역침전법을이용, 또다른결합단백

57 질을검색하였음. - IGF-1에의해발현이유도되는유전자군을조사하여 IGF-1/IGF-1R에의한신호계가암세포에미치는효과를매개할수기전에대한이해를높였음. 심도있는후속연구를통해본과제가지속적으로수행된다면 IGF-1/IGF-1R을비롯한진단마커로서사용가능한효용가치가높은유전자를발굴할수있을것으로여겨짐. The type III transforming growth factor-beta receptor negatively regulates nuclear factor kappa B signaling through its interaction with beta-arrestin2. GIPC mediates the generation of reactive oxygen species and the regulation of cancer cell proliferation by insulin-like growth factor-1/igf-1r signaling. IGF-1 induces expression of zinc-finger protein 143 in colon cancer cells through phosphatidylinositide-3-kinase and reactive oxygen species. Insulin-like growth factor receptor induces cell proliferation in a p53-dependent manner in cancer cells A Study on the regulatory mechanism of IGF-1R in cell proliferation A Study on the regulatory mechanism of IGF-1R in cell proliferation The type III transforming growth factor-beta receptor negatively regulates nuclear factor kappa B signaling through its interaction with beta-arrestin2. The type III transforming growth factor-beta receptor negatively regulates nuclear factor

58 kappa B signaling through its interaction with beta-arrestin2. Role of IGF-1/IGF-1R in the expression of zinc-finger protein 143 in colon cancer cells A study on the regulatory mechanism for zinc-finger protein 143 expression in colon cancer cells A regulatory mechanism of insulin-like growth factor-1 and its receptor, IGF-1R for cancer cell proliferation and survival 발명특허 암세포에서의케라틴리모델링유도방법및이를 이용한항암제스크리닝방법 이창훈 / 김수열 / 오승현 / 유혜진 / 정경채 / 이병일 대한민국 암유전자 활 성에따른암 발달단계에 1차서 IGF-1R 관년도련새로운항암표적분자 l 의도출 l 암유전자에의한 세포 변형시 IGF-1R 신호계활 성화여부고찰 암유전자발현및 l 활성화에따른암 발달에서 IGF-1R l 기존의확립된암세포내에서 IGF-1/IGF-1R 에의한세포증식이 p53 암 유전자의활성과상관성이있음이확인됨. Ras 암유전자의돌연변이를가지는세포 들에서 IGF-1R 의발현이증가됨이확인 됨. IGF-1R의결합단백질이지만아직그역 할이명확하지않은 GIPC 의유전자발현 억제시 IGF-1 에의한암세포증식이감소

59 l l 2차 l 년도 l 3차년도 신호전달경로조절 가능성 암세포내에서 l GIPC의변형 (ubiquitination, sumolyation 등 ) 확 인및역할규명암유전자특이적암세포주 ( 세부1과제 ) 에서 IGF-1R의활성또는발현억제에따른발암기전가능성확인및기전연구 암세포주에서 IGF-1에의한세포증식조절분자발굴및확인 암세포주의암발 l 달과정에서 IGF-1R의조절에있어서 GIPC의역할규명연구 l 화합물 l 스크리닝을통해도출된화합물의세포증식억제, 사멸유도기전분석및항암효과조사 l l IGF-1R 결합단백질GIPC 의수용체조절에대한상세기전규명및항암효과조사 함을확인하였고, GIPC 과다발현유도시세포내 IGF-1R의발현이증가함으로확 인하여 IGF-1R 의발현양조절및세포증 식에 GIPC 가관련성이있음을확인하였 음. GIPC 의항체를이용하여암세포내 GIPC 를침전시켜면역염색을통해 GIPC 변형 여부를확인하였으나확인에어려움이있 었음 l 암유전자특이적암세포주내 IGF-1/IGF-1R 관련단백질들의발현확인및상세연구를하기위한일부화합물 스크리닝을시작. 부분적달성완료 l microarray 분석에서발현차이를보이는유전자들의양상을 mrnalevel 에서분석, 일부는 protein level 분석완료및기전연구시작하였음달성완료 IGF-1 에의한세포증식에서 GIPC 가수용체활성에따른 ROS 의생성에관여하는것을확인하였고, 다양한암세포주에서확인하였음, 달성완료 암유전자과발현세포주에서 4000 여개 화합물스크리닝완료및 2, 3 차스크리 닝실시로최종 2 개화합물발굴완료. myc 과발현특이적증식저해현상확인 및세포사멸현상관찰하였음. 면역침전법을이용하여인산화된 IGF-1R 의결합단백질들을조사하였고, 일부단 백질들이실제세포내결합함을확인하였 으며암발달과정에서의특이적현상이 발견되어현재심도있는연구가진행중 임. l 기존암세포네 l 기존의확립된암세포 HCT116은 K-ras mutation을가지고있었고, IGF-1/IGF-1R신호계와 p53 의발현은특이적으로유전자제거를통해이루어진것이라

60 암유전자활성화연 계성고찰여부 l IGF-1/IGF-1R 신호전 달경로조절가능성 규명 l GIPC 변형 (modification) 여부확 인 l l l 암유전자특이적암세포주모델과확립된암세포주간의 IGF-1 /IGF-1R 신호계비교여부 l l 암유전자특이적암세포주모델에서 IGF-1에의한세포증식조사여 l 부 l 암유전자와 IGF-1R 수용체및관련유전자발현변화조사여부 l IGF-1에의한발현양 l 의차이를보이는유전자스크리닝여부 l 발굴된유전자의발현차이규명여부 l l 암유전자와의연관성조사여부 l GIPC에의한 IGF-1R 안정성조사여부 l l IGF-1R변형과 GIPC의연계성조사여부 l IGF-1R 세포내도메인 l 을이용한결합단백질조사여부 l 암유전자특이적세포 l 주별증식저해화합물을발굴하였는가 IGF-1/IGF-1R 에의한암세포증식과 p53 발현간의연계성을찾기위 한적당한접근이었고, 기존의유전적배경은다르지만같은대장 암세포들인 HT29, LoVo 세포의경우에는 p53 이돌연변이거나정상 이이미확인된상태에서 HCT116 에서의결과와유사한현상이확 인됨에따라더자세한실험을이루어져야하겠지만, 현재까지의 미있는고찰이이루어졌다고보임. IGF-1R의발현과 GIPC의발현이높은 MCF7세포에서 GIPC에의한 IGF-1R 의조절가능성을세포증식과 ERK/AKT 등의신호전달계측면 에서확인하였고, 세포내수용체와 GIPC 간의단백질상호작용이 IGF-1 에의존성을보임을확인하였으므로적절히연구가진행되었 다고생각됨. 단백질변형을직접적으로확인하기에앞서서면역침전을통해농 축한뒤에이들의변형여부를항체로확인하고자하였고, IGF-1 에 의한특이적변형이확인되지않음. 또한세포내많이발현되는단 백질이긴하지만보다정확한실험을위해과다발현을유도하여 수행하고자함. 이에좀더시간을두고진행하고자하므로 80% 정 도단계에도달했다고여겨짐. 암유전자세포주들을이용, IGF-1/IGF-1R 관련단백질들의발현양조사하였음. 기본적인증식주기에차이를보이나 IGF-1에의한증식은현재조사중임. 보다효율적인연구를위해암유전자특이적증식억제소분자스크리닝을수행중. microarray를통해 IGF-1에의해발현유도, 저해되는유전자군들의분류완료 l 발굴된유전자들의발현차이를 RT-PCR, realtime-pcr 또는 western blotting으로규명완료일부유전자들의암세포사멸및항암제저항성관련성이보고되어자료확인및연구실에서연구진행중. GIPC 발현억제된 stable세포주에서 IGF-1R발현양의차이없음을확인하였고, 세포증식에미치는영향및그기전에활성산소의관련성을조사및규명하였음. 결합단백질발굴을위해과발현세포주를이용한연구진행중 세차례에걸친스크리닝을통해 c-myc 과발현세포주특이적증식 억제화합물을 2 종도출하였음 - 완료.

61 l 특정암유전자에대 해증식저해를유도하는분자들을이용 l 세포증식억제현상을 검증하였고, 사멸기전을 분석하기 위해 하여그사멸기전을 caspase3, caspase7 등의절단현상을확인하였음. 더자세한기전조사하였는가 l 분자적특징을이용을조사하기위해후속과제에서다양한연구를수행할계획임. 하여표적가능분자에 l EGFR, K-Ras, Bcl-XL 등다른암유전자과발현세포에서는이두 대한자료를도출하 화합물이세포사멸을유도하지않을뿐아니라세포내 myc의상 l 였는가위신호계로알려진일부신호계가거의활성화되어있지않음을세포주내암유전자확인하여보다깊이있는분석을위해후속과제에서 protein array 특이적 IGF-1R 신호 계활성여부와특정 를수행하려고계획중임. 항암제반응성에대한조사를하였는가 l GIPC가 IGF-1 신호계 l GIPC가암세포에서 IGF-1/IGF-1R 신호계를통해세포증식을유도 에미치는영향을다양한관점 ( 증식과생 하는과정에서활성산소의역할을명확하게규명하였음. 이것은수용체가활성화되는직후의현상으로서수용체의세포내유입등과 존, 사멸, 항암제저항의연관성을규명중에있으나세포에따라변이가보임을확인. 성 ) 에서조사하였는가 l GIPC과발현에의해 IGF-1R과의결합이유도되는단백질을찾기위 l IGF-1R와 GIPC의상 호작용에연관된세포내단백질을조사하였는가 해과발현시킨세포에서인산화된 IGF-1R에특이적으로결합하는단백질을면역침전법과 mass spectrum 분석을통해도출하였고, 일부단백질은세포내실제결합여부를확인하였음. 학술지논문게재 2 cancer letters(3.704), JBiolChem(5.581) 산업재산권등록 1 대한민국, 항암제용약학조성물특허출원 기 타 - IGF-1에의해유도되는세포증식유도신호기전에서변화를보이는유전자군을탐색, 발굴된유전자의암세포특이적발현조절가능성규명하였음. - 다양한암유전자와 IGF-1/IGF-1R 신호계의관련성을연구함으로서 IGF-1R 표적항암제의치료가능질환에대한이해를높임 - IGF-1/IGF-1R 표적항암제가임상시험중에원인불명의부작용으로중단되는사례가많으나그기전은아직명확하게알려진바가없음. 이에보다근본적인 IGF-1/IGF-1R 결합유전자발굴및

62 유도되는유전자에대한후속연구는보다깊이있는 IGF-1R 저해기전에대한정보를제공할것임. - 암유전자특이적세포주의증식저해분자를찾기위한화합물스크리닝을통해특정유전자에반응하는분자를발굴하고, 그사멸유도경로를규명하고, 다른암유전자들과의상관성을조사함으로써기존표적항암후보물질들의효과를뛰어넘는후보분자의도출을가능하리라여겨짐. Baserga R et al. (2003) the IGF-1 receptor in cancer biology. Int. J. Cancer 107, Bos JL (1989) ras Oncogenes in Human Cancer: A Review. Cancer Res. 49, Breuhahn et al. (2006) Dysregulation of growth factor signaling in human hepatocellular carcinoma. Oncogene 25, Floyd et al. (2007) The insulin-like growth factor-1-mtor signaling pathway induces the mitochondrial Pyrimidine nucleotide carrier to promote cell growth. Mol. Biol. Cell 18, Grimberg A and Cohen P. (2000) Role of Insulin-like growth factors and their binding proteins in growth control and carcinogenesis. J. Cell. Physiol. 183, 1-9. Jonkers J and Berns A (2007) Oncogene AddictionLsometimes a temporary slavery. Cancer Cell 6, Kelloff GJ and Sigman CC. (2007) Assessing intraepithelial neoplasia and drug safety in cancer-preventive drug development. Nature Rev. Cancer, 7, Kim et al. (2006) Tumorigenic conversion of primary human esophageal epithelial cells using oncogene combinations in the absence of exogenous ras. Cancer Res. 66, Miller BS and Yee D. (2005) Type I insulin-like growth factor receptor as a therapeutic target in cancer. Cancer Res. 65, Muders et al. (2006) Expression and regulatory role of GAIP-interacting protein GIPC in pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res. 66, Ouban et al (2003) Expression and distribution of Insulin-like growth factor-1 receptor in human carcinomas. Human Pathol. 23, Ross et al. (2001) Inhibitioini of Kirsten-ras expression in human colorectal cancer using

63 rationally selected Kirsten-ras antisense oligonucleotides. Mol. Cancer Ther. 1, Rustgi AK. (2007) The genetics of hereditary colon cancer. Genes & Dev. 21, Tao et al (2007) Mechanism of Disease:Signaling of the insulin-like growth factor 1 receptor pathway-therapeutic perspectives in cancer. Nature Clin. Prac. Oncol. 4, Wood et al. (2007) The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science 318,

64

65

66

67 세부과제명 : 암유전자특이적발현세포에서항암제의감수성을증가시키 는 DNA 손상반응저해제의기전연구 세부과제책임자 ( 성명 / 소속 ) : 김선신 / 발암원연구과

68 w w

69 w w w

70

71

72

73 γ γ

74 γ

75

76 γ γ γ

77

78

79 γ

80 γ

81

82

83

84

85

86