Dermatophagoides Pteronyssinus 종 집먼지진드기추출물을사용한 알레르기결막염동물모델의확립 연세대학교대학원 의학과 이영지
Dermatophagoides Pteronyssinus 종 집먼지진드기추출물을사용한 알레르기결막염동물모델의확립 지도교수서경률 이논문을석사학위논문으로제출함 2014 년 6 월 연세대학교대학원 의학과 이영지
감사의글 연세대학교의과대학을거쳐세브란스병원에서인턴, 레지던트, 펠로우까지수년의과정을거쳐안과전문의가되기까지지금껏많은가르침을주셨던모든스승님들과자식만의행복을바라고항상응원해주신부모님께진심으로감사드립니다. 특히이번동물실험을진행하며많은시행착오가있었는데, 그과정에서의오류를찾고수정할수있도록많은조언을주시고실험에대한기본개념을잡아갈수있도록아낌없는도움을주신안과실험실한수정선생님, 김은도선생님께도진심으로감사드립니다. 그리고이실험을계획하고진행하는데있어가장많은도움을주신서경률교수님께감사드리며, 연구계획서발표때, 경험담을비롯, 도움을주신박중원, 김태임교수님께도감사드리고싶습니다. 저를항상옆에서격려해준대학동기친구인임지혜, 김세경에게감사를전하고싶고, 자기계발서등을통해아낌없는조언을주시던김재근선생님께도감사드립니다. 저자이영지씀
< 차례 > 국문요약 1 Ⅰ. 서론 2 II. 재료및방법 4 1. 4 2. 4 3. 5 4. 6 5. 7 6. 8 7. 9 8. 9 9. 10 III. 결과 10 1. 11 2. 12 3. 13 4. 16 5. 16 IV. 고찰 17 V. 결론 20 참고문헌 21 ABSTRACT 24
그림차례 그림 1. 알레르기결막염실험프로토콜 6 그림 2. 심한안구염증발생시눈찡그리는모습 7 그림 3. 점안시행 20 분후쥐의임상증상 11 그림 4. 혈액내 total Ig E 및 HDM-specific IgE 수치 12 그림 5. 목림프절 lymphocyte 배양시항원첨가유무에따른상층액내사이토카인측정. 14 그림 6. 목림프절 lymphocyte 배양시항원유무에따른각군의항원특이 lymphocyte 증식분석 (BrdU assay) 15 그림 7. 목림프절 lymphocyte 배양시항원유무에따른각군의항원특이 CD4+ lymphocyte 증식분석 (BrdU assay) 15 그림 8. 결막의조직병리학적검사. 16 그림 9. 결막내 CD4+ 림프구의 ST2 발현의증가및 IL-5 분비의증가. 17
표차례 표 1. 알레르기결막염의임상점수기준 6 표 2. 알레르기결막염에임상양상점수 12
국문요약 Dermatophagoides Pteronyssinus 종의집먼지진드기추출물을사용한알레르기결막염동물모델의확립 목적 : 인간질환과치료적방법의효용성을탐구하기위해질환동물모델이필수적으로중요하다. 본연구는사람의주요알레르기항원인자인집먼지진드기추출물을사용하여알레르기결막염을일으키는동물모델을만들고자한다. 방법 : 40 마리의 BALB/c 품종의암컷쥐를 5군으로나누어위약과항원 Ovalbumin 10ug, Dermatophagoides pteronyssinus로부터얻은항원 10ug, 100ug, 500ug 으로 1주간격으로 2차례전신면역감작을시키고, 2주째이틀간격으로연속 3차례항원의안구점안후, 쥐에서알레르기반응이일어나는지임상적으로관찰하고, 실험시작 19일째쥐안락사를통해얻은검체로전체 Ig E 및항원특이 IgE 검사를하고, 항원특이림프구증식및상층액사이토카인양검사를진행하고, 안구조직병리검사를시행하였다. 결과 : 집먼지진드기로유도된쥐의알레르기결막염은기존 Ovalbumin 알레르기결막염모델및인간질환과임상및검사결과상비슷한양상을보였다. 목림프절내항원특이 lymphocyte 및항원에대한 IL-4와 IL-5 수치, 혈액내 Ig E 수치또한대조군에비해유의하게높았고, 결막내 mast cell 및 eosinophil 침윤증가및 CD4 cell의 STll 발현이증가되어있었고, IL-5 분비증가와관련이있었다. Conclusions : 이번쥐모델은미래치료적기반을위한면역병리학적연구에적합한것으로보이며, D.pteronyssinus 결막염모델유도시 10ug 항원을면역감작시사용하는것이가장좋은면역반응을유도하는것으로생각된다. ---------------------------------------------- 핵심되는말 : Dermatophagoides Pteronyssinus, 집먼지진드기, 알레르기결막염 1
Dermatophagoides Pteronyssinus 종 집먼지진드기추출물을사용한 알레르기결막염동물모델의확립 < 지도교수서경률 > 연세대학교대학원의학과 이영지 Ⅰ. 서론 알레르기안구질환은가장흔한안구면역질환으로현재그유병률과발병률은전세계적으로선진국에서점차증가추세중이다. 1,2 이질환은종종알레르기비염, 아토피피부염, 알레르기천식같은다른알레르기질환과병합되기도한다. 3 이러한알레르기반응은 Immunoglobulin E (Ig E) 가관여하거나 T cell 관여한반응의혼합으로발생한다. 3,4 항원과 dentritic cell(dc, MHCⅡ) 의만남으로 Th2 cell이활성화되어 IL-4를분비하게되면항원특이 Th2 cell이증식하면서 IL-4,5,9,13 등의분비가일어나 mast cell 활성화및 eosinophil의조직침윤을증가시키고, B-cell에서 IL-E의 class switching이증가하게만든다. 4 알레르기결막염에서도항원의결막자극시, mature DC가 lymph node로옮겨가 B cell 및 Th2 반응을활성화시켜결막내에 mast cell 및 eosinophil 침착을증가시킨다. 5,6 알레르기알레르기결막염은임상적으로 7가지정도로분류되는데, 그중 type 1 과민반응이주로관계하는계절성알레르기결막염 2
및통년성알레르기결막염이가장흔하다. 1 이중통년성알레르기결막염은인구의 0.03% 정도의유병율이라고알려져있으나, 주로집먼지진드기나곰팡이항원에대한노출이원인으로알려져있으며, 계절성에비해증상은다소덜하나지속적이며, eosinophil 결막내침윤이많다고보고된바있다. 7 집먼지진드기 (house dust mite, HDM)) 는 1968년부터흡입성또는접촉성항원으로알레르기질환의주요인자로알려졌으며, 한국도산업화와서구화와함께집먼지진드기에대한감작율이증가해왔다. 8 한국에서는 Dermatophagoides farinae와 D. pteronyssinus 종이가장흔한것으로보고되었다. 8,9 D. pteronyssinus 종의 10가지이상의항원중 Der p1 및 p2가전체면역성의 40-60% 관련성이있다고알려져있다. 10 알레르기결막염의병리기전및면역학적기전을밝히고, 새로운치료접근법개발을위해여러가지항원을이용하여인간과좀더유사한알레르기결막염동물모델을개발하는것이필요하다. 현재까지알레르기결막염은주로 guinea pig나 rat, mice 종의동물에서 ovalbumin, ragweed pollen 및 cat allergen 등의항원에국한되어동물모델들이개발되어왔다. 이에반해통년성알레르기결막염의원인인집먼지진드기를이용한알레르기결막염재현동물모델은문헌상드물다. 11,12 본연구자는애초에통년성알레르기결막염에서의약물의치료적효과를검증하기위해위연구에서소개된과정에따라알레르기결막염동물모델을재현하려수차례시도하였으나위방법대로동물모델이재현실패를거듭했다. 임상적으로믿을만한알레르기결막염의쥐모델을개발한다는것은연구자에게안구알레르기연구를하는데중요하다. 따라서, 임상적, 세포학적, 체액적측정인자들을활용, 한국에서집먼지진드기중주요알레르기항원종인 D. pteronyssinus 추출물을이용한알레르기결막염동물모델을재확립하고자이번실험을진행하였다. 알레르기는항원의양이과도한경우에는 Th2의활성화뿐만아니라 T 억제림프구의활성화나 Th1 림프구와의상호작용으로인해면역반응의억제가발생할수있기 3
때문에감작하는항원의농도와투여횟수를달리하여실험을진행하였다. 13-15 현재모델은인간질환과양상이비슷하고안구알레르기병리기전을밝히고치료적수단을시험하는데정확성있는방법이될거라생각한다. Ⅱ. 재료및방법 1. 동물 BALB/c 품종 40마리의암컷쥐들 (6-8 주연령 ) 을 Charles River 연구실 ( 오리엔트회사, 성남, 한국 ) 로부터구입하여, 서울연세대학교의과대학내 specific pathogen-free 환경에서사육되었다. 모든동물실험은연세대학교동물윤리연구회의승인을받아진행되었다. 2. Ovalbumin(OVA) 과집먼지진드기추출물을사용한전신면역감작주입물준비면역감작하기 30분전 Ovalbumin(Grade V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 10 µg를 2mg의 aluminium hydroxide (ALUM; Imject Alum, Thermo scientific Inc., Rockford, IL, USA) 이들어있는 PBS 200 µl에녹여준비한다. 그리고쥐안구점안시 5µl 내 250µg의 OVA이함유되도록 OVA를 PBS에녹여 5% 의 OVA 안구점안액으로사용하도록한다. 16 D. pteronyssinus종의 HDM 추출물동결건조가루를서울연세대학교알레르기내과에서구매하여사용하였다. D. pteronyssinus 추출물동결건조가루를 1mg/ml의농도로현탁하여 2-site ELISA 방식으로단백질항원농도를쟀을때, 주요단백질항원농도는 24.0 µg/mg (Der p 1, 11.6 µg/mg 및 Der p 2 12.4 µg/mg) 이었다. 17 Chloramphenicol (CAP) 억제검사에서 D. pteronyssinus 추출물 AU 4
는 12.8 AU/µg 로측정되었다. 17 면역감작하기 30 분전 HDM 동결 건조가루를각 10 µg, 100 µg, 500 µg씩 2mg의 ALUM이들어있는 PBS 200µl 용액에녹여준비한다. 그리고 HDM 동결건조가루를 PBS에녹여 5 µl 안구점안시 500 µg HDM이공급될수있도록 10% 의 HDM 안구점안액을준비한다. 항원비투여군의경우엔 2mg의 ALUM이포함된 PBS 200 µl 용액을전신감작시사용하고, PBS를안구점안시위약으로사용하였다. 3. OVA과 HDM 을이용한감작및안구점안으로인한알레르기결막염의유도실험은총두번에걸쳐진행되었고, 20마리의쥐들은총 5그룹으로나누어각그룹당 4마리씩분리되어실험이진행되었다. 쥐들은다음과같은다섯그룹으로나뉘었다 ; 대조군은항원비투여군, OVA 로유도된기존의알레르기결막염실험군, HDM 항원을서로다른세가지농도로감작된세개의실험군. 면역감작을위해대조군은 2mg의 ALUM을, OVA군은 10 µg OVA과 2mg ALUM을, 나머지세 HDM군은각각다른농도 10 µg, 100 µg, 500 µg의 HDM 항원과 2mg ALUM을복강내주사시행받았다. 7일후, 똑같은농도로전신감작을시행하였고, 실험시작 14, 16, 18일째, 호흡마취를시행한후각군별로앞에서준비된안구점안액을양안에각 5µl씩점안하고 20분뒤임상증상을관찰하였다. 19일째쥐를안락사시켜혈액, 목림프절, 눈꺼풀을포함한안구적출등실험에필요한검체를얻었다. ( 그림 1.) 5
그림 1. 알레르기결막염실험프로토콜. 실험시작당일, 7일째준비된감작용액으로복강내주사시행하고, 14, 16, 18일이틀간격으로쥐양안에항원점안을시행하고, 20분뒤임상증상을관찰하였다. 19일째, 쥐안락사를시행하여검사진행을위한검체를채취하였다. 4. 임상증상평가 호흡마취하에양안안구점안시행하고 20 분후, 알레르기반응 이얼마나일어나는지쥐들을주의깊게관찰하였다. 급성알레르기 반응으로눈물및눈꼽, 결막부종, 결막충혈, 눈꺼풀부종, 눈찡그 림및몸웅크림등의증상이일어나는지를 6 가지항목에대해평가 하고, 이중눈찡그림및몸웅크림은심한안구불편감및자극감 을반영하는것으로간주된다. 18 ( 그림 2.) 임상점수는각항목당 0 점 부터 2 점까지로등급화하여채점하였으며, 사진을찍었다. 총점수는 6 개항목의각점수의합으로도출, 0 점부터최대 12 점사이이다. 표 1. 알레르기결막염의임상점수기준 등급 ( 점수 ) 정상 (0) 경도 (1) 심함 (2) 행동 정상 불안정하고격앙됨 털세우고몸웅크림 눈뜨기 정상 가늘게뜸 눈찡그림 눈물 / 눈꼽 정상 눈표면에약간맺힘 두드러짐 결막부종 없음 경도 심함 결막충혈 없음 경도 심함 눈꺼풀부종 없음. 경도 심함 6
그림 2. 심한안구염증발생시눈찡그리는모습. 쥐가눈을심하게찡그리고털을세우고몸웅크리는모습으로심한안구염증및통증이발생함을알수가있다. 5. 혈액내전체및 HDM 특이 Ig E 의측정 안락사한동물로부터혈액을수집하여 total Ig E 및 HDM-specific Ig E 항체수치를 ELISA 방법을통해측정했다. 19 간단히말해 total Ig E 를측정하기위해서는 2 µg/ml 농도의 purified rat anti-mouse IgE Ab (R35-72; BD Biosciences Pharmigen, San Diego, CA, USA) 100 µl 를, Antigen specific Ig E 를측정하기위해서는 PBS 를이용하여 50 µg /ml 농도로희석한항원 HDM 추출물 100 µl 을 96 well maxisorp immunoplate (Nunc, VWR Canlab, Mississauga, Canada) 에 coating 하기위해 4 에서밤새보관하였다. 이 immunoplate 를 1% bovine serum albumin (BSA) 을포함한 PBS 용액으로 37 에서 1 시간보관한후 plate wash 한후 1% BSA 를포함한 PBS 로 1:10 으로희석했던혈액샘플들과 standard mouse Ig E Ab (27-74;BD Pharmigen) 을 well 에넣어 4 에서밤새보관하였다. Plate 를 0.05% Tween 이첨가된 PBS (PBS-T) 로씻혀내고 PBS-T 용액에 2 µg /ml 의 horseradish peroxidase(hrp)-conjugated rat anti-mouse Ig E antibody (Southern biotech, Birmingham, AL) 을한 well 당 100 µl 씩첨가하고 37 에 2 시간보관한다. PBS-T 씻어낸후, tetramethyl-benzidine (TMB, Moss Inc., Psadena, CA) 을더해실온에 15 분있은후, 0.5N HCI 로반응을멈춘다. Plate 는 450nm 파장의판독기에서결과를읽는다. 혈액샘플내의전체 Ig E 농도는 7
희석된 purified mouse IgE Ab 로생성된표준선형곡선을사용하여 계산되었다. 6. 목림프절의 lymphocyte 세포배양 수집했던목림프절을 10% fetal calf serum, penicillin (50 units/ml), streptomycin (50 µg/ml) 과 L-gluamine (2 mm) 이포함된 RPMI 1640 media(gibco, Carlsbad, CA, USA) 내에서터트린후, 100 µm strainer 를통과시켜단일세포현탁액을얻는다. 4 10 6 cells/ml 농도의배양액을 100 μl 씩 U 바닥모양의 96-well immunoplate (Nunc, Rochester, NY, USA) 에담아 37 및 5% CO2 환경에서배양한다. 이때, 각군을둘로나눠항원첨가없이배양액만, 혹은배양액에 OVA (1mg/ml) 이나 HDM(100 µg/ml) 을첨가한경우로배양한다. 72시간배양후, 각군의세포들을분리하여 BrdU ELISA kit(bd Biosciences, San Jose, California, USA) 를사용하여측정한다. 그리고이때상층액은 multiplex immunobead assay (BD Cytometric Bead Array(CBA) Mouse Th1/Th2 cytokine kit; BD Biosciences, San Jose, California, USA) 와 flow cytometry (BDTM FACS LSR II; BD Biosciences) 를이용하여림프절배양상층액내 TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4 및 IL-5의농도를측정하였다. 7. 조직병리학적연구첫번째실험시, 20마리의각군에속하는쥐들의눈꺼풀을포함한좌측안구를적출하여 4 % buffered formalin 에고정시키고 8
안구중심부를연속으로수직절개한 4 μm 두께의파라핀절편들을제작하여전체적인모양을보기위한 Hematoxylin-Eosin (HE) 과 mast cell을보기위해 Toluidine blue (TB) 염색을시행하였다. HE와 TB으로염색된샘플들을모두광학현미경 (Olympus, Olympus Optical co. Ltd., Tokyo, Japan) 으로 400배확대하에검사하였고, Eosinophil은 HE에서 eosin으로염색되는세포내과립을지닌세포로수를세었다. 세포침착이항상전절편에균일하지않기때문에결막하조직, 결막의원개부및안검결막두부위, 총네곳의 mast cell과 eosinophil 수를세어평균내었다. 각그룹의총 8개절편에서얻은전체세포수를평균치로계산하였다. 8. 결막내 CD 4+ T lymphocyte 분석 두번째실험시진행했던추가실험으로항원비투여군, OVA 군, HDM 10μg 군쥐들의우측안구중위아래결막의원개부를포함한안구결막및눈꺼풀결막을조심스럽게채취하여잘게자른다. 조직으로부터세포를분리해내기위해 5mg/ml collagenase (type D, Roche Diagnostics, Burgess Hill, UK) 와 100 μg/ml DNase(type 1, Roche Diagnostics) 이함유된 complete media 에넣은뒤 37 C 에서 1 시간동안분해시킨다. 그뒤 100 μm cell strainer 에걸러낸뒤 complete media 에재현탁하고원심분리시킨다. 여기서얻은세포를다시 1% BSA 가포함된 PBS 로씻어준뒤 PMA(50ng/ml), Ionomycin(750ng/ml), Golgi-plug(1ug/ml) 가함유된세포배양액에넣고 37 C 에서 4 시간동안자극을한다. 비특이적 binding 을막기위해 purified anti-mouse CD16/32 (E-bioscience, San Diego, CA, USA) 로 15 분간염색을한후, PBS(1% BSA) 로씻어준뒤 anti- 9
mouse CD4-efluor 605NC (E-bioscience), anti-mouse CD3-FITC(E-bioscience), anti-mouse ST2-percp-efluor 710 (E-bioscience) 를넣어주고 4 C 에서 30 분정도표면염색을시행한다. 이후에 BD cytofix/cytoperm 을사용하여세포에구멍을낸뒤 anti-mouse IL-5-PE (E-bioscience) 로 4 C 에서 30 분정도염색을시행한다. Flow cytometry (BDTM FACS LSR II; BD Biosciences) 를이용하여데이터를수집한다. 9. Statistical Analysis 통계학적분석은 SPSS Windows version 20.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA) 를사용하여시행하였다. 각실험군간의통계학적차이는 paired student t-test 방법으로검증하였다. P<0.05 의경우통계적으로유의한것으로, P<0.01 은아주유의하게, P<0.001 은굉장히신뢰성이높게유의한것으로간주하였다. Ⅲ. 결과 OVA이나 HDM을항원으로사용한모든실험군에서임상증상, total Ig E 및항원특이 Ig E의증가, 결막내 mast cell 혹은 eosinophil 침윤, 항원자극시목림프절의항원특이림프구증식증가및 Th2 타입사이토카인분비증가등으로알레르기결막염이발생했음을확인할수있었고, D. pteronyssinus 종의집먼지진드기추출물로 BALB/c mouse에서알레르기결막염을유도할때, 가장최적의감작농도는 group 3에서의 HDM 추출물 10μg을사용하였을 10
때였다. 이외에결막내 CD4+ T lymphocyte 의 ST2 발현증가및 ST2 발현한 CD4+ T lymphocyte 의 IL-5 의분비증가와의관련성을 엿볼수있었다. 1. 임상증상그림 3. 은알레르기급성반응시사진모음이다. 모든실험군에서항원점안시모두눈꼽이나눈물등의분비물이현저히증가하였고눈을가늘게뜨고찡그리는표정및털을세우고몸을웅크리는등안구의심한염증및통증을대변하는임상증상을보였다. 간헐적인결막충혈을보였으나, 결막부종이나눈꺼풀부종은뚜렷하지않았다. ( 표 2.) group 1, 2, 3, 4, 5의평균임상점수는각 0, 7, 7, 6, 6점이었으며, 어떤쥐도 12점인쥐는없었으며, 가장높은점수인 8 점이 group 2에서 3마리였다. 실험군간의유의한임상점수차이는없었다. 그림 3. 점안시행 20분후쥐의임상증상. A. 대조군에 PBS를점안한경우 B. OVA군에 5% OVA 점안한경우눈꼽이끼고충혈되는양상을관찰할수있다. C. 10% HDM 점안시 HDM 10μg 군에서의반응. D. HDM 100μg. E. HDM 500μg. 11
표 2. 알레르기결막염에임상양상점수 대조군 OVA HDM10μg HDM100μg HDM500μg 행동 0 2 2 2 2 눈뜨기 0 2 2 2 2 눈물 / 눈꼽 0 2 2 2 1 결막부종 0 0 0 0 0 결막충혈 0 1 1 0 1 눈꺼풀부종 0 0 0 0 0 2. 혈액내 total Ig E 및 HDM-specific Ig E 혈액내 total Ig E 수치는대조군과비교하였을때 OVA군이나 HDM 실험군모두유의하게증가하고 HDM-specific Ig E가존재함으로써 HDM으로인해알레르기결막염이생겼음을확인시켜주었고 HDM 감작시사용한항원양이많을수록혈액내 total Ig E의수치는낮았다. ( 그림 2A). 그림 4. 혈액내 total Ig E 및 HDM-specific IgE 수치. 모든샘플은 1:10 으로희석되었고, 모든값은 450nm 파장의 optical density(od) 값으로표기되었다. A. 혈액내 total Ig E 비교. B. ALUM 이 Ig E 12
production 을증가시키는역할을하므로아무런처치도하지않은 naïve mouse 의혈액을추가로이용하여 HDM-specific Ig E 측정비교에이용하였는데, HDM-specific Ig E 의경우에는군간의유의한차이는없었다. 대조군과비교하였을때, *p <0.05, **p <0.01, *** p <0.001 3. OVA이나 HDM 등의항원존재시면역감작된동물의 lymphocyte의증식및주로 Th 2 type 사이토카인의분비목림프절에서얻은 lymphocyte를항원이첨가되지않은배양액에서배양한경우와비교하여항원을같이첨가하여배양한경우, 모든군에서주로 Th 2 type의사이토카인 IL-4, IL-5 생산이유의하게증가함을볼수있었다. ( 그림 5D. 와 5E.) 그러나 Th 1 type인사이토카인 IL-2와 IFN-γ는 OVA군과 HDM 500 μg인군에서만유의하게증가하였다. 목림프절의 lymphocyte를항원첨가하여배양한경우만살펴볼경우, 이들이생산한 TNF-α, IFN-γ, IL-2의수치는대조군과실험군간의유의한차이가없었지만, IL-4, IL-5 의수치는모든실험군이대조군보다유의하게높은값을보였고, HDM 10μg 감작군에서다른 HDM군에비해 IL-5의분비가더많은것을볼수있었다. ( 그림 5.) 그리고배양시킨세포주기를 BrdU assay로살펴보았을때, 면역감작시킨동물의목림프절에서항원자극에대응하여활발히림프구의세포증식을야기하는항원특이 lymphocyte 및항원특이 CD 4+ cell line이존재함을확인할수가있었다. ( 그림 6. 과그림 7.) 13
그림 5. 목림프절 lymphocyte 배양시항원첨가유무에따른상층액내사이토카인측정. 대조군과면역감작군의생산된사이토카인수치비교시통계적으로유의한경우 * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 같은동물의 lymphocyte 배양액에항원첨가안한경우와항원첨가해서배양한경우상층액내사이토카인수치가유의하게다른경우 : P < 0.05 14
그림 6. 목림프절 lymphocyte 배양시항원유무에따른각군의항원특이 lymphocyte 증식분석 (BrdU assay). BrdU assay 는세포주기별로세포분율살펴볼수있는검사로 S phase 는증식, 복제를위한단백질생성기간을의미하며, G2/M phase 의경우는실제증식을하고있거나일어난상태라고볼수있다. 그림 7. 목림프절 lymphocyte 배양시항원유무에따른각군의항원특이 CD4+ lymphocyte 증식분석. (BrdU assay) 15
4. 조직병리검사광학현미경검사상 mast cell 침윤은모든실험군에서뚜렷했다. 대조군에비해실험군에서유의하게결막내 mast cell 침윤이증가했고, 실험군간에는유의한차이는없었다. Eosinophil도대조군에비해실험군모두에서유의하게침윤증가된것이관찰되었으며, 실험군간에는유의한차이는없었다. ( 그림 9.) 그림 8. 결막의조직병리학적검사. A. 결막내 eosinophil 침윤의양 적분석. B. 결막내 mast cell 침윤의양적분석. 데이터는평균 ± 표준편차로나타내진다. * p <0.05, 대조군과비교시. 5. 결막내 CD 4+ T lymphocyte 분석결막내조직에서 T lymphocyte를분리하여그중 CD 4+ lymphocyte에서 ST2를발현한정도를알아보고자했는데, 면역감작군이대조군보다결막내활성화된 CD 4+ ST2+ Th lymphocyte 수가늘어나있음을확인할수있었다. 그리고이러한 CD4+ ST2+ Th lymphocyte에서 IL-5 분비또한늘어나있음을확인할수있었다. ( 그림 8.) 16
그림 9. 결막내 CD4+ 세포의 ST2 발현의증가및 IL-5 분비의증가. Ⅳ. 고찰 연구자는본래통년성알레르기결막염에서알레르기결막염약물의치료적효과를검증하기위해기존에발표된 HDM을이용한알레르기결막염모델에서소개된과정에따라모델을재현하려수차례시도하였으나, 11,12 Ovalbumin이나 ragweed 등이용한기존의다른알레르기결막염동물모델에서발견되는면역반응이실험결과상뚜렷하게나타나지않았다. 이런과정동안, C57B1/6 쥐보다는 BALB/c 쥐에서알레르기반응이좀더잘일어나는것을알수가있었고, 전신면역을반영하는 spleen보다는 cervical lymph node가좀더국소적인알레르기결막염반응을살펴보는데, 효과적이라는교훈을얻을수있었다. 따라서 BALB/c 쥐를사용하여 HDM 알레르기결막염모델확립하는연구를기존의동물모델개발연구들보다는좀더구체적이고다양한실험방법등을통해모델확립을확인하고자했다. 결과적으로 D. pteronyssinus 추출물로 17
일으킨이번알레르기결막염모델은기존에사람에서알려진통년성알레르기결막염의급성기와후기반응과잘상응함을확인할수가있었다. 20 눈꼽, 결막충혈, 눈찡그림등의임상증상외에도혈액내 total Ig E의증가및 HDM specific Ig E 검출, HDM stimulation 시행시목림프절에서의 lymphocyte 및 CD 4 + lymphocyte 증식증가및 Th2 사이토카인 IL-4, IL-5의분비증가등은기존의 OVA로인한알레르기결막염의양상과도거의동일했다. 특히본실험에서는 D. pteronyssinus 추출물 10μg의용량으로감작을시행한경우, Th 2 type의알레르기결막염반응이가장잘일어나는것으로보였는데, 이는기존의 Giavina-Bianchi이 500μg으로감작을시행했을때, 5μg으로시행했을때보다알레르기결막염반응이크다는것과는차이가있다. 12 이연구와다르게우리는전신감작을두번시행하였고, 항원을 4.18 μg/μl 농도로두방울점안하는방식이아니라항원양을 500μg / 5μl로고농도로정량하여점안을시행했다. Liu et al. 가 D. farinae 추출물로 BALB/c mice에서알레르기결막염을만든쥐모델을살펴보면, 우리보다 3.86kUA/L라는 potency가약한추출물로 2mg으로전신감작을시행하고, 한눈당 5mg의과량의항원을점안으로시행한경우알레르기결막염반응이일어났다고한다. 11 집먼지진드기추출물은 1g에 10만원정도의가격으로알레르기모델을만들때, 고가의재료비가들어간다. 따라서보다적은용량으로, 알레르기반응이잘나타나는효과적인알레르기결막염을발생시키는모델이있다면향후면역기전및치료효과실험등의다양한테마의실험을진행할때경제적이다. 우리는기존의알레르기결막염모델확립연구들보다 FACS 등을사용한더많은추가적인실험들을함께진행하였다. 목림프절세포와항원을함께첨가하여배양시배양액에서만키웠을때와비교하여항원의종류나농도에관계없이전실험군에서 18
IL-4와 IL-5의분비가유의하게증가함을알수가있었고, OVA군과 HDM 500μg군에서는각항원자극에대해 IL-2, IFN-γ 등의 Th 1 type 사이토카인분비가증가하는것이관찰되었으나대조군에비해유의하게증가하는것이아니었다. 하지만이를통해인해 Th1과 Th2 반응의상호작용으로인해 HDM 500μg군이 HDM 10μg이나 100μg을사용한경우보다혈액내 total Ig E의수치가낮게나타난것은아닌가추정된다. 림프구증식분석에서도모든면역감작실험군의목림프절내에항원특이 lymphocyte 및항원특이 CD4+cell line이존재하며결막내 eosinophil 과 mast cell의침윤이증가하였는데, 이는기존에항원의결막자극시, mature dentritic cell이 lymph node로옮겨가 B cell 및 Th2 반응을활성화시켜결막내에 mast cell 및 eosinophil 침착을증가시킨다고알려진것과맥락을같이한다. 5,6 최근알레르기에서 IL-33과 ST2에대해서주목을하고있다. ST2는 IL-1 R family로 Naïve CD4+cell은 ST2를발현하지않지만, 활성화된 CD4+cell은반복되는항원자극에대해세포표면에 ST2를발현하게된다. 21 이외에도 mast cell, eosinophil, innate lymphoid cell 등의표면에도발현되는것으로알려져있다. 22 그리고 IL-33은 IL-1 family로공기중 allergen, virus, 대기오염물질등과같은여러환경자극에의한상피손상등에의해방출되는데, 조직내 Th2 lymphocyte, mast cell, eosinophil 표면의 ST2와결합하여을이들을활성화시켜 Th2 관련사이토카인분비를증가시키고, 알레르기피부염및천식, 비염, 알레르기결막염에서도중요한역할을하는것으로최근알려져있다. 23-27 본실험에서 HDM 항원에의한알레르기결막염이일어난동물에서도국지적인결막내 CD4+T lymphocyte에서의 ST2 발현이증가됨을확인할수있었고, 이러한세포에서 IL-5의분비량이증가하는것으로보아집먼지 19
진드기알레르기결막염에서 ST2이발현된활성화된 CD4+ T lymphocyte가결막내 eosinophil 침윤에결정적인역할을함을추정할수있었다. IL-5 뿐만이아니라결막내 CD 4+ T lymphocyte의알레르기반응과관련된 IL-4, IL-9, IL-10, 혹은 IL-13 등의 Th2 사이토카인분비와의관련성및역할에대해추가실험으로알아볼수있으면좋을것같다. Ⅴ. 결론 이번쥐모델은미래치료적기반을위한면역병리학적연구에적합한것으로보이며, D. pteronyssinus 결막염모델유도시 HDM 추출물 10ug 항원을면역감작시사용하는것이가장좋은면역반응을유도하는것으로생각된다. 집먼지진드기추출물을이용한알레르기의결막염의이번쥐모델인경우에사람의통년성알레르기결막염과거의흡사하게주로 Th 2 타입의사이토카인분비가일어났으며, 혈액내 Ig E 수치및결막내 mast cell 및 eosinophil 침윤이증가되어있고결막내 CD4+T lymphocyte의 ST2 발현이증가되어있었으며, 이러한림프구에서 IL-5 분비능이증가되어결막내 eosinophil 침윤의큰역할을함을확인할수있었다. 따라서장차공기중의집먼지진드기나공기중환경오염물질등으로발생하는알레르기결막염치료를위해 IL-33 또는 ST2 발현을억제하거나차단을유도하는방법등을통해치료적방법을모색하는추가적인연구를시도해볼수있겠으며, 이번모델이향후알레르기결막염의치료적연구에있어많은기여를할수있을것으로기대하는바이다. 20
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ABSTRACT Development of allergic conjunctivitis induced by house dust mite extract from Dermatophagoides Pteronyssinus Young Ji Lee Department of Medicine The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Kyoung Ryul Seo) Purpose : To develop the murine model of allergic conjunctivitis induced by house dust mite(hdm) extract from Dermatophagoides pteronyssinus, one of major allergens in human. 방법 : Fourty BALB/c mice were immunized with placebo, Ovalbumin 10 μg, or 10ug, 100ug, 500ug of HDM extract. After ocular challenge, the mice were examined clinically. Material collected from animals was used for total and specific Ig E level, for assays of HDM specific lymphocyte proliferation and supernant cytokine assay, for histopathological evaluation of conjunctiva, and flow cytometric analysis of conjunctival cells subsets. Results : This murine model is similar to human disease and ovalbumin induced allergic conjunctivitis both clinically and according to laboratory findings. In the cervical lymph nodes of immunized mice, there were antigen specific lymphocytes in the cervical to produce IL-4, IL-5 upon challenge. Total Ig E levels in the sera and infiltrations of mast cell and eosinophil in the conjunctiva were significant higher than control group. Immunized mice showed increased CD 4+T cell with expression of ST2 to secrete IL-5. Conclusions: D. pteronyssinus extract successfully induced the symptoms of allergic conjunctivitis in Balb/c mice. This 24
model is suitable for the study of immunopathogesis and the new therapeutic approach. 10μg of HDM extract was optimal dose for the immunization in the murine model of allergic conjunctivitis. ----------------------------------------------- Key Words : allergic conjunctivitis, house dust mite, Dermatophagoides pteronyssinus, BALB/c, eosinophil, 25